CN113307864A - 用于产生嵌合多肽的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于产生嵌合多肽的方法和组合物。具体地，本发明提供用于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法和组合物。本发明包括两种载体：包括第一多肽的序列的第一载体和包括第二多肽的第二载体。载体包括互补位点特异性重组基序使得两种载体间的位点特异性重组导致包括第一多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分的嵌合多肽的产生。位点特异性重组基序可位于内含子内或位于第一或第二载体上的编码序列内。

Description

用于产生嵌合多肽的方法和组合物
本申请是申请日为2016年6月7日、名称为“用于产生嵌合多肽的方法和组合物”的201680047211.8号中国发明专利申请(即PCT/US2016/036233)的分案申请。
发明背景
已利用不同的方法来鉴定能够结合特定抗原的结合部分。现有技术方法已被用于产生抗体或抗体片段，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP。因为这些类型的结合部分具有截然不同的性质，所以将第一类型的结合部分转化为第二类型的结合部分有时是有利的。用于将第一类型的多肽转化为第二类型的多肽的某些现有方法可能是无效率的。因此，本领域存在对用于将第一类型的多肽有效转化为第二类型的多肽(例如嵌合多肽)的组合物和方法的需要。
发明概述
本发明提供将第一类型的多肽转化至包括第一类型的多肽的至少一部分和优选其它多肽或其片段的嵌合多肽(例如不同类型的多肽)的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明包括两种载体：包括第一多肽的序列(例如结合部分)的第一载体和包括第二多肽的序列(例如构架)的第二载体。要认识到，术语“第一载体”和“第二载体”和术语“第一多肽”和“第二多肽”可以是互换的。载体可进一步包括互补位点特异性重组基序，使得两种载体间的位点特异性重组导致包括第一多肽的至少一部分和第二载体的第二多肽的至少一部分的嵌合多肽的产生。
第一个方面，本发明的特征在于将单链可变片段(scFv)转化至嵌合多肽的方法。所述方法包括：
(a)提供以从5’到3’的顺序包括以下的第一载体，
第一哺乳动物表达控制基序，
第一大肠杆菌(E.coli)表达控制基序，
编码scFv的重链可变区(VH)的序列，
第一位点特异性重组基序，
编码scFv的轻链可变区(VL)的序列，
5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
融合展示蛋白序列，
3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，和
编码轻链恒定区(CL)的序列，和
(b)提供以从5’到3’的顺序包括以下的第二载体
第二哺乳动物表达控制基序，
第二位点特异性重组基序，和
编码多肽的序列；和
(c)在重组酶存在下使第一载体和第二载体接触，
其中重组酶使第一载体和第二载体以位点特异性方式组合形成整合载体，
其中整合载体表达与CL融合的VL和与多肽融合的单独VH，
从而在表达时将scFv转化至嵌合多肽。
在第一方面的一些实施方案中，第一载体是噬菌粒载体。在某些实施方案中，第二载体是噬菌粒载体。在一个实施方案中，第一载体是噬菌粒载体，第二载体不是噬菌粒载体。
在第一方面的一些实施方案中，第一载体进一步包括：位于第一哺乳动物表达控制基序和第一大肠杆菌表达控制基序之间的5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)和位于第一大肠杆菌表达控制基序和编码scFv的VH的序列之间的3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。在某些实施方案中，第一载体进一步包括位于第二3’哺乳动物剪接位点和编码scFv的VH的序列之间的前导序列。
在第一方面的一些实施方案中，第一载体进一步包括位于第一大肠杆菌表达控制基序和编码scFv的VH的序列之间的前导序列。
在第一方面的一些实施方案中，第一载体进一步包括：位于编码scFv的VH的序列和第一位点特异性重组基序之间的其它5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)和位于第一位点特异性重组基序和编码scFv的VL的序列之间的其它3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。
在第一方面的一些实施方案中，第二载体进一步包括：位于第二哺乳动物表达控制基序和第二位点特异性重组基序之间的另外的5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)和位于第二位点特异性重组基序和编码多肽的序列之间的另外的3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。
在第一方面的一些实施方案中，多肽包括重链恒定区。
在第一方面的一些实施方案中，整合载体表达IgG抗体。
在第一方面的一些实施方案中，多肽包括融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白包括标签(例如FLAG、HA、Myc、V5、His、GST、MBP、AviTag、链霉抗生物素标签或本领域已知的任何其它标签)。在不同的实施方案中，融合蛋白包括荧光蛋白(例如GFP、YFP、CFP、RFP、dsRed、mCherry或本领域已知的任何荧光蛋白)。
在第一方面的一些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供包括编码重组酶的多核苷酸的其它载体。在某些实施方案中，重组酶由其它载体表达。
第二个方面，本发明的特征在于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法。所述方法包括：
(a)提供：
i.包括编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸包括第一位点特异性重组基序；
ii.包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用重组酶使第一载体和第二载体重组，从而形成编码包括以下的嵌合多肽的重组载体：
i.第一多肽或其部分，和
ii.第二多肽或其部分。
在第二方面的一些实施方案中，第一多核苷酸的第一多肽编码区包括第一位点特异性重组基序。在一些实施方案中，第一多肽包括接头，且编码接头的多核苷酸的部分包括第一位点特异性重组基序。在某些实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸。在具体的实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供包括编码重组酶的多核苷酸的其它载体。
第三个方面，本发明的特征在于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法。所述方法包括：
(a)提供：
i.包括编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸包括含有第一位点特异性重组基序的内含子；
ii.包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用重组酶使第一载体和第二载体重组，从而形成编码包括以下的嵌合多肽的重组载体：
i.第一多肽或其部分，和
ii.第二多肽或其部分。
在第三方面的一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸的部分包括内含子。在某些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸的部分不包括内含子。在具体的实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸。
在第三方面的一些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供包括编码重组酶的多核苷酸的其它载体。
第四个方面，本发明的特征在于将第一多肽转化至至少两种嵌合多肽之一的方法。所述方法包括：
(a)提供第一载体，其包括编码包括第一位点特异性重组基序和备选位点特异性重组基序的第一多肽的第一多核苷酸，和
i.第二载体，其包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；或
ii.包括截然不同于第一位点特异性重组基序的第三位点特异性重组基序和编码备选多肽的备选多核苷酸；和能够使备选位点特异性重组基序与第三位点特异性重组基序重组的备选重组酶的第三载体；和
(b)使第一载体和；
i.第二载体用重组酶进行重组，从而形成编码包括第一多肽或其部分和第二多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体；和/或
ii.第三载体用备选重组酶进行重组，从而形成编码包括第一多肽或其部分和备选多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体。
在第四方面的一些实施方案中，第一多核苷酸包括第一位点特异性重组基序。在某些实施方案中，第一多核苷酸包括含有第一位点特异性重组基序的内含子。在不同的实施方案中，第二多核苷酸包括含有第二位点特异性重组基序的内含子。在具体的实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸，和/或第一载体或第三载体包括编码备选重组酶的多核苷酸。
第五个方面，本发明的特征在于将scFv转化至嵌合多肽的方法。所述方法包括：
(a)提供：
i.第一载体，其包括编码包括scFv的第一多肽的第一多核苷酸，所述scFv含有轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，所述第一多核苷酸的部分编码包括第一位点特异性重组基序(例如attP位点)的接头区；
ii.第二载体，其包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和
iii.能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用重组酶使第一载体和第二载体重组，从而形成编码包括以下的嵌合多肽的重组载体：
i.轻链可变结构域和/或重链可变结构域，和
ii.第二多肽或其部分；
其中嵌合多肽不是scFv。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽包括抗体或抗体片段。在某些实施方案中，抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。在不同的实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG。
在某些实施方案中，抗体片段包括scFv、单域抗体(sdAb)、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。在具体的实施方案中，抗体片段是scFv。在一个实施方案中，scFv是细胞溶胶稳定的scFv。在某些实施方案中，scFv是牛scFv。在一个实施方案中，sdAb是骆驼VHH。在不同的实施方案中，scFv包括位于scFv的轻链可变结构域和重链可变结构域之间的接头，接头包括第一位点特异性重组基序。在具体的实施方案中，嵌合多肽包括scFv的轻链可变结构域和/或scFv的重链可变结构域。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽包括嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，第一多肽包括CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在某些实施方案中，嵌合多肽包括第一多肽的CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在不同的实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)第一多肽的CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域，和(ii)第一多肽或其部分。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在不同的实施方案中，嵌合多肽包括抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。在不同的实施方案中，抗体是IgG。在具体的实施方案中，第一多肽包括IgG的可变轻链和/或可变重链。在具体的实施方案中，第一载体包括编码IgG的恒定结构域的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，恒定结构域包括CL结构域或Fc结构域。在一个实施方案中，恒定结构域包括包含Fc结构域的CH结构域。
在某些实施方案中，抗体片段包括scFv、sdAb、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。在具体的实施方案中，抗体片段是scFv。在具体的实施方案中，scFv是细胞溶胶稳定的scFv。在一个实施方案中，scFv是牛scFv。在一个实施方案中，sdAb是骆驼VHH。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽包括嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，第二多肽包括CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的轻链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在不同的实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的轻链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在具体的实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的重链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在不同的实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的重链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在其它实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在不同的实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽包括泛素连接酶结构域。在某些实施方案中，第二多肽包括泛素连接酶结构域。在具体的实施方案中，泛素连接酶结构域包括CHIPΔTPR结构域。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽包括knocksideways捕食结构域(prey domain)。在某些实施方案中，第二多肽包括knocksideways捕食结构域。在具体的实施方案中，knocksideways捕食结构域包括FKBP结构域。在某些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供knocksideways诱饵蛋白(baitprotein)。在具体的实施方案中，knocksideways诱饵蛋白包括FRB结构域。在具体的实施方案中，knocksideways诱饵蛋白包括线粒体外膜引导信号。在一个实施方案中，knocksideways诱饵蛋白是Mitotrap蛋白。
在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括泛素连接酶结构域。在具体的实施方案中，第二多肽包括泛素连接酶结构域。在一个实施方案中，泛素连接酶结构域包括CHIPΔTPR结构域。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。在某些实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。在一个实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31。在某些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供辅助因子。在一个实施方案中，辅助因子包括Xis。在某些实施方案中，酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。在具体的实施方案中，重组酶选自表2所示整合酶。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽包括标记。在某些实施方案中，标记是表位标签和/或荧光蛋白。在具体的实施方案中，表位标签是FLAG、HA、Myc、V5、His、GST、MBP、AviTag或链霉抗生物素标签或本领域已知的任何其它表位标签。在具体的实施方案中，荧光蛋白是EGFP、GFP、YFP、CFP、mCherry、dsRed或本领域已知的任何荧光蛋白。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，重组步骤发生在细胞中。在具体的实施方案中，细胞包含在乳滴中。在某些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供细胞，而细胞包含载体和重组酶。在某些实施方案中，第一载体是质粒或噬菌粒。在具体的实施方案中，第一载体包括编码展示蛋白的多核苷酸。在具体的实施方案中，展示蛋白能够在细胞(例如其中发生重组步骤的细胞)的胞外表面展示第一多肽或其部分。在一个实施方案中，展示蛋白包括ompA。在另一个实施方案中，展示蛋白包括bclA。在不同的实施方案中，细胞是细菌细胞。在具体的实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌。在不同的实施方案中，细胞是真核细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
在某些实施方案中，细胞进一步包含包括编码重组酶的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，细胞进一步包含包括编码重组酶的多核苷酸的染色体。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，重组步骤发生在无细胞系统中。在某些实施方案中，无细胞系统是包括载体和重组酶的溶液。在一个实施方案中，重组酶是噬菌体λ整合酶。在不同的实施方案中，无细胞系统包含在乳滴中。在具体的实施方案中，多个这类重组步骤可平行发生在多个乳滴中。预期在例如这类乳滴中大量多重平行的重组反应。这类多重系统可包括例如本领域已知的基于任何液体处理或乳滴的系统。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在某些实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制第一多肽或其部分的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制第一多肽或其部分的表达。在具体的实施方案中，第一多肽或其部分当在第一细胞类型表达时与某一蛋白质片段融合。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。在某些实施方案中，第一细胞类型是细菌细胞，第二细胞类型是真核细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在另一个实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在某些实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制第二多肽或其部分的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制第二多肽或其部分的表达。在具体的实施方案中，第二多肽或其部分当在第一细胞类型表达时与某一蛋白质片段融合。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。在某些实施方案中，第一细胞类型是细菌细胞，第二细胞类型是真核细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在另一个实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，重组载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在不同的实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制嵌合多肽的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制嵌合多肽的表达。在某些实施方案中，第一细胞类型是细菌细胞，第二细胞类型是真核细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在另一个实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。
在上述任一个的某些实施方案中，一个或多个不同的调节元件是启动子。在具体的实施方案中，启动子是细菌启动子(例如lac启动子、T7启动子或T3启动子)。在一个实施方案中，细菌启动子是lac启动子。在其它实施方案中，启动子是真核启动子(例如能够在哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞中控制表达的启动子)。在一个实施方案中，能够在哺乳动物细胞中控制表达的启动子是CMV启动子或EF1a启动子。在另一个实施方案中，能够在昆虫细胞中控制表达的启动子是多角体(polyhedron)启动子。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一多核苷酸包括包含内含子调节元件的内含子。在某些实施方案中，内含子调节元件在原核细胞中控制第一多肽或其部分的表达。在具体的实施方案中，原核细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌。在不同的实施方案中，第一多肽或其部分当在原核细胞中表达时与某一蛋白质片段融合。在某些实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13 gpIII。在不同的实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。在某些实施方案中，内含子进一步包括编码蛋白质片段的多核苷酸。在具体的实施方案中，内含子调节元件控制蛋白质片段的表达。在一个实施方案中，内含子调节元件在真核细胞中通过RNA剪接从第一多核苷酸的转录物中除去。在某些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
在某些实施方案中，内含子调节元件是启动子。在具体的实施方案中，启动子是细菌启动子(例如lac启动子、T7启动子或T3启动子)。在一个实施方案中，细菌启动子是lac启动子。在其它实施方案中，启动子是真核启动子(例如能够在哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞中控制表达的启动子)。在一个实施方案中，能够在哺乳动物细胞中控制表达的启动子是CMV启动子或EF1a启动子。在另一个实施方案中，能够在昆虫细胞中控制表达的启动子是多角体启动子。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体进一步包括一对互补位点特异性重组基序(例如两个loxP位点、两个FRT位点或attB位点和attP位点)。在某些实施方案中，第一多核苷酸、其片段和/或第一位点特异性重组基序位于互补位点特异性重组基序对之间。在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体进一步包括一对互补位点特异性重组基序。在某些实施方案中，第二多核苷酸、其片段和/或第二位点特异性重组基序位于互补位点特异性重组基序对之间。
在某些实施方案中，使互补位点特异性重组基序对定位使得互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的倒位。在其它实施方案中，使互补位点特异性重组基序对定位使得互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的缺失。
在某些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供能够使互补位点特异性重组基序对重组的重组酶(例如Cre、FRT、phiC31或噬菌体λ整合酶)。在具体的实施方案中，所述方法进一步包括使互补位点特异性重组基序对重组的步骤。在具体的实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括一对loxP位点。在一个实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供Cre重组酶。在具体的实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括一对FRT位点。在一个实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供Flp重组酶。在具体的实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括attB位点和attP位点。在某些实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供能够使所述第一位点特异性重组基序和/或所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶(例如phiC31或BxB1)和能够使互补位点特异性重组基序对重组的不同的重组酶(例如BxB1、phiC31、Cre或Flp)。在一个实施方案中，所述提供步骤进一步包括提供适于使互补位点特异性重组基序对的attB位点和attP位点重组的phiC31或BxB1重组酶。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体是病毒载体。在某些实施方案中，第一载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体是病毒载体。在某些实施方案中，第二载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。在某些实施方案中，一个或多个病毒元件位于内含子之内。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体是噬菌粒载体。在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体是噬菌粒载体。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体进一步包括第一重组基序片段，第二载体包括第二重组基序片段，而重组载体包括包含第一重组基序片段和第二重组基序片段的隐蔽位点特异性重组基序，和
所述方法进一步包括：
(c)用能够使隐蔽位点特异性重组基序与另外的位点特异性重组基序重组的另外的重组酶使重组载体和包括以下的另外的载体重组
(i)另外的位点特异性重组基序，和
(ii)编码另外的多肽的多核苷酸；
从而形成编码包括以下的第二嵌合多肽的第二重组载体：
(i)嵌合多肽或其部分，和
(ii)另外的多肽或其部分。
在某些实施方案中，第一位点特异性重组基序和隐蔽位点特异性重组基序是相同的。在其它实施方案中，第一位点特异性重组基序和隐蔽位点特异性重组基序是不同的。在不同的实施方案中，另外的重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。在具体的实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。在一个实施方案中，丝氨酸家族重组酶是BxB1。在具体的实施方案中，酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。在某些实施方案中，另外的重组酶选自表2所示整合酶。
在某些实施方案中，第二嵌合多肽包括抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体是IgG。在某些实施方案中，第二嵌合多肽包括CAR。在具体的实施方案中，另外的多肽包括CD3-ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、CD28胞质域、41BB胞质域、ICOS胞质域、FcεRIγ胞质域、流感MP-1胞质域、VZV胞质域和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，抗原是Tyro3。在某些实施方案中，另外的多肽包括泛素连接酶结构域。在某些实施方案中，另外的多肽包括knocksideways捕食结构域。在一个实施方案中，另外的多肽包括泛素连接酶结构域和knocksideways捕食结构域。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，编码第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽的mRNA转录物能够通过ADAR酶编辑。在某些实施方案中，编辑包括激活mRNA转录物中隐蔽剪接位点以从转录物中除去外显子。在不同的实施方案中，编辑包括除去mRNA转录物中的剪接位点。在某些实施方案中，mRNA转录物包括第一区和能够与第一区杂交形成双链体的第二区。在一个实施方案中，第一区与第二区互补，双链体的长度为至少100bp。在另一个实施方案中，双链体的长度不超过30bp并包括编辑位点互补序列。在进一步的实施方案中，双链体的长度大于30bp并包括一个或多个错配碱基、凸出或环。在某些实施方案中，第一载体或第二载体进一步包括编码ADAR酶的多核苷酸。
在第一个至第五个方面的任一个的一些实施方案中，编码第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽的mRNA转录物包括一个或多个翻译绕行元件(byp)。
第六个方面，本发明的特征在于包含以下的组合物：
(a)包括编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸包括第一位点特异性重组基序；
(b)包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中重组导致编码包括以下的嵌合多肽的重组载体形成：
i.第一多肽或其部分，和
ii.第二多肽或其部分。
在第六个方面的一些实施方案中，第一多核苷酸的第一多肽编码区包括第一位点特异性重组基序。在一些实施方案中，第一多肽包括接头，且编码接头的多核苷酸的部分包括第一位点特异性重组基序。在某些实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸。在不同的实施方案中，组合物进一步包含包括编码重组酶的多核苷酸的其它载体。
第七个方面，本发明的特征在于包含以下的组合物：
(a)包括编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸包括含有第一位点特异性重组基序的内含子；
(b)包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中重组导致编码包括以下的嵌合多肽的重组载体形成：
i.第一多肽或其部分，和
ii.第二多肽或其部分。
在第七个方面的一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸的部分包括内含子。在第七个方面的其它实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸的部分不包括内含子。
在某些实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸。在进一步的实施方案中，组合物包含包括编码重组酶的多核苷酸的其它载体。
第八个方面，本发明的特征在于包含以下的组合物：
(a)第一载体，其包括编码包括第一位点特异性重组基序和备选位点特异性重组基序的第一多肽的第一多核苷酸，和
(b)(i)第二载体，其包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶，或
(ii)第三载体，其包括不同于第一位点特异性重组基序的第三位点特异性重组基序和编码备选多肽的备选多核苷酸；和能够使备选位点特异性重组基序与第三位点特异性重组基序重组的备选重组酶；
其中第一载体和第二载体通过重组酶的重组导致编码包括第一多肽或其部分和第二多肽的嵌合多肽的重组载体形成；和
其中第一载体和第三载体通过备选重组酶的重组导致编码包括第一多肽或其部分和备选多肽的嵌合多肽的重组载体形成。
在第八个方面的一些实施方案中，第一多核苷酸包括第一位点特异性重组基序。在某些实施方案中，第一多核苷酸包括含有第一位点特异性重组基序的内含子。在具体的实施方案中，第一载体或第二载体包括编码重组酶的多核苷酸，和/或第一载体或第三载体包括编码备选重组酶的多核苷酸。
第九个方面，本发明的特征在于包含以下的组合物：
(a)第一载体，其包括编码scFv的第一多核苷酸，所述scFv包括轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，第一多核苷酸的部分编码包括第一位点特异性重组基序(例如attP位点)的接头区；
(b)包括第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使第一位点特异性重组基序与第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中第一载体与第二载体通过重组酶的重组形成编码包括以下嵌合结合部分的重组载体：
i.轻链可变结构域和/或重链可变结构域，和
ii.第二多肽或其部分。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽是抗体或抗体片段。在某些实施方案中，抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG。
在某些实施方案中，抗体片段是scFv、sdAb、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。在具体的实施方案中，抗体片段是scFv。在具体的实施方案中，scFv是细胞溶胶稳定的scFv。在一个实施方案中，scFv是牛或骆驼scFv。在一个实施方案中，sdAb是骆驼VHH。在具体的实施方案中，scFv包括位于scFv的轻链可变结构域和重链可变结构域之间的接头，接头包括第一位点特异性重组基序。在不同的实施方案中，嵌合多肽包括scFv的轻链可变结构域和/或scFv的重链可变结构域。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，第一多肽包括CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，嵌合多肽包括第一多肽的CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)第一多肽的CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域，和(ii)第一多肽或其部分。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽是抗体或抗体片段。在某些实施方案中，抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。在一个具体的实施方案中，抗体是IgG。在一个实施方案中，第一多肽包括IgG的可变轻链和/或可变重链。在具体的实施方案中，第一载体包括编码IgG的恒定结构域的多核苷酸。在具体的实施方案中，恒定结构域包括CL结构域或Fc结构域。在一个实施方案中，恒定结构域包括包含Fc结构域的CH结构域。
在某些实施方案中，抗体片段是scFv、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。在一个具体的实施方案中，抗体片段是scFv。在一个具体的实施方案中，scFv是细胞溶胶稳定的scFv。在一个实施方案中，scFv是牛或骆驼scFv。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，第二多肽包括CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的轻链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的轻链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在其它实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的重链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的重链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在进一步的实施方案中，第一多肽是scFv，嵌合多肽包括scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域和CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括位于以下之间的肽接头结构域：(i)scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域，和(ii)CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。在具体的实施方案中，肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸或约1-250个氨基酸(例如约1-50、1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸)。在一个优选的实施方案中，肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽包括泛素连接酶结构域。在某些实施方案中，第二多肽包括泛素连接酶结构域。在具体的实施方案中，泛素连接酶结构域包括CHIPΔTPR结构域。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，嵌合多肽包括knocksideways捕食结构域。在某些实施方案中，第二多肽包括knocksideways捕食结构域。在一个实施方案中，knocksideways捕食结构域包括FKBP结构域。
在某些实施方案中，组合物进一步包括knocksideways诱饵蛋白。在一个特定的实施方案中，knocksideways诱饵蛋白包括FRB结构域。在具体的实施方案中，knocksideways诱饵蛋白包括线粒体外膜引导信号。在一个实施方案中，knocksideways诱饵蛋白是Mitotrap蛋白。
在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括泛素连接酶结构域(例如嵌合多肽包括knocksideways捕食结构域和泛素连接酶结构域)。在一个特定的实施方案中，第二多肽包括泛素连接酶结构域。在一个实施方案中，泛素连接酶结构域包括CHIPΔTPR结构域。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。在某些实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。在一个实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31。在某些实施方案中，组合物进一步包括辅助因子。在一个实施方案中，辅助因子包括Xis。在进一步的实施方案中，酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。在具体的实施方案中，重组酶选自表2所示整合酶。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽包括标记。在某些实施方案中，标记是表位标签和/或荧光蛋白。在具体的实施方案中，表位标签是FLAG、HA、Myc、V5、His、GST、MBP、AviTag或链霉抗生物素标签或本领域已知的任何其它表位标签。在具体的实施方案中，荧光蛋白是EGFP、GFP、YFP、CFP、mCherry、dsRed或本领域已知的任何荧光蛋白。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，组合物进一步包括包含载体和重组酶的细胞。在具体的实施方案中，细胞包含在乳滴中。在某些实施方案中，第一载体是质粒或噬菌粒。在具体的实施方案中，第一载体包括编码展示蛋白的多核苷酸。在具体的实施方案中，展示蛋白能够在细胞(例如其中发生重组步骤的细胞)的胞外表面展示第一多肽或其部分。在一个实施方案中，展示蛋白包括ompA。在另一个实施方案中，展示蛋白包括bclA。在某些实施方案中，细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌。在其它实施方案中，细胞是真核细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。在某些实施方案中，细胞进一步包含包括编码重组酶的多核苷酸的载体。在进一步的实施方案中，细胞进一步包含包括编码重组酶的多核苷酸的染色体。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，载体和重组酶(例如phiC31或噬菌体λ整合酶)位于无细胞系统内。在一个实施方案中，重组酶是噬菌体λ整合酶。在某些实施方案中，无细胞系统包含在乳滴中。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在某些实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制第一多肽或其部分的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制第一多肽或其部分的表达。在具体的实施方案中，第一多肽或其部分当在第一细胞类型表达时与某一蛋白质片段融合。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在某些实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制第二多肽或其部分的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制第二多肽或其部分的表达。在具体的实施方案中，第二多肽或其部分当在第一细胞类型表达时与某一蛋白质片段融合。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，重组载体包括彼此相邻定位的多个不同的调节元件。在某些实施方案中，调节元件之一在第一细胞类型中控制嵌合多肽的表达，调节元件的另一个在第二细胞类型中控制嵌合多肽的表达。在具体的实施方案中，第一细胞类型是细菌细胞，第二细胞类型是真核细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在进一步的实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。
在上述任一个的某些实施方案中，一个或多个不同的调节元件是启动子。在具体的实施方案中，启动子是细菌启动子(例如lac启动子、T7启动子或T3启动子)。在一个实施方案中，细菌启动子是lac启动子。在其它实施方案中，启动子是真核启动子(例如能够在哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞中控制表达的启动子)。在一个实施方案中，能够在哺乳动物细胞中控制表达的启动子是CMV启动子或EF1a启动子。在另一个实施方案中，能够在昆虫细胞中控制表达的启动子是多角体启动子。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一多核苷酸包括包含内含子调节元件的内含子。在某些实施方案中，内含子调节元件在原核细胞中控制第一多肽或其部分的表达。在一个特定的实施方案中，原核细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌。在某些实施方案中，第一多肽或其部分当在原核细胞中表达时与某一蛋白质片段融合。在一个特定的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13 gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌信号肽。在具体的实施方案中，内含子进一步包括编码蛋白质片段的多核苷酸。在不同的实施方案中，内含子调节元件控制蛋白质片段的表达。在某些实施方案中，内含子调节元件在真核细胞中通过RNA剪接从第一多核苷酸的转录物中除去。在具体的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞)、昆虫细胞或真菌细胞。
在某些实施方案中，内含子调节元件是启动子。在具体的实施方案中，启动子是细菌启动子(例如lac启动子、T7启动子或T3启动子)。在一个实施方案中，细菌启动子是lac启动子。在其它实施方案中，启动子是真核启动子(例如能够在哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞中控制表达的启动子)。在一个实施方案中，能够在哺乳动物细胞中控制表达的启动子是CMV启动子或EF1a启动子。在另一个实施方案中，能够在昆虫细胞中控制表达的启动子是多角体启动子。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体进一步包括一对互补位点特异性重组基序(例如两个loxP位点、两个FRT位点或attB位点和attP位点)。在某些实施方案中，第一多核苷酸、其片段和/或第一位点特异性重组基序位于互补位点特异性重组基序对之间。在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体进一步包括一对互补位点特异性重组基序(例如两个loxP位点、两个FRT位点或attB位点和attP位点)。在某些实施方案中，第二多核苷酸、其片段和/或第二位点特异性重组基序位于互补位点特异性重组基序对之间。
在某些实施方案中，使互补位点特异性重组基序对定位使得互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的倒位。在其它实施方案中，使互补位点特异性重组基序对定位使得互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的缺失。在某些实施方案中，组合物进一步包括能够使互补位点特异性重组基序对重组的重组酶(例如Cre、FRT、phiC31或噬菌体λ整合酶)。
在具体的实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括一对loxP位点。在一个实施方案中，组合物进一步包括Cre重组酶。
在其它实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括一对FRT位点。在一个实施方案中，组合物进一步包括Flp重组酶。
在再进一步的实施方案中，互补位点特异性重组基序对包括attB位点和attP位点。在具体的实施方案中，组合物进一步包括适于使互补位点特异性重组基序对的attB位点和attP位点重组的phiC31或BxB1重组酶。在某些实施方案中，组合物进一步包括能够使所述第一位点特异性重组基序和/或所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶(例如phiC31或BxB1)和能够使互补位点特异性重组基序对重组的不同的重组酶(例如BxB1、phiC31、Cre或Flp)。在一个实施方案中，组合物进一步包括适于使互补位点特异性重组基序对的attB位点和attP位点重组的phiC31或BxB1重组酶。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体是病毒载体。在某些实施方案中，第一载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。在进一步的实施方案中，第二载体是病毒载体。在某些实施方案中，第二载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。在具体的实施方案中，一个或多个病毒元件位于内含子之内。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体是噬菌粒载体。在第六个到第九个方面的其它实施方案中，第二载体是噬菌粒载体。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，
第一载体进一步包括第一重组基序片段，第二载体包括第二重组基序片段，和
重组载体包括含有第一重组基序片段和第二重组基序片段的隐蔽位点特异性重组基序，
其中用能够使隐蔽位点特异性重组基序与另外的位点特异性重组基序重组的另外的重组酶使重组载体和包括以下的另外的载体重组
(i)另外的位点特异性重组基序，和
(ii)编码另外的多肽的多核苷酸；
导致编码包括以下的第二嵌合多肽的第二重组载体的形成：
(i)嵌合多肽或其部分，和
(ii)另外的多肽或其部分。
在某些实施方案中，第一位点特异性重组基序和隐蔽位点特异性重组基序是相同的。在其它实施方案中，第一位点特异性重组基序和隐蔽位点特异性重组基序是不同的。
在某些实施方案中，另外的重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。在具体的实施方案中，丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。在一个实施方案中，丝氨酸家族重组酶是BxB1。在进一步的实施方案中，酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。在某些实施方案中，另外的重组酶选自表2所示整合酶。
在某些实施方案中，第二嵌合多肽包括抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体是IgG。在进一步的实施方案中，第二嵌合多肽包括CAR。在具体的实施方案中，另外的多肽包括CD3-ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、CD28胞质域、41BB胞质域、ICOS胞质域、FcεRIγ胞质域、流感MP-1胞质域、VZV胞质域和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。在某些实施方案中，CAR包括能够与疾病相关抗原结合的胞外结合部分(例如scFv)。在具体的实施方案中，疾病是细胞增殖病症，例如癌症。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，抗原是CD19，疾病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，抗原是Tyro3。在再进一步的实施方案中，另外的多肽包括泛素连接酶结构域。在其它的实施方案中，另外的多肽包括knocksideways捕食结构域。在一个具体的实施方案中，另外的多肽包括泛素连接酶结构域和knocksideways捕食结构域。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，组合物进一步包含编码第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽的mRNA转录物，其中mRNA转录物能够通过ADAR酶编辑。在某些实施方案中，编辑包括激活mRNA转录物中隐蔽剪接位点以从转录物中除去外显子。在不同的实施方案中，编辑包括除去mRNA转录物中的剪接位点。在具体的实施方案中，mRNA转录物包括第一区和能够与第一区杂交形成双链体的第二区。在一个实施方案中，第一区与第二区互补，双链体的长度为至少100bp。在另一个实施方案中，双链体的长度不超过30bp并包括编辑位点互补序列。在一个备选的实施方案中，双链体的长度大于30bp并包括一个或多个错配碱基、凸出或环。在某些实施方案中，第一载体或第二载体进一步包括编码ADAR酶的多核苷酸。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，组合物进一步包含编码第一多肽、第二多肽和/或嵌合多肽的mRNA转录物，其中mRNA转录物包括一个或多个翻译绕行元件(byp)。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体包括能够在细菌细胞(例如大肠杆菌)中控制第一多肽的表达的启动子。在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一载体包括能够在真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞；昆虫细胞或真菌细胞，例如酵母细胞)中控制第一多肽的表达的启动子。在某些实施方案中，第一载体包括能够在细菌细胞(例如大肠杆菌)中控制第一多肽的表达的启动子和能够在真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞；昆虫细胞或真菌细胞，例如酵母细胞)中控制第一多肽的表达的启动子。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体包括能够在细菌细胞(例如大肠杆菌)中控制第二多肽的表达的启动子。在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第二载体包括能够在真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞；昆虫细胞或真菌细胞，例如酵母细胞)中控制第二多肽的表达的启动子。在某些实施方案中，第二载体包括能够在细菌细胞(例如大肠杆菌)中控制第二多肽的表达的启动子和能够在真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞；昆虫细胞或真菌细胞，例如酵母细胞)中控制第二多肽的表达的启动子。在上述任一个的某些实施方案中，能够在细菌细胞中控制第一或第二多肽的表达的启动子是lac启动子、T7启动子或T3启动子。在上述任一个的某些实施方案中，能够在哺乳动物细胞中控制第一或第二多肽的表达的启动子是CMV启动子或EF1a启动子。在上述任一个的某些实施方案中，能够在昆虫细胞中控制第一或第二多肽的表达的启动子是多角体启动子。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，编码第一多肽或其部分的第一载体的部分另编码与某一蛋白质片段的融合物。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13 gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌或哺乳动物信号肽。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，编码第二多肽或其部分的第二载体的部分另编码与某一蛋白质片段的融合物。在具体的实施方案中，该蛋白质片段包括病毒外被蛋白。在一个实施方案中，病毒外被蛋白是M13 gpIII。在某些实施方案中，该蛋白质片段进一步包括细菌或哺乳动物信号肽。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第一位点特异性重组基序位于第一多核苷酸的上游(例如其5’)。在某些实施方案中，第一位点特异性重组基序位于编码标记(例如抗性标记，例如氯霉素(CAM)基因、ampR基因或本文所述任何其它标记)的多核苷酸的上游(例如其5’)。在某些实施方案中，第二位点特异性重组基序位于调节元件(例如启动子)和第二多核苷酸之间。在一个实施方案中，调节元件控制第二多核苷酸的表达。在具体的实施方案中，第二位点特异性重组基序位于调节元件(例如启动子，例如细菌启动子，例如CAM抗性基因启动子)和编码重组酶(例如phiC31、噬菌体λ整合酶、BxB1、Cre或Flp)的多核苷酸之间。在一个具体的实施方案中，调节元件不控制重组酶的表达。在一个实施方案中，调节元件控制标记的表达。在一个优选的实施方案中，重组载体按顺序包括启动子和编码标记的多核苷酸，使得启动子控制标记自重组载体表达。
在第六个到第九个方面的任一个的一些实施方案中，第二位点特异性重组基序位于第二多核苷酸的上游(例如其5’)。在某些实施方案中，第二位点特异性重组基序位于编码标记(例如抗性标记，例如CAM基因、ampR基因或本文所述任何其它标记)的多核苷酸的上游(例如其5’)。在某些实施方案中，第一位点特异性重组基序位于调节元件(例如启动子)和第一多核苷酸之间。在一个实施方案中，调节元件控制第一多核苷酸的表达。在具体的实施方案中，第一位点特异性重组基序位于调节元件(例如启动子，例如CAM启动子)和编码重组酶(例如phiC31、噬菌体λ整合酶、BxB1、Cre或Flp)的多核苷酸之间。在一个具体的实施方案中，调节元件不控制重组酶的表达。在一个实施方案中，调节元件控制标记的表达。在一个优选的实施方案中，重组载体按顺序包括启动子和编码标记的多核苷酸，使得启动子控制标记自重组载体表达。
第十个方面，本发明的特征在于包括本文所述任何组合物(例如第六个到第十个方面的组合物)和按照本文所述任何方法(例如第一个到第十个方面的方法)产生嵌合多肽的使用说明的试剂盒。
第十一个方面，本发明的特征在于将单链可变片段(scFv)转化至免疫球蛋白G(IgG)抗体的方法，所述方法包括
(a)提供以5’-3’顺序包含以下的第一噬菌粒载体，
第一哺乳动物表达控制基序，
任选第一5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
第一大肠杆菌表达控制基序，
任选第一3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码scFv的重链可变区(VH)的序列，
任选第二5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
第一位点特异性重组基序，
任选第二3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码scFv的轻链可变区(VL)的序列，
第三5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
融合展示蛋白序列，
第三3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码轻链恒定区(CL)的序列，
(b)提供以5’-3’顺序包含以下的第二噬菌粒载体
第二哺乳动物表达控制基序
任选第四5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
第二位点特异性重组基序，
任选第四3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)；
编码可结晶片段(Fc)区(例如编码CH区的区域)的序列；和
c)在重组酶存在下使第一噬菌粒载体和第二噬菌粒载体接触，
其中重组酶以位点特异性方式使第一噬菌粒载体和第二噬菌粒载体组合形成整合载体，
其中整合载体表达与CL融合的VL和包括Fc(例如CH区)的多肽结构域融合的单独VH以形成IgG，
从而在表达时将scFv转化至IgG抗体。
在第十二个方面，本发明的特征在于将单链可变片段(scFv)转化至CAR的方法，所述方法包括
(a)提供以5’-3’顺序包含以下的第一噬菌粒载体，
第一哺乳动物表达控制基序，
任选第一5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
第一大肠杆菌表达控制基序，
任选第一3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码scFv的重链可变区(VH)的序列，
任选第二5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
第一位点特异性重组基序，
任选第二3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码scFv的轻链可变区(VL)的序列，
第三5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
融合展示蛋白序列，
第三3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，
编码轻链恒定区(CL)的序列，
(b)提供以5’-3’顺序包含以下的第二噬菌粒载体
第二位点特异性重组基序，和
编码TCRζ区的序列；和
c)在重组酶存在下使第一噬菌粒载体和第二噬菌粒载体接触，
其中重组酶以位点特异性方式使第一噬菌粒载体和第二噬菌粒载体组合形成整合载体，
其中整合载体表达与CL融合的VL和与TCRζ区融合的单独VH以形成CAR，
从而在表达时将scFv转化至IgG抗体。
在第十一个到第十二个方面的一些实施方案中，第一噬菌粒载体包括介于第三5’哺乳动物剪接位点和融合展示蛋白序列之间的第一终止密码子和/或介于融合展示蛋白序列和第三3’哺乳动物剪接位点之间的第二终止密码子。在某些实施方案中，整合载体能够表达选择标记。在具体的实施方案中，整合载体只能够在整合发生后表达选择标记。
定义
所谓“嵌合多肽”意指包括至少两个多肽和/或其多肽片段的融合物的多肽。嵌合多肽可包括两个或更多个不同的结构域，各自包括至少一种多肽(或其一部分)或多肽片段。在某些情况下，嵌合多肽包括与具有所需功能的多肽结构域(例如抗体恒定结构域、CD3-ζ结构域、泛素连接酶结构域或knocksideways捕食结构域)融合的结合部分(例如抗体可变结构域)的抗原决定区。编码嵌合多肽的多核苷酸(例如载体)可按照本文所述重组方法产生。例如嵌合多肽可由这样的多核苷酸编码，其中第一多肽或其部分的编码序列例如按照本发明的方法通过重组与第二多肽(或其片段)的编码序列连接。示例性嵌合多肽包括通过使抗体的可变结构域(例如一个或多个VH或VL结构域)或抗体片段(例如scFv)与恒定结构域(例如一个或多个CH或CL结构域)融合产生的IgG、通过使抗体的可变结构域(例如一个或多个VH或VL结构域)与异源跨膜结构域和胞质域(例如CD3-ζ结构域)融合产生的嵌合抗原受体(CAR)及结合部分(或其一部分)和泛素连接酶结构域或knocksideways捕食结构域之间的融合物。
本文所用“多肽片段”意指小于全长野生型多肽的任何氨基酸序列。本发明的多肽片段可包括例如以下的一个或多个：抗原决定区(例如抗体可变结构域)、结构结构域(例如抗体恒定结构域)、构架(例如如本文所述)、跨膜结构域(例如CD3-ζ跨膜结构域)、能够信号转导的结构域(例如CD3-ζ胞质域)、具有所需功能的结构域(例如泛素连接酶结构域或knocksideways捕食结构域)或本领域已知的任何其它多肽部分。在某些情况下，编码多肽片段的多核苷酸可存在于载体(例如第一载体或第二载体)上。在某些情况下，可按照本发明的方法通过使载体与包括其它多核苷酸的载体重组，使编码多肽片段的多核苷酸与编码某一多肽(例如第一多肽、第二多肽或其片段)的另一个多核苷酸缀合。
“重组载体”或“整合载体”意指通过两个亲本载体(例如本发明的第一载体和第二载体)的重组形成的多核苷酸载体。待重组的亲本载体可各自包括位点特异性重组基序，从而两个位点特异性重组基序可通过重组酶进行重组以使一个载体的至少一部分与另一个的至少一部分连接，从而形成新的重组载体。重组载体可包括编码来自这些亲本载体的相同或不同的多肽的一个或多个多核苷酸。在某些情况下，编码来自一个亲本载体(例如本发明的第一载体)的第一多肽或其片段(例如抗原决定区，例如抗体的可变结构域或抗体片段)的多核苷酸可与编码来自另一个载体的第二多肽(例如构架，例如抗体的恒定区或抗体片段；CAR跨膜结构域和/或胞质域；泛素连接酶结构域；和/或knocksideways捕食结构域)或其片段的连接，形成编码嵌合多肽的重组载体中的多核苷酸，所述嵌合多肽包括来自第一亲本载体的多肽或其片段和来自第二亲本载体的第二多肽或其片段两者。
“结合部分”意指能够结合靶分子，例如靶蛋白，例如抗原的作用剂。在某些情况下，结合部分是蛋白质、多肽、多肽片段、核酸、多糖、小分子、适体或其任何组合。特定的结合部分如果能够结合某一靶标，则与该靶标是“关联的”。在某些情况下，例如，结合部分可包括一个或多个亚基(例如一个或多个相同的亚基，或一个或多个不同的亚基)，从而亚基必须与结合部分紧密地实体接近以发挥功能。在其中结合部分由多个亚基组成的某些情况下，亚基可通过两个或更多个亚基的相互作用而紧密相邻地连在一起。示例性结合部分包括而不限于抗体、抗体片段和结合蛋白或其片段。
“抗体”意指免疫球蛋白的任何形式、重链抗体、轻链抗体、LRR型抗体或具有抗体样性质的其它蛋白质支架，以及本领域已知的任何其它免疫结合部分，包括抗体片段(例如Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP)。不同抗体类别的亚基结构和三维构型是本领域已知的。
“抗体片段”意指包括衍生于抗体或与抗体有显著同源性的部分的结合部分，例如抗体的抗原决定区。示例性的抗体片段包括Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv和SMIP。
所谓“嵌合抗原受体”(CAR)意指包括结合部分、跨膜结构域和胞质域的多肽结合部分，其中配体与结合部分的结合导致通过胞质域激活下游信号转导途径。在某些情况下，结合部分是抗体或抗体片段(例如scFv)。在某些情况下，跨膜结构域和/或胞质域衍生于由免疫细胞(例如T细胞)表达的膜结合受体。例如，跨膜结构域和/或胞质域可衍生于CD8(例如CD8的铰链和/或跨膜结构域)、CD3-ζ和/或CD28。胞质域可包括能够将激活信号传导至免疫细胞(例如T细胞)的一个或多个多肽结构域。例如，多肽结构域可包括CD3-ζ胞质域、CD28胞质域、4-1BB胞质域、OX40结构域、ICOS结构域和/或其任何组合或衍生物。可按照本发明的重组方法使CAR或其部分与另一个多肽(例如结合部分)融合。
本文所用“泛素连接酶结构域”意指能够催化将泛素转移至多肽底物中的多肽结构域。可按照本发明的重组方法，使泛素连接酶结构域与另一多肽(例如结合部分)融合。在某些情况下，可用于本发明的方法和组合物的泛素连接酶结构域包括E3连接酶结构域(例如Hsc70相互作用蛋白(CHIP)E3连接酶的C端)。泛素连接酶及其例如用于定向蛋白质沉默的用途描述于例如Portnoff et al.(J.Biol.Chem.289:7844-7855,2014)，通过引用以其整体结合到本文中。
“Knocksideways捕食结构域”意指可通过例如按Robinson and Hirst(Curr.Protoc.Cell Biol.61:15.20.1-15.20.7,2013)和Robinson et al.(Dev.Cell 18:324-331,2010)所述(其每一个通过引用以其整体结合到本文中)使靶蛋白隔离在胞内区域，用于使靶蛋白快速失活的多肽结构域。在某些情况下，knocksideways捕食结构域可在特定小分子(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物)存在下与knocksideways诱饵蛋白结合。在某些情况下，knocksideways捕食结构域包括识别待隔离的靶蛋白的结合结构域(例如本发明的结合部分)和识别小分子的第二结合结构域，从而小分子的存在导致包括knocksideways捕食结构域、靶蛋白、小分子和knocksideways诱饵蛋白的复合物的形成。knocksideways诱饵蛋白可与胞内细胞器(例如线粒体)连接，从而复合物的形成导致将靶蛋白隔离在胞内细胞器内。在某些实施方案中，knocksideways诱饵蛋白包括FRB结构域，knocksideways捕食结构域包括FKBP结构域，而小分子是雷帕霉素或其衍生物。在一个实施方案中，knocksideways诱饵蛋白是Mitotrap蛋白，如Robinson和Hirst所述，同上。
“融合蛋白”意指包括两个蛋白质或多肽区段连接在一起的单一蛋白质或多肽。一般而言，两个蛋白质或多肽区段不是天然连接在一起的。
本文所用“接头”意指连接两个多肽区的肽。接头的长度可为例如0-100个氨基酸(例如长度约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75或100个氨基酸)。接头可包括茎区(stalk region)(例如包括位点特异性重组基序例如attB位点或attP位点的茎区)。茎可以是适于在两个连接的多肽区之间设置距离的任何长度(例如长度约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、30、40、50、75或100个氨基酸或更多个)。在某些情况下，接头连接融合蛋白的两个区段。在某些情况下，接头连接结合部分的两个抗原决定区(例如抗体的可变结构域或抗体片段)。在一个实施方案中，接头使scFv的重链可变结构域与轻链可变结构域连接。
“恒定区”意指在特定类型或组群的结合部分中是相当保守的结合部分的一部分(例如抗体或抗体片段)。结合部分恒定区(在某些情况下称为恒定结构域)的鉴定是本领域众所周知的。
本文所用“构架”意指特定多肽类型或组群的一套的一个或多个恒定区(例如结合部分)或其部分，任选以该结合部分类型或组群特有排列方式。在某些情况下，构架包括抗体构架区(例如互补决定区以外且具有比互补决定区少的变化性的抗体的可变结构域中的区域)。在其它情况下，构架包括抗体的恒定区(例如免疫球蛋白轻链恒定区或免疫球蛋白重链恒定区)。在某些情况下，构架包括可结晶片段(Fc)区。
“抗原决定区”意指在结合部分特定的类型或组群内基本是变化的结合部分的部分。抗原决定区(在某些情况下称为可变结构域)的鉴定是本领域众所周知的。示例性抗原决定区包括例如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和互补决定区(CDR；例如位于VH或VL结构域内的CDR)。
如本文所用，多肽(例如结合部分)的“类型”意指特征在于构成区的特定配置的多肽(例如结合部分)组群，所述构成区任选包括一个或多个功能结构域、恒定区、一个或多个抗原决定区、一个或多个接头和/或本领域已知的其它任选的结合部分盒。多肽(例如结合部分)的类型是本领域技术人员已知的，包括而不限于IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD、IgE、Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP结合部分。在一些实施方案中，多肽是scFv。
第一多肽“转化”至嵌合多肽意指第一多肽或其一个或多个部分与第二多肽或其一个或多个部分融合，从而形成包括第一多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分的嵌合多肽。在某些情况下，编码结合部分的抗原决定区或其片段的多核苷酸区段与编码不同结合部分的构架的至少一部分的多核苷酸区段组合形成编码嵌合结合部分(例如不同类型的结合部分)的多核苷酸区段。例如，本发明的方法可用于将scFv结合部分转化至例如IgG结合部分。
“重组基序”意指能够与具有核酸的第二形式的第二核酸序列或结构域一起参与重组事件的具有核酸的第一形式的核酸序列或结构域。能够彼此一起参与重组反应的两个重组基序可称为例如互补的。能够彼此一起参与重组反应的两个重组基序可称为例如直向同源的。重组反应可包括其它试剂或具体条件。“重组酶”意指能够促进互补重组基序间重组的一种酶或多种酶。
“位点特异性重组基序”意指能够以序列依赖性方式与第二重组基序一起参与重组事件的重组基序。位点特异性重组事件可包括其它试剂或具体条件。“隐蔽位点特异性重组基序”是隐蔽的直到特定事件(例如按照本文所述方法进行重组或通过限制性内切酶消化)发生的位点特异性重组基序。例如隐蔽位点特异性重组基序可由在按照本发明的方法对两种载体进行重组后连接在一起的两个或更多个单独的核酸元件构成，使得在重组时形成能够被重组酶识别的完整和未破坏的位点特异性重组基序。在某些情况下，隐蔽位点特异性重组基序可通过本领域众所周知的例如限制酶切消化，转化至功能位点特异性重组基序。
“ADAR酶”是能够在特定核酸(例如mRNA)下修饰多核苷酸的双链RNA特异性腺苷脱氨酶。在某些情况下，ADAR酶例如通过将腺苷转化至肌苷来执行mRNA序列的转录后修饰或“编辑”。因为肌苷模拟鸟嘌呤的活性(例如与胞嘧啶配对)，所以这在转录的mRNA序列中有效地引起单核苷酸多态性形成。在某些情况下，编辑可导致“隐蔽的”剪接位点、重组基序或其它核酸元件的形成。ADAR酶和RNA编辑描述于Savva et al.(Genome Biol.13:252,2012),Nishikura(Annu.Rev.Biochem.79:2.1-2.29,2010)和Schoft et al.(Nuc.AcidsRes.35(11):3723-3732,2007)，其每一个通过引用以其整体结合到本文中。
“表达”意指多核苷酸区段的转录或者转录和翻译。表达的多核苷酸区段是转录物从中产生的多核苷酸区段，任选蛋白质从转录物中产生。因此，已表达的转录物或蛋白质是分别通过多核苷酸区段转录或者转录和翻译产生的转录物或蛋白质。可作为单一转录物和/或蛋白质或多肽表达的两个蛋白质、多肽或多核苷酸区段可称为“融合的”。
“调节元件”意指有助于控制存在于同一核酸的多核苷酸区段表达的多核苷酸区段，例如相邻的和/或3+多核苷酸区段或其序列。调节元件可以例如增加或降低多核苷酸区段的表达。可通过一个或多个转录因子的结合激活或抑制调节元件。示例性调节元件包括而不限于启动子、增强子和沉默子。
本文所用术语“载体”是指如本领域已知可以携带遗传物质进入例如细胞中的任何多核苷酸分子。在某些情况下，载体是包括待表达的一个或多个多核苷酸(例如编码多肽的多核苷酸)的表达载体。示例性载体包括而不限于质粒、噬菌粒、黏粒、病毒载体和人工染色体(例如细菌人工染色体或酵母人工染色体)。病毒载体可包括例如反转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体。用于产生这类载体的方法是本领域众所周知的。
所谓“Mitotrap蛋白”意指knocksideways诱饵蛋白，包括衍生自酵母蛋白质Tom70的线粒体外膜引导信号、YFP报道分子、HA标签和FRB结构域，如例如Robinson和Hirst(同上)所述。Mitotrap蛋白和本文预期或本领域已知的其它knocksideways诱饵蛋白或其部分可以是本发明可用的第一多肽、第二多肽或嵌合多肽。
“隐蔽剪接位点”是mRNA剪接位点是隐蔽的直到特定事件发生(例如按照本文所述方法第一载体和第二载体之间的重组)。例如隐蔽剪接位点可由在按照本发明的方法对两种载体进行重组后连接在一起的两个或更多个单独的核酸元件构成，使得在重组时，完整和未破坏的mRNA剪接位点存在于所得整合载体的多核苷酸中。因此，当多核苷酸在例如能够进行mRNA剪接的真核细胞中转录时，多核苷酸将在通过重组事件产生的剪接位点处剪接。
附图简述
图1是显示大肠杆菌细胞用噬菌粒载体转导的意图。大肠杆菌细胞包括可通过例如重组酶(例如phiC31)用噬菌粒载体重组的接纳体载体。在该实例中，噬菌粒载体编码scFv，其中接头由位点特异性重组基序(例如attP或attB位点；优选attP位点)编码，接纳体载体包括重链恒定区和氯霉素抗性盒。
图2A-2C是显示包括针对多种表达宿主设计的启动子和信号肽的多功能内含子的一系列示意图。(A)显示了人工构建的DNA序列，其包括例如CMV启动子(所示核酸序列)、哺乳动物和细菌信号肽(所示氨基酸序列和核酸序列)、VH序列的第一部分和不同元件的序列。(B)在该图中，突出显示了细菌表达盒的元件，其包括大肠杆菌lac启动子、细菌信号肽和VH基因。(C)在该图中，突出显示了哺乳动物表达盒的元件，其包括CMV启动子、哺乳动物信号肽、含有细菌元件(其在mRNA加工期间可被切离)的内含子和VH基因。
图3是显示含有attP位点的小载体被phiC31介导整合至含有attB位点的较大宿主载体的示意图。在整合时在两种载体重组的位置处形成attL和attR位点。
图4A-4C是显示(A)第一载体和第二载体，(B)第一载体和第二载体之间的重组，和(C)编码免疫球蛋白嵌合多肽的第一载体和第二载体之间重组的重组产物的示意图。
图5是显示多功能启动子的序列的示意图(上)和显示在多种载体和细胞类型中CAM抗性蛋白自多功能启动子表达的蛋白质印迹(下)。泳道1-9是考马斯染色的。大肠杆菌泳道1显示大肠杆菌中蛋白质自pSK215载体中的多功能启动子的表达。大肠杆菌泳道2显示大肠杆菌中蛋白质自pSK215cat载体中的多功能启动子表达。大肠杆菌泳道3显示大肠杆菌中蛋白质自表达pRSETcat载体中的多功能启动子表达。大肠杆菌泳道4含有分子量标记。昆虫泳道5显示昆虫T.ni细胞中蛋白质自pSK215cat(杆粒)中的多功能启动子表达。昆虫泳道6显示昆虫T.ni细胞中蛋白质自pFastBacCat(杆粒)中的多功能启动子表达。昆虫泳道7显示未感染的T.ni细胞。昆虫泳道8显示被野生型杆状病毒感染的T.ni细胞。昆虫泳道9含有分子量标记。哺乳动物泳道1-3显示使用抗Cat抗体的cat的哺乳动物细胞系表达的Western分析。哺乳动物泳道1显示未处理CV-1细胞的Western分析。哺乳动物泳道2显示用pSK215cat转染的CV-1细胞的Western分析。泳道3含有分子量标记。箭头表明cat基因产物。上条带是在未处理细胞的Western分析中也观察得到的人为产物。
图6是显示包括位点特异性重组基序的第一多核苷酸、包括与pATTP构建体的互补的位点特异性重组基序的第二多核苷酸(pATTB)和产生于pATTP和pATTB之间重组的重组产物的示意图。
图7是显示含有VL、VH、CH(包括Fc区)和gpIII基因的噬菌粒载体(pAXM688)的结构以及哺乳动物和细菌控制元件的示意图。噬菌粒载体还包括可阻抑和不可阻抑终止密码子，其允许在阻抑性大肠杆菌菌株(大肠杆菌Sup+)中scFv-gpIII融合蛋白的表达和在非阻抑性大肠杆菌菌株(大肠杆菌Sup-)中仅scFv的表达。
图8是显示通过phiC31整合酶介导的噬菌粒载体pAXM688和接纳体载体(p接纳体)间的重组的示意图。重组导致形成包括噬菌粒和接纳体载的所有元件的整合载体，不同的是attB和attP位点被attL和attR位点置换。
图9A-9B是显示例如通过图8所示整合方案所产生的整合载体中IgG的哺乳动物表达的示意图。(A)整合载体包括轻链基因和重链基因。attL和attR位点特异性重组位点、细菌启动子(PE.c.)和gpIII基因位于剪接位点之间。(B)因此，通过轻链基因或重链基因转录产生的pre-mRNA分子可将这些元件剪除，得到只包括各自的哺乳动物信号肽、可变和恒定结构域及polyA尾的成熟mRNA分子。
图10是显示用于scFv-to-IgG转化的pMINERVA系统的示意图。该系统包括两种载体，噬菌粒载体和接纳体载体(p接纳体)，其可通过phiC31整合酶重组形成整合载体pMINERVA。
图11A-11B是显示可用于产生功能scFvs和IgG的pMINERVA系统的示意图和图示。(A)pMINERVA整合载体包括重链表达盒和轻链表达盒。(B)用pMINERVA整合载体转染的CHO细胞可表达IgG蛋白，而用噬菌粒载体转染的大肠杆菌细胞表达scFv蛋白。其中phiC31整合酶位点特异性重组基序attP而非attB被成功用作VH-VL接头以产生功能scFv。已表明attL和attR基序两者适于作为CL-VL接头以产生功能IgG。
图12A-12C是显示某些phiC31整合酶位点特异性重组基序适于在scFv或IgG中用作接头的图和示意图。(A)产生了带有3种不同接头序列(野生型；WT(Gly4Ser)3、phiC31attB位点或读框2中的phiC31 attP位点)的相同的scFv。在ELISA中以靶蛋白或无关对照为背景对各scFv进行了测试。抗FLAG-HRP用来检测scFv的FLAG标签，ELISA用Ultra TMB试剂显现。相对于标准接头，带有attP接头的scFv保持功能性。attP基序在显示结合活性的功能scFv中成功地用作接头，但使用attB基序作为接头形成无结合活性的scFv。(B)产生在VL和CL之间无接头(WT)或带有读框2中的重组phiC31整合酶位点(attL或attR)的相同的IgG。在ELISA中对靶蛋白或非特异性对照为背景对各IgG进行了测试。抗小鼠-HRP用来检测IgG，ELISA用Ultra TMB试剂显现。所有3种IgG构建体是表达性和有功能的。attL和attR基序的每一个在功能IgG分子中成功地用作IgG接头。(C)测试了在attL和attR基序作为IgG的轻链中的CL-VL接头。
图13是显示示例性供体噬菌粒载体中attB位点、核糖体结合位点(RBS)和间隔基及氯霉素抗性基因(CAM)的相对定位的图示。在该供体载体中，phiC31整合酶的attB位点在RBS、fMet和CAM基因之前(例如位于其5’)。CAM基因的起始甲硫氨酸(fMet)用框标出。在该盒之前没有启动子，因此含有该供体载体的细胞是CAM敏感的。
图14是显示示例性接纳体载体中CAM启动子、attP位点和phiC31基因的相对位置的图示。在这个接纳体载体中，attP位点位于启动子的下游(例如其3’)和phiC31基因的上游(例如其5’)。phiC31基因的起始甲硫氨酸(fMet)用框标出。该盒没有CAM基因，所以含有接纳体载体的细胞是CAM敏感的。
图15是显示图13的供体载体和图14的接纳体载体通过例如phiC31重组酶进行重组所产生的整合载体的图示。在该整合载体中，重组的元件按下列顺序排列：CAM启动子、attR位点、核糖体结合位点(RBS)和CAM基因。换句话说，重组的phiC31位点(attR)位于CAM启动子的下游(例如其3’)和RBS、CAM基因的起始甲硫氨酸(fMet；用框标明)和CAM基因的上游(例如其5’)。此外，因为整合载体包括CAM基因上游的CAM启动子，含有该载体的细胞(例如供体载体和接纳体载体进行了重组的细胞)是CAM抗性的。
图16是显示含有在编码IgG的多核苷酸的VH-CH连接处引入的gpIII的合成内含子剪接的图示。将所得载体或野生型(WT)对照转染至HEK-293细胞，收获IgG，并通过SDS-PAGE分析。显示了在梯条带的3个泳道和泳道1-4中间的BSA标准物。泳道1和2显示来自野生型载体的蛋白质表达，而泳道3和4显示来自包括gpIII内含子的载体的蛋白质表达。泳道1和3显示非还原条件，泳道2和4显示还原条件。
图17是显示将scFv转化至多种IgG和/或嵌合抗原受体(CAR)的方法的图示。在某些情况下，这种转化可发生在短时间范围内(例如超过约一夜)。该方案可用于通过使用直系同源整合酶从同一载体系统中产生IgG和CAR-T两者。在该方案中，噬菌粒使用两种不同的整合酶(phiC31和BxB1)与两种不同的接纳体载体重组。phiC31反应导致编码IgG的整合载体(例如适于在哺乳动物细胞例如CHO细胞中表达IgG的载体)的形成，而BxB1反应导致编码CAR(例如适用于T细胞测定法的CAR)的整合载体的形成。
图18A-18B是显示的图示(A)用于CAR表达的最终载体，和(B)用于IgG表达的最终载体。(A)哺乳动物剪接位点(5’ss和3’ss)侧接scFv上游的细菌表达元件。另一个内含子含有M13 gp3基因和重组的BxB1连接位点(attR)。哺乳动物细胞中的适当剪接除去细菌表达元件并使scFv与TCRζ的铰链、跨膜和信号转导结构域融合。HEK-293包装细胞系可用来从该载体中产生慢病毒，Jurkat细胞随后可用该病毒转导。转导的细胞表达CAR融合物和EGFP。(B)哺乳动物剪接位点(5’ss和3’ss)侧接重链上游的细菌表达元件。另一个内含子含有M13gp3基因、BxB1连接位点(attP)和zeocin基因。哺乳动物细胞中的适当剪接除去重链上游的细菌表达元件并使轻链可变结构域(VL)与κ轻链恒定结构域(CL)融合。CHO细胞可用该载体转染以产生全长IgG。
图19A-19B是显示供体载体和接纳体载体的phiC31介导的重组的一系列图示。(A)将p供体和p接纳体质粒共转化至表达phiC31整合酶的大肠杆菌中。attP和attB位点之间phiC介导的重组导致启动子与氯霉素抗性基因融合。可使用来源于供体质粒的正向引物和来源于接纳体质粒的反向引物，通过PCR筛选重组体。(B)在大肠杆菌中通过phiC31介导的重组产生900bp PCR产物。当将两个独立的质粒混合并用于PCR反应时未检出产物(-phiC31)。
图20A-20B是显示经设计与至少3种不同的接纳体载体的任一个重组的pMINERVA载体系统的形式的一系列图示。图22A显示在将pMINERVA转导至含有p接纳体的phiC31+大肠杆菌菌株后pMINERVA噬菌粒载体和示例性接纳体载体p接纳体之间的整合。图22B显示pMINERVA和3种示例性接纳体载体(p接纳体1、p接纳体2和p接纳体3)间可能的整合反应。pMINERVA与p接纳体1的重组产生scFv与CAR元件的3’融合物，因此得到能够表达包括scFv作为胞外结合结构域的CAR的整合载体。pMINERVA与p接纳体2的重组导致接头交换，其中scFv的VH结构域与p接纳体2上的CH结构域融合。pMINERVA与p接纳体3的重组产生scFv的5’融合物，用于例如转换至备选启动子。Pmam，哺乳动物启动子；Pyeast，酵母启动子；Pcmv，CMV启动子；5’ss和3’ss，剪接信号；VL，轻链的可变部分；VH，重链的可变部分；gp3，噬菌体M13基因3产物；PE.coli，大肠杆菌启动子；CH或Fc，重链的恒定区；attB，attP，整合酶基因的底物；attR和attL，整合酶基因的产物；polyA，聚腺苷酸化序列；CamS，CamR，分别没有或带有启动子的氯霉素抗性基因；TCRζ，T细胞受体ζ；CAR-T，嵌合抗原受体；Prosplice，Procat，双功能启动子类型(有关详情见教科书)；IRES，内部核糖体进入位点；RBS，核糖体结合位点。
图21A-21D是显示基于双重表达启动子系统的scFv与IgG重排方法(reformattingapproach)的一系列图示：(A，C)启动子剪接(Prosplice)或(B，D)连环多功能启动子(catenated polyfunctional promoter)(Procat)。(A)在Prosplice剪接化启动子系统中，细菌启动子(例如LacPO)位于哺乳动物内含子内，从而细菌启动子可用于驱动在细菌细胞中转录，但可在能够剪接的细胞(例如哺乳动物细胞)中剪除。(B)在Procat连环启动子系统中，多个启动子(例如CMV启动子、多角体启动子和LacPO启动子)彼此共连锁至待表达的基因的上游。将ATG起始密码子从最5’端启动子下游的启动子中除去，从而起始位点对所有细胞类型(例如分别为哺乳动物、昆虫和细菌细胞)都相同。(C)在Prosplice双重功能启动子系统的一个实施方案中，LacPO和细菌信号肽(SigPepE.c.)序列可包含在哺乳动物内含子内。细菌信号肽序列可以例如覆盖3’剪接位点(3’ss)。在大肠杆菌中，来自哺乳动物内含子内细菌启动子的转录导致与大肠杆菌的琥珀抑制菌株(例如TG1)中的M13gp3蛋白融合的scFv在细菌周质中表达。在哺乳动物细胞中，5’(5’ss)和3’ss处mRNA的内含子剪接除去位于内含子内的细菌LacPO调节序列。内含子剪接可合乎需要地产生哺乳动物信号序列。该内含子核苷酸序列可包括启动子共有序列、信号序列共有序列和剪接位点共有序列，例如本领域已知的那些。(D)在连环启动子系统的另一个实例中，将哺乳动物启动子(例如PCMV)下游的ATG起始位点可从lac启动子/操纵基因(LacPO)控制元件中除去。可如本文所述包括下游多角体启动子。可设计Kozak序列和大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)使得用于细胞、昆虫和/或哺乳动物表达的第一个ATG fMet起始位点是相同的。在一个实例中，相同的信号序列(SigPep)可用于所有3种生物。
图22A-22B是显示哺乳动物细胞培养物中轻链表达中gp3基因剪接的结果和双重表达启动子表达的一系列图像。(A)野生型轻链与掺入gp3剪接基因的轻链的比较。箭头表明相当于轻链基因产物的条带。(B)在E1A启动子、Prosplice或Procat任一个的表达控制下生长于HEK293细胞中IgG的表达比较。
图23是显示可能的pMINERVA恒定构架文库的不同类型的表格。可用于本发明的载体系统的示例性构架区包括而不限于IgY(禽)、骆驼类、IgNAR(鲨鱼)、哺乳动物IgG(例如牛、兔)、其它IgG、哺乳动物IgM和Fab(例如酵母展示Fab)。在pMINERVA文库的情况下，还提供这类构架的可能优势。
图24A-24E是显示pMINERVA转化系统和包括phiC31整合酶位点的scFv和IgG的表达和功能的一系列图示。(A)pMINERVA系统的特征是3种载体：编码scFv的p供体噬菌粒载体、p接纳体载体和表达载体的IgG。可在噬菌体展示生物淘选程序中筛选在p供体载体上作为M13gpIII-融合物编码的scFv抗体以鉴定编码具有所需生物物理性质的scFv的噬菌粒。将该噬菌粒转导至表达phiC31整合酶和带有IgG接纳体载体的大肠杆菌菌株中。重组事件使VH区与CH区融合。此外，重组事件将哺乳动物启动子和功能蛋白质起始位点5’两者引入VL基因中。要特别注意，scFv的VH和VL结构域间的接头由能够用作以下两者的phiC31 36-bpattP位点组成：(i)重和轻可变结构域间的肽接头，和(ii)phiC31整合酶的36-bp功能底物。Pmam，哺乳动物启动子；5’ss和3’ss，剪接信号；VL，轻链的可变部分；VH，重链的可变部分；gp3，噬菌体M13基因3产物；PE.coli，大肠杆菌启动子；CH或Fc，重链的恒定区；attB，attP，整合酶基因的底物；attR和attL，整合酶基因的产物；polyA，聚腺苷酸化序列；CamS，CamR，分别没有或带有启动子的氯霉素抗性基因；Prosplice，Procat，双功能启动子类型；RBS，核糖体结合位点。(B)产生了带有两种不同接头序列WT(Gly4Ser)3或读框2中phiC31 attP位点的相同scFv。在ELISA中以纯化的靶蛋白或无关抗原对照为背景对两种噬菌体-scFv进行了测试。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗M13抗体用于噬菌体检测，酶联免疫吸附测定(ELISA)用Ultra Tetramethylbenzidine(TMB)试剂显现。显示了每个受测噬菌体相对于背景的倍数(FOB)，其是针对靶标的信号相对于针对无关对照的信号。误差条表示一式三份测试的噬菌体结合的标准差。(C)带有attL和attR的模型化的IgG分子。将attL(粗的蓝色环)和attR(粗的红色环)肽图解性地插入如带状物(重链：白色，轻链：青色)所示典型的人IgG1分子(PDBID：1hzh)中。(D)产生了在IL2信号序列(ss)和VL之间的没有接头或有重组的phiC31整合酶attL位点的相同的IgG。平行地，对野生型IgG的表达与VH和CH之间具有重组的phiC31整合酶位点attR位点的相同IgG的表达进行了比较。显示了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。(E)在细胞ELISA中针对与特异性和无关靶抗原两者的结合测试了在IL2ss和VL之间有attL的IgG(上图)和在VH和CH之间有attR的IgG(下图)。将两种分子的结合与野生型IgG的结合进行了比较。两个ELISA使用抗人-HRP检测IgG，ELISA用Ultra TMB试剂显现。显示了450nm处的OD。
图25A-25J是显示pMINERVA系统的应用和验证及其排列的一系列图示和表。(A)phiC31整合酶活性的阳性选择。构建了pMINERVA系统的两种质粒，p供体和p接纳体，各自具有功能camR基因的呈反式的所需组分。p供体中的attP位点(加下划线)上游侧接大肠杆菌5’控制元件。p接纳体中的attB位点(小写字母DNA序列)置于无启动子camR基因的5’。在phiC31整合酶(蓝色短划线)存在下两种质粒上attP和attB位点的成功重组产生整合子(co-integrant)(pMINERVA；下端序列)并在双顺反子重链-CamR信息前与大肠杆菌启动子融合。(B)scFv和含有侧接M13 gpIII基因的剪接位点的IgG的表达和功能。含有p接纳体的感受态TG1细胞用p供体或对照模拟重组载体转化，并在含有氨苄西林或氯霉素的板中生长。计算氨苄西林板与氯霉素板上集落的比率。(C)p供体中含和不含侧接M13 gpIII基因的剪接位点的噬菌体-scFv融合物自大肠杆菌中产生，并在噬菌体ELISA中针对功能性进行了测试。针对与纯化的靶抗原和无关对照蛋白质的结合对噬菌体-scFv进行了测试。显示了两者相对于背景的倍数(FOB)。误差条表示一式三份测试的噬菌体结合的标准差。(D)产生了在VH和CH之间无接头或含有M13 gpIII基因的内含子的相同IgG。置于M13 gpIII基因3’的赭石终止密码子防止全长轻链蛋白质自未剪接的mRNA表达。SDS-PAGE中，上方箭头表明相当于重链的条带，下方箭头相当于轻链基因产物。在ELISA中使用纯化的抗原针对功能性对IgG分子进行了测试。显示了两者的FOB(相对于背景的倍数)信号。(E)在连环双重启动子系统(Procat)中，将哺乳动物EF1a(PEF1a)启动子下游的ATG从下游多角体(未显示)和PhoA细菌启动子中除去。设计Kozak序列和大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)，使得细菌、昆虫(未显示)或哺乳动物表达的任一种的第一个ATG fMet起始位点是相同的。在这种情况下，对于所有3种生物使用相同的信号序列(SigPep)。(F)在剪接的双重功能启动子系统(Prosplice)中，LacPO和细菌信号肽(SigPepE.c.)序列包含在哺乳动物内含子内。细菌信号肽序列覆盖3’剪接位点(3’ss)。大肠杆菌中，自哺乳动物内含子内的细菌启动子转录导致与大肠杆菌的琥珀阻抑性菌株(例如TG1)中的M13 gpIII蛋白融合的scFv在细菌周质中表达。在哺乳动物细胞中，5’(5’ss)和3’ss处mRNA的内含子剪接除去位于内含子内的细菌LacPO调节序列。内含子剪接产生哺乳动物信号序列。(G)噬菌体-scFv自Procat和Prosplice启动子的产生。在噬菌体ELISA中针对与纯化的靶抗原和无关对照抗原的结合对噬菌体进行了测试。显示了FOB(相对于背景的倍数)信号，误差条表示一式三份测试的噬菌体结合的标准差。(H)HEK293哺乳动物细胞中野生型(wt)\Prosplice和Procat启动子的表达。IgG自其中IgG重链基因在仅EF1A启动子、Prosplice或Procat任一个的表达控制下的HEK293细胞中纯化。(I)用于p供体和p接纳体系统的遗传元件。标明用于pMINERVA系统中的各元件的来源。还标明遗传元件是否自现有质粒合成或克隆。(J)IgG表达试验载体的产量分析。使用Procat启动子将11个scFvVH和VL序列克隆至单一IgG表达试验载体中以驱动重链。将IgG载体转染至HEK293细胞中，转染后6天从上清液中纯化分泌的IgG蛋白。测定最终纯化的IgG的量，根据转染的100mL细胞培养物体积计算产量。
图26A-26E是显示pMINERVA系统(包括表达启动子系统)中的表达和剪接和共整合子表达产量的一系列图示。(A)启动子类型Prosplice。在这个双重功能启动子中，LacPO和细菌信号肽(SigPepE.c.)序列包含在哺乳动物内含子内。细菌信号肽序列覆盖3’剪接位点(3’ss)。大肠杆菌中，自哺乳动物内含子内的细菌启动子转录导致与大肠杆菌的琥珀阻抑性菌株(例如TG1)中的M13gp3蛋白融合的scFv在细菌周质中表达。在哺乳动物细胞中，5’(5’ss)和3’ss处mRNA的内含子剪接除去位于内含子内的细菌LacPO调节序列。内含子剪接产生哺乳动物信号序列。使用启动子共有序列、信号序列共有序列和剪接位点共有序列设计内含子核苷酸序列。(B)启动子类型Procat。在这个连环启动子系统中，将哺乳动物CMV启动子(PCMV)下游的ATG从下游多角体和lac启动子/操纵基因(LacPO)控制元件中除去。设计Kozak序列和大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)，使得细菌、昆虫或哺乳动物表达任一个的第一个ATG fMet起始位点是相同的。在这种情况下，对于所有3种生物使用相同的信号序列(SigPep)。(C)HEK293细胞培养物中野生型(WT)、Prosplice和Procat启动子的表达。自其中IgG基因在EF1A启动子、Prosplice或Procat任一个的表达控制下的HEK293细胞中纯化IgG。(D)Prosplice中的轻链gp3剪接M13gp3内含子剪接。将野生型轻链蛋白质与掺入剪接的M13gp3剪接基因的轻链蛋白质进行比较。置于M13gp3基因3’的pMINERVA中的赭石终止密码子防止全长轻链蛋白质自未剪接的mRNA表达。箭头表明相当于轻链基因产物的条带。(E)来自HEK293细胞的单一质粒和共整合子IgG产量的比较。通过凝胶成像(来自SDS-PAGE)估算共整合子的估计产量：1.pAX1984＝19.4ug/mL(野生型IgG)，2.pAX3A-5＝11.6ug/mL(共整合子)，3.pAX3B-5＝13.5ug/mL(共整合子)。
图27是显示体内过夜亚克隆scFv至IgG的pMINERVA方案的图示。所有亚克隆步骤通过内含子剪接和整合酶重组进行。
图28A-28B是显示可用于例如本发明的p接纳体质粒的3’融合物构建体的实例和表达可转化至表达IgG的pMINERVA整合载体的scFv的示例性p接纳体载体的一系列图示。
图29是显示一套p接纳体载体与编码人抗Her2抗体的VH、VL和CL结构域的p供体载体每个的共整合的图示。hcH(control)＝人IgG1 CH对照；hCH＝人IgG1 CH；rCH＝兔CH；和rCH-FLAG＝含修饰的FLAG标签的兔CH。证实了所得整合载体的适当的共整合和序列。
图30A-30B是显示非还原(A)和还原(B)条件下杂合嵌合体IgG的表达的一系列图示。
图31A-31C是显示杂合嵌合体功能验证的一系列曲线图。H-H＝人-人；H-R＝人-兔嵌合体。
图32是显示杂合嵌合体功能验证的曲线图。杂合嵌合体中的FLGA标签被证实是有功能的。
发明详述
总的来说，本发明提供用于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明包括至少两种载体：包括第一多肽的序列的第一载体，包括第二多肽的序列的第二载体。载体包括互补位点特异性重组基序使得两种载体间的位点特异性重组导致包括第一多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分的嵌合多肽的产生。位点特异性重组基序可位于内含子内或位于第一或第二载体上的编码序列内。
将第一多肽转化至嵌合多肽的方法
本发明提供使用例如可以重组的一对载体将第一多肽转化至嵌合多肽的方法。例如，载体之一包括编码第一多肽或其片段的多核苷酸区段，而第二载体包括编码第二多肽或其片段的多核苷酸区段。载体各自进一步包括重组基序(例如位点特异性重组基序)，从而两种载体可通过重组酶，例如整合酶(例如phiC31整合酶)整合。因此，本发明的方法包括提供载体对并诱导重组，从而将两种载体整合至整合载体，其中第一多肽或其片段和第二多肽或其片段融合形成嵌合多肽。下面描述了可用于本发明的方法的载体、重组酶和重组基序。
在某些情况下，重组事件发生在细胞中。例如细胞可含有载体和重组酶两者，从而引发载体的整合。在某些实施方案中，细胞最初含有一个载体(例如第二载体)，并与另一个载体一起转染或转化。编码重组酶的基因可存在于细胞内第一或第二载体、第三载体的一个中，或存在于细胞基因组中。预期该方法的变化，其中编码第一多肽或第二多肽的多核苷酸可存在于细胞基因组中，而不是载体中。基因组序列可位于可与本发明的第一载体或第二载体的重组基序重组的重组基序附近或含有可与本发明的第一载体或第二载体的重组基序重组的重组基序。因此，载体的重组基序和基因组的重组基序之间的重组导致载体的元件(例如编码第一多肽或第二多肽或其片段的多核苷酸序列)整合至细胞的基因组。
在某些情况下，重组事件发生在体外。例如，第一和第二载体可与重组酶(例如噬菌体λ整合酶)一起存在于溶液中。在某些情况下，第一载体、第二载体和重组酶可存在于容器(例如乳滴)中。第一载体、第二载体和/或重组酶的不同组合可存在于大量乳滴的每一个中。因此，多个不同的整合载体在一系列平行反应中产生，每一个发生在单独的乳滴中。乳滴因此可用于例如免疫库克隆。
例如多种多肽(例如各自包括不同抗原决定区，例如可变结构域或CDR的多肽)各自可在单独的第一载体中编码。在某些情况下，第一载体各自包含在单独的乳滴中。乳滴各自可进一步包括第二载体和重组酶。在一个实施方案中，第二载体的每一个编码相同的构架。因此，在该实例中，因此存在于各个乳滴内的第一载体和第二载体之间的重组产生各包括例如不同的抗原决定区，但所有都含有相同的第二多肽或其片段的多种整合载体。
组合物
本发明的特征在于包含编码可按照本文所述方法转化至嵌合多肽(例如不同类型的多肽)的第一多肽的载体的组合物。组合物可进一步包括编码第二多肽的第二载体。第二多肽或其片段可与第一多肽或其片段组合形成嵌合多肽。载体各自可包括重组基序(例如位点特异性重组基序)。在某些情况下，两种载体的位点特异性重组基序是互补的，使得重组酶(例如如本文所述)可使两种载体重组形成包括两种原始载体的组分(例如编码第一多肽的多核苷酸，编码第二多肽或其部分的多核苷酸)的整合载体。组合物还可包括重组酶。本文详细描述了适于纳入本发明的组合物的示例性载体和重组酶。
载体
本发明的特征在于可用于将第一多肽转化至嵌合多肽(例如不同类型的多肽)的核酸载体(例如第一载体或第二载体)。这两种核酸载体可包括位点特异性重组基序，其允许两种载体间重组以产生包括来自两种原始载体的元件(例如呈编码嵌合多肽的多核苷酸区段的形式)的重组产物(例如整合载体)。优选，第一载体包括待转化的第一多肽，第二载体包括第二多肽(例如包括目标结合部分构架和/或功能结构域的多肽)。第二多肽或其片段可与第一多肽或其片段融合形成嵌合多肽。因此，第一载体和第二载体之间的位点特异性重组导致编码嵌合多肽的整合载体的形成。
本发明的整合载体可包括第一载体和/或第二载体的任何组分。在某些情况下，整合载体可与另外的载体(例如包括另外的第一多肽或另外的第二多肽的另外的载体)在另外的重组反应中用作第一载体或第二载体，从而形成包括原始整合载体和另外的载体的部分的另一种整合载体。这可用来例如将嵌合多肽转化回到第一多肽，或例如将嵌合多肽转化至包括嵌合多肽和另外的第一多肽或另外的第二多肽的至少一部分的另外的嵌合多肽。
本发明的载体(例如第一载体、第二载体或整合载体)可包括多个不同的位点特异性重组基序(例如直向同源位点特异性重组基序或互补位点特异性重组基序)。例如载体可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点特异性重组基序。在某些情况下，载体可包括互补的和直向同源的位点特异性重组基序的混合物，使得载体可通过互补位点特异性重组基序内部重组，或与含有与载体的位点特化重组基序之一互补的位点特异性重组基序的另一种载体重组。
在某些情况下，本发明的载体能够在一种细胞类型内表达一种基因(例如编码第一多肽的基因)，在第二细胞类型中表达第二种基因。在某些情况下，载体能够在一种细胞类型表达基因(例如编码第一多肽的基因)的一种变体(例如在细菌细胞中表达scFv)，在第二细胞类型中表达相同基因的第二种变体(例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达scFv-Fc融合物或IgG)。例如，基因的一种变体的一个或多个部分可位于内含子内，使得这些部分在不进行内含子剪接的细胞(例如细菌)中表达，但在真核细胞(例如哺乳动物细胞和昆虫细胞)中通过内含子剪接从转录物中除去。在一个实例中，适用于噬菌体展示、与噬菌体外被蛋白融合的抗体片段(例如Fab片段或scFv)可在细菌(例如大肠杆菌)中表达，而抗体片段的全长IgG变体可通过噬菌体外被蛋白嵌入免疫球蛋白重链基因的内含子内而在哺乳动物细胞中自单个载体表达(参见例如Tesar and Hotzel,Prot.Eng.Des.Selection 26(10):655-662,2013；通过引用结合到本文中)。
载体可包括在特定细胞类型中控制特定变体表达的调节元件(例如启动子、增强子和沉默子)。在某些情况下，本发明的载体将能够在多种细胞类型中表达基因(或变体和/或其部分)。例如，载体可包括多种调节元件，各能够控制(例如激活或抑制)基因在不同的细胞类型中表达。在某些情况下，如本文所述，这些调节元件的一个或多个可位于内含子中。
在某些情况下，载体包括一个或多个位点特异性重组基序。所述位点特异性重组基序例如可允许元件自载体中切离和/或与第二载体进行位点特异性重组以产生杂合载体。如本文所述，两种载体间的位点特异性重组可导致编码嵌合多肽的整合载体的形成。本发明的载体(例如第一载体或第二载体)可按照例如本领域众所周知的方法产生。例如，可通过标准技术，包括例如限制性内切酶消化、连接、聚合酶链式反应(PCR)、位点定向诱变和随机诱变，对现有表达载体进行修饰。还可按例如美国临时专利申请号62/087,440(通过引用结合到本文中)所述合成载体。载体文库(例如噬菌体展示文库)可按照本领域已知的方法产生。例如文库可按例如PCT申请号PCT/US2014/018672(通过引用结合到本文中)所述通过定向进化产生。载体文库(例如第一载体或第二载体)可例如作为起始克隆的变体产生(例如通过本领域众所周知的诱变方法)。载体文库还可通过例如描述于PCT公布号WO2014/134166(通过引用以其整体结合到本文中)的方法产生。
可通过例如描述于PCT申请号PCT/US2014/068595(通过引用以其整体结合到本文中)的例如延迟感染性方法(delayed infectivity method)(例如延迟乳液感染性筛选)，或通过本领域已知的其它筛选方法(例如生物淘选方法例如噬菌体展示筛选)，针对抗原结合筛选载体文库的载体。在某些情况下，对载体文库进行多路筛选。按照所述方法鉴定为与目标靶分子(例如蛋白质)结合的scFv随后可按照本发明的方法转化至嵌合多肽(例如IgG和嵌合抗原受体)。在某些情况下，本发明的载体(例如第一载体或第二载体)或其部分的核酸序列可按照本领域众所周知的测序方法(例如Sanger测序或下一代测序技术)测定。
下面详细描述了可用于本发明方法的特定载体。要认识到，本文所述第一载体可用作第二载体，本文所述第二载体可用作第一载体。
第一载体
在某些情况下，本发明包括两种载体：编码第一多肽(例如结合部分)的第一载体和编码第二多肽(例如结合部分构架或其部分)的第二载体。在某些情况下，第一载体是噬菌粒载体(图1)。在某些情况下，第一多肽与病毒蛋白例如病毒外被蛋白(例如GpIII)融合。优选，表达第一多肽的噬菌体颗粒能够感染细胞，例如细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)，从而将噬菌粒DNA转导至细胞中。在具体情况下，细菌细胞含有第二载体(图1所示作为接纳体载体)和重组酶(例如phiC31)，使得第一和第二载体在细菌细胞中进行重组形成含有编码嵌合多肽(例如包括第一多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分的嵌合多肽)的多核苷酸的载体。由第一载体编码的第一多肽可以是经选择、克隆、分离、测序或以别的方式产生或通过针对例如能够结合一种或多种特定抗原的抗体筛选方法鉴定的结合部分。例如，第一多肽可以是通过生物淘选技术，例如噬菌体展示、核糖体展示或噬菌体乳化、分泌和俘获(噬菌体ESCape)鉴定的结合部分。在一些实施方案中，第一多肽是通过合理设计产生的结合部分。在本发明的不同实施方案中，因为生物淘选通常包括自载体表达候选结合部分，所以本发明的第一多肽由用于在生物淘选方法中表达第一多肽的载体编码，所述方法的实例包括噬菌体展示、核糖体展示或噬菌体ESCape。
编码第一多肽的第一载体可进一步编码一个或多个功能盒(例如如本文所述)。第一载体的功能盒可以是能够促进嵌合多肽的产生、表达或分离的任何多核苷酸区段，而非编码第一多肽的多核苷酸本身。编码第一多肽或其部分的多核苷酸区段可与编码第二多肽或其片段的功能盒融合，使得第一多肽作为包括第一多肽和由一个或多个功能盒编码的一个或多个其它氨基酸的融合蛋白表达。功能盒可编码独立于第一多肽表达的蛋白质或多肽，使得在表达时，它作为有别于编码第一多肽的任何转录物的单独转录物转录。
一个或多个多肽和/或功能盒的表达可由本文所述的各种调节盒驱动。可排列多个启动子盒，使得第一多肽或其变体可在多种不同的细胞类型中表达，或使得细胞类型可决定蛋白质变体的表达，各变体包括由相同多核苷酸区段编码的至少一个区段。
第一载体可进一步编码一个或多个信号肽功能盒(例如编码细菌信号肽或哺乳动物信号肽的盒)。在某些情况下，第一载体编码第一多肽的一个或多个信号肽3′。在某些情况下，第一载体编码第一多肽的一个或多个信号肽5′。信号肽功能盒可与第一多肽或与另一个功能盒融合。在具体情况下，由第一载体编码的第一多肽以包括一个或多个信号肽(例如N端信号肽)的融合蛋白表达。
在本发明的一些实施方案中，一个或多个信号肽的表达取决于其中第一载体存在的细胞。例如，第一载体可编码第一多肽的哺乳动物信号肽和细菌信号肽5′的每一个。在某些情况下，哺乳动物信号肽编码细菌信号肽的5′，但是还预期例如相反的顺序。哺乳动物信号肽可自哺乳动物启动子表达，而细菌信号肽可自细菌启动子表达。在具体的实施方案中，细菌启动子和细菌信号肽功能盒与第一多肽接近编码序列，使得细菌中的表达产生包括细菌信号肽和第一多肽的融合蛋白。此外，细菌启动子和信号肽盒侧接剪接位点，使得在哺乳动物细胞中哺乳动物启动子的表达产生包括哺乳动物信号肽和第一多肽，但非细菌信号肽或启动子的融合蛋白。在这类实施方案的一个实例中，第一载体从5′到3′编码哺乳动物启动子、哺乳动物信号肽、剪接位点、细菌启动子、细菌信号肽、第二剪接位点和第一多肽。在某些情况下，编码信号肽(例如细菌或哺乳动物信号肽)的多核苷酸位于内含子内，使得它只通过原核细胞(例如细菌细胞)表达，因为在真核细胞中在内含子剪接期间它将被除去。在特定情况下，编码细菌信号肽的多核苷酸位于内含子中，使得它在细菌细胞中作为与第一多肽的融合物表达，但在哺乳动物细胞被剪除。
第一多肽可存在于包括能够展示的区段的融合蛋白中。例如，如果第一载体编码通过其中展示结合部分的生物淘选技术鉴定的结合部分，则这可能便是这种情况。在某些情况下，第一多肽存在于进一步包括使病毒展示成为可能的区段的融合蛋白中。使病毒展示成为可能的区段可以是例如包括已知病毒跨膜结构域的序列或从中衍生的序列的多肽。在具体的实例中，本发明的多肽(例如第一多肽)存在于包括GpIII(例如M13 GpIII)的融合蛋白中。编码GpIII的功能盒可以是例如编码结合部分的多核苷酸区段的3′。用于具体生物淘选方法中展示或其它应用的许多其它构建体是本领域已知的。
第一载体可进一步编码在表达时显示可检测表型的一种或多种标记蛋白。在具体情况下，第一载体编码两种或更多种标记蛋白，例如自不同启动子表达的两种或更多种标记蛋白。在这些情况下，它可以是一种标记蛋白自例如细菌或哺乳动物启动子表达，另一种标记蛋白自例如第二种细菌或哺乳动物启动子表达。在某些情况下，一种标记蛋白自细菌启动子表达，另一种标记蛋白自哺乳动物启动子表达。在某些情况下，编码标记蛋白的多核苷酸位于内含子内，使得它只通过原核细胞(例如细菌细胞)表达，因为它在真核细胞中在内含子剪接期间将被除去。
第一载体可包括一个或多个位点特异性重组基序(例如互补和/或直向同源位点特异性重组基序)。存在于两种单独的载体上的两个互补位点特异性重组基序间的重组可导致包括例如第一载体的核酸和第二载体的核酸的重组产物(例如编码嵌合多肽的重组产物，其中嵌合多肽包括由第一载体编码的第一多肽的至少一部分和由第二载体编码的第二多肽的至少一部分)的产生。本文描述了使用所述第一载体和第二载体将第一多肽转化至嵌合多肽的方法和组合物。
在其它情况下，第一载体可包括两个互补位点特异性重组基序，使得重组可发生在载体内这两个互补位点特异性重组基序之间。在某些情况下，使第一载体内这两个位点特异性重组基序重组导致位于两个互补位点特异性重组基序间的核酸切离或倒位。或者，这两个位点特异性重组基序之间的重组可导致第一多肽转化至嵌合多肽中(例如无需使用第二载体)。在任一情况下，重组的一个或多个点可被以第一位点特异性重组基序的一部分和第二位点特异性重组基序的一部分组合产生的杂合重组位点标记。例如，attL和attR通过使具有attB位点特异性重组基序的第一载体和具有attP位点特异性重组基序的第二载体之间重组产生的杂合重组基序而产生。
第一载体可包括如此定位的一对互补位点特异性重组基序，使得在能够介导位点特异性重组基序之间的重组的重组酶存在下，第一载体的一部分被切离。存在于同一载体中的一对互补位点特异性重组基序可称为切离基序对。在具体的实施方案中，切离除去来自第一载体一个或多个功能单元，例如编码标记蛋白的功能盒。在一些实施方案中，切离除去多肽(例如第一多肽)的一部分，例如结合部分恒定区。在某些情况下，切离可除去结合部分融合蛋白的GpIII(例如M13 GpIII)编码功能盒。第一载体的一部分的切离可能是在按照本文所述方法实现将第一多肽转化至嵌合多肽中的可取步骤。
第一载体可编码结合部分构架功能盒。在某些情况下，结合部分构架功能盒通过一个或多个其它的功能盒与编码第一多肽的多核苷酸区段分隔开来。在具体情况下，编码第一多肽的多核苷酸区段和结合部分构架功能盒之间的间插多核苷酸的全部或相当部分的两侧是切离基序对的位点特异性重组位点。在这类实施方案中，切离导致能够表达包括第一多肽的全部和部分和由结合部分构架盒编码的构架的融合蛋白的多核苷酸区段的产生。在某些情况下，第一结合部分的结合部分构架盒可编码对应于与第一多肽类型不同的多肽类型的构架。在其它情况下，结合部分构架盒和/或第二多肽具有相同类型，但其排列有助于将第一多肽转化到不同类型的多肽。
第一载体可包括编码转录终止信号的多核苷酸区段，例如polyA盒。例如，如果第一载体包括结合部分构架盒，则polyA盒可以是构架盒的3′。真核转录终止信号包括例如加polyA序列(AAAUAA)和/或多个下游核苷酸。许多转录终止序列是本领域已知的，这些的大部分已用于基因自载体表达。某些排列包括纳入包括内含子和在编码序列结束后的转录终止序列的片段。本领域已知的内含子的实例包括兔β-珠蛋白内含子和SV40内含子。转录终止序列的实例包括来自SV40或人生长激素的那些。组合序列的实例包括SV40内含子/终止序列、人生长激素的最后一个外显子加终止序列或完整的人生长激素基因。
在一些实施方案中，第一载体包括能够参与本发明的第二载体的位点特异性重组事件的重组基序(例如位点特异性重组基序)。优选第二载体，但不是第一载体，具有与第一载体的这类位点特异性重组基序互补的位点特异性重组基序(即第一载体不包括能够与第二载体重组的基序的互补序列)。预期第一载体可包括能够与第二载体重组的多个不同的位点特异性重组基序，另预期各种重组酶的存在可介导这些基序(如果有的话)可以重组。第一载体可进一步包括一个或多个隐蔽重组基序，各包括可连接形成功能重组基序的多个多核苷酸区段。隐蔽重组基序在多核苷酸区段连接之前可能是无功能的。例如，第一载体可进行第一重组事件，其导致自隐蔽重组基序的多核苷酸区段形成功能重组基序。
鉴于可获得的重组酶，可评价互补位点特异性重组基序的存在。在某些实施方案中，第一载体只包括能够参与与第二载体的位点特异性重组事件的各个位点特异性重组基序中的一个。适用于第一载体的各种各样的互补重组基序是本领域已知的。例如一对互补重组基序可包括attP基序和attB基序。在第二个实例中，一对互补重组基序可包括hixL基序和hixR基序。位点特异性重组基序的其它实例包括Tn7位点特异性attTn7基序。其它实例是本领域已知的。
除上述盒和其它序列元件以外，本发明的第一载体可包括一个或多个终止密码子作为其它功能盒。因为本发明的载体或其多核苷酸区段可在多种细胞类型中表达，所以适当的是终止密码子的密码子选择在一些物种中不同。例如，琥珀终止密码子(UAG)可被细菌某些菌株抑制。因此，有可能包括在某些细胞类型起作用，而在其它细胞类型(例如某些细菌细胞类型)连读的终止密码子。可以这种方式选择性使用的示例性终止密码子包括琥珀终止密码子、赭石终止密码子(UAA)和乳白终止密码子(UGA)。本发明的第一载体可包括例如编码第一多肽的最后一个核苷酸和编码随后的盒的第一个核苷酸之间的琥珀终止密码子。在另外更多的具体实例中，第一载体包括在包括GpIII(例如M13 GpIII)的融合蛋白中的scFv结合部分，琥珀终止密码子位于编码scFv的VH或VL的最后一个核苷酸和编码GpIII(例如M13GpIII)的第一个核苷酸之间。
第二载体
本发明的第二载体与第一载体重组产生编码嵌合多肽的重组产物。在某些情况下，第二载体编码第二多肽，例如结合部分的构架(即至少一个恒定区)或其部分。由第二载体编码的第二多肽可以是相当于与第一多肽类型不同的多肽类型(例如不同的结合部分类型)的构架。或者，由第二多肽编码的构架可与第一多肽类型一致，但以如此方式定位从而嵌合多肽中抗原决定区和恒定区的重排仍然构成转化。第二载体的第二多肽可由一个或多个构架盒编码。嵌合多肽可以是单一蛋白质或能够形成例如单一结合部分，例如一对抗体链的两个或更多个独立表达的蛋白质。不同的第二载体可用于本发明的方法(例如以与特定的第一载体重组)以构建包括编码不同嵌合多肽(例如不同的IgG融合物、嵌合抗原受体、泛素连接酶融合物和/或knocksideways蛋白)的多核苷酸区段的不同重组产物。例如，各自包括来自不同物种的构架的不同的第二载体可用来在来自各物种的结合部分构架之间交换一个或多个抗原决定区。在一个实例中，来自第一载体的轻链和/或重链可变结构域与第二载体中的人构架融合形成人源化结合部分(例如人源化IgG)。
在某些情况下，由第二载体编码的构架包括结合部分的至少一个恒定区。例如，构架可来源于或包括例如免疫球蛋白恒定区，例如CL、CH1、CH2或CH3。在某些情况下，构架可包括整个CH结构域(例如包括CH1、CH2和CH3)。免疫球蛋白恒定区可以是、来源于或包括与例如人Igκ、Igλ、IgA α1、IgA α2、IgDδ、IgEε、IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4或IgMμ链有关或来源于其中的恒定区。构架还可以是、来源于或包括这些区(例如Fc区)的组合。构架可以是、来源于或包括一个或多个人T细胞恒定区，例如TcR Cγ1或TcR Cγ2。本发明的构架可来源于鸡、人、兔、山羊、小鼠、骆驼、鲨鱼或能够产生抗体或包括恒定区的其它结合部分的其它生物。本发明的构架还可以是人工设计的结合部分的构架。构架可以是已知天然存在的任何形式的修饰形式，条件是构架能够在结合部分构建体内发挥功能。许多结合部分构建体是本领域已知的，这些中的任一种可全部或部分用于本发明的构建体中。任何这些构架的全部或部分或从中衍生的构架可包括在第一载体或第二载体构架盒中。
除一个或多个构架盒以外，第二载体可进一步编码一个或多个功能盒。第二载体的功能盒可以是能够促进嵌合多肽的产生、表达或分离的任何多核苷酸区段。功能盒可编码蛋白质或多肽，例如不与第二载体的结合部分构架融合的蛋白质或多肽。功能盒备选地可以是调节多核苷酸区段，例如启动子、polyA序列、Kozak序列或调节表达的其它多核苷酸区段。功能盒可以是介导转录或转录物稳定性、翻译或重组的多核苷酸区段。调节盒可以是例如能够驱动嵌合多肽或其组分表达的启动子。能够调节基因表达的多种多核苷酸序列是本领域已知的，与其用于指导表达的方法一样。在某些情况下，两个或更多个功能盒可作为融合蛋白表达。
编码蛋白质或多肽的一个或多个盒的表达可由不同的调节盒驱动。正如本领域已知的，对不同的启动子进行优化用于在特定的细胞类型中表达。例如，一些启动子只有或基本上只有当存在于细菌细胞中时才能够驱动表达。一些启动子只有或基本上只有当存在于哺乳动物细胞或存在于昆虫细胞中时才能够驱动表达。一些启动子只有或基本上只有在更具体的细胞类型的亚型中才能够驱动表达，而其它启动子可在例如细菌细胞和哺乳动物细胞两者中广泛地发挥功能。这些差异可部分产生于相关细胞类型内源的不同细胞蛋白质的可用性和功能。正如本文更详细描述的，可排列多个启动子盒，使得编码蛋白质或多肽的单个多核苷酸区段可在多种不同的细胞类型中表达，或使得细胞类型可支配蛋白质变体的表达，各变体包括由相同多核苷酸区段编码的至少一部分。
在某些情况下，第二载体编码一个或多个信号肽功能盒。在某些情况下，第二载体编码第二多肽盒(例如构架盒)的一个或多个信号肽5′。在某些情况下，第二载体编码构架盒的一个或多个信号肽5′。信号肽盒可任选与构架盒或与另一个盒融合。在具体情况下，嵌合多肽或其组分在包括来源于第二载体的一个或多个信号肽的融合蛋白中表达。
第二载体可进一步编码在表达时显现可检测表型的一种或多种标记蛋白。在具体情况下，第二载体编码两种或更多种标记蛋白，例如，自不同启动子表达的两种或更多种标记蛋白。在这些情况下，它可以是一种标记蛋白自例如细菌或哺乳动物启动子表达，另一种标记蛋白自例如第二种细菌或哺乳动物启动子表达。在某些情况下，一种标记蛋白自细菌启动子表达，另一种标记蛋白自哺乳动物启动子表达。
第二载体可包括一个或多个位点特异性重组基序(例如互补和/或直向同源位点特异性重组基序)。在某些情况下，第二载体包括能够参与与本发明的第一载体的位点特异性重组事件的位点特异性重组基序。在某些情况下，第一载体，但不是第二载体，具有与例如第二载体的位点特异性重组基序互补的位点特异性重组基序(即第二载体不包括能够与第一载体重组的基序的互补序列)。预期第二载体可包括能够与第一载体重组的多个不同的位点特异性重组基序，另预期各种重组酶的存在可介导这些基序(如果有的话)可以重组。还预期第二载体可包括例如能够彼此重组的一对或多对互补位点特异性重组基序。
第二载体可进一步包括一个或多个隐蔽重组基序，各自包括可以连接形成功能重组基序的多个多核苷酸区段。隐蔽重组基序在多核苷酸区段连接之前可能是无功能的。例如，第二载体可进行导致第一重组事件，其自隐蔽重组基序的多核苷酸区段形成功能重组基序。在某些情况下，第一和第二载体各自可包括构成隐蔽重组基序的一个或多个多核苷酸区段，使得第一和第二载体之间的重组导致多核苷酸区段连接形成功能重组基序。
鉴于可获得的重组酶，对互补位点特异性重组基序的存在进行评价。在某些实施方案中，第二载体只包括能够参与与第一载体的位点特异性重组事件的各个位点特异性重组基序中的一个。
第二载体可包括编码转录终止信号，例如polyA盒的多核苷酸区段。例如polyA盒可以是构架盒的3′且与构架盒融合。真核转录终止信号包括例如加polyA序列(AAAUAA)和/或多个下游核苷酸。许多转录终止序列是本领域已知的，这些的多种已知用于基因自载体表达。某些排列包括纳入包括内含子和在编码序列结束后的转录终止序列的片段。本领域已知的内含子的实例包括兔β-珠蛋白内含子和SV40内含子。转录终止序列的实例包括来自SV40或人生长激素的那些。组合序列的实例包括SV40内含子/终止序列、人生长激素的最后一个外显子加终止序列或整个人生长激素基因。
适用于第二载体的各种各样的互补重组基序是本领域已知的。例如一对互补重组基序可包括attP基序和attB基序。在第二个实例中，一对互补重组基序可包括hixL基序和hixR基序。位点特异性重组基序的其它实例包括Tn7位点特异性attTn7基序。其它实例是本领域已知的。
除上述盒和其它序列元件以外，本发明的第二载体可包括一个或多个终止密码子作为其它功能盒。因为本发明的载体或其多核苷酸区段可在多种细胞类型中表达，所以适当的是终止密码子的密码子选择在一些物种中不同。例如，琥珀终止密码子(UAG)可被细菌某些菌株抑制。因此，有可能包括在某些细胞类型起作用，而在其它细胞类型(例如某些细菌细胞类型)连读的终止密码子。可以这种方式选择性使用的示例性终止密码子包括琥珀终止密码子、赭石终止密码子(UAA)和乳白终止密码子(UGA)。本发明的第二载体可包括例如基因(例如编码本文所述多肽的基因)的最后一个核苷酸和polyA盒之间的琥珀终止密码子，其在某些情况下，可为能够表达标记蛋白的盒的上游。
本领域技术人员应认识到，本发明的关键方面可能不限于第一或第二载体任一个的任一种组分存在与否，而是至少包括其组分的组合和特定排列使得通过本发明的第一载体和第二载体重组发生结合部分的转化。此外，应认识到，本发明的第一载体和第二载体可以是可互换的。
多种载体和载体文库
在某些情况下，按照本发明的方法同时将多种不同的第一多肽转化至另一类型的多肽。例如，第一多肽的每一个可以是结合部分(例如抗体)的特定变体。可按照本领域众所周知的方法，构建包括各自编码变体之一的多种第一多肽的文库。在某些情况下，可构建其中各个载体编码抗体的文库，其中抗体每个的轻链是相同的，每个抗体的重链不同的。例如，抗体的每一个可包括一个或多个不同的重链抗原决定区(例如CDR)。在其它情况下，可构建其中各个载体编码抗体的文库，其中重链抗体每一个的重链是相同的，每个抗体的轻链是不同的。例如，抗体的每一个可包括一个或多个不同的轻链抗原决定区(例如CDR)。例如可采用鉴定强结合克隆或显示结合亲和力提高的克隆的本领域已知的方法，针对例如目标抗原(例如被保持恒定的抗体部分识别的抗原)筛选这类文库。
在某些情况下，本发明的特征在于能够与多种不同的第二载体(例如接纳体载体)整合的第一载体(例如噬菌粒载体)。在某些情况下，第一载体包括多个不同的重组基序(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的重组基序)。重组基序可以是例如位点特异性重组基序。例如，第一载体可包括第一位点特异性重组基序和与第一位点特异性重组基序直向同源的第二位点特异性重组基序。第一和第二位点特异性重组基序可允许第一载体与两种不同的第二载体整合。通过第一载体与不同的第二载体之一重组所产生的整合载体的每一个可产生例如不同的嵌合多肽(例如来自第一多肽的不同类型的结合部分)。在一个实例中，第二载体包括attP和attP2位点特异性重组基序两者。在某些情况下，第一载体可包括位于scFv编码序列下游但gpIII序列上游的attP2位点。这个第二整合酶位点可用来产生scFv与其它多肽和/或多肽片段(例如如本文所述)的融合物。
在某些情况下，第一位点特异性重组基序允许第一载体与第二载体(例如包括结合部分构架的接纳体载体)整合从而所得整合载体能够表达包括来自第一载体的多肽(或其一部分)的IgG；第二位点特异性重组基序允许第一载体与不同的第二载体(例如包括本文所述任何功能结构域，例如CAR的载体)整合，使得例如所得整合载体能够表达与功能结构域融合的scFv。例如，scFv可与泛素连接酶结构域、knocksideways结构域或CAR结构域融合。CAR结构域可包括例如CD3-ζ或CD28跨膜结构域和/或CD3-ζ、CD28、41BB、ICOS、FcεRIγ、流感MP-1，VZV和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。在一个实施方案中，scFv与CD3-ζ结构域融合，从而形成scFv-CD3-ζ融合蛋白，例如，包括scFv和CD3-ζ之间的跨膜结构域(例如CD3-ζ跨膜结构域)的scFv-CD3-ζ融合蛋白。这类scFv-CD3-ζ融合蛋白可包括例如由包括整合载体的宿主细胞(例如T细胞)在胞外提供的scFv，使得scFv与关联结合配偶体的结合导致胞内ζ信号通过CD3-ζ结构域传递。这进而可导致例如T细胞的激活。
腺病毒载体
在某些情况下，本发明的载体(例如第一载体或第二载体)可以是腺病毒载体。重组腺病毒可采用本领域已知的任何方法产生。例如，大肠杆菌中Tn7介导的转座可用来产生适于用作本发明载体的腺病毒。在一个实例中，构建了含有以lacZattTn7替代E1的全长腺病毒基因组的低拷贝数大肠杆菌质粒。腺病毒质粒或“admid”以及高拷贝数祖代可在细胞，例如大肠杆菌(例如大肠杆菌菌株DH10B)中稳定保持。示例性admid系统描述于Richardset al.(Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis,Chapter 39:231-240,2001)，通过引用结合到本文中。含有两侧是Tn7R和Tn7L的哺乳动物表达盒的转移载体可用作供体以使mini-Tn7转座至腺病毒基因组的E1区。因此，转座的重组admid可容易地通过β-半乳糖苷酶表型鉴定出来。将admid DNA转染至生产者细胞导致感染性腺病毒的有效产生。该系统可将涉及无需连续数轮噬斑纯化来产生重组腺病毒的纯的克隆原液的时间从4-6周缩短至只有2-3天。
标记蛋白
本发明的载体可包括一种或多种标记蛋白，其在表达时可允许选择含有载体的细胞。标记蛋白的表达可导致可检测表型的显现。可产生于标记蛋白的表达的可检测表型的实例包括而不限于发光、荧光、抗生素抗性、抗生素敏感性、毒素抗性、毒素敏感性、改变的生长速率、改变的对分析物的响应、改变的细胞结构、改变的集落形成或改变的辅源营养。其它的可检测表型是本领域已知的。此外，能够显现这些可检测表型的基因也是本领域已知的。例如可检测表型可产生于绿色荧光蛋白(例如gfp)、红色荧光蛋白(例如rfp)、黄色荧光蛋白(例如yfp)、氨苄西林抗性基因(amp)、四环素抗性基因(tet)、卡那霉素抗性基因(kan)、β半乳糖苷酶(β-gal)、丙氨酸合成基因(例如rgA)、胱氨酸合成基因(例如cysE)、亮氨酸合成基因(例如lysA)、苏氨酸合成基因(例如thrC)或本领域已知的多种其它天然或合成基因的任一种的表达。或者，标记蛋白可以是例如通过转录因子的表达，指导或有助于显现可检测表型的基因表达的功能盒。在这些情况下，显现可检测表型的基因对细胞可能是内源的，存在于第一载体中、存在于第二载体中或存在于另一种载体中。在某些情况下，标记蛋白(例如zeocin或氯霉素)可用来如下选择整合子：通过包括第一载体中的表达元件(例如启动子)和第二载体中的标记基因，使得重组连接标记基因上游的启动子元件。
选择或分离具有可检测表型的细胞的方法是本领域已知的。根据可检测表型，选择或分离具有产生于标记蛋白表达的表型的一个或多个细胞可包括流式细胞术、将一群细胞在有关的抗生素或毒素存在下培养、将一群细胞在特定的有机化合物存在或不存在下培养或显微镜技术。选择和分离具有特定的可检测表型的细胞的其它方法是本领域已知的。
功能盒
本发明的载体可适于在多种不同的细胞类型(例如细菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞)中表达一个或多个基因。例如，载体可编码一个或多个功能盒。功能盒可以是例如能够有助于基因(例如编码结合部分的基因)的产生、表达或分离的任何多核苷酸区段。功能盒可编码蛋白质或多肽。编码这类蛋白质或多肽(例如结合部分)的多核苷酸区段可与编码蛋白质或多肽的功能盒融合，从而蛋白质或多肽(例如结合部分)作为包括蛋白质或多肽和由一个或多个功能盒编码的一个或多个其它氨基酸的融合蛋白表达。功能盒可编码独立于所述蛋白质或多肽(例如结合部分)而表达的另外的蛋白质或多肽，这意味着当表达时，它作为有别于编码第一蛋白质或多肽的任何转录物的单独的转录物转录。
A.调节盒
功能盒可包括一个或多个调节盒。调节盒可以是介导转录或转录物稳定性、翻译或重组的多核苷酸区段。示例性调节盒包括调节序列，例如启动子、polyA序列、Kozak序列或调节表达(例如结合部分的表达)的任何其它多核苷酸序列。调节盒可以是调节多肽表达的盒或调节一个或多个其它的功能盒表达的盒。能够调节基因表达的许多多核苷酸区段是本领域已知的，正如其应用于指导表达的方法一样。在某些情况下，两个或更多个功能盒可作为融合蛋白表达。
一个或多个多肽或功能盒的表达可由不同的调节盒驱动。正如本领域已知的，对不同的启动子进行优化用于在特定的细胞类型中表达。例如，一些启动子只有或基本上只有当存在于细菌细胞中时才能够驱动表达(例如大肠杆菌lac启动子)。其它启动子只有或基本上只有当存在于哺乳动物细胞(例如CMV启动子)或存在于昆虫细胞(例如多角体启动子)中时才能够驱动表达。一些启动子只有或基本上只有在更具体的细胞类型的亚型中才能够驱动表达，而其它启动子可在例如细菌细胞和哺乳动物细胞两者中广泛地发挥功能。这些差异可部分产生于相关细胞类型内源的不同细胞蛋白质的可用性和功能。此外，可排列多个启动子盒，使得编码蛋白质或多肽的单个多核苷酸区段可在多种不同的细胞类型中表达，或使得细胞类型可支配蛋白质变体的表达，每个变体包括由相同多核苷酸区段编码的至少一个区段。
在某些情况下，载体可包括处于串联以控制位于启动子3’的单个基因表达的多个启动子。例如载体可包括下文所述的双重启动子元件，例如连环启动子和/或内含子启动子。
(1)连环启动子
可串联地排列多个启动子盒以形成能够控制(例如增加或降低)下游基因(例如编码本发明的第一多肽、第二多肽、嵌合多肽或其任何组合或片段的基因)表达的一组连环启动子，其中连环启动子的每一个控制下游基因在特定的生物中表达。在一个实施方案中，两个或更多个启动子相对于待表达的基因是连环的5’，使得任一启动子下游存在的第一个ATG是待表达的基因的起始密码子。在某些情况下，连环启动子可驱动待分泌的蛋白质的表达。在某些情况下，待分泌的蛋白质包括在细菌和哺乳动物细胞两者中运转的信号肽(例如IL2信号序列)。连环启动子的实例描述于例如Kadwell et al.(“Update to:The AdmidSystem:Generation of recombinant adenoviruses by Tn7-mediated transpositionin E.coli,”Chapter 39,Cloning and Expression Vectors for Gene FunctionAnalysis,2001)和Tan et al.(Genome Res.13:1938-1943,2003)，其每一个通过引用结合到本文中。
(2)内含子启动子
在另一个实施方案中，载体可包括位于内含子的启动子(例如原核启动子，例如细菌启动子)(“内含子启动子”)，使得如果在真核细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)中表达时，启动子序列从所得转录物中剪除。这可能是需要的，例如，如果位于内含子启动子3’的外显子要在内含子启动子控制下表达，但位于内含子启动子5’的外显子不表达。在某些情况下，内含子可进一步包括其它的调节元件或编码区(例如信号肽)。例如，内含子启动子可以是细菌启动子，且5’外显子和3’外显子两者可位于哺乳动物启动子的下游。因此，如果载体在哺乳动物细胞(例如HEK-293细胞)中，则两个外显子转录，而包括细菌启动子的内含子在RNA剪接时除去。如果载体在细菌细胞中，仅3’外显子转录。因此，这种双重启动子系统允许在不同的细胞类型中表达特定蛋白质的不同变体。
在这类双重启动子系统的一个实例中，设计噬菌粒载体，其中将大肠杆菌lac启动子和细菌信号肽置于哺乳动物表达盒的内含子内(图2)。将启动子(例如CMV启动子或EF1启动子)和哺乳动物信号肽置于该内含子的5’，并将编码VH基因的基因定位于该内含子3’的外显子中。因此，在哺乳动物细胞中，启动子驱动与哺乳动物信号肽融合的VH基因的产生，而在细菌细胞中，lac启动子驱动与细菌信号肽融合的VH基因的表达。包括这类双重启动子的另外的载体描述于例如美国专利号7,112,439，通过引用结合到本文中。
B.信号肽盒
第一载体可编码一个或多个信号肽功能盒。在某些情况下，第一载体编码第一多肽的一个或多个信号肽3′。在某些情况下，第一载体编码第一多肽的一个或多个信号肽5，。信号肽功能盒可与第一多肽或与另一个功能盒融合。在具体情况下，由第一载体编码的第一多肽以包括一个或多个信号肽(例如N-端信号肽)的融合蛋白表达。在某些情况下，信号肽功能盒编码在细菌和哺乳动物细胞两者中运转的信号肽(例如IL2信号序列)。
在本发明的一些实施方案中，一个或多个信号肽的表达取决于其中第一载体存在的细胞。例如，第一载体可编码第一多肽的哺乳动物信号肽和细菌信号肽5，的每一个。在某些情况下，哺乳动物信号肽细菌信号肽的编码的5，，但还预期例如相反的顺序。哺乳动物信号肽可自哺乳动物启动子表达，而细菌信号肽可自细菌启动子表达。在具体的实施方案中，细菌启动子和细菌信号肽功能盒与第一多肽接近，使得细菌中的表达产生包括细菌信号肽和第一多肽的融合蛋白。此外，使细菌启动子和信号肽盒侧接剪接位点，使得在哺乳动物细胞中，哺乳动物启动子的表达产生包括哺乳动物信号肽和第一多肽的融合蛋白，但不是细菌信号肽或启动子。在这类实施方案的一个实例中，第一载体从5，到3，编码哺乳动物启动子、哺乳动物信号肽、剪接位点、细菌启动子、细菌信号肽、第二剪接位点和第一多肽。
重组基序
重组基序与之可参与重组事件的一段核酸可称为互补重组基序。位点特异性重组基序选择性地参与与具有特定序列或特定序列特性的互补重组基序的重组。例如，互补重组基序attB和attP可在由例如phiC31整合酶或噬菌体λ整合酶催化的反应中彼此重组。在某些情况下，重组基序可被分开，具有基本上不受约束和/或不直接参与重组的一个或多个序列分隔开来、具有特定序列要求的两个或更多个区。在某些情况下，互补重组基序是相同的(例如配对的loxP位点或配对的FRT位点)。在其它情况下，互补重组基序是不相同的。在某些情况下，可确定包含位点特异性重组基序的所有核苷酸。在其它情况下，只可确定包含位点特异性重组基序的部分核苷酸，例如5％、10％、15％、20％、25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的存在于位点特异性重组基序的核苷酸。互补重组基序可包括例如噬菌体基序、细菌基序或同向重复基序。在某些情况下，一段核酸可用作重组基序和当翻译成其相应的氨基酸序列时在两个多肽部分(例如VH和VL蛋白，如图1所示)间的接头两者。
可用作本发明的载体中的重组基序的示例性重组基序包括而不限于：attB、attP、loxP、FRT、hixL、hixR及其变体。重组基序的变体是本领域已知的(例如JT15，一种显示与野生型loxP有相当的重组效率的loxP变体)，并且可在例如本文所述方法和组合物中取代和测试。具有合适的重组效率的attB和attP变体的实例可见于例如Groth et al.(PNAS 97(11):5995-6000,2000)的图3，通过引用结合到本文中。某些重组基序用于体外重组反应可能是优选的，例如噬菌体λ整合酶，例如描述于Hartley et al.(Genome Res.10:1788-1795,2000)，其通过引用结合到本文中。在进一步的实例中，互补位点特异性重组基序对attB1/attP1和attB1/attP1可用于本发明的载体中。在某些情况下，重组基序的变体能够置换该变体衍生自其中的原始重组基序。在其它情况下，重组基序的变体不能够置换原始重组基序。在具体情况下，变体重组基序可形成不同类别的互补重组基序。例如，attB1可与attP1重组，但不与attP2重组。
重组酶
某些位点特异性重组基序的重组可被一种或多种重组酶促进。重组酶可以是重组酶或整合酶。重组酶可以是例如丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。正如本领域已知的，丝氨酸和酪氨酸重组酶家族根据在重组期间与DNA相互作用的保守的亲核氨基酸命名。丝氨酸家族重组酶包括例如phiC31，它识别attB和attP位点；HIN转化酶，它识别hix位点；Bxb1整合酶；phiRv1整合酶；phiBT1整合酶；phiFC1整合酶和Tn3解离酶。Bxb1整合酶、phiRv1整合酶、phiBT1整合酶和phiFC1整合酶，像phiC31整合酶一样，可识别attB和attP位点，并可在例如辅助因子例如Xis存在下进一步催化逆反应。丝氨酸重组酶的详述评论见Smith et al.(Biochem.Soc.Trans.38:388-394,2010)，通过引用结合到本文中。酪氨酸家族重组酶包括例如噬菌体λ整合酶，它像phiC31一样，识别att位点；Cre，它识别lox位点；和Flp，它识别frt位点。例如，噬菌体λ整合酶连同整合宿主因子(IHF)蛋白介导attB位点和attP位点间的重组，形成attL和attR位点(参见例如Hartley et al.，同上)。逆反应(attL+attR to attB+attP)由噬菌体λ整合酶、IHF和切除酶(Xis)介导。噬菌体λ整合酶将非常适用于体外(例如不在细胞内)进行的重组。在本发明的不同实施方案中，Cre重组酶诱导两个loxP位点间的重组。在其它实施方案中，Flp重组酶诱导两个FRT位点间的重组。在某些情况下，重组酶可切除多核苷酸(例如载体)的一部分。这类重组酶在本文可称为“切除酶”。在某些情况下，切除酶可以是Cre或Flp。
在一些实施方案中，phiC31整合酶用来驱动本发明的两种载体间的整合(图3)。phiC31整合酶是识别36-bp位点特异性重组基序(例如attP、attB、attL和attR)的位点特异性丝氨酸重组酶。例如，两个核酸(一个含有attP基序，另一个含有attB基序)通过phiC31整合酶的重组导致两个核酸在基序位点处的整合且attP和attB基序被attL和attR基序置换。phiC31整合酶还可诱导逆反应(其中attL和attR转化成attP和attB，例如以切除整合的核酸区段)，虽然这可能需要辅助蛋白Xis的存在。可适用于本发明的结合部分转化方法的其它重组酶是本领域已知的。
多肽
本发明提供用于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法和组合物(例如不同类型的多肽)。在某些情况下，多肽(例如第一多肽、第二多肽或嵌合多肽)是或包括结合部分，例如抗体、抗体片段、嵌合抗原受体和/或其部分。本发明的多肽可包括或与一个或多个功能结构域融合(例如结合部分可与一个或多个功能结构域融合)。本发明的多肽可与之融合的示例性功能结构域包括而不限于结合部分、泛素连接酶结构域、knocksideways捕食结构域和标记蛋白(例如碱性磷酸酶、lacZ、或荧光蛋白、例如GFP、RFP、YFP、CFP、dsRed、mCherry或本领域已知的任何其它标记蛋白)。这类功能结构域可组合以赋予例如本文所述多肽有用的功能性。
要认识到，本文所述第一多肽可用作第二多肽，而本文所述第二多肽可用作第一多肽。
嵌合多肽
本发明的嵌合多肽可由例如按照本发明的方法在至少第一载体与第二载体重组时形成的整合载体编码。通过这个重组事件产生的整合载体包括编码嵌合多肽的多核苷酸。整合载体可编码单一嵌合多肽或一组两个或更多个嵌合多肽，例如重链和轻链。在某些情况下，嵌合多肽包括由第一载体编码的第一多肽的至少一部分(例如抗原决定区)和由第二载体编码的第二多肽的至少一部分(例如结合部分构架盒)。编码嵌合多肽的多核苷酸还可存在于非整合载体中。例如，编码嵌合多肽的多核苷酸可通过本领域已知的亚克隆方法转移至不同的载体中。
本发明的嵌合多肽可在细胞内以大于、等于或小于自本领域已知载体表达的相同类型的多肽表达的水平表达。例如由本发明的重组产物编码的嵌合多肽可以是这样的IgG抗体，其以大于、等于或小于自人分离并从已知载体表达的IgG所表达的水平的水平表达。或者，嵌合多肽可使用例如本领域众所周知的无细胞表达系统体外表达。
结合部分
本发明的特征在于包括编码一个或多个多肽或其片段的核酸序列的载体(例如第一载体或第二载体)。由载体编码的多肽可包括例如结合部分或其片段。本发明的结合部分可以是能够结合例如本文所述抗原的任何蛋白质或多肽。本发明的某些结合部分可包括抗原决定区和/或构架(例如恒定区或可变结构域的构架区)。
在某些情况下，结合部分是抗体，例如完整抗体或抗体片段，例如抗原-结合抗体片段。或者，本发明的结合部分可为不是抗体的蛋白质或多肽。结合部分可以是例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素、β半乳糖苷酶、亲和标签(例如HA、His、FLAG、SNAP、avitag或本领域已知的任何其它肽标签)、能够可用例如SFP或AcpS磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶标记的短肽标签(例如S6或A1标签；参见例如Zhou et al.,ACS Chem.Biol.2(5):337-346,2007，通过引用结合到本文中)、荧光蛋白(例如GFP、YFP、CFP、RFP、dsRed、mCherry或本领域已知的任何荧光蛋白)、碱性磷酸酶、激酶、磷酸酶、蛋白酶体蛋白、蛋白质伴侣、受体(例如先天免疫受体或信号转导肽受体)、嵌合抗原受体、synbody、人工抗体、具有硫氧还蛋白折叠的蛋白质(例如二硫键异构酶、DsbA、谷氧还蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、集钙蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶或谷胱甘肽过氧化物氧还蛋白)、具有衍生自硫氧还蛋白折叠的折叠的蛋白质、重复蛋白、已知参与蛋白质复合物的蛋白质、本领域已知的作为能够参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质的蛋白质或其任何变体(例如改进其结构或结合性质的变体)。本发明的结合部分可以是具有本领域已知的蛋白质结合结构域的任何蛋白质或多肽，包括包含蛋白质结合结构域的任何天然或合成蛋白质。本发明的结合部分还可以是具有本领域已知的多核苷酸结合结构域的任何蛋白质或多肽，包括包含多核苷酸结合结构域的任何天然或合成蛋白质。结合部分可包括例如靶向它用于例如在细胞表面作为跨膜蛋白质分泌或表达信号肽(例如细菌信号肽或哺乳动物信号肽)。
本发明的结合部分可包括一个或多个功能结构域(例如结合部分可与一个或多个功能结构域融合)。结合部分可与之融合的示例性功能结构域包括而不限于泛素连接酶结构域、knocksideways捕食结构域和标记蛋白(例如碱性磷酸酶、lacZ或荧光蛋白，例如GFP、RFP、YFP、CFP、dsRed、mCherry或本领域已知的任何其它标记蛋白)。这类功能结构域可以组合以赋予结合部分有效的功能性。例如，泛素连接酶结构域与结合部分的融合可用于使结合部分能够使与之结合的靶分子泛素化(ubiquinate)并驱动该分子的蛋白酶体降解。在第二个实例中，knocksideways捕食结构域可与结合部分融合使得将结合部分能够与之结合的靶分子隔离在特定胞内区域域(例如线粒体)内。在某些情况下，结合部分是抗原受体，例如T细胞受体。在某些情况下，结合部分是改造的抗原受体或抗体。在具体的实施方案中，结合部分是嵌合抗原受体(CAR)，例如描述于Sadelain et al.(Cancer Discovery 3:388-398,2013；通过引用结合到本文中)并如本领域众所周知的。在某些情况下，CAR可适于通过T细胞表达用于检测肿瘤相关抗原(TAA)。在某些情况下，CAR在T细胞表面上呈现(例如通过位于T细胞质膜的跨膜结构域锚定在T细胞表面)。由T细胞表达的CAR一般包括胞外TAA特异性结合部分(例如由通过短的柔性接头连接的抗体可变重链和轻链基因组成的scFv)。CAR的结合部分可通过例如铰链和跨膜结构域与胞内信号转导结构域(来自例如CD28、CD3ζ或4-1BB)连接。CAR和抗原间的相互作用可引发效应子功能，并且可例如介导肿瘤细胞的细胞溶解。CAR改造的T细胞可介导多种癌症的肿瘤消退。例如，针对淋巴恶性肿瘤中的CD19抗原的CAR在急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗中显示积极结果。
在某些情况下，通过筛选能够结合一种或多种特定抗原的抗体的方法，选择、克隆、分离、测序或以其它方式产生或鉴定出本发明的结合部分。例如，某一部分可以是通过生物淘选技术，例如噬菌体展示、核糖体展示或噬菌体乳化、分泌和俘获(噬菌体ESCape)鉴定的结合部分。在一些实施方案中，第一结合部分是通过合理设计产生的结合部分。在本发明的不同实施方案中，因为生物淘选通常包括候选结合部分自载体表达，所以本发明的第一结合部分是用于在生物淘选方法表达第一结合部分的载体，所述方法的实例包括噬菌体展示、核糖体展示或噬菌体ESCape。
本发明的方法和组合物可用来将某一结合部分转化至具有相同或类似类型的结合部分的变体。例如，结合部分可包括可与备选构架序列交换的构架序列。在某些情况下，结合部分是抗体或抗体片段，将其转化至具有不同构架的相同或类似类型的抗体或抗体片段。在另一个实例中，将来自杂交瘤的抗体转化至热稳定的或细胞溶胶稳定的抗体中。
抗体和抗体片段
本发明的载体(例如第一载体、第二载体和整合载体)可编码抗体或其片段。在某些情况下，由第一载体编码的第一多肽是抗体或抗体片段。在某些情况下，由第二载体编码的第二多肽包括抗体、抗体片段或构架。在具体情况下，由整合载体编码的嵌合多肽编码抗体或抗体片段(例如与由第一载体编码的抗体或抗体片段相比的不同类型的抗体或抗体片段)。在某些情况下，可按照本发明的方法，将抗体或抗体片段转化至另一多肽类型(例如CAR、泛素连接酶融合物和/或knocksideways捕食结构域融合物)，反之亦然。
本发明的抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白或抗体片段。抗体可以是多特异性的，例如双特异性的。本发明的抗体可以是哺乳动物(例如人或小鼠)、人源化、嵌合、重组、合成产生或天然分离的。示例性的本发明的抗体包括而不限于IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD、IgE、Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、scFv-Fc和SMIP结合部分。在某些实施方案中，抗体是scFv。scFv可包括例如允许scFv以不同方向定向使抗原结合成为可能的柔性接头。在不同的实施方案中，抗体可以是在细胞内的还原环境中保持其结构和功能的细胞溶胶稳定的scFv或胞内抗体(参见例如Fisher and DeLisa,J.Mol.Biol.385(1):299-311,2009；通过引用结合到本文中)。在具体的实施方案中，按照本文所述方法将scFv转化至IgG或嵌合抗原受体中。
在大多数的哺乳动物(包括人)中，完整抗体具有通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)及CH1和CH2之间的铰链区组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，中间有较保守的称为构架区(FR)的区域。每条VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
本发明的抗体包括抗体的所有已知形式和具有抗体样性质的其它蛋白质支架。例如，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体或具有抗体样性质的蛋白质支架，例如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体可具有以下任一种同种型：IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD或IgE。
本发明的抗体片段可包括来自抗体的一个或多个区段。来自抗体的区段可保持与特定抗原特异性结合的能力。抗体片段可以是例如Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP。抗体片段可以是例如双抗体(diabody)、三抗体、亲和体(affibody)、纳米体(nanobody)、适体、结构域抗体、线性抗体、单链抗体或可从抗体片段形成的多种多特异性的抗体的任一种。
抗体片段的实例包括：(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段：包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段：由VH和CH1结构域组成的片段；(iv)Fv片段：由抗体单臂的VL和VH结构域组成的片段；(v)dAb片段：包括VH和VL结构域的片段；(vi)dAb片段：是VH结构域的片段；(vii)dAb片段：是VL结构域的片段；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)可任选通过一个或多个合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可采用重组方法，例如通过使它们能够作为单一蛋白质表达的合成接头连接，其中VL和VH区对形成单价结合部分(称为单链Fv(scFv))。抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规技术获得，在某些情况下，可以与完整抗体相同的方式使用。抗原-结合片段可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整的免疫球蛋白产生。抗体片段可进一步包括添加了其它的C端氨基酸、N-端氨基酸或分隔各个片段的氨基酸的上文所述的任何抗体片段。
抗体如果包括来自第一物种的一个或多个抗原决定区或恒定区和来自第二物种的一个或多个抗原决定区或恒定区，则可称为嵌合的。嵌合抗体可通过例如基因工程构建。嵌合抗体可包括属于不同物种(例如来自小鼠和人)的免疫球蛋白基因区段。
本发明的抗体可以是人抗体。人抗体是指具有其中构架和CDR区均来自人免疫球蛋白序列的可变区的结合部分。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来自人免疫球蛋白序列。人抗体可包括非人免疫球蛋白序列中鉴定的氨基酸残基，例如一个或多个序列变异，例如突变。例如，可通过人为操作，引入变异或其它氨基酸。本发明的人抗体不是嵌合的。
本发明的抗体可以是人源化的，这意味着包括基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的一个或多个抗原决定区(例如至少一个CDR)的抗体经经操作以包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。可采用本文所述转化方法，例如通过将来自由第一载体编码的非人抗体的抗原识别序列插入由第二载体编码的人构架中，使抗体人源化。例如，第一载体可包括编码非人抗体(或其片段)和位点特异性重组基序的多核苷酸，而第二载体可包括编码人构架和与第一载体上的位点特异性重组基序互补的位点特异性重组互的多核苷酸。位点特异性重组基序可位于每个载体中使得重组事件导致来自非人抗体的一个或多个抗原决定区插入人构架中，从而形成编码人源化抗体的多核苷酸。
在具体的实施方案中，本发明的一个或多个结合部分是来自由接种受试者的细胞(例如B细胞)表达的抗体序列的抗体。在具体的实施方案中，本发明的一个或多个结合部分是来自由幼稚细胞表达抗体序列的抗体。
在本发明的某些实施方案中，结合部分以备选支架为基础。基于不同的人或非人蛋白质或蛋白质结构域的支架是本领域已知的(参见例如Gebauer etal.2009Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-255)。已研究了不同的蛋白质，包括亲和体、脂笼蛋白、锚蛋白重复蛋白、天然肽结合结构域、酶、GFP、小的二硫键合的肽、蛋白酶抑制剂等。
接头
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽或嵌合多肽包括接头，即未定义为结合部分恒定区或抗原决定区，相反形成两个这类区(例如两个恒定区、两个抗原决定区或每个之一)间的连接的一个或多个氨基酸。编码接头的多核苷酸区段可位于例如编码第一抗原决定区的多核苷酸区段和编码第二抗原决定区的多核苷酸区段之间。在包括接头的某些实施方案中，第一多肽、第二多肽或嵌合多肽是scFv。编码接头的多核苷酸区段可包括位点特异性重组基序，例如切离基序对的重组基序或能够介导与本发明的第二载体重组的重组基序。在某些实施方案中，编码接头的多核苷酸区段的每个核苷酸翻译成第一多肽、第二多肽或嵌合多肽的氨基酸。因此，在某些情况下，接头是双功能的；也就是说，它是或包括位点特异性重组基序，且接头的每个核苷酸，包括位点特异性重组基序的核苷酸转录并翻译，使得各核苷酸对应于结合部分的氨基酸。
本发明包括双功能接头的鉴定、优化、使用和/或设计。例如，具有序列5，-ccccaactggggtaacctttgggctccccgggcgcgtac-3，(SEQ ID NO:1)的attR位点可在不含终止密码子的5个读框(PNWGNLWAPRAR，SEQ ID NO:2；PTGVTFGLPGRV，SEQ ID NO:3；VRARGAQRLPQLG，SEQID NO:4；YAPGEPKGYPSW，SEQ ID NO:5；和TRPGSPKVTPVG，SEQ ID NO:6)以及的确含有终止密码子的第6个读框中翻译。既编码第一多肽、第二多肽或嵌合多肽的区段又包括位点特异性重组基序的接头的产生和优化是本发明的一个方面。
嵌合抗原受体
包括在本发明中的例如作为第一多肽、第二多肽或嵌合多肽的多肽的一种类型是嵌合抗原受体(CAR)。如本领域已知的，CAR是嵌合细胞表面受体(例如免疫受体)，其包括与能够在表达CAR的细胞中诱导下游效应的效应结构域融合的结合部分(例如抗体或抗体片段)。在某些情况下，结合部分在细胞表面的外部展示，效应结构域是面向细胞内部的胞质域。结合部分和效应结构域一般通过跨膜结构域或茎连接。茎的长度(例如scFv接头的长度或T细胞受体跨膜结构域的长度)可变化。在某些情况下，结合部分和靶分子间的结合可导致胞内信号转导途径的诱导。可按照本发明的方法，例如通过将CAR的结合部分或其部分置于来自另一类型的多肽(例如抗体或抗体片段)的构架中，将CAR转化至另一类型的多肽。相反地，可按照本发明的方法，例如通过使来自另一类型的多肽的结合部分(例如抗体的一个或多个抗原决定区或抗体片段)与例如本文所述的CAR跨膜结构域和/或一个或多个CAR效应结构域融合，将另一类型的多肽(例如抗体或抗体片段)转化至CAR。
在某些情况下，CAR是改造的T细胞受体，其中一个或多个T细胞受体结构域与结合部分(例如抗体或抗体片段)连接，使得结合部分与靶分子的结合导致表达CAR的T细胞的激活。T细胞然后可继续识别和杀灭表达靶分子的细胞。CAR的结合部分可包括例如抗体或抗体片段(例如scFv)。跨膜结构域可包括例如CD3-ζ或CD28跨膜结构域。效应结构域可包括例如CD3-ζ、CD28、41BB、ICOS、FcεRIγ、流感MP-1、VZV和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。可用于CAR的其它结合部分、跨膜结构域和效应部分是本领域已知的。例如，抗体修饰的CAR描述于Maus et al.(Blood 123(17):2625-2635,2014)，通过引用以其整体结合到本文中。
在某些情况下，可通过例如本发明的方法，产生包括茎区(例如本文描述的或本领域已知的茎)的变体的CAR变体的文库。例如多种茎变体可按照本领域已知方法产生，然后将各茎变体插入CAR中(例如在T细胞受体和CAR的scFv结构域之间)，从而产生具有相同的TCR和scFv结构域和可变的茎的CAR文库。例如，可通过本文所述转化方法将茎变体转化至CAR。在一些实施方案中，可针对所需性质(例如T细胞活性提高)，筛选这类CAR文库。显示所需性质改进的候选CAR变体可采用本领域已知的筛选方法(例如荧光激活细胞分选法或体内测定法)选择，任选通过对表达选择的CAR变体的载体进行测序来鉴定。可利用该方法鉴定赋予CAR这类所需性质的改进的茎区。
泛素连接酶
可用于本发明的方法和组合物、例如作为第一多肽、第二多肽或嵌合多肽的另外的多肽类型是包括泛素连接酶结构域的多肽。本领域众所周知的泛素连接酶(例如E3泛素连接酶)，是使泛素(一种小的调节蛋白)与多肽底物在赖氨酸残基处连接的泛素缀合酶。这类多肽底物的多聚泛素化靶向底物以被蛋白酶体降解。因此，泛素连接酶可用于驱动多肽的降解。
泛素连接酶的泛素缀合结构域或泛素连接酶结构域可与结合部分连接形成能够靶向特定目标多肽用于蛋白酶体降解的“ubiquibody”。例如结合部分(例如抗体或抗体片段)可按照本发明的方法与泛素连接酶结构域融合形成靶向结合部分的结合配偶体用于降解的泛素。ubiquibody可通过例如编码结合部分(例如抗体或抗体片段)的第一载体和编码泛素连接酶结构域的第二载体的重组产生，从而形成编码嵌合多肽的整合载体，其中结合部分与泛素连接酶结构域融合。或者，可按照本发明的方法，将ubiquibody用作本发明的第一多肽并转化至另一类型的多肽。适用于本发明的方法和组合物的泛素连接酶结构域包括本领域已知的任何E3泛素连接酶结构域(例如CHIP或CHIPΔTPR泛素连接酶结构域)。用于产生ubiquibodies的方法及其实例描述于例如Portnoff et al.(J.Biol.Chem.289(11)7844-7855,2014)，以其整体结合到本文中。
Knocksideways蛋白
本发明的多肽可包括或与促进多肽隔离在特定胞内区域或区室内的功能结构域融合。例如多肽可包括定位信号(例如信号肽)，其将多肽集中在细胞内的具体位置(例如定位在细胞器内，插入膜(例如细胞膜、内质网膜、线粒体膜、高尔基膜、内体膜或任何其它细胞膜)中，或从细胞分泌)。或者，多肽可包括或与knocksideways捕食或诱饵结构域融合。knocksideways系统描述于例如Robinson and Hirst(Curr.Protoc.Cell Biol.15.20.1-15.20.7,2013)和Robinson et al.(Dev.Cell 18:324-331,2010)，其每一个通过引用以其整体结合到本文中。
简单地说，knocksideways系统可用来将目标多肽隔离在特定的胞内位置(例如线粒体表面)中，这可使例如目标多肽灭活。目标多肽可以是需要调节其胞内位置的任何多肽。在某些情况下，目标多肽的隔离导致目标多肽的功能失活。knocksideways系统包括诱饵蛋白和捕食蛋白。诱饵蛋白可包括隔离结构域(例如线粒体跨膜结构域)和能够识别信号分子(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如P21967)的第一结合部分(例如FRB结构域或FKBP结构域)。捕食蛋白可包括目标多肽和还能够识别信号分子的第二结合部分(例如FRB结构域或FKBP结构域)。这种第二结合部分或其部分在本文亦称为knocksideways捕食结构域。因此，当信号分子存在时，诱饵蛋白和捕食蛋白两者结合，因此连在一起。因为诱饵蛋白被隔离在隔离结构域靶定的细胞区域，所以捕食蛋白同样被隔离在该细胞区域。
在一个实例中，诱饵蛋白包括FRB结构域和与线粒体外膜连接的跨膜结构域，而捕食蛋白包括FKBP结构域和待灭活的蛋白质(Robinson和Hirst，同上)。在一个实施方案中，诱饵蛋白是Mitotrap蛋白。在雷帕霉素或雷帕霉素类似物不存在时，捕食蛋白在细胞溶胶内是自由漂浮的，而诱饵蛋白被限制在线粒体表面。然而，当加入雷帕霉素或雷帕霉素类似物时，FRB结构域和FKBP结构域两者均与雷帕霉素分子结合。单个雷帕霉素或雷帕霉素类似物分子可同时与FRB结构域和FKBP结构域两者结合。因此，每个雷帕霉素或雷帕霉素类似物分子可将诱饵和捕食蛋白连接在一起。因为诱饵蛋白已被限制在线粒体表面，所以这将导致也将含有捕食蛋白的FKBP结构域隔离在线粒体表面。因此，如果待灭活的蛋白质必须位于的其它位置以起作用，则加入雷帕霉素或雷帕霉素类似物导致待灭活的蛋白质失活。
本发明的方法和组合物可用于产生适用于knocksideways系统的捕食蛋白或诱饵蛋白—换句话说，嵌合多肽可以是knocksideways捕食或诱饵蛋白。例如可将与另一功能结构域(例如泛素连接酶结构域或CAR的胞外、跨膜和/或胞内结构域)融合的另一类型的结合部分(例如抗体或抗体片段)或第一多肽转化至knocksideways诱饵或捕食蛋白。结合部分或第一多肽可在本发明的第一载体上编码，所述第一载体与包括knocksideways捕食或诱饵蛋白(或其一部分，例如knocksideways捕食结构域)的第二载体重组，从而产生编码包括结合部分或第一多肽或其部分和knocksideways捕食或诱饵蛋白或其部分的融合蛋白的整合载体。Knocksideways捕食或诱饵蛋白还可用作本发明的方法和组合物的第一多肽，因此可按照本文所述方法转化至其它类型的多肽。
RNA编辑
本发明的载体包括编码多肽(例如第一多肽、第二多肽和嵌合多肽)的多核苷酸区段。这些多核苷酸区段可包括例如内含子、外显子和各种调节和非编码元件。在某些情况下，非编码元件包括一旦转录为RNA便能够进行RNA编辑的一个或多个位点。如本领域已知的，RNA编辑一般通过RNA编辑酶进行，例如作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)。简单地说，ADAR酶催化在双链RNA底物中把腺苷转化至肌苷。肌苷模拟鸟苷的性质，因此优先与胞嘧啶形成碱基对。因此，由ADAR酶催化的腺苷-肌苷转化有效地导致RNA中的A-G单核苷酸多态性，这可改变例如由RNA编码的氨基酸序列、RNA剪接、翻译效率、RNA半寿期、RNA与另一多核苷酸杂交的能力(例如siRNA、shRNA、miRNA、其它RNA与靶多核苷酸的结合能力或特异性)和/或本领域已知的RNA分子的核苷酸序列赋予的任何其它因子。
ADAR酶可存在于含有本发明的载体的溶液中，或者载体和ADAR酶均可存在于细胞内。在某些情况下，本发明的载体包括编码ADAR酶的多核苷酸。在某些情况下，ADAR酶在另一种载体或在细胞的基因组中编码。ADAR酶可诱导双链RNA(例如自杂交的RNA链或彼此杂交的两个RNA链)中的腺苷-肌苷转化。在某些情况下，本发明的载体包括编码多肽(例如第一多肽、第二多肽或嵌合多肽)的多核苷酸区段，其转录产生mRNA转录物。在某些情况下，mRNA转录物能够自杂交形成双链RNA分子。例如，mRNA转录物可包括第一区和能够与第一区杂交形成双链体的第二区。能够由ADAR酶编辑的这类双链RNA区是本领域已知的。在第一个实例中，包括至少约100个碱基对(bp)(例如至少100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、175bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1250bp、1500bp、1750bp、2000bp、2500bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10,000bp或更多)的长双链RNA可不加选择地编辑(即在整个序列的腺苷残基上)。在某些情况下，这类长双链RNA中所有腺苷残基的约50％可转化为肌苷。在第二个实例中，短双链RNA(例如包括约1-100bp的RNA；优选包括约20-30bp，例如约20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp和30bp的RNA)包括一个或多个特异性编辑位点互补序列(ECS)，其在腺苷-肌苷编辑位点周围的外显子序列和下游(例如内含子)互补序列之间形成不完整对叠的双链RNA结构。这类ECS可以例如用于位点特异性RNA编辑。在第三个实例中，长度大于约30bp(例如至少30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp或100bp或更多)的双链RNA区可包括一个或多个错配碱基、凸出或环。在该实例中，序列中的腺苷残基可被例如选择性地编辑为肌苷。
可用于本发明的方法和组合物的示例性RNA编辑酶包括而不限于哺乳动物ADAR1、ADAR2和ADAR3；秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)CeADR1和CeADR2、果蝇ADAR、鸡ADAR、斑马鱼ADAR、海胆ADAR、海葵ADAR、本领域已知的任何其它ADAR、作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)和原核tRNA腺苷脱氨酶(TadA)。示例性RNA编辑酶和所述酶以之进行RNA编辑的力学描述于例如Nishikura(Annu.Rev.Biochem.79:2.1-2.29,2010)、Savva et al.(Genome Biol.13:252,2012)和Schoft et al.(Nuc.Acids Res.35(11):3723-3732,2007)，其每一个通过引用以其整体结合到本文中。在某些情况下，mRNA可通过程式化翻译绕行(核糖体通过其绕过mRNA序列的间隔)在转录后编辑(参见例如Lang et al.,PNAS 111(16):5926-5931,2014；通过引用结合到本文中)。例如，由本发明的载体编码的mRNA(例如编码第一多肽、第二多肽或嵌合多肽的mRNA)可包括一个或多个翻译绕行元件(byp)，例如，包括终止密码子上游的起飞密码子(takeoff codon)接着能够形成发夹的序列，以及配对着陆三联体(matching landing triplet)，例如约50个核苷酸下游。
细胞
本发明提供将第一多肽或其片段转化至第二多肽或其片段的方法和组合物。本发明的方法可在细胞中进行。例如，两种载体，编码第一多肽的一种和编码第二多肽的另一种，可在细胞(例如表达重组酶的细胞)中重组形成编码包括第一多肽或其片段和第二多肽或其片段的嵌合多肽的整合载体。本发明的组合物可包括细胞(例如包括本发明的第一载体和第二载体的一个或两个的细胞)。在某些情况下，细胞包括能够例如按照本发明的方法使第一载体和第二载体重组的重组酶。本发明的细胞可以是本领域已知的任何可操作的细胞，例如从本领域已知的实验室、商用或工业用细胞系传下来的细胞。细胞可以是古细菌细胞、细菌细胞、真菌细胞或真核细胞。细胞可以是酵母细胞、植物细胞或动物细胞。在某些情况下，细胞可以是大肠杆菌细胞、酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞或动物细胞。细胞可以是例如哺乳动物细胞例如人细胞。或者，细胞可以是例如昆虫细胞(例如果蝇细胞)。细胞可以是永生化细胞。或者，细胞可以是非永生化细胞。因为本发明的载体可包括能够驱动由载体编码的一种或多种蛋白质或多肽在一种、两种或更多种细胞类型的任一种中表达的多个启动子，所以本发明的载体能够按照启动子、剪接位点和其它表达决定序列的排列在一种或多种不同细胞类型的任一种中表达一种或多种蛋白质。要了解，在本发明的不同实施方案中，本发明的第一、第二和/或重组载体旨在两种或更多种细胞类型中表达一种或多种蛋白质或多肽。
为了使位点特异性重组在本发明的细胞内发生，细胞必须包括重组酶。在特定的重组反应中，根据存在于第一载体和/或第二载体中的特定的位点特异性重组位点，可能需要本发明的一种或多种重组酶。例如，第一重组酶可用于第一载体和第二载体之间的重组，而不同的重组酶可用来介导切离事件。重组酶对于细胞可能是内源的(即由该细胞的基因组天然编码)或可以是转基因的(即通过分子生物学导入)。细胞中表达的转基因重组酶可自载体(例如本发明的第一或第二载体或另一种载体)表达。
重组酶可以是本领域已知的任何重组酶。在某些情况下，重组酶可以是整合酶。在某些情况下，重组酶可以是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。丝氨酸和酪氨酸重组酶家族各自根据在重组期间与DNA相互作用的保守的亲核氨基酸命名。丝氨酸家族重组酶包括例如phiC31整合酶，它识别att位点；HIN转化酶，它识别hix位点；和Tn3解离酶。酪氨酸家族重组酶包括例如λ整合酶，它识别att位点；Cre，它识别lox位点；和FLP，它识别frt位点。其它重组酶是本领域已知的。对于本发明的目的，可选择能够促进存在于本发明的一个或多个载体的互补重组基序重组的重组酶。
本发明包括重组酶(例如重组酶和整合酶)的不同组合。在某些情况下，多种重组酶在相同细胞中在相同的时间和功能独立地表达。
体外转化
本发明提供将第一多肽或其片段转化至嵌合多肽的方法和组合物。本发明的转化方法可以体外进行(例如在细胞之外，例如在无细胞系统中)。在一个实例中，两种载体，编码第一多肽的一种和编码第二多肽的另一种可在溶液(例如包括本发明的第一载体、第二载体和重组酶的溶液)中重组形成编码包括第一多肽或其片段和第二多肽或其片段的嵌合多肽的整合载体。溶液可包括能够使重组酶成功地催化重组反应(例如本领域已知的)的其它因子、试剂和/或缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法的多个实例可采用本领域已知的多重系统平行地进行。例如，平行反应可在水包油乳滴、多孔板、多个管或包括多个区室的其它系统中运行。
本发明的组合物可包括本发明的第一载体和第二载体的一个或两个。在某些情况下，组合物包含例如能够按照本发明的方法使第一载体和第二载体重组的重组酶。在某些情况下，组合物可能不包括细胞，或可包括不含第一载体、第二载体和/或重组酶的细胞。在某些情况下，本发明的组合物可包括多个区室，各自含有第一载体、第二载体和/或重组酶，使得各区室的第一载体可按照本发明的方法与该区室的第二载体重组，从而导致多个转化反应平行地发生。
在一个实例中，提供含有第一载体、第二载体和重组酶的溶液。第一载体包括编码第一多肽和位点特异性重组位点(例如attP位点)的多核苷酸。例如，第一多肽可以是scFv，attP位点可位于编码scFv的接头区的多核苷酸内。第一载体可进一步包括一个或多个其它的多肽编码元件(例如编码CH或CL结构域的多核苷酸)。第二载体包括编码第二多肽和位点特异性重组位点(例如attB位点)的多核苷酸。例如，第二多肽可包括IgG的一部分(例如CL结构域)。attB位点可位于CL结构域的上游。重组酶(例如噬菌体λ整合酶或phiC31整合酶)能够使第一载体和第二载体的位点特异性重组位点重组。溶液可进一步包括例如辅助因子(例如Xis切除酶和整合宿主因子(IHF))、试剂(例如精脒和BSA)、缓冲剂和溶质(例如TrisHCl、NaCl和EDTA)。例如，溶液可包括25mM Tris Hcl pH 7.5、22mM NaCl、5mM EDTA、5mM精脒HCl和1mg/mL BSA(例如Hartley等人所述，同上)。第一载体和第二载体之间通过重组酶的重组导致编码包括与第二多肽的至少一部分融合的第一多肽的至少一部分的嵌合多肽(例如IgG包括scFv的可变结构域、第一载体的CH结构域和第二载体的CH结构域)的整合载体的形成。
用于实现转化的多肽编码序列和功能盒的排列
本发明的一个重要方面是第一多肽的组分和第二多肽的组分如此定位，使得第一和第二载体之间的重组导致例如不同于该第一结合部分的类型的功能嵌合多肽。本文提供的描述和实例有关用于构建能够以这类方式重组的各种不同的第一和第二载体的足够信息。虽不限制本发明的范围，但本文描述了多个第一和第二载体对作为示例性实例。
在一个实施方案中，由第一载体编码的第一多肽是自5′到3′包括免疫球蛋白轻链(VL)、接头和免疫球蛋白重链的可变区(VH)的scFv。第一载体包括能够指导scFv表达的启动子，例如双功能启动子或三功能启动子。重要的是，第一载体的scFv的接头是双功能的，能够翻译至位于VL和VH之间的氨基酸接头，并且还编码位点特异性重组基序。第一载体备选地包括3′并与编码scFv、CH盒和polyA盒的多核苷酸区段分开。编码CH和polyA的多核苷酸区段与编码scFv的多核苷酸区段由多个核苷酸分隔开。这些核苷酸侧接切离基序对(例如loxP位点)。该实施方案的第二载体包括与接头的位点特异性重组位点互补的位点特异性重组位点。第二载体编码位点特异性重组位点的5′、启动子，例如双功能或三功能启动子。它还编码位点特异性重组位点的3′、polyA盒和免疫球蛋白轻链恒定区盒。该实施方案中的两个重组事件介导scFv转化至免疫球蛋白。在一个事件中，切离基序对间的位点特异性重组基序间的重组(例如通过Cre重组酶)切离第一结合部分的scFv的VH和第一结合部分的CH间的多个多核苷酸。这个事件使VH、CH和polyA连在一起形成免疫球蛋白重链的大部分。在另一个事件中，其可发生在切离事件之前、之后或同时，存在于第一结合部分的接头上的位点特异性重组基序与第二载体的位点特异性重组基序重组。该事件将scFv的VH和VL分隔开，取而代之使VH与第二载体的启动子缔合，完成了可表达的免疫球蛋白重链构建体。此外，scFv的VL与第二载体的轻链恒定区和polyA缔合，完成了可表达的免疫球蛋白轻链构建体。
要了解，根据存在于所述载体上的位点特异性重组基序，所述重组事件可发生在任一种或多种特定的所需重组酶存在下。要认识到，许多(如果不是所有的话)各种各样的已知位点特异性重组基序和相关的酶适用于本发明的应用。另要认识到在本发明的这个或其它方法中，在重组后留下的任何或所有的重组基序或杂合基序可以是双功能的(氨基酸编码的)。
试剂盒
本文所述载体、文库、细胞(例如大肠杆菌菌株)、重组酶和/或其它材料可装配在试剂盒中。试剂盒可包括按照本发明的方法产生嵌合多肽的使用说明。
更具体地，本申请涉及以下一些实施方式：
实施方式1.一种将单链可变片段(scFv)转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括
(a)提供以从5’到3’的顺序包含以下的第一载体，
第一哺乳动物表达控制基序，
第一大肠杆菌表达控制基序，
编码scFv的重链可变区(VH)的序列，
第一位点特异性重组基序，
编码scFv的轻链可变区(VL)的序列，
5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
融合展示蛋白序列，
3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，和
编码轻链恒定区(CL)的序列，和
(b)提供以从5’到3’的顺序包含以下的第二载体，
第二哺乳动物表达控制基序，
第二位点特异性重组基序，和
编码多肽的序列；和
(c)在重组酶存在下使第一载体和第二载体接触，
其中所述重组酶使第一载体和第二载体以位点特异性方式组合形成整合载体，
其中所述整合载体表达与CL融合的VL和与所述多肽融合的单独VH，
从而在表达时将scFv转化至嵌合多肽。
实施方式2.实施方式1的方法，其中所述第一载体是噬菌粒载体。
实施方式3.实施方式1或2的方法，其中所述第二载体是噬菌粒载体。
实施方式4.实施方式1的方法，其中所述第一载体是噬菌粒载体，所述第二载体不是噬菌粒载体。
实施方式5.实施方式1-4中任一项的方法，其中所述第一载体另包含：
位于所述第一哺乳动物表达控制基序和所述第一大肠杆菌表达控制基序之间的第二5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，和
位于所述第一大肠杆菌表达控制基序和编码scFv的所述VH的所述序列之间的第二3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。
实施方式6.实施方式5的方法，其中所述第一载体另包含位于所述第二3’哺乳动物剪接位点和编码scFv的所述VH的所述序列之间的前导序列。
实施方式7.实施方式1-4中任一项的方法，其中所述第一载体另包含位于所述第一大肠杆菌表达控制基序和编码scFv的所述VH的所述序列之间的前导序列。
实施方式8.实施方式1-7中任一项的方法，其中所述第一载体另包含：
位于编码scFv的所述VH的所述序列和所述第一位点特异性重组基序之间的其它5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，和
位于所述第一位点特异性重组基序和编码scFv的所述VL的所述序列之间的其它3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。
实施方式9.实施方式1-8中任一项的方法，其中所述第二载体另包含：
位于所述第二哺乳动物表达控制基序和所述第二位点特异性重组基序之间的另外的5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，和
位于所述第二位点特异性重组基序和编码所述多肽的所述序列之间的另外的3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)。
实施方式10.实施方式1-9中任一项的方法，其中所述多肽包含重链恒定区。
实施方式11.实施方式1-10中任一项的方法，其中所述整合载体表达IgG抗体。
实施方式12.实施方式1-10中任一项的方法，其中所述多肽包含融合蛋白。
实施方式13.实施方式12的方法，其中所述融合蛋白包含标签。
实施方式14.实施方式13的方法，其中所述标签是FLAG、HA、Myc、V5、His、GST、MBP、AviTag或链霉抗生物素标签。
实施方式15.实施方式12-14中任一项的方法，其中所述融合蛋白包含荧光蛋白。
实施方式16.实施方式1-15中任一项的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供包含编码所述重组酶的多核苷酸的其它载体。
实施方式17.一种将第一多肽转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，其中所述第一多核苷酸的第一多肽编码区包含第一位点特异性重组基序；
ii.包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下的嵌合多肽的重组载体：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
实施方式18.实施方式17的方法，其中所述第一多肽包含接头，编码所述接头的所述多核苷酸的部分包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式19.实施方式17或18的方法，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸。
实施方式20.实施方式17或18的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供包含编码所述重组酶的多核苷酸的其它载体。
实施方式21.一种将第一多肽转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸含有包含第一位点特异性重组基序的内含子；
ii.包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下的嵌合多肽的重组载体：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
实施方式22.实施方式21的方法，其中编码所述第一多肽的所述第一多核苷酸的部分包含所述内含子。
实施方式23.实施方式21的方法，其中编码所述第一多肽的所述第一多核苷酸的部分不含所述内含子。
实施方式24.实施方式21-23中任一项的方法，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸。
实施方式25.实施方式21-24中任一项的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供包含编码所述重组酶的多核苷酸的其它载体。
实施方式26.一种将第一多肽转化至至少两种嵌合多肽之一的方法，所述方法包括：
(a)提供第一载体，其包含编码包含第一位点特异性重组基序和备选位点特异性重组基序的第一多肽的第一多核苷酸，和
i.第二载体，其包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；或
ii.第三载体，其包含不同于所述第一位点特异性重组基序的第三位点特异性重组基序和编码备选多肽的备选多核苷酸；和能够使所述备选位点特异性重组基序与所述第三位点特异性重组基序重组的备选重组酶；和
(b)使所述第一载体
i.与所述第二载体用所述重组酶进行重组，从而形成编码包含所述第一多肽或其部分和所述第二多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体；和/或
ii.与所述第三载体用所述备选重组酶进行重组，从而形成编码包含所述第一多肽或其部分和所述备选多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体。
实施方式27.实施方式26的方法，其中所述第一多核苷酸包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式28.实施方式26或27的方法，其中所述第一多核苷酸含有包含所述第一位点特异性重组基序的内含子。
实施方式29.实施方式26-28中任一项的方法，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸，和/或所述第一载体或所述第三载体包含编码所述备选重组酶的多核苷酸。
实施方式30.一种将scFv转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.第一载体，其包含编码包含scFv的第一多肽的第一多核苷酸，所述scFv包含轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，编码所述接头区的所述第一多核苷酸的部分包含第一位点特异性重组基序；
ii.包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.重组酶，其能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组，和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下的嵌合多肽的重组载体：
i.所述轻链可变结构域和/或所述重链可变结构域，和
ii.所述第二多肽或其部分；
其中所述嵌合多肽不是scFv。
实施方式31.实施方式17-30中任一项的方法，其中所述第一多肽包含抗体或抗体片段。
实施方式32.实施方式31的方法，其中所述抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。
实施方式33.实施方式31或32的方法，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。
实施方式34.实施方式33的方法，其中所述抗体是IgG。
实施方式35.实施方式31或32的方法，其中所述抗体片段是scFv、单域抗体(sdAb)、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。
实施方式36.实施方式35的方法，其中所述抗体片段是scFv。
实施方式37.实施方式36的方法，其中所述scFv是细胞溶胶稳定的scFv。
实施方式38.实施方式36或37的方法，其中所述scFv是牛scFv。
实施方式39.实施方式35的方法，其中所述sdAb是骆驼VHH。
实施方式40.实施方式36-38中任一项的方法，其中所述scFv包含位于所述scFv的轻链可变结构域和重链可变结构域之间的接头，所述接头包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式41.实施方式36-40中任一项的方法，其中所述嵌合多肽包含所述scFv的轻链可变结构域和/或所述scFv的重链可变结构域。
实施方式42.实施方式17-41中任一项的方法，其中所述第一多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式43.实施方式42的方法，其中所述第一多肽包含CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式44.实施方式43的方法，其中所述嵌合多肽包含所述第一多肽的所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式45.实施方式44的方法，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述第一多肽的所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域，和(ii)所述第一多肽或所述其部分。
实施方式46.实施方式45的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式47.实施方式46的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式48.实施方式47的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式49.实施方式47的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸。
实施方式50.实施方式17-49中任一项的方法，其中所述嵌合多肽包含抗体或抗体片段。
实施方式51.实施方式50的方法，其中所述抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。
实施方式52.实施方式50的方法，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。
实施方式53.实施方式52的方法，其中所述抗体是IgG。
实施方式54.实施方式53的方法，其中所述第一多肽包含所述IgG的可变轻链和/或可变重链。
实施方式55.实施方式53或54的方法，其中所述第一载体包含编码所述IgG的恒定结构域的多核苷酸。
实施方式56.实施方式55的方法，其中所述恒定结构域包含CL结构域或Fc结构域。
实施方式57.实施方式56的方法，其中所述恒定结构域含有包含所述Fc结构域的CH结构域。
实施方式58.实施方式50的方法，其中所述抗体片段是scFv、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、VHH或SMIP。
实施方式59.实施方式58的方法，其中所述抗体片段是scFv。
实施方式60.实施方式59的方法，其中所述scFv是细胞溶胶稳定的scFv。
实施方式61.实施方式59或60的方法，其中所述scFv是牛或骆驼scFv。
实施方式62.实施方式17-61中任一项的方法，其中所述嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式63.实施方式62的方法，其中所述第二多肽包含CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式64.实施方式63的方法，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的轻链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式65.实施方式64的方法，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述轻链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式66.实施方式65的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式67.实施方式66的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式68.实施方式67的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式69.实施方式67的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-10、10-20、20-50或50-100个氨基酸。
实施方式70.实施方式63的方法，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的重链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式71.实施方式70的方法，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述重链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式72.实施方式71的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式73.实施方式72的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式74.实施方式73的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式75.实施方式63的方法，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式76.实施方式75的方法，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式77.实施方式76的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式78.实施方式77的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式79.实施方式78的方法，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式80.实施方式17-79中任一项的方法，其中所述嵌合多肽包含泛素连接酶结构域。
实施方式81.实施方式80的方法，其中所述第二多肽包含所述泛素连接酶结构域。
实施方式82.实施方式80或81的方法，其中所述泛素连接酶结构域包含CHIPΔTPR结构域。
实施方式83.实施方式17-82中任一项的方法，其中所述嵌合多肽包含knocksideways捕食结构域。
实施方式84.实施方式83的方法，其中所述第二多肽包含所述knocksideways捕食结构域。
实施方式85.实施方式83或84的方法，其中所述knocksideways捕食结构域包含FKBP结构域。
实施方式86.实施方式83-85中任一项的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供knocksideways诱饵蛋白。
实施方式87.实施方式86的方法，其中所述knocksideways诱饵蛋白包含FRB结构域。
实施方式88.实施方式86或87的方法，其中所述knocksideways诱饵蛋白包含线粒体外膜引导信号。
实施方式89.实施方式87或88的方法，其中所述knocksideways诱饵蛋白是Mitotrap蛋白。
实施方式90.实施方式83-89中任一项的方法，其中所述嵌合多肽另包含泛素连接酶结构域。
实施方式91.实施方式90的方法，其中所述第二多肽包含所述泛素连接酶结构域。
实施方式92.实施方式90或91的方法，其中所述泛素连接酶结构域包含CHIPΔTPR结构域。
实施方式93.实施方式17-92中任一项的方法，其中所述重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。
实施方式94.实施方式93的方法，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。
实施方式95.实施方式94的方法，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31。
实施方式96.实施方式95的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供辅助因子。
实施方式97.实施方式96的方法，其中所述辅助因子包含Xis。
实施方式98.实施方式93的方法，其中所述酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。
实施方式99.实施方式17-98中任一项的方法，其中所述重组步骤发生在细胞中，任选其中所述细胞包含在乳滴中。
实施方式100.实施方式99的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供所述细胞，所述细胞包含所述载体和所述重组酶。
实施方式101.实施方式99或100的方法，其中所述第一载体是质粒或噬菌粒。
实施方式102.实施方式101的方法，其中所述第一载体包含编码展示蛋白的多核苷酸。
实施方式103.实施方式102的方法，其中所述展示蛋白能够在细胞的胞外表面展示所述第一多肽或其部分。
实施方式104.实施方式103的方法，其中所述展示蛋白包含ompA或bclA。
实施方式105.实施方式99-104中任一项的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
实施方式106.实施方式105的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
实施方式107.实施方式99-106中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
实施方式108.实施方式107的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
实施方式109.实施方式99-108中任一项的方法，其中所述细胞另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的载体。
实施方式110.实施方式99-109中任一项的方法，其中所述细胞另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的染色体。
实施方式111.实施方式17-110中任一项的方法，其中所述重组步骤发生在无细胞系统中。
实施方式112.实施方式111的方法，其中所述无细胞系统是包含所述载体和所述重组酶的溶液。
实施方式113.实施方式111或112的方法，其中所述重组酶是噬菌体λ整合酶。
实施方式114.实施方式111-113中任一项的方法，其中所述无细胞系统包含在乳滴中。
实施方式115.实施方式17-114中任一项的方法，其中所述第一载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件。
实施方式116.实施方式115的方法，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达。
实施方式117.实施方式116的方法，其中当在所述第一细胞类型中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合。
实施方式118.实施方式117的方法，其中所述蛋白质片段包含病毒外被蛋白。
实施方式119.实施方式118的方法，其中所述病毒外被蛋白是M13 gpIII。
实施方式120.实施方式117-119中任一项的方法，其中所述蛋白质片段另包含细菌信号肽。
实施方式121.实施方式17-120中任一项的方法，其中所述重组载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件。
实施方式122.实施方式121的方法，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述嵌合多肽的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述嵌合多肽的表达。
实施方式123.实施方式115-122中任一项的方法，其中所述第一细胞类型是细菌细胞，所述第二细胞类型是真核细胞。
实施方式124.实施方式123的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
实施方式125.实施方式123或124的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
实施方式126.实施方式125的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
实施方式127.实施方式125的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
实施方式128.实施方式17-127中任一项的方法，其中所述第一多核苷酸含有包含内含子调节元件的内含子。
实施方式129.实施方式128的方法，其中所述内含子调节元件在原核细胞中控制所述第一多肽或其部分的表达。
实施方式130.实施方式129的方法，其中所述原核细胞是细菌细胞。
实施方式131.实施方式130的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
实施方式132.实施方式129-131中任一项的方法，其中当在所述原核细胞中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合。
实施方式133.实施方式132的方法，其中所述蛋白质片段包含病毒外被蛋白。
实施方式134.实施方式133的方法，其中所述病毒外被蛋白是M13 gpIII。
实施方式135.实施方式132-134中任一项的方法，其中所述蛋白质片段另包含细菌信号肽。
实施方式136.实施方式132-135中任一项的方法，其中所述内含子另包含编码所述蛋白质片段的多核苷酸。
实施方式137.实施方式136的方法，其中所述内含子调节元件控制所述蛋白质片段的表达。
实施方式138.实施方式128-137中任一项的方法，其中所述内含子调节元件在真核细胞中通过RNA剪接从所述第一多核苷酸的转录物中除去。
实施方式139.实施方式138的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
实施方式140.实施方式17-139中任一项的方法，其中所述第一载体另包含一对互补位点特异性重组基序。
实施方式141.实施方式140的方法，其中所述第一多核苷酸、其片段和/或所述第一位点特异性重组基序位于所述互补位点特异性重组基序对之间。
实施方式142.实施方式17-141中任一项的方法，其中所述第二载体另包含一对互补位点特异性重组基序。
实施方式143.实施方式140的方法，其中所述第二多核苷酸、其片段和/或所述第二位点特异性重组基序位于所述互补位点特异性重组基序对之间。
实施方式144.实施方式140-143中任一项的方法，其中使所述互补位点特异性重组基序对定位使得所述互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的倒位。
实施方式145.实施方式140-143中任一项的方法，其中使所述互补位点特异性重组基序对定位使得所述互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的缺失。
实施方式146.实施方式140-145中任一项的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供能够使所述互补位点特异性重组基序对重组的重组酶。
实施方式147.实施方式146的方法，所述方法进一步包括使所述互补位点特异性重组基序对重组的步骤。
实施方式148.实施方式140-147中任一项的方法，其中所述互补位点特异性重组基序对包含一对loxP位点。
实施方式149.实施方式148的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供Cre重组酶。
实施方式150.实施方式140-147中任一项的方法，其中所述互补位点特异性重组基序对包含一对FRT位点。
实施方式151.实施方式150的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供Flp重组酶。
实施方式152.实施方式140-147中任一项的方法，其中所述互补位点特异性重组基序对包含attB位点和attP位点。
实施方式153.实施方式152的方法，其中所述提供步骤进一步包括提供适于使所述互补位点特异性重组基序对的所述attB位点和所述attP位点重组的phiC31或BxB1重组酶。
实施方式154.实施方式17-153中任一项的方法，其中所述第一载体是病毒载体。
实施方式155.实施方式154的方法，其中所述第一载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。
实施方式156.实施方式17-155中任一项的方法，其中所述第二载体是病毒载体。
实施方式157.实施方式156的方法，其中所述第二载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。
实施方式158.实施方式154-157中任一项的方法，其中一个或多个病毒元件位于内含子之内。
实施方式159.实施方式17-158中任一项的方法，其中所述第一载体是噬菌粒载体。
实施方式160.实施方式17-159中任一项的方法，其中所述第二载体是噬菌粒载体。
实施方式161.实施方式17-160中任一项的方法，其中：
所述第一载体另包含第一重组基序片段，所述第二载体包含第二重组基序片段，和
所述重组载体含有包含所述第一重组基序片段和所述第二重组基序片段的隐蔽位点特异性重组基序，
所述方法进一步包括：
(c)用能够使所述隐蔽位点特异性重组基序与所述另外的位点特异性重组基序重组的另外的重组酶，使所述重组载体和包含以下的另外的载体重组
(i)另外的位点特异性重组基序，和
(ii)编码另外的多肽的多核苷酸；
从而形成编码包含以下的第二嵌合多肽的第二重组载体：
(i)所述嵌合多肽或其部分，和
(ii)所述另外的多肽或其部分。
实施方式162.实施方式161的方法，其中所述第一位点特异性重组基序和所述隐蔽位点特异性重组基序是相同的。
实施方式163.实施方式161的方法，其中所述第一位点特异性重组基序和所述隐蔽位点特异性重组基序是不同的。
实施方式164.实施方式161-163中任一项的方法，其中所述另外的重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。
实施方式165.实施方式164的方法，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。
实施方式166.实施方式165的方法，其中所述丝氨酸家族重组酶是BxB1。
实施方式167.实施方式164的方法，其中所述酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。
实施方式168.实施方式161-167中任一项的方法，其中所述第二嵌合多肽包含抗体或抗体片段。
实施方式169.实施方式168的方法，其中所述抗体是IgG。
实施方式170.实施方式161-169中任一项的方法，其中所述第二嵌合多肽包含CAR。
实施方式171.实施方式170的方法，其中所述另外的多肽包含CD3-ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、CD28胞质域、41BB胞质域、ICOS胞质域、FcεRIγ胞质域、流感MP-1胞质域、VZV胞质域和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。
实施方式172.实施方式161-171中任一项的方法，其中所述另外的多肽包含泛素连接酶结构域。
实施方式173.实施方式161-172中任一项的方法，其中所述另外的多肽包含knocksideways捕食结构域。
实施方式174.实施方式173的方法，其中所述另外的多肽包含泛素连接酶结构域和knocksideways捕食结构域。
实施方式175.实施方式17-174中任一项的方法，其中编码所述第一多肽、所述第二多肽和/或所述嵌合多肽的mRNA转录物能够通过ADAR酶编辑。
实施方式176.实施方式175的方法，其中所述编辑包括激活所述mRNA转录物中的隐蔽剪接位点以从所述转录物中除去外显子。
实施方式177.实施方式175或176的方法，其中所述编辑包括除去所述mRNA转录物中的剪接位点。
实施方式178.实施方式175-177中任一项的方法，其中所述mRNA转录物包含第一区和能够与所述第一区杂交形成双链体的第二区。
实施方式179.实施方式178的方法，其中所述第一区与所述第二区互补，所述双链体的长度为至少100bp。
实施方式180.实施方式178的方法，其中所述双链体的长度不超过30bp并包含编辑位点互补序列。
实施方式181.实施方式178的方法，其中所述双链体的长度大于30bp并包含一个或多个错配碱基、凸出或环。
实施方式182.实施方式178-181中任一项的方法，其中所述第一载体或所述第二载体另包含编码ADAR酶的多核苷酸。
实施方式183.实施方式17-182中任一项的方法，其中编码所述第一多肽、所述第二多肽和/或所述嵌合多肽的mRNA转录物包含一个或多个翻译绕行元件(byp)。
实施方式184.一种组合物，其包含：
(a)包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，其中所述第一多核苷酸的第一多肽编码区包含第一位点特异性重组基序；
(b)包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中所述重组导致编码包含以下的嵌合多肽的重组载体的形成：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
实施方式185.实施方式184的组合物，其中所述第一多肽包含接头，编码所述接头的所述多核苷酸的部分包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式186.实施方式184或185的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸。
实施方式187.实施方式184或185的组合物，其另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的其它载体。
实施方式188.一种组合物，其包含：
(a)包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸含有包含第一位点特异性重组基序的内含子；
(b)包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中所述重组导致编码包含以下的嵌合多肽的重组载体的形成：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
实施方式189.实施方式188的组合物，其中编码所述第一多肽的所述第一多核苷酸的部分包含所述内含子。
实施方式190.实施方式188的组合物，其中编码所述第一多肽的所述第一多核苷酸的部分不含所述内含子。
实施方式191.实施方式188-190中任一项的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸。
实施方式192.实施方式188-191中任一项的组合物，其另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的其它载体。
实施方式193.一种组合物，其包含：
(a)第一载体，其包含编码包含第一位点特异性重组基序和备选位点特异性重组基序的第一多肽的第一多核苷酸，和
(b)(i)第二载体，其包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶，或
(ii)第三载体，其包含不同于所述第一位点特异性重组基序的第三位点特异性重组基序和编码备选多肽的备选多核苷酸；和能够使所述备选位点特异性重组基序与所述第三位点特异性重组基序重组的备选重组酶；
其中所述第一载体和所述第二载体通过所述重组酶的所述重组导致编码包含所述第一多肽或其部分和所述第二多肽的嵌合多肽的重组载体的形成；和
其中所述第一载体和所述第三载体通过所述备选重组酶的所述重组导致编码包含所述第一多肽或其部分和所述备选多肽的嵌合多肽的重组载体的形成。
实施方式194.实施方式193的组合物，其中所述第一多核苷酸包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式195.实施方式193或194的组合物，其中所述第一多核苷酸含有包含所述第一位点特异性重组基序的内含子。
实施方式196.实施方式193-195中任一项的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体包含编码所述重组酶的多核苷酸，和/或所述第一载体或所述第三载体包含编码所述备选重组酶的多核苷酸。
实施方式197.一种组合物，其包含：
(a)包含编码scFv的第一多核苷酸的第一载体，所述scFv包含轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，编码所述接头区的所述第一多核苷酸的部分包含第一位点特异性重组基序；
(b)包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
(c)能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；
其中所述第一载体与所述第二载体通过所述重组酶的重组形成编码包含以下的嵌合结合部分的重组载体：
i.所述轻链可变结构域和/或所述重链可变结构域，和
ii.所述第二多肽或其部分。
实施方式198.实施方式184-197中任一项的组合物，其中所述第一多肽包含抗体或抗体片段。
实施方式199.实施方式198的组合物，其中所述抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。
实施方式200.实施方式198或199的组合物，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。
实施方式201.实施方式200的组合物，其中所述抗体是IgG。
实施方式202.实施方式198或199的组合物，其中所述抗体片段是scFv、单域抗体(sdAb)、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。
实施方式203.实施方式202的组合物，其中所述抗体片段是scFv。
实施方式204.实施方式202的组合物，其中所述scFv是细胞溶胶稳定的scFv。
实施方式205.实施方式202或204的组合物，其中所述scFv是牛或骆驼scFv。
实施方式206.实施方式202的组合物，其中所述sdAb是骆驼VHH。
实施方式207.实施方式203-205中任一项的组合物，其中所述scFv包含位于所述scFv的轻链可变结构域和重链可变结构域之间的接头，所述接头包含所述第一位点特异性重组基序。
实施方式208.实施方式203-207中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽包含所述scFv的轻链可变结构域和/或所述scFv的重链可变结构域。
实施方式209.实施方式184-208中任一项的组合物，其中所述第一多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式210.实施方式209的组合物，其中所述第一多肽包含CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式211.实施方式210的组合物，其中所述嵌合多肽包含所述第一多肽的所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式212.实施方式211的组合物，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述第一多肽的所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域，和(ii)所述第一多肽或所述其部分。
实施方式213.实施方式212的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式214.实施方式213的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式215.实施方式214的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式216.实施方式184-215中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽是抗体或抗体片段。
实施方式217.实施方式216的组合物，其中所述抗体或抗体片段是人、小鼠、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。
实施方式218.实施方式216的组合物，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或胞内抗体。
实施方式219.实施方式218的组合物，其中所述抗体是IgG。
实施方式220.实施方式219的组合物，其中所述第一多肽包含所述IgG的可变轻链和/或可变重链。
实施方式221.实施方式219或220的组合物，其中所述第一载体包含编码所述IgG的恒定结构域的多核苷酸。
实施方式222.实施方式221的组合物，其中所述恒定结构域包含CL结构域或Fc结构域。
实施方式223.实施方式222的组合物，其中所述恒定结构域含有包含所述Fc结构域的CH结构域。
实施方式224.实施方式216的组合物，其中所述抗体片段是scFv、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、VHH或SMIP。
实施方式225.实施方式224的组合物，其中所述抗体片段是scFv。
实施方式226.实施方式225的组合物，其中所述scFv是细胞溶胶稳定的scFv。
实施方式227.实施方式225或226的组合物，其中所述scFv是牛或骆驼scFv。
实施方式228.实施方式184-227中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式229.实施方式228的组合物，其中所述第二多肽包含CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式230.实施方式229的组合物，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的轻链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式231.实施方式230的组合物，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述轻链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式232.实施方式231的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式233.实施方式232的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式234.实施方式233的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式235.实施方式229的组合物，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的重链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式236.实施方式235的组合物，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述重链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式237.实施方式236的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式238.实施方式237的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式239.实施方式238的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式240.实施方式229的组合物，其中所述第一多肽包含scFv，所述嵌合多肽包含所述scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域和所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式241.实施方式240的组合物，其中所述嵌合多肽另包含位于以下之间的肽接头结构域：(i)所述scFv的所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域，和(ii)所述CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、4-1BB胞质域和/或CD28胞质域。
实施方式242.实施方式241的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约0-250个氨基酸。
实施方式243.实施方式242的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-250个氨基酸。
实施方式244.实施方式243的组合物，其中所述肽接头结构域的长度为约1-50个氨基酸。
实施方式245.实施方式184-244中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽包含泛素连接酶结构域。
实施方式246.实施方式245的组合物，其中所述第二多肽包含所述泛素连接酶结构域。
实施方式247.实施方式245或246的组合物，其中所述泛素连接酶结构域包含CHIPΔTPR结构域。
实施方式248.实施方式184-247中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽包含knocksideways捕食结构域。
实施方式249.实施方式248的组合物，其中所述第二多肽包含所述knocksideways捕食结构域。
实施方式250.实施方式248或249的组合物，其中所述knocksideways捕食结构域包含FKBP结构域。
实施方式251.实施方式248-250中任一项的组合物，其中所述组合物另包含knocksideways诱饵蛋白。
实施方式252.实施方式251的组合物，其中所述knocksideways诱饵蛋白包含FRB结构域。
实施方式253.实施方式251或252的组合物，其中所述knocksideways诱饵蛋白包含线粒体外膜引导信号。
实施方式254.实施方式252或253的组合物，其中所述knocksideways诱饵蛋白是Mitotrap蛋白。
实施方式255.实施方式248-254中任一项的组合物，其中所述嵌合多肽另包含泛素连接酶结构域。
实施方式256.实施方式255的组合物，其中所述第二多肽包含所述泛素连接酶结构域。
实施方式257.实施方式255或256的组合物，其中所述泛素连接酶结构域包含CHIPΔTPR结构域。
实施方式258.实施方式184-257中任一项的组合物，其中所述重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。
实施方式259.实施方式258的组合物，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。
实施方式260.实施方式259的组合物，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31。
实施方式261.实施方式260的组合物，其另包含辅助因子。
实施方式262.实施方式261的组合物，其中所述辅助因子包含Xis。
实施方式263.实施方式258的组合物，其中所述酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。
实施方式264.实施方式184-263中任一项的组合物，其中所述组合物另含有包含所述载体和所述重组酶的细胞，任选其中所述细胞包含在乳滴中。
实施方式265.实施方式264的组合物，其中所述第一载体是质粒或噬菌粒。
实施方式266.实施方式265的组合物，其中所述第一载体包含编码展示蛋白的多核苷酸。
实施方式267.实施方式266的组合物，其中所述展示蛋白能够在细胞的胞外表面展示所述第一多肽或其部分。
实施方式268.实施方式267的组合物，其中所述展示蛋白包含ompA或bclA。
实施方式269.实施方式264-267中任一项的组合物，其中所述细胞是细菌细胞。
实施方式270.实施方式269的组合物，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
实施方式271.实施方式264-267中任一项的组合物，其中所述细胞是真核细胞。
实施方式272.实施方式271的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
实施方式273.实施方式264-272中任一项的组合物，其中所述细胞另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的载体。
实施方式274.实施方式264-273中任一项的组合物，其中所述细胞另含有包含编码所述重组酶的多核苷酸的染色体。
实施方式275.实施方式184-274中任一项的组合物，其中所述载体和所述重组酶位于无细胞系统内。
实施方式276.实施方式275的组合物，其中所述重组酶是噬菌体λ整合酶。
实施方式277.实施方式275或276的组合物，其中所述无细胞系统包含在乳滴中。
实施方式278.实施方式184-277中任一项的组合物，其中所述第一载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件。
实施方式279.实施方式278的组合物，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达。
实施方式280.实施方式279的组合物，其中当在所述第一细胞类型中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合。
实施方式281.实施方式280的组合物，其中所述蛋白质片段包含病毒外被蛋白。
实施方式282.实施方式281的组合物，其中所述病毒外被蛋白是M13 gpIII。
实施方式283.实施方式280-282中任一项的组合物，其中所述蛋白质片段另包含细菌信号肽。
实施方式284.实施方式184-283中任一项的组合物，其中所述重组载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件。
实施方式285.实施方式284的组合物，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述嵌合多肽的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述嵌合多肽的表达。
实施方式286.实施方式278-285中任一项的组合物，其中所述第一细胞类型是细菌细胞，所述第二细胞类型是真核细胞。
实施方式287.实施方式286的组合物，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
实施方式288.实施方式286或287的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
实施方式289.实施方式288的组合物，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
实施方式290.实施方式288的组合物，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
实施方式291.实施方式184-290中任一项的组合物，其中所述第一多核苷酸含有包含内含子调节元件的内含子。
实施方式292.实施方式291的组合物，其中所述内含子调节元件在原核细胞中控制所述第一多肽或其部分的表达。
实施方式293.实施方式292的组合物，其中所述原核细胞是细菌细胞。
实施方式294.实施方式293的组合物，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
实施方式295.实施方式292-294中任一项的组合物，其中当在所述原核细胞中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合。
实施方式296.实施方式295的组合物，其中所述蛋白质片段包含病毒外被蛋白。
实施方式297.实施方式296的组合物，其中所述病毒外被蛋白是M13 gpIII。
实施方式298.实施方式295-297中任一项的组合物，其中所述蛋白质片段另包含细菌信号肽。
实施方式299.实施方式295-298中任一项的组合物，其中所述内含子另包含编码所述蛋白质片段的多核苷酸。
实施方式300.实施方式299的组合物，其中所述内含子调节元件控制所述蛋白质片段的表达。
实施方式301.实施方式291-300中任一项的组合物，其中所述内含子调节元件在真核细胞中通过RNA剪接从所述第一多核苷酸的转录物中除去。
实施方式302.实施方式301的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
实施方式303.实施方式184-302中任一项的组合物，其中所述第一载体另包含一对互补位点特异性重组基序。
实施方式304.实施方式303的组合物，其中所述第一多核苷酸、其片段和/或所述第一位点特异性重组基序位于所述互补位点特异性重组基序对之间。
实施方式305.实施方式184-304中任一项的组合物，其中所述第二载体另包含一对互补位点特异性重组基序。
实施方式306.实施方式303的组合物，其中所述第二多核苷酸、其片段和/或所述第二位点特异性重组基序位于所述互补位点特异性重组基序对之间。
实施方式307.实施方式303-306中任一项的方法，其中使所述互补位点特异性重组基序对定位使得所述互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的倒位。
实施方式308.实施方式303-306中任一项的方法，其中使所述互补位点特异性重组基序对定位使得所述互补位点特异性重组基序对的重组导致间插序列的缺失。
实施方式309.实施方式303-308中任一项的组合物，其另包含能够使所述互补位点特异性重组基序对重组的重组酶。
实施方式310.实施方式303-309中任一项的组合物，其中所述互补位点特异性重组基序对包含一对loxP位点。
实施方式311.实施方式310的组合物，其另包含Cre重组酶。
实施方式312.实施方式303-309中任一项的组合物，其中所述互补位点特异性重组基序对包含一对FRT位点。
实施方式313.实施方式312的组合物，其另包含Flp重组酶。
实施方式314.实施方式303-309中任一项的组合物，其中所述互补位点特异性重组基序对包含attB位点和attP位点。
实施方式315.实施方式314的组合物，其另包含适于使所述互补位点特异性重组基序对的所述attB位点和所述attP位点重组的phiC31或BxB1重组酶。
实施方式316.实施方式184-315中任一项的组合物，其中所述第一载体是病毒载体。
实施方式317.实施方式316的组合物，其中所述第一载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。
实施方式318.实施方式184-317中任一项的组合物，其中所述第二载体是病毒载体。
实施方式319.实施方式318的组合物，其中所述第二载体是腺病毒、慢病毒或杆状病毒载体。
实施方式320.实施方式316-319中任一项的组合物，其中一个或多个病毒元件位于内含子之内。
实施方式321.实施方式184-320中任一项的组合物，其中所述第一载体是噬菌粒载体。
实施方式322.实施方式184-321中任一项的组合物，其中所述第二载体是噬菌粒载体。
实施方式323.实施方式184-322中任一项的组合物，其中：
所述第一载体另包含第一重组基序片段，所述第二载体包含第二重组基序片段，和
所述重组载体含有包含所述第一重组基序片段和所述第二重组基序片段的隐蔽位点特异性重组基序，
其中用能够使所述隐蔽位点特异性重组基序与所述另外的位点特异性重组基序重组的另外的重组酶，使所述重组载体和包含以下的另外的载体重组
(i)另外的位点特异性重组基序，和
(ii)编码另外的多肽的多核苷酸；
导致编码包含以下的第二嵌合多肽的第二重组载体的形成：
(i)所述嵌合多肽或其部分，和
(ii)所述另外的多肽或其部分。
实施方式324.实施方式323的组合物，其中所述第一位点特异性重组基序和所述隐蔽位点特异性重组基序是相同的。
实施方式325.实施方式323的组合物，其中所述第一位点特异性重组基序和所述隐蔽位点特异性重组基序是不同的。
实施方式326.实施方式323-325中任一项的组合物，其中所述另外的重组酶是丝氨酸家族重组酶或酪氨酸家族重组酶。
实施方式327.实施方式326的组合物，其中所述丝氨酸家族重组酶是phiC31、BxB1、HIN转化酶或TN3解离酶。
实施方式328.实施方式327的组合物，其中所述丝氨酸家族重组酶是BxB1。
实施方式329.实施方式326的组合物，其中所述酪氨酸家族重组酶是噬菌体λ整合酶、Cre或Flp。
实施方式330.实施方式323-329中任一项的组合物，其中所述第二嵌合多肽包含抗体或抗体片段。
实施方式331.实施方式330的组合物，其中所述抗体是IgG。
实施方式332.实施方式323-331中任一项的组合物，其中所述第二嵌合多肽包含CAR。
实施方式333.实施方式332的组合物，其中所述另外的多肽包含CD3-ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞质域、CD28胞质域、41BB胞质域、ICOS胞质域、FcεRIγ胞质域、流感MP-1胞质域、VZV胞质域和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。
实施方式334.实施方式323-333中任一项的组合物，其中所述另外的多肽包含泛素连接酶结构域。
实施方式335.实施方式323-334中任一项的组合物，其中所述另外的多肽包含knocksideways捕食结构域。
实施方式336.实施方式335的组合物，其中所述另外的多肽包含泛素连接酶结构域和knocksideways捕食结构域。
实施方式337.实施方式184-336中任一项的组合物，其另包含编码所述第一多肽、所述第二多肽和/或所述嵌合多肽的mRNA转录物，其中所述mRNA转录物能够通过ADAR酶编辑。
实施方式338.实施方式337的组合物，其中所述编辑包括激活所述mRNA转录物中的隐蔽剪接位点以从所述转录物中除去外显子。
实施方式339.实施方式337或338的组合物，其中所述编辑包括除去所述mRNA转录物中的剪接位点。
实施方式340.实施方式337-339中任一项的组合物，其中所述mRNA转录物包含第一区和能够与所述第一区杂交形成双链体的第二区。
实施方式341.实施方式340的组合物，其中所述第一区与所述第二区互补，所述双链体的长度为至少100bp。
实施方式342.实施方式340的组合物，其中所述双链体的长度不超过30bp并包含编辑位点互补序列。
实施方式343.实施方式340的组合物，其中所述双链体的长度大于30bp并包含一个或多个错配碱基、凸出或环。
实施方式344.实施方式337-343中任一项的组合物，其中所述第一载体或所述第二载体另包含编码ADAR酶的多核苷酸。
实施方式345.实施方式184-344中任一项的组合物，其另包含编码所述第一多肽、所述第二多肽和/或所述嵌合多肽的mRNA转录物，其中所述mRNA转录物包含一个或多个翻译绕行元件(byp)。
实施方式346.一种试剂盒，其包含实施方式184-345中任一项的组合物和按照实施方式17-183中任一项的方法产生嵌合多肽的使用说明。
实施例
以下示例性方法将不限制上文其它部分描述的本发明的范围。以下示例性方法说明一组本发明的方法。
实施例1：scFv结合部分转化至IgG结合部分
可通过生物淘选技术(例如噬菌体展示)鉴定能够结合一种或多种特定抗原的结合部分。通过这类技术鉴定的许多结合部分是单链结合部分，例如scFv。然而，例如出于有关稳定性、商业偏好、研究偏好、与现有技术或开发中的技术整合或组合的潜力和例如因亲合力作用所致抗原结合增加的原因，IgG分子对于某些应用将是合乎需要的。可通过涉及亚克隆的方法使单链抗体转化至IgG型抗体。这可牵涉相当的时间和费用。该实施例描述了scFv，例如通过展示生物淘选鉴定为对特定抗原具有高亲和力的scFv转化至IgG分子。所述方法利用在大肠杆菌中第一载体和第二载体之间的重组。更具体的说，scFv由第一载体编码，并通过该第一载体和包括IgG构架的第二载体间的重组转化至IgG。该重组的重组产物能够表达IgG轻链和IgG重链(合起来为IgG分子)，各包括源自scFv的抗原决定区。重要的是，这个IgG分子不由第一载体、第二载体或配成对时的第一和第二载体编码。重组产物能够在哺乳动物细胞中表达IgG分子，例如用于生产目的。
如图4中的概述，第一载体(图4A的载体1)是包括与GpIII融合的scFv结合部分(合起来为scFv融合蛋白)的噬菌粒供体载体。该第一载体是在针对编码能够结合特定抗原的scFv的噬菌粒的噬菌体展示生物淘选程序中鉴定的载体。方框内所示scFv结合部分的组分包括免疫球蛋白轻链的可变区(VL)、接头和免疫球蛋白重链的可变区(VH)。重要的是，载体1的scFv的接头是双功能的。它编码12或更多个氨基酸的scFv接头，且另外编码是phiC31的底物的位点特异性重组位点(attP′)。phiC31整合酶来自链霉菌属(Streptomyces)phiC31，且是介导互补位点特异性重组位点，即36bp噬菌体连接位点attP和36bp细菌连接位点attB间的单向位点特异性重组的酶。scFv接头的attP′自已知的attP位点优化用于双功能应用。
位于scFv融合蛋白的5′，第一载体从5′到3′编码第一CMV启动子(Pcmv1)、哺乳动物信号肽(mSigP)、第一剪接位点(5′ss)、lac操纵子启动子(PLacOP)、细菌信号肽(bSigP)和第二剪接位点(3′ss)。作为该排列的结果，例如在哺乳动物细胞中自Pcmv1表达，导致包括哺乳动物信号肽但不是细菌信号肽的scFv蛋白，而自PLacOP表达导致包括细菌信号肽但不是哺乳动物信号肽的scFv融合蛋白。要了解，这些启动子和信号肽功能盒的多核苷酸3′的修饰可修饰翻译的蛋白质而不改变该排列的基础作用，即具有两个信号肽的一个或另一个的蛋白质的细胞特异性翻译。
位于scFv的3′，第一载体从5′到3′编码是Cre重组酶的底物的位点特异性重组位点(loxP，例如JT15)、琥珀终止密码子(未显示)、编码噬菌体M13基因3产物的盒(GpIII)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)SacR启动子(PSacR)、选择标记(SacB)、嵌合trp和lac启动子(Ptac)、选择标记(LacZα)、cre重组酶(loxP)的第二底物、编码IgG重链的第二和第三恒定结构域(CH；注意，虽然CH可意指结合部分包括免疫球蛋白的第二和第三恒定结构域两个的每一个，但在本文与该实施例一起使用时意指包括各个之一的免疫球蛋白抗体链片段)的多核苷酸区段、琥珀终止密码子和聚腺苷酸化序列(polyA；未显示)。在某些情况下，zeocine基因存在于琥珀终止密码子和polyA之间。位于scFv和GpIII基因之间的琥珀终止密码子允许scFv在非阻抑性大肠杆菌宿主中表达。
第一载体的loxP位点是切离基序对。切离发生在loxP位点重组酶Cre重组酶存在下。Cre重组酶是来源于P1噬菌体的酪氨酸重组酶。Cre重组酶催化loxP位点的位点特异性重组，loxP位点是包括侧接8bp间隔基区的两个13bp回文序列的34bp位点。loxP位点重组的产物取决于loxP位点的位置和相对取向。以相同方向取向的两个loxP位点间的DNA作为DNA的圆环切离，正如本实施例所发生的。作为loxP位点的当前排列的结果，将第一载体与cre重组酶一起孵育导致两侧是loxP位点的核苷酸切离(图4B和4C)。同样，如图4C中所示，切离事件在切离产物留下杂合loxP位点。
将第一载体转移至大肠杆菌中。在本实施例代表的一些实施方案中，将第一载体转化至大肠杆菌细胞中。在本实施例代表的其它实施方案中，将第一载体转导至大肠杆菌细胞中，在该情况下大肠杆菌细胞是F+大肠杆菌细胞。第一载体转导至其中的大肠杆菌细胞包括第二载体(图4B)。第二载体从5′到3′编码CMV启动子(Pcmv2)、哺乳动物信号肽(mSigP)、是phiC31整合酶的底物且与attP′互补的36bp位点特异性重组位点(attB)、免疫球蛋白轻链恒定区、琥珀终止密码子、聚腺苷酸化序列(polyA)和zeocin抗性蛋白质(Zeo)。zeocin抗性盒在哺乳动物细胞和大肠杆菌两者中提供选择。在某些情况下，在本实施例所述步骤之前，使用zeocin抗性盒置换可存在于第一载体中的氨苄西林抗性盒。在其它情况下，zeocin抗性盒可用备选抗性盒(例如CamR盒)置换。在某些情况下，聚腺苷酸化信号位点(polyA)是现有的attB位点的3’。在具体情况下，可变链恒定区存在于attB位点和polyA之间。
除第二载体以外，第一载体转化至其中的大肠杆菌细胞包括例如cre重组酶和phiC31整合酶。如所述，且如本领域已知的，cre重组酶能够介导loxP位点间的位点特异性重组，phiC31整合酶能够介导attP，和attB间的位点特异性重组。因此，如果该实施例的第一和第二载体一起存在于细胞中，则至少两个重组事件发生在细胞内。本实施例中没有规定phiC31整合酶和cre重组酶的一个或两个是大肠杆菌细胞内源的，还是通过分子生物学技术，例如通过整合导入大肠杆菌细胞或自第一载体、第二载体、一个或多个其它载体表达。也未进一步规定这些元件是组成型表达的还是诱导型表达的。因此，在一些实施方案中，Cre重组酶介导的和phiC31整合酶介导的重组事件可以任何顺序或同时发生。在本发明的一些实施方案中，所述顺序可被完全或部分调节或控制。然而，所述调节或控制不一定是必需的。
在一个实例中，Cre重组酶在载体(例如pAX889载体)中表达。Cre基因可置于诱导型启动子例如携带与噬菌粒不同的复制起点和抗生素抗性基因(例如p15A起点和大观霉素抗性)的载体中的阿拉伯糖诱导型araC启动子的控制下，因此可将两个质粒保持在同一大肠杆菌细胞中。使用用pAX889转化的TG1细胞测试pAX889载体，所述细胞用携带具有两个loxP位点作为侧接300bp基因座的同向重复的噬菌粒的噬菌体转染。在2％阿拉伯糖(其诱导Cre表达)存在下，噬菌粒进行分子内重组得到间插区缺失的产物。
Cre重组酶介导第一载体的loxP位点间的重组，导致编码GpIII、PSacR、SacB、Ptac和LacZα的多核苷酸区段切离。在图4B中，短划线形成表明切离区段的方框。此外，在切离后，分隔编码scFv结合部分的多核苷酸区段与CH盒的核苷酸数大大减少。如图4C中所示，VH和CH仍被至少在切离事件后保留在重组点上的杂合loxP位点分隔。更具体的说，CH与scFv的VH融合从而VH和CH可作为单个蛋白质表达(合起来为VH-CH融合蛋白)。例如，在切离后分隔VH和CH的核苷酸当与VH和CH符合读框地转录和翻译时可编码氨基酸。或者，间插在编码VH和CH的多核苷酸区段间的核苷酸可包括剪接位点，使得编码VH和CH的多核苷酸区段在单一转录物中的转录可产生能够表达包括VH和CH的单一蛋白质的成熟mRNA。在如此表达的VH-CH融合蛋白中，VH和CH的末端氨基酸可以直接相邻或被由间插核苷酸编码的一个或多个氨基酸分隔。可针对出现或效率通过筛选与SacB和LacZα盒有关的表型来监测切离。具体地说，其中一个或所有第一载体已进行切离的细胞因失去SacB而在蔗糖中存活，并因此当在LacZ底物X-gal存在下培养时将出现白色，而不是蓝色。
在phiC31整合酶介导的重组事件中，第一载体的attP′位点特异性重组基序和第二载体的attB位点特异性重组基序重组产生重组产物(例如其中导入一个或多个调节元件以控制表达例如VH-CH融合蛋白的基因的表达的重组产物)。在某些情况下，将调节元件(例如哺乳动物和/或细菌启动子和功能蛋白质起始位点)加至VH-CH融合蛋白编码基因的5’。如图4B中所示，该重组事件导致第一载体(接头内)和第二载体(哺乳动物信号肽和polyA间)之间的交换。当这个重组事件与本实施例的上述切离事件组合发生时，产生编码嵌合多肽的多核苷酸区段。如图4C中所示，该编码的嵌合多肽包括两个单独表达的蛋白质：包括scFv的VL和(未显示)免疫球蛋白轻链恒定区(免疫球蛋白轻链)的蛋白质和包括scFv的VH和免疫球蛋白重链CH(IgG重链)的蛋白质。因此，第一结合部分scFv被转化至具有两条链(每条链包括scFv的一部分)的免疫球蛋白中。
为了概括通过本实施例的转化引起的一些主要事件，可留意两个重组事件每一个的整体结果。Cre重组酶介导的切离事件导致包括CH的scFv融合蛋白。该融合蛋白包括免疫球蛋白重链的所有恒定区和抗原决定区(VH和CH)。然而，它进一步包括轻链抗原决定区，VL。将VL与VH分隔的接头包括attP′重组基序。当与第二载体attB基序的重组发生时，VL与VH和CH分隔开来，并与由第二载体编码的轻链恒定区(LC)融合。由于这些重组事件合起来的结果，重组产物包括单独表达的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链。因此，scFv被转化至免疫球蛋白中。虽然这个简短描述没有抓住本发明的每个优势，但它提供一个实施方案的通用机制的基本综述。
有关第一和第二载体的另一个功能盒，以下发生在本实施例中。编码PCMV1、mSigP、5′ss、PLacOP、bSigP和3′ss的第一载体的区段保持与VL结合。在与第二载体重组后，VL的后面是attL′杂合重组基序、琥珀终止密码子、来源于第二载体的polyA和来源于第二载体的zeocin抗性盒。第二载体的CH和polyA分别保持与VH结合。在与第二载体重组后，VH的前面是来源于第二载体的Pcmv2启动子、来源于第二载体的哺乳动物信号肽(未显示)和attR杂合重组基序。因此，嵌合多肽的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链两者可在哺乳动物细胞中表达。虽然在图4中未明确注明，但重组产物包括编码嵌合多肽的各免疫球蛋白链的多核苷酸区段5′的功能蛋白质起始序列。预期在本发明的不同实施方案中，一种或多种嵌合多肽蛋白质可包括在细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的任一种或多种中表达的启动子和其它序列元件。
实施例2：双功能表达构建体
本实施例涉及特定的双功能表达构建体用于实施例1的技术中的用途。如本实施例所用，表达构建体意指指导特定蛋白质或该蛋白质的一组变体表达的调节元件的组合。
已知在例如细菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞中蛋白质表达的要求可以不同。此外，已知表达的要求在细菌中、在哺乳动物细胞中和在昆虫细胞中可以变化。表达构建体可以是双功能表达构建体从而特定蛋白质或该蛋白质的一组变体可在哺乳动物细胞和细菌细胞两者中表达。本实施例包括人IgG1构架作为第一载体Fc和第二载体LC，因为人IgG是具有例如针对病原体和癌细胞使用的治疗价值的多种构架之一。
对于本实施例的双功能表达构建体，构建体包括基于强巨细胞病毒(CMV)启动子的盒。该CMV启动子是类似于实施例1的噬菌粒scFv的5′的亚克隆。该构建体进一步包括基于图2中所示哺乳动物启动子的盒。CMV启动子定位于包括内含子的哺乳动物IgG重链分泌信号的5′，其之后可自CMV启动子表达。哺乳动物内含子含有lac启动子/操纵基因。定位于lac启动子/操纵基因的3′并仍在哺乳动物内含子内的是编码细菌信号肽的多核苷酸区段。细菌信号肽序列与剪接接纳体位点重叠(参见Quinlan et al.,J.Biol.Chem.288:18803-10,2013；通过引用结合到本文中)。细菌启动子、信号肽和剪接位点可以是或包括之前表征的本领域众所周知的共有序列。细菌信号肽是一种pelB信号肽，其具有已知支持Fab在大肠杆菌周质中产生并在哺乳动物细胞中有效剪接的共有剪接接纳体位点(参见U.S.7,112,439，通过引用结合到本文中)。可使用例如本领域众所周知的启动子共有序列、信号序列共有序列和剪接位点共有序列设计内含子核苷酸序列(参见例如Mergulhao et al.,Biotechnology Advances 23:177-202,2005；Stern et al.,Trends Cell Mol.Biol.2:1-17,2007和Jackson,Nucleic Acids Res.19:3795-3798,1991；其每一个通过引用结合到本文中)。
在大肠杆菌中，该表达构建体可自哺乳动物内含子内的细菌启动子表达包括细菌信号肽的scFv蛋白。该蛋白质可存在于例如细菌周质中。该蛋白质可例如作为外被蛋白(例如GpIII)的融合物在病毒(例如M13噬菌体)表面展示。哺乳动物细胞中的同一表达构建体可剪除细菌启动子/操纵基因和信号肽序列，导致包括哺乳动物信号肽的scFv蛋白表达。
蛋白质在特定的细胞类型中的适当表达可进一步包括聚腺苷酸化信号。在本实施例中，第一和第二载体各自包括是SV40聚腺苷酸化信号的聚腺苷酸化信号。该信号是分离或合成和克隆的例如Fc盒(其是人IgG1 Fc)的3′。
实施例3：三功能表达构建体
结合部分，例如本发明的第一多肽、第二多肽和嵌合多肽可自三功能表达构建体表达。具体地说，已知蛋白质在例如细菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的要求可以不同。此外，已知表达的要求在细菌中、在哺乳动物细胞中和在昆虫细胞中可以变化。表达构建体可以是三功能表达构建体，使得它能够促进哺乳动物细胞、细菌细胞和昆虫细胞中特定蛋白质或该蛋白质的一组变体的表达。
多种功能盒可用于多功能表达构建体。这些盒包括CMV内含子/增强子区(CMVIE)、多角体启动子(PPH，来自杆状病毒)、tac启动子(Ptac)、噬菌体T7启动子(PT7)、PCMV启动子(图5中未显示完全序列)、大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)和Kozak序列。图5显示引导直到蛋白质翻译ATG起始位点(fMet)的这些多功能多核苷酸盒的排列。该排列包括从盒中除去所有ATG序列，以便从三功能表达构建体内排除可能的fMet蛋白起始位点的存在。如所示按PCMV、CMV IE、P多角体、Ptac、PT7、RBS、Sfil限制位点和Kozak，最后一个紧接在fMet之前的顺序，从5′到3′装配这些盒。CMV、多角体和Lac启动子的这种连环使得单一多功能表达构建体能够在以下这3种宿主类型的任一种中自单一编码序列表达蛋白质：哺乳动物、昆虫和细菌。
实施例4：大肠杆菌用第一载体和第二载体转化或转导的验证
实施例1和2的第一和第二载体可包括琥珀终止密码子。这些琥珀终止密码子在TG1大肠杆菌细胞中可被抑制。TG1细胞可以是表达Cre和PhiC31的TG1细胞。按照本实施例，实施例1和2中提供的技术使用TG1大肠杆菌细胞执行。可通过在zeocin存在下生长，阳性选择用第二载体成功转化或转导的TG1细胞。
可通过在6％蔗糖上生长的反应，鉴定用第一载体成功转化或转导的TG1细胞。表达SacB的TG1细胞不能在蔗糖培养基中生长。因此，通过拼补或重复铺板于含和不含6％蔗糖的板中，使转化或转导的TG1细胞一式两份生长以区别表达或不表达SacB的细胞。转化或转导的TG1细胞还可或备选拼补或重复铺板或生长在含有X-gal和IPTG的板中以通过蓝色白色选择证实LacZα基因的表达。
实施例5：双功能att位点特异性重组位点的优化
在本发明的不同实施方案中，第一结合部分包括是或包括位点特异性重组基序的接头。在具体的实施方案中，编码结合部分蛋白的两个组分的多核苷酸区段被多个核苷酸分隔，其每一个编码接头的氨基酸。因此，间插核苷酸的数目必须是3的倍数，编码结合部分的一个氨基酸的一个密码子的各核苷酸部分。各种已知的位点特异性重组基序不适于该双功能应用。也就是说，它们不包括可转录或翻译的读框。在某些情况下，这可能是因为所有读框包括至少一个终止密码子或因为基序通常不包括是3的倍数的核苷酸的数目。本实施例描述了位点特异性重组基序的优化以鉴定其双功能变体。
变体attP和/或attB序列的文库可从已知的功能位点特异性重组位点开始的随机诱变产生。文库可以克隆至试验载体中。具体地说，可产生包括attP变体的一组载体，并可产生包括attB变体的一组载体。任选这些位点可侧接不同长度的亲水柔性氨基酸(例如(Gly4Ser)N)。要注意，连续存在于attB和attP位点的12个读框中的9个是可读框。
设计了允许鉴定当存在于包括phiC31整合酶的单细胞中时能够重组的两种载体的测定法。各载体包括位点特异性重组位点。在第一试验载体中，氯霉素抗性(CamR)基因的一部分(包括编码在表达时导致氯霉素抗性的蛋白质的多核苷酸的构建体)是变体重组基序(此处为一种变体或已知的attP基序)的5’并与之相邻。在第二试验载体中，CamR基因的其余部分是可能的互补重组基序(此处为一种变体或已知的attB基序)的3′并与之相邻。因此，可使用第一试验载体上的attP基序的变体和第二试验载体中的已知的attB基序、第一试验载体已知的attP基序和第二试验载体中的attB基序的变体或两种载体中的变体进行测定。包括phiC31整合酶的细胞中第一试验载体和第二试验载体间的重组导致CamR表型显现。
在一个特定的实例中，CamR基因包括大肠杆菌启动子和包括ATG蛋白质起始位点的CamR蛋白编码区。attP基序的部分5′包括启动子和ATG蛋白质起始位点(图6，pATTP)。attB基序的部分3′包括CamR基因的其余部分(图6，pATTB)。attP基序的核苷酸以加下划线的字母表示(图6，pATTP)，attB基序的核苷酸以小写字母表示(图6，pATTB)。如图6中所示，这两类试验载体间的重组导致包括功能CamR基因内attR杂合基序的产物(图6，pATTR)。如果attR不能够表达以使attR的各个核苷酸有助于向CamR基因的蛋白质产物提供氨基酸的密码子，则CamR表型不显现。因此，在包括Cam的LB培养基中生长可用来鉴定具有含可翻译的attR的重组产物的细胞。可通过本领域已知的各种方法的任一种，克隆、测序或以别的方式鉴定存在于这些细胞中的重组产物。
可测试所鉴定的基序对的实用性。可将基序库在编码鉴定为能够结合靶蛋白(例如MS2外被蛋白)的scFv的多核苷酸的接头位置亚克隆至噬菌粒。噬菌体可自VL-(亚克隆)-VH scFv载体产生。可采用标准噬菌体展示方法或本领域已知的另一种生物淘选方法，针对抗原对这些噬菌体进行生物淘选。可分离表达功能scFv结合部分的克隆，并可通过PCR扩增接头的序列，随后通过DNA测序或本领域已知的其它方法证实。可对克隆进行重复测试以排除假阳性。还可在HEK-293细胞中测试克隆。
虽然实施例特别描述了双功能attP和attB基序的优化，但进一步优化与attP和attB连用或取而代之的其它基序可能具有价值。因此，本实施例的方法可用来优化其它位点特异性重组基序的双功能变体。这些可包括FLP/FRT位点特异性重组基序和其它备选重组酶例如表1所示的那些。
表1.位点特异性重组酶的实例
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实施例6：双功能位点特异性重组基序的进一步优化
在某些情况下，与只编码双功能重组基序可能是必需的相比，在双功能接头中包括更多的密码子可能是有益的。例如，开发较长的接头可能是有益的，或添加可改进转录、翻译或重组的效率。本实施例包括鉴定纳入不破坏接头的重组功能的双功能接头的其它序列材料。例如，如前述实施例描述的载体可进一步包括位点特异性重组基序的其它核苷酸位置5’或3’。这些其它的序列可以是一个或多个柔性疏水盒，例如(Gly4Ser)N。所述盒通常用作scFv接头序列。除重组基序以外，这些和其它已知的接头序列可以是纳入双功能接头的候选物。所选的双功能重组基序可通过这些手段优化以进一步提高表达效率、结合部分活性等。在某些情况下，编码双功能接头或其部分的多核苷酸的两侧可以是哺乳动物剪接位点，从而由两侧是哺乳动物剪接位点的区编码的双功能接头的一部分只在非哺乳动物细胞中表达。
优化双功能接头的另一种机制可以是将限制位点插入接头内使得当包括接头的转录物产生时，限制性内切酶除去转录物的一部分，除去导致转录物的可读框突出。该技术可适宜地包括在限制酶切后和在翻译前转录物切割末端的胞内连接。
这些技可用于优化一种或多种重组酶或结合部分。可通过与标准实验室构建体或野生型构建体比较效率。
实施例7：双功能LoxP位点特异性重组位点的优化
变体LoxP序列的文库可通过始于已知的功能LoxP位点的随机诱变产生。可产生M13噬菌粒载体使得每个载体包括GpIII盒的3′、编码LacZα的多核苷酸的第一部分、已知的或变体loxP、枯草芽孢杆菌SacB、第二种已知的或变体loxP元件和LacZα多核苷酸的其余部分。当在蔗糖存在下在细胞中表达时，SacB在大肠杆菌中是致死的。相比之下，SacB的丧失供在含蔗糖培养基中生长。因此，将载体转移至包括Cre重组酶并孵育足以允许重组的一段时间的TG1大肠杆菌细胞中。将这些细胞在蔗糖中培养。因此，仅侧接loxP的SacB基因被切离的细胞存活。此外，仅其中现位于LacZα基因的第一和第二部分之间的新形成的杂合loxP位点是双功能(即杂合loxP位点的每个核苷酸均编码氨基酸)的细胞当在X-gal存在下培养时会出现蓝色。在这种测定法的不同实施方案中，第一loxP基序可以是变体loxP基序，而第二loxP基序是已知的loxP基序，第一loxP基序可以是已知的loxP基序，而第二loxP基序是变体loxP基序，两个loxP基序可以是不同的变体loxP基序，或两个loxP基序可以是相同的变体loxP基序。
实施例8：本发明技术的不同方面的优化
如有需要，可对本发明的不同方面进行优化。优化可发生在自多种变体鉴定出最能够具有一种或多种特定功能的那些。
可以优化的一种这类功能是分泌scFv进入周质的效率。在本发明的不同实施方案中，分泌scFv进入周质由pelB前导序列/信号肽指导。为了提高scFv分泌至周质的效率，可修饰pelB与哺乳动物剪接接纳体位点共有序列连用。另外或备选，在pelB序列中产生变异，可使用噬菌体展示针对改进的分泌筛选变体。需要时，可类似地测试和/或修饰备选信号肽(例如ompA、phoA)。在某些情况下，可使用在细菌和哺乳动物细胞两者中运行的信号肽(例如IL2信号序列)。
可优化的第种二功能是SacB的功效。如果SacB不能有效地区分用第一载体转化的细胞和/或用第一载体转化但SacB盒已从第一载体中切离的细胞，则可使用其它选择标记。需要时可测试和/或修饰其它选择标记例如galK和thyA。
可优化的第三种功能是嵌合多肽的表达。在某些情况下，嵌合多肽是scFv-Fc。如果scFv-Fc没有很好地表达，则可测试和/或修饰CMV启动子以外的启动子以改进表达。可测试的其它调节序列包括hEF1-HTLV启动子(之前显示支持scFv-Fc融合物结合部分的哺乳动物表达)、EF1启动子或已知的IgG重链和轻链调节区。
此外，可针对密码子选择在一个或多个特定的细胞类型中对本发明的任何结合部分或构架，包括在第一载体和第二载体重组之前或之后的嵌合多肽或任何组分进行优化。例如，本发明的一些实施方案包括scFv第一结合部分。在这些情况下，可在嵌合多肽产生之前，针对密码子选择在大肠杆菌中对本发明的第一结合部分scFv进行优化。在任何实施方案中，密码子选择可从例如细菌密码子选择变成哺乳动物密码子选择。
对于嵌合多肽表达，可能需要对哺乳动物细胞类型进行优化。在一些实施方案中，哺乳动物细胞类型是HEK-293。优化可包括评价多种细胞类型中的嵌合多肽表达。例如，CHO细胞可用于替换HEK-293细胞。
在某些情况下，对于某些应用，有可能本发明的嵌合多肽不以足够的亲和力结合靶抗原。亲和力成熟的技术是本领域已知的。一些可在短至一周内完成。还可采取其它步骤。例如，预期因亲合力所致相对于scFv，加入IgG二聚化结构域提高结合部分对抗原的亲和力达4-10倍。
可通过修饰重组酶基因使重组效率优化。可测试不同的构成型或诱导型表达系统。例如，可测定诱导型重组酶(例如其表达可因存在阿拉伯糖而被诱导的重组酶)的效率。各种启动子(包括例如tet启动子)是本领域已知的，并可针对为提高重组效率对重组酶表达的优化进行测试。可通过例如量化跨整合位点的PCR扩增，来监测重组效率。
实施例9：靶向大量抗原的结合部分的筛选与随后的转化
构建了编码scFv结合部分用于展示的载体文库(例如噬菌体展示文库)。文库包括大于1010种载体，每个编码变体scFv分子和否则具有与文库中的其它载体基本相同的序列。载体基本上按照实施例1的第一载体构建。这类文库通过Kunkel诱变产生。然而，这类文库还可通过其它方法产生。可针对能够结合不同蛋白质(例如约10种不同的蛋白质，例如USP11、SAR1A、CTBP2、PLAA、MAP2K5、CTBP1、CDK2、MAPK8、HSP90B1和COPS5)的scFv结合部分筛选展示scFv文库的噬菌体。在某些情况下，可在自动筛选管道(例如使用约1毫克的各种抗原的管道)中筛选变体scFv分子。可通过本领域已知的方法选择对各抗原具有最高亲和力和/或亲合力的scFv分子。例如，可按照本文所述方法，将以这种方式选择的scFv分子(例如最前面的1-2种候选scFv分子)转化至IgG分子。在某些情况下，可选择共10-20种scFv分子用于转化至IgG分子。因此，该实施例描述了10-20种scFv结合部分的转化。
可将所选载体转化至HB2151大肠杆菌细胞，该细胞包括基本上按照实施例1构建的第二载体并进一步表达Cre重组酶和phiC31整合酶。这导致scFv分子转化至IgG分子。HB2151大肠杆菌细胞不抑制琥珀终止密码子。
独立地，可将所选载体转化至包括Cre重组酶但不包括本发明的第二载体或phiC31整合酶的HB2151大肠杆菌细胞中。这些载体进行导致scFv转化至scFv-Fc的切离事件。
可将转化的产物转染至HEK-293细胞和并在其中表达。在5-7天后从培养上清液中纯化结合部分。可通过例如蛋白质印迹和ELISA，测定结合部分的产量(mg/L)和结合部分对相对靶抗原的亲和力或亲合力。作为对照，所选的结合部分还可在标准IgG和Fc融合物质粒(例如pFuse-Fc，Invivogen)中在HEK-293细胞中表达。此外，所选的scFv分子可作为可溶性蛋白质在HB2151大肠杆菌细胞中表达。
实施例10：使用pAX688文库载体系统的scFv至IgG转化
在一个实例中，将各自编码scFv的噬菌粒载体通过phiC31介导的重组转化至可各自在哺乳动物细胞中表达包括scFv的VL和VH区的IgG的整合载体。该系统利用内含子剪接和整合酶活性以进行亚克隆。图7显示pAXM688噬菌粒载体的结构。噬菌粒载体按从5’到3’的顺序包括例如哺乳动物启动子(Pmam)、哺乳动物信号肽(MamSP)、第一5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、大肠杆菌启动子(PE.c.)、大肠杆菌信号肽(EcSP)、第一3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、VL基因、第二5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、attP位点特异性重组基序、第二3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、VH基因、第三5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子；TAG*)、gpIII基因、不可阻抑终止密码子(例如赭石终止密码子；TAA*)、第三3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、CH基因和聚腺苷酸化序列(polyA)。由于分别位于GpIII基因5’和3’的琥珀和赭石终止密码子的存在，scFv与gpIII的融合可受琥珀阻抑控制。换句话说，如果该载体存在于大肠杆菌的琥珀阻抑性菌株中，则产生scFv-gpIII融合物。如果该载体相反存在于非阻抑性大肠杆菌菌株中，则只产生scFv。
噬菌粒载体可用来例如产生在其表面展示结合部分蛋白(例如包括由噬菌粒载体的VH和VL基因编码的VH和VL结构域的scFv蛋白)的噬菌体。这类噬菌体可用于例如结合部分蛋白的基于噬菌体展示的生物淘选(例如以鉴定能够结合靶分子的结合部分或其抗原决定区)。各载体表达不同scFv的这类噬菌粒载体的文库，可按照本领域众所周知的方法和/或如本文所述方法产生。
如图8中所示，phiC31整合酶可用来诱导噬菌粒载体与接纳体载体(p接纳体)的位点特异性整合。从5’到3’，p接纳体载体包括例如attB位点特异性重组基序(未显示)、5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、哺乳动物信号肽(MamSP)、哺乳动物启动子(Pmam)、聚腺苷酸化序列(polyA)、多顺反子CamR复合物(Ter RBS CamR)、CL基因和3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)。
两种载体的phiC31介导的整合产生包括来自两种起始载体的元件的整合载体。在该实例中，整合载体从5’到3’包括例如哺乳动物启动子(Pmam)、哺乳动物信号肽(MamSP)、5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、大肠杆菌启动子(PE.c.)、大肠杆菌信号肽(EcSP)、3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、VL基因、5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、attL位点特异性重组基序、3’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、CL基因、多顺反子CamR复合物(Ter RBS CamR)、聚腺苷酸化序列(polyA)、哺乳动物启动子(Pmam)、哺乳动物信号肽(MamSP)、5’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、attR位点特异性重组基序、3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、VH基因、5’哺乳动物剪接位点(Mam5’ss)、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子；TAG*)、gpIII基因、不可阻抑终止密码子(例如赭石终止密码子；TAA*)、3’哺乳动物剪接位点(Mam3’ss)、CH基因和聚腺苷酸化序列(polyA)。
整合载体可表达轻链基因(包括与CL融合的VL)和各个重链基因(包括与CH融合的VH)。如图9A中所示，使剪接位点如此定位，从而细菌调节元件和attR位点从轻链转录物中剪除，而attL位点和gpIII基因从重链转录物中剪除。琥珀终止密码子和赭石终止密码子也从重链转录物中剪除。此外，整合导致CamR盒激活，使得可通过在含有氯霉素的培养基中生长选择成功的整合子。如图9B中所示，轻链和重链基因自整合载体的表达产生pre-mRNA，其中细胞和病毒元件位于内含子中。轻链经剪接的成熟mRNA包括哺乳动物信号肽、VL结构域、CL结构域和poly A尾。重链经剪接的成熟mRNA包括哺乳动物信号肽、VH结构域、CH结构域和polyA尾。因此，在哺乳动物细胞中，剪接可用于排除对于哺乳动物表达是不需要的元件，导致容易转染至哺乳动物细胞(例如CHO细胞)用于IgG产生的表达载体。
在备选实例中，pAX688噬菌粒载体包括位于gpIII和CH-编码基因之间的直向同源位点特异性重组位点(例如用于phiC31以外的重组酶的整合位点)。在某些情况下，直向同源位点特异性重组位点位于3’哺乳动物剪接位点的上游。该直向同源位点特异性重组位点的对应物存在于第二接纳体载体(其可编码功能结构域，例如本文描述的那些)中。例如，功能结构域可以是泛素连接酶结构域、knocksideways结构域或CAR结构域。CAR结构域可包括例如CD3-ζ或CD28跨膜结构域和/或CD3-ζ、CD28、41BB、ICOS、FcεRIγ、流感MP-1、VZV和/或OX40胞质域或其任何组合或衍生物。在一个例子中，接纳体载体包括编码例如能够表达CD3-ζ跨膜结构域和胞质域的CD3-ζ构建体(例如14g2a-Zeta)的多核苷酸。噬菌粒载体和第二接纳体载体间的整合导致能够表达包括噬菌粒载体的scFv(或其包括噬菌粒载体的scFv可变结构域的至少一个和优选两个的衍生物)和CD3-ζ结构域的融合蛋白的第二整合载体，随位于scFv和CD3-ζ内结构域(endodomain)之间的CD3-ζ跨膜结构域定向。这可导致其中scFv与关联抗原的结合引发来自CD3-ζ内结构域的胞质ζ信号的功能跨膜受体。因此，如果第二整合载体在T细胞中表达，则scFv与其关联抗原的结合导致T细胞激活。因此，包括能够识别靶细胞类型(例如恶性B细胞)上的抗原的抗原决定区的scFv，可以这种方式与CD3-ζ整合并转染至T细胞以产生待快速、廉价、多重和/或高通量测试的T细胞。在一个实例中，可采用该方案将scFv转化至scFv-CD3-ζ融合物以备在一天或更短时间内的T细胞测试。
实施例11：使用pMINERV载体系统的快速scFv至IgG转化
在一个实例中，通过phiC31介导的重组将编码scFv的噬菌粒载体(pMINERVA)与接纳体载体(p接纳体)一起转化至可在哺乳动物细胞中表达包括scFv的VL和VH基因的IgG结合部分的整合载体(图10)。该系统利用内含子剪接和整合酶活性以进行亚克隆。在某些情况下，系统以完全无缺陷的方式运作，例如，其中所有亚克隆通过内含子剪接和/或整合酶活性进行，从而避免PCR、亚克隆和DNA测序步骤。噬菌粒载体从5’到3’包括例如哺乳动物启动子(Pmam)、第一5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、酵母启动子(Pyeast)、B42转录激活结构域(B42)、大肠杆菌启动子(PE.coli)、第一3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、VH基因、第二5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、位点特异性重组基序(例如attB或attP位点；优选attP位点)、第二3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、VL基因、第三5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子)、gpIII基因、不可阻抑终止密码子(例如赭石终止密码子)、第三3’哺乳动物剪接位点(3’ss)和CL基因。在该实例中，p接纳体载体包括例如哺乳动物表达盒，任选细菌表达盒(例如相对于哺乳动物表达盒反向平行取向)。哺乳动物表达盒从5’到3’包括哺乳动物启动子(Pmam)、第一5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、位点特异性重组基序(例如attB或attP位点；优选attB位点)、第一3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、CH基因、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子)和氯霉素抗性标记基因(CamR)。在一个实例中，细菌表达盒包括大肠杆菌启动子(PE.coli)和Lpp-OmpA’融合物。在某些情况下，attB和attP基序可交换，从而attB基序存在于p接纳体载体中，attP基序存在于噬菌粒载体中。
phiC31整合酶可用来诱导噬菌粒载体和p接纳体载体的位点特异性整合。这些载体间phiC31介导的重组产生整合载体，其包括噬菌粒载体和p接纳体载体的所有元件，不同的是attB和attP基序被attR基序和attL基序置换。如图11A中所示，所得整合载体包括彼此平行取向的重链表达盒和轻链表达盒。在整合载体形成中重链和轻链的物理连接可用于免疫库筛选。重链表达盒从5’到3’包括例如哺乳动物启动子(Pmam)、5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、B42转录激活结构域(B42)、大肠杆菌启动子(PE.coli)、3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、VH基因、5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、attL位点特异性重组基序、3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、CH基因、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子)和氯霉素抗性标记基因(CamR)。轻链表达盒从5’到3’包括例如哺乳动物启动子(Pmam)、5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、attR位点特异性重组基序、3’哺乳动物剪接位点(3’ss)、VL基因、5’哺乳动物剪接位点(5’ss)、可阻抑终止密码子(例如琥珀终止密码子)、gpIII基因、不可阻抑终止密码子(例如赭石终止密码子)、3’哺乳动物剪接位点(3’ss)和CL基因。在一个实例中，保留用于自p接纳体载体表达Lpp-OmpA’融合物的反向平行细菌表达盒。在某些情况下，RNA编辑可用来改变整合载体(或其它载体，例如噬菌粒载体或接纳体载体)上的剪接，因此允许双功能抗体的快速构建。
我们产生了pMINERVA系统的组分，并针对其在哺乳动物或细菌细胞中产生功能结合部分的能力对噬菌粒载体和整合载体进行了测试(图11B)。这包括测定不同的位点特异性重组基序是否可用作连接例如两个抗原决定区(例如VH和VL结构域，或CL和VL结构域)的接头区。我们表明，可在表达IgG的HEK293细胞和表达scFv的大肠杆菌细胞两者中检测来自pMINERV载体系统的蛋白质表达。对于来自噬菌粒载体的scFv表达，我们表明，attP基序适宜作为VH和VL结构域间的scFv接头区，如通过scFv活性表明的，但attB基序不适宜。因此，可能需要在噬菌粒载体中使用attP基序作为scFv的VL和VH结构域间的接头。在某些情况下，attP或attB基序的任一个在噬菌体展示中可适于用作接头，其中作为接头掺入重组基序的蛋白质的高表达可能不太重要。对于来自整合载体的IgG表达，发现attR和attL基序两者是合适的CL-VL接头，其所得IgG显示可检测的结合活性。
我们还进行了phiC31整合酶位点特异性重组基序是否可在scFv或IgG中起肽接头作用的可行性分析。产生了带有3个不同接头序列WT(Gly4Ser)3、phiC31 attB位点或读框2中的phiC31 attP位点的相同的scFv。在ELISA中以靶蛋白或无关对照为背景对各scFv进行了测试。抗FLAG-HRP用来检测scFv上的FLAG标签，ELISA用Ultra TMB试剂显现。如图12A中可见，包括attP基序作为VH-VL接头结构域的scFv显示结合活性，包括attB基序的scFv没有。产生了在VL和CL间无接头(WT)间或带有读框2中的重组phiC31整合酶位点attL或attR的相同的IgG。在ELISA中对靶蛋白或非特异性对照为背景对各IgG进行了测试。抗小鼠-HRP用来检测IgG，ELISA用Ultra TMB试剂显现。如图12B中所示，包括attL基序或attR基序任一个作为CL-VL接头的IgG(图12C)显示结合活性。所有3种IgG构建体均是表达的和有功能的。attP基序还在功能scFv中起CL和VL结构域间的12个氨基酸接头的作用。这些结果证实attP基序可scFv和IgG中起肽接头的作用，并且attL和attR基序各自可在IgG中起肽接头的作用。在进一步的实施方案中，这类重组基序(例如attB、attP、attL或attR基序)可用作重链上的CH-VH接头。
在备选实例中，pMINERVA噬菌粒载体包括位于gpIII和CL基因之间的直向同源位点特异性重组位点(例如phiC31以外的重组酶的整合位点)。该直向同源位点特异性重组位点的对应物存在于第二接纳体载体中，其是能够表达CD3-ζ跨膜结构域和胞质域的CD3-ζ构建体(例如14g2a-Zeta)。噬菌粒载体和第二接纳体载体间的整合导致能够表达包括噬菌粒载体的scFv(或其包括噬菌粒载体scFv的可变结构域的至少一个，优选两个的衍生物)和CD3-ζ结构域的融合蛋白的第二整合载体，随位于scFv和CD3-ζ内结构域之间的CD3-ζ跨膜结构域定位。这可导致其中scFv与关联抗原的结合引发来自CD3-ζ内结构域的胞质ζ信号的功能跨膜受体。因此，如果第二整合载体在T细胞中表达，则scFv与其关联抗原结合导致T细胞激活。因此，包括能够识别靶细胞类型(例如恶性B细胞)上的抗原的抗原决定区的scFv，可以这种方式与CD3-ζ一起整合，并转染至T细胞以产生待快速、廉价、多重和/或高通量测试的T细胞。在一个实例中，该方案可用来将scFv转化至scFv-CD3-ζ融合物以备在一天或更短时间内的T细胞测试。
实施例12：载体内元件的相对定位
在某些情况下，供体载体和接纳体载体内元件的相对定位对于规定通过供体载体与接纳体载体重组产生的整合载体内元件的定位是重要的，例如，大肠杆菌启动子、phiC31整合酶的连接位点、核糖体结合位点和抗生素抗性基因的放置对于用本文所述pMINERV载体系统适当选择phiC介导的重组事件可能是重要的。
图13显示用来验证phiC31功能的供体噬菌粒载体的序列。在该供体载体中，attB位点特异性重组位点位于核糖体结合位点(RBS)、间隔基和氯霉素抗性基因(CAM)的上游。用来验证phiC31功能的接纳体载体序列的一部分见图14。在这个接纳体载体中，attP位点特异性重组位点位于CAM启动子和phiC31基因之间。值得注意的是，供体载体或接纳体载体都不包括CAM启动子和CAM基因两者。因此，含有任一载体的细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)是氯霉素敏感的。
通过重组酶(例如phiC31)在供体载体和接纳体载体间的重组产生整合载体，其一部分见图15。供体和接纳体载体中，因CAM启动子、RBS、间隔基和CAM基因相对于相应的位点特异性重组位点的定位所致，重组的整合载体以从5’到3’的顺序包括CAM启动子、attR位点特异性重组位点、核糖体结合位点、间隔基和CAM基因。因此，含有整合载体的细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)(例如其中供体载体和接纳体载体进行了phiC31介导的重组的细胞)表达CAM基因，并因此对氯霉素有抗性。
实施例13：合成内含子的剪接
在某些情况下，可将内含子(例如合成内含子)加至本发明的载体(例如第一载体或第二载体)中，使得如果载体在原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞)中则位于内含子内的多核苷酸(例如编码多肽或多肽片段的多核苷酸)表达，但在能够mRNA剪接的真核细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)中不表达。
在一个实例中，将含有M13 gpIII片段(例如用于噬菌体展示)的合成内含子引入表达载体的IgG中的VH和CH区连接处(图16)。gpIII内含子序列如下(SEQ ID NO:21)：
Figure BDA0003067529460001041
Figure BDA0003067529460001051
关键：5’剪接位点，His标签，琥珀终止密码子，M13 gp3基因片段，3’剪接位点
将HEK-293细胞用原始野生型(WT)载体或含有合成内含子的变体瞬时转染。IgG载体的两种形式来自单一载体、双重启动子系统。修饰的WT IgG载体含有位于VH和CH区间的内含子内的gpIII的截短形式。在不剪接时，在gpIII之后有多个终止密码子，这可能导致无CH产生。在剪接时，CH可保留在读框中，因此可以表达。
从培养上清液中收获IgG，在非还原(泳道1和3)或还原(泳道2和4)条件下通过SDS-PAGE进行分析。来自原始构建体(泳道1和2)和含内含子(泳道3和4)的构建体IgG的产量和纯度相当。
实施例14：scFv至多种IgG和CAR的过夜转化
图17显示了通过噬菌体展示生物淘选用于抗体选择的载体系统和采用体内重组化的选择输出库至嵌合抗原受体(CAR)或IgG形式的体内转化。该方案利用识别不同位点特异性重组基序的多种丝氨酸整合酶以使编码scFv的噬菌粒载体的不同部分与特定的接纳体载体选择性地重组。该方法可用于例如快速转化至测试Fc、酶融合物、CAR茎序列或噬菌粒载体和/或接纳体载体的任何其它元件。
如图17中所示，将含有编码scFv的噬菌粒载体的噬菌体转导至表达BxB1整合酶并含有用于产生CAR融合物的慢病毒接纳体载体的大肠杆菌菌株中。在噬菌粒上的attP’位点和慢病毒载体上的attB’位点间的BxB1介导的重组使scFv与TCRζ的铰链和跨膜和信号转导结构域融合。在哺乳动物细胞中，含有M13 gp3基因和attP位点的内含子通过剪接除去。重组事件还使大肠杆菌启动子与zeocin基因融合，允许整合子在zeocin培养基(ZeoR)中选择。病毒可在哺乳动物包装细胞系中自最终的载体产生，并用以例如转导Jurkat细胞用于CAR-T测定法。
或者，可将噬菌体转导至表达phiC31整合酶并含有IgG接纳体载体的大肠杆菌菌株中。attP和attB位点间的重组(显示为attP*和attB*)使VH与CH和哺乳动物启动子与VL基因融合。CHO细胞中的剪接清除侧接M13 gp3基因的内含子，并使VL与CL符合读框地融合。整合子可通过氯霉素抗性(CAMR)选择。CHO细胞可用最终的载体转染以产生全长IgG。
实施例15：scFv体内转化至嵌合抗原受体(CAR)或IgG的载体系统
本发明的特征在于无需任何亚克隆和/或DNA序列证实步骤将第一类型的多肽(例如scFv)直接转化至第二类型的多肽(例如IgG和CAR)的方法。在一个实例中，提供用于将scFv转化(例如体内转化)至嵌合抗原受体(CAR)形式的载体系统。该载体系统还可用来将scFv转化至全长免疫球蛋白G(IgG)中。需要时，例如可按本文所述，在通过噬菌体展示生物淘选的抗体选择中使用初始scFv，且随后可将选择的输出库转化至CAR或IgG。在某些情况下，载体系统利用大肠杆菌中的噬菌体整合酶和/或哺乳动物细胞中的内含子剪接。使用该载体系统，可在T细胞中以CAR形式直接筛选噬菌体选择的输出。
掺入适于phiC31介导的转化的细菌和哺乳动物控制元件的载体系统
构建了包括能够支持抗体分别在细菌和哺乳动物细胞中表达的细菌和哺乳动物调节区两者的噬菌粒载体。载体的将细菌控制元件隐藏在哺乳动物内含子内(例如如图2中所示)。载体包括在细菌中编码与噬菌体M13 gp3基因融合的scFv的多核苷酸。可将scFv转化至通过将噬菌粒转导至第二种大肠杆菌F+菌株中可在哺乳动物细胞中表达的IgG。phiC31丝氨酸整合酶可用来使来自接纳体质粒的CH基因与VH基因重组，并将控制元件引入VL基因的上游。phiC31的attP识别位点可在scFv中用作接头。设计载体，从而可变和恒定结构域间重组的phiC31整合酶位点(attL或attR)不干扰IgG表达或功能(参见例如图10)。对于产生轻链VL-CL融合物的目的，哺乳动物剪接位点侧接M13 gp3基因，允许在哺乳动物细胞中VL与CL融合。因此，使用该载体系统，可将单一穿梭载体用于噬菌体文库构建、噬菌体展示筛选和哺乳动物细胞中的IgG抗体产生。
用于噬菌体展示和CAR-T的慢病毒载体的设计和测试
(A)用于CAR表达的慢病毒载体的产生。在该实例中，我们产生了根据标准慢病毒载体产生CAR融合物的接纳体质粒。可将scFv与铰链(例如CD8铰链结构域)和胞质域(例如来源于TCRζ的跨膜胞质信号转导区)符合读框地克隆至该载体。在某些情况下，scFv具有N-端FLAG标签以利于检测。在TCRζ区和终止密码子的下游，我们可掺入内部核糖体进入位点(IRES)和标记，例如编码荧光蛋白的基因(例如EGFP基因)。荧光蛋白可利于通过免疫荧光(IF)或荧光激活细胞分选法(FACS)筛选转导的细胞。病毒可在包装细胞系中产生，并用来转导细胞(例如Jurkat细胞)。可通过例如FACS评价EGFP+FLAG+细胞的百分比。为了评价功能，可将转导Jurkat细胞与抗原表达细胞共培养，并通过例如FACS评价CD69的表达(T细胞激活的早期标志物)。
(B)哺乳动物和细菌调节序列两者的掺入。我们设计了用于哺乳动物和细菌两者表达的调节盒，其中将细菌控制元件隐藏在哺乳动物内含子内(参见例如图2)。为了测试其在T细胞中的功能，可以克隆该调节盒替换慢病毒载体中的CMV启动子用于CAR表达。例如按上文第(A)节所述，可评价用病毒转导的Jurkat细胞中的CAR表达，并与慢病毒CAR表达载体中的表达进行比较。
(C)噬菌体展示中的侧接整合酶连接位点和M13 gp3的哺乳动物剪接位点的测试。例如可按本文所述，产生两侧是天然剪接供体和接纳体序列的合成内含子。可在噬菌粒上gp3基因下游的这个合成内含子内编码丝氨酸整合酶的连接位点(图18A)。为了测试剪接，可在scFv和CAR的TCRζ结构域间克隆该合成内含子。因此，可在哺乳动物细胞中剪接含有gp3基因和整合酶连接位点的内含子。可证实T细胞上CAR的适当剪接和表达，并与例如第(A)和(B)节所述构建体进行比较。
(D)用于测试整合酶介导的重组的载体的构建。丝氨酸整合酶(例如噬菌体编码的丝氨酸整合酶)可介导短attP和attB DNA位点间的直接调节的位点特异性重组而无宿主因子要求。表达这类整合酶(例如phiC31整合酶)的大肠杆菌菌株中供体噬菌粒上的连接位点(attP)和接纳体质粒上的相应连接位点(attB)间的重组可导致噬菌粒中的scFv与慢病毒载体上的铰链(例如CD8)和跨膜胞质信号转导区(例如来源于TCRζ)重组(参见例如图17)。产生了大肠杆菌中phiC31整合酶表达的菌株，并证实了其功能性(图19A和19B)。备选整合酶(例如BxB1)还可用来提高系统的灵活性。例如，慢病毒载体上的启动子元件可用大肠杆菌启动子置换使得连接位点处的重组还使慢病毒载体中的大肠杆菌启动子与噬菌粒中的抗生素抗性标记(例如zeocin)融合(图18A)，允许选择大肠杆菌中的整合事件。可通过非选择性培养基中的PCR筛选集落，测定重组的效率。
(E)载体功能的验证。在一个实例中，对照抗Tyro3 scFv自本文所述噬菌粒载体和大肠杆菌中产生的噬菌体表达。如上所述，通过全细胞淘选针对Tyro3表达人细胞开发了几种示例性抗Tyro3抗体。可通过例如ELISA和/或FACS，证实与表达所需靶分子(例如Tyro3)的细胞结合，而不与不表达所需靶分子和/或表达不同靶分子的对照细胞系结合的噬菌体和可溶性scFv。含有慢病毒接纳体载体并表达备选丝氨酸整合酶(例如BxB1)的大肠杆菌可用噬菌体转导，可通过zeocin抗性选择整合子。病毒然后可从重组的载体产生，并用来转导Jurkat细胞。可如本文所述证实CAR融合物的功能展示。
用于噬菌体展示、IgG表达和CAR-T的三功能载体系统的开发
(A)scFv上attP接头的测试。如上所述，开发了利用phiC31整合酶的连接位点(attP)作为scFv中的接头的载体。证实了在噬菌体上和作为可溶性蛋白质的scFv的功能表达(图12A)。还证实了IgG的VL和CL结构域间的attP序列不影响IgG表达或功能(图12B)。相同的接头可任选用于CAR融合物中。如需要，可评价含有ttP接头的CAR的表达和功能，并与具有野生型scFv接头的CAR进行比较(例如如本文所述)。
(B)scFv转化至IgG和CAR两者中。可修饰上文所述噬菌粒以掺入例如含有M13 gp3基因的内含子、备选整合酶(例如BxB1)连接位点和zeocin抗性基因下游的人κ轻链恒定结构域(CL)(图18B)。还可修饰scFv以含有步骤(A)验证的attP接头序列。来源于该载体的噬菌体可用来转导接纳体菌株用于IgG转化(例如如图10和17中所示)。在接纳体菌株中，phiC31整合酶介导噬菌粒中的attP位点和接纳体载体中的attB位点间的重组以使噬菌粒中的VH与接纳体载体中的人IgG1恒定结构域(CH)融合并使来自接纳体的CMV启动子与噬菌粒中的VL基因融合。可通过氯霉素(CAM)抗性基因的表达在大肠杆菌中选择整合事件(图18B)。可分离来自CAM抗性克隆的DNA，并且例如用来瞬时转染CHO细胞。哺乳动物细胞中的剪接导致内含子的除去和VL与CL结构域的融合。可证实IgG的表达，并与用标准载体获得的表达水平进行比较。可通过例如ELISA和/或FACS，针对Tyro3-表达细胞证实IgG功能。可针对与Gas6配体竞争Tyro3的能力测试IgG抗体。
其它噬菌体整合酶连接位点可用作phiC31的备选物。可通过例如随机诱变产生attP变体文库。可针对在例如LB+氯霉素培养基中生长选择phiC31-功能整合酶底物位点。然后可将这些整合酶-功能att位点库亚克隆至VH和VL结构域间无接头的scFv的接头位点。可采用例如标准方法，从VL-att*-VH克隆产生噬菌体，并针对表达靶标的细胞进行生物淘选。可对表达功能scFv和编码功能att序列的各个独特的克隆进行再测试。可进一步测试呈IgG和CAR形式仍是阳性的那些克隆。
使用三功能载体产生和筛选人组合抗体文库
(A)文库构建。可使用本文所述载体系统，在例如恒定构架中构建例如至少1010个不同成员的功能噬菌体展示scFv文库。在某些情况下，可通过将终止密码子和限制性内切酶切割位点置于所选的scFv构架的互补决定区(CDR)中，然后使用基于Kunkel的位点定向诱变以用编码NNK密码子的寡核苷酸置换这些终止密码子，来构建这类文库。
(B)噬菌体展示筛选。产生了表达与癌症有关的细胞表面靶标(例如Tyro3、NRP2、ErbB2、xCT和AGTR1)的稳定细胞系。或者，可利用表达CD19(其是经证实的CAR疗法的靶标)的细胞。可进行采用全细胞淘选通过噬菌体展示的筛选以分离例如Tyro3的新生命中物(denovo hit)。全细胞淘选技术已证实可成功地用于获得细胞表面靶标(例如Tyro3)的结合物。可包括含有用于开发载体系统的模式抗Tyro3 scFv的强化文库(spiked library)作为阳性对照。
(C)scFv、IgG和CAR-T细胞的产生。在一个实例中，以Tyro3表达细胞和表达不同细胞表面受体对照细胞系为背景，通过噬菌体ELISA，筛选来自选择的一组克隆(例如约2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个克隆)。独特的结合物可作为可溶性蛋白质自不能阻抑scFv和M13 gp3间的琥珀终止密码子的大肠杆菌(例如HB2151)表达。纯化的scFv可以靶标表达细胞和对照细胞为背景，通过ELISA来证实。来源于阳性命中物的噬菌体可平行地用于转导：(i)表达BxB1整合酶和含有慢病毒接纳体载体的大肠杆菌，和/或(ii)表达phiC31整合酶和含有IgG接纳体载体的大肠杆菌。可从表达BxB1整合酶的大肠杆菌的zeocin抗性重组克隆中提取慢病毒DNA，病毒可在包装细胞系中产生。Jurkat细胞然后用病毒转导，可通过例如FACS评价EGFP+FLAG+细胞的百分比。可从表达phiC31整合酶的大肠杆菌的CAM抗性重组克隆提取质粒DNA，并例如用来转染CHO细胞。然后可从培养上清液纯化可溶性IgG，并通过例如ELISA和/或FACS针对与靶细胞的结合来测试。
(D)所选分子的功能验证。转导的Jurkat细胞可与靶标表达细胞一起共培养。如本文所述，可通过例如FACS，评价CD69的表达。可针对与受体配体(可获得的话)的竞争测试IgG。
实施例16：在scFv的5’端、接头区或3’端具有直系同源整合酶位点的pMINERVA转化系统
在某些情况下，本发明的特征在于将第一多肽(例如scFv、F(ab')2、Fab、Fab'或Fv片段或免疫球蛋白例如IgG)转导至不同嵌合多肽(例如IgG、scFv、F(ab')2、Fab、Fab'、Fv、CAR或本文所述多肽的任何其它类型)的载体系统(例如图20中所示pMINERVA噬菌粒载体)，其中重组可发生在例如载体内的第一多肽(例如scFv)编码多核苷酸的5’端、接头区或3’端的任一处。例如，第一多肽5’端处的重组可用来交换启动子、控制元件和/或前导肽。第一多肽接头处的重组可用来使第一多肽的一部分与第二多肽的一部分融合。例如，scFv可变结构域(例如VH结构域)可与恒定结构域(例如CH结构域)融合以转化至IgG中。第一多肽3’端处的重组可用来例如交换3’结构域或使第一多肽与不同的目标元件融合。这类元件可包括例如酶(例如βgal、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)、亲和标签(例如His6、FLAG或蛋白A)、标记(例如GFP、Halotag、sfp和SNAPtag)、内体标签(例如泛素连接酶和FKB12)、Avitags、sfp合酶、ACP-tag、TCRζ和本文所述的任何其它功能结构域和/或结合部分。
在一个实例中，pMINERV载体包括位于scFv的接头区的attP位点(即VH和VL结构域之间)，如图20A中所示。该attP位点例如可在接纳体载体(例如p接纳体)中与关联attB位点重组，所述接纳体载体包括如此定位的CH结构域使得重组导致形成编码IgG的重链和轻链的整合载体，其包括来自之前pMINERV载体的scFvVH和VL结构域。例如，在pMINERVA噬菌粒供体载体中作为gp3-融合物编码的scFv Ab可在噬菌体展示生物淘选程序中筛选，以鉴定编码具有某些所需生物物理性质(例如对靶分子的结合特异性和/或亲和力)的scFv的一个或多个噬菌粒克隆。可将鉴定的噬菌粒克隆转导至表达phiC31整合酶和带有例如IgG接纳体载体(p接纳体)的大肠杆菌菌株。重组事件可将聚腺苷酸化信号位点引入CH基因的3’端附近。此外，重组事件可将哺乳动物启动子和功能蛋白质起始位点引入VL基因的5’。要特别注意，scFv的VH和VL结构域间的接头由能够起以下两种作用的phiC31 36-bp attP位点组成：(i)重和轻可变结构域间的肽接头，和(ii)phiC31整合酶的36-bp功能底物。
在另外的实例中，供体载体(例如pMINERVA)能够与多个接纳体载体(例如p接纳体1、p接纳体2和p接纳体3，如图20B中所示)整合。在某些情况下，供体载体可包括多个不同的直系同源位点特异性重组基序，各自能够与特定的关联位点特异性重组基序重组。例如，pMINERV载体可包括相对scFv基因5’的attP#位点、scFv基因接头区内的attP*位点和相对于scFv基因3’的attP’位点。这些重组基序的每一个能够与可存在于一个或多个不同的接纳体载体中的特定的关联重组基序(例如分别为attB#、attB*和attB’)重组。在某些情况下，多个直系同源关联重组基序可存在于单个接纳体载体中。在其它情况下，各个不同的接纳体载体包括直系同源关联重组基序之一。
例如，图20B显示3种接纳体载体，各包括一个直系同源关联重组基序(如attB#、attB*和attB’所示)。p接纳体1包括LacOP启动子下游和编码CAR的组分(例如TCRζ结构域，和任选荧光标记蛋白，例如GFP)的多核苷酸上游的attB’位点。p接纳体2包括位于哺乳动物启动子(例如CMV启动子)下游和重链恒定结构域上游的attB*位点。p接纳体3包括位于酵母启动子下游的attB#位点。当pMINERVA噬菌粒载体和接纳体载体之一存在于大肠杆菌宿主中时，整合酶蛋白质(例如phiC31整合酶)可使两个载体的attP和attB序列重组，从而产生编码单一嵌合分子(包括按预先确定的方向的归巢和供体载体序列两者)的多核苷酸。可通过直系同源整合酶扩展该系统。在一个实例中，第二整合酶，例如下表2所示那些，可用来催化VL区下游attP#位点(p接纳体1)位的重组。
表2.示例性的整合酶
Figure BDA0003067529460001111
该重组事件可导致例如scFv与T细胞受体融合以产生CAR-T，和/或scFv或IgG的VL基因下游的CL基因产物的交换。其它的直系同源整合酶位点(例如置于如p接纳体3中VH基因的上游)可用来使供体和接纳体载体的启动子、前导肽或其它元件进行交换。
实施例17：剪接启动子和连环启动子
开发了能够在两种或更多种不同的细胞类型中表达的载体，其在每种细胞类型中的表达受不同的调节元件控制。例如，所述载体可包括细菌启动子和哺乳动物启动子，其控制特定基因分别在细菌或哺乳动物细胞中的表达。可采用用于这种多启动子载体(例如包括双重表达启动子的载体)的至少两种不同的策略：(a)剪接化启动子(例如Pro剪接，如图21A中所示)和(b)连环启动子(例如Procat，如图21B中所示)。
在启动子剪接的实例中，使用例如图21A和21C所示布局的Pro剪接载体，scFv可在大肠杆菌中自lac启动子表达，并且在哺乳动物细胞中自启动子(例如CMV或EF1启动子)表达。在Pro剪接载体中，哺乳动物启动子(例如CMV或EF1启动子)控制哺乳动物信号肽(例如哺乳动物IgG重链分泌信号序列)和VH基因的表达。设计Pro剪接载体的哺乳动物信号肽以包括内含子，其包括LacPO启动子/操纵基因和细菌信号肽。细菌信号序列与剪接接纳体位点重叠。因此，在细菌细胞(例如大肠杆菌)中，自哺乳动物内含子内的细菌启动子转录可导致scFv在细菌周质中表达。相比之下，在哺乳动物细胞(或能够内含子剪接的另一种细胞类型)中，位于内含子中的细菌调节序列可通过剪接除去，从而产生哺乳动物信号序列与VH基因的融合物。在某些情况下，内含子核苷酸序列可包括本领域已知的任何启动子共有序列、信号序列共有序列和剪接位点共有序列。
在Procat连环启动子系统的一实例中，将哺乳动物启动子(例如CMV或EF1启动子)、多角体启动子(昆虫表达)和LacPO启动子(细菌表达)按顺序置于核糖体结合位点/KozakfMet、多功能信号肽和VH基因的上游(图21B)。在某些情况下，连环启动子可包括至少一个CMV启动子、LacPO启动子、信号肽(例如IL2信号序列)和待表达的基因，如图21D中所示。在图21B中所示的Procat系统的实例中，将ATG起始位点从多角体和lacPO启动子中除去，使得用于细菌、昆虫和哺乳动物表达的第一个ATG fMet起始位点是相同的。在这种情况下，同一信号序列用于所有3种生物。因此，3个连环启动子的每一个驱动信号肽-VH融合物在合适的细胞类型中表达。在一个实例中，通过测定所需蛋白质产物是否由目标细胞类型产生，来测试本发明的载体。图22显示哺乳动物细胞培养物中轻链或IgG表达的结果。在一个实例中，将掺入gp3剪接基因的轻链基因的表达与没有gp3剪接基因的野生型对照轻链进行了比较(图22A)。还针对其在HEK293细胞中驱动IgG表达的能力，对两个双重表达启动子，Pro剪接和Procat进行了测试。将E1启动子用作对照。Pro剪接和Procat载体两者显示成功地驱动IgG以与由对照启动子诱导的无区分的水平表达(图22B)。
实施例18：抗体文库设计
本发明提供可用于将第一多肽转化至嵌合多肽的方法和组合物。在某些情况下，可能需要将抗体或抗体片段的文库转化至不同类型的嵌合多肽(例如本文所述不同类型的抗体或抗体片段、CAR、泛素连接酶、knocksideways结构域或任何其它多肽类型)的文库中。对于这类抗体文库，可使用本领域已知的任何恒定和可变结构域。在某些情况下，抗体或抗体片段可以是免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、scFv、F(ab')2、Fab、Fab'或Fv。在某些情况下，该文库的抗体或抗体片段在可变结构域的氨基酸序列中可能不同，但在恒定结构域中无不同。在具体情况下，文库中的抗体或抗体片段的每一个可包括相同的恒定构架。可用于这类文库的示例性恒定构架见图23。
实施例19：scFv体内重组至IgG分子的供体-接纳体系统
通过噬菌体展示选择的重组抗体的验证通常需要关联全长免疫球蛋白G(IgG)的早期产生。噬菌体文库输出物通过标准亚克隆转化至完整免疫球蛋白可能是耗时的和/或限制可以评价的克隆数。本文描述了将来自噬菌体展示载体的scFv直接转化至IgG而无需任何体外亚克隆步骤的载体系统。该载体系统，本文称为pMINERVA，利用在大肠杆菌中表达的位点特异性噬菌体整合酶和在哺乳动物细胞中发生的内含子剪接。在pMINERVA系统中，噬菌体展示载体含有支持抗体在大肠杆菌中和哺乳动物细胞中表达的细菌和哺乳动物调节区两者。在一个实例中，单链可变片段(scFv)抗体是作为与gpIII外被蛋白的遗传融合物在噬菌体M13表面表达。理想的是通过转导第二种大肠杆菌菌株将scFv转化至可在哺乳动物细胞中表达的IgG中。在第二种大肠杆菌菌株中，phiC31重组酶使来自接纳体质粒的重链恒定结构域与重链可变结构域融合并在轻链可变结构域上游引入控制元件。在哺乳动物细胞中，剪接除去含有M13 gpIII基因的合成内含子以产生轻链可变结构域与恒定结构域的融合物。使用该系统产生的展示scFv和重组IgG的噬菌体以野生型水平表达并保持正常功能。pMINERVA的使用因此可排除之前将scFv转化至功能IgG Ab中需要的耗费劳力的亚克隆和DNA序列证实步骤。
概要
本文描述了体内将噬菌体展示scFv容易地亚克隆至IgG分子的示例性低成本系统，pMINERVA。该系统利用两个遗传原理，在大肠杆菌中重组和在哺乳动物细胞中剪接。如图24A中所示，pMINERVA噬菌体展示载体含有支持抗体在细菌和哺乳动物系统中表达的细菌和哺乳动物调节区两者。scFv在细菌中作为与噬菌体M13 gp3基因的融合物表达，并通过将噬菌粒转导至第二种大肠杆菌F+菌株而将scFv转化至可在哺乳动物细胞中表达的IgG。在第二种大肠杆菌菌株中，使用phiC31丝氨酸整合酶使来自接纳体质粒的重链恒定结构域(CH)与重链可变结构域(VH)融合并引入轻链可变结构域(VL)上游的控制元件。重组事件的阳性选择是嵌入该系统中。为了产生轻链VL-CL融合物，哺乳动物剪接位点侧接M13 gIII基因，允许在哺乳动物细胞中VL与轻链恒定结构域(CL)融合。因此，使用pMINERV载体系统，单个穿梭载体可用于噬菌体文库构建、噬菌体展示筛选和在哺乳动物细胞中的IgG抗体产生。
材料与方法
细菌菌株和载体。TG1大肠杆菌菌株(F'(traD36 proAB+lacIq lacZΔM15)supEthi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5，(rK-mK-)购自Lucigen。模板噬菌粒pAX1565是具有与噬菌体M13的外被蛋白III融合的单链可变片段抗体(scFv)的噬菌粒pAP-III6的衍生物。pAX1565中的scFv以单克隆抗体赫赛汀(DrugBank#DB00072)为基础，并在VH和VL结构域间含有(Gly4Ser)3接头。
分子生物学。本领域众所周知的标准克隆方法用于克隆、亚克隆、DNA提取、蛋白质纯化、蛋白质和DNA定量。使用位点定向诱变试剂盒(Agilent)进行所需诱变。在GeneArt(Life Technologies，Carlsbad，CA)构建了合成基因。质粒pCDF-1b购自Novagen(EMDMillipore，Billerica，MA)。限制性内切酶、连接酶和聚合酶购自(New England Biolabs，Ipswich，MA)并按照生产商的建议使用。电感受态细胞(Electro-competent cell)购自Lucigen(Middletown，WI)。CHO Free style和HEK293 Free Style细胞获自LifeTechnologies(Carlsbad，CA)。哺乳动物细胞生长培养基购自Life Technologies。
p供体和p接纳体质粒的构建。使用噬菌粒pAPIII6作为p供体构建体的模板载体。两侧是剪接位点的全长M13 gpIII基因由GeneArt(Life Technologies，Carlsbad，CA)合成并使用Sal I和Xho I限制位点克隆至pAPIII6载体。κ轻链(CL)的恒定区和SV40晚期polyA序列由GeneArt合成并使用Xho I限制位点克隆至上述载体。针对方向性对重组体进行序列证实。将基于抗Her2抗体赫赛汀、以phiC31的36bp attP序列作为可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因间的接头的合成scFv克隆至载体的Hind III和Sal I位点之间。通过位点定向诱变(QuikChange，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)将Mlu I位点引入载体中的pho启动子的上游。将合成启动子和前导肽(例如ProCat或Pro剪接)克隆至Mlu I位点和Hind III位点之间，置换scFv基因上游的pho启动子。p供体载体中包括的所有基因和区的起源和参考资料(其每一个通过引用以其整体结合到本文中)列于所示的图25I表中。
为了改造p接纳体载体，phiC31基因通过GeneArt(Life Technologies)合成并使用Not I和Avr II限制位点克隆至pCDF-1b(EMD Millipore，Billerica，MA)。通过GeneArt(Life Technologies)合成了由人EF1启动子、IL-2信号序列、与信号序列符合读框的phiC31的36bp attB序列、人IgG1恒定结构域、核糖体结合位点和间隔基接着氯霉素基因(CAM)、BGH polyA序列和T7转录终止子组成的重链接纳体构建体。使用Acc65 I限制位点将该3.3Kb DNA区克隆至pCDF-1b/phiC31载体以产生p接纳体。对重组体进行了序列证实。p接纳体载体中包括的所有基因和区的起源和参考资料列于图25I中所示的表中。
IgG表达试验载体的构建。使用由轻链(可变轻链(VL)和恒定轻链(CL)区)上游的EF1启动子和重链(可变重链(VH)和恒定重链(CH)区)上游的第二哺乳动物启动子组成的用于IgG表达的单一载体系统以测试pMINERVA系统的各个组分。对于在信号序列和VL之间加入attL序列，使用Not I限制性内切酶(NEB)将attL双链体克隆至IgG表达载体并测序以针对方向性进行筛选。对于在VH和CH之间加入attR序列，按照生产商的方案，进行位点定向诱变以引入36碱基对attR序列(QuikChange，Agilent Technologies)。为了在IgG表达试验载体的VH和CH之间引入两侧是剪接位点的M13 gpIII序列，基因通过GeneArt(LifeTechnologies)合成并使用BsiW I限制位点克隆至IgG表达试验载体。通过测序针对方向性筛选重组体。为了交换驱动含Procat或Pro剪接的IgG的轻链的哺乳动物启动子，启动子序列通过GeneArt(Life Technologies)合成并使用Mlu I和Not I限制位点克隆至IgG表达试验载体。为了交换驱动含Procat的IgG的重链的哺乳动物启动子，Procat序列通过GeneArt(LifeTechnologies)合成并使用EcoR V和Nde I限制位点克隆至IgG表达试验载体。为了交换IgG载体中的VH和VL区，VH基因自商购的人IgG重链表达载体(Invivogen，San Diego，CA)进行PCR扩增并使用Nde I和BsiW I限制性内切酶(NEB)和T4 DNA连接酶(NEB)克隆至IgG表达试验载体。整个轻链(VL和CL)和一段SV40晚期polyA序列自商购的人IgG轻链表达载体(Invivogen)进行PCR扩增并使用Not I和Hpa I限制位点克隆至含有正确的VH的IgG表达试验载体。对重组体进行了序列证实。
DNA转化。在该实施例中，转化反应如下进行：将0.5μl连接产物与50μl TG1电感受态细胞(Lucigen)混合，加入0.1cm gap杯中。使用Gene Pulser(Bio-Rad，按以下设置：1.6kV，200ohms，25μF)将DNA电穿孔至细菌细胞中。加入1ml回收培养基，将电穿孔的细胞转移到14ml培养管中，在37℃下振荡。1小时后，将100μl的每种稀释液接种在含有氨苄西林(100μg/ml)的LB板中，将板在37℃下孵育过夜。按照生产商方案使化学感受态NEB5α细胞(NEB)转化。简单地说，将50μL细胞与1μL DNA在冰上孵育30分钟，在42℃下热激30秒钟，加入250μL回收培养基。在振荡的同时将细胞在37℃下孵育1小时，将100μL接种在含100μg/mL氨苄西林的LB板中。
单克隆噬菌体ELISA。对于含有Pro剪接启动子的载体，由TYE/Amp/葡萄糖板挑出转化的TG1细胞的单个集落放入2ml补充氨苄西林(100μg/ml)和1％葡萄糖的2YT的起子培养物中。将含有Procat载体的单个集落从含有氨苄西林(100μg/ml)的LB板中挑出放入2ml补充氨苄西林(100μg/ml)的LB的起子培养物中。将培养物在振荡的同时在37℃下孵育2-3小时，稀释至50ml其各自的培养基中，在振荡的同时在37℃下再孵育直到达到600nm处的吸光度为0.4。一旦培养物达到对数中期，便将10ml转移到各个15ml圆锥管中，加入5μlKM13辅助噬菌体。在不振荡时在37℃下孵育30分钟，将管以2000x g离心10分钟，吸出上清液。将沉淀重新悬浮于50ml合适的培养基(Pro剪接：补充氨苄西林(100μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和0.1％葡萄糖的2YT；ProCat：补充氨苄西林(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB)中，振荡的同时在30℃下孵育过夜。在孵育过夜后，将培养物以15,000x g离心10分钟。将上清液转移到用特异性靶抗原预包被的ELISA板上。
对于ELISA板包被，将在1X PBS中稀释为2.5μg/ml的100μl/孔抗原加入maxisorpELISA板(ThermoScientific，NUNC)中，在4℃下孵育过夜。将孔用特异性抗原或用无关蛋白质包被用于非特异性结合测试。将孔用PBS(250μl/孔)洗涤3次，用2％PBS中的脱脂奶粉(MPBS)封闭1小时。将孔用PBS洗涤共3次。将100μl含有噬菌体的未稀释的上清液加入ELISA板中，在室温下孵育1小时。将孔用含有0.01％Tween(PBS-T)的PBS洗涤3次接着1小时同与辣根过氧化物酶缀合的抗M13单克隆抗体一起室温孵育(HRP；GE Healthcare，Piscataway，NJ)。通过将100μl TMB Ultra(Pierce，目录号34029)加入各孔中，使ELISA显现，反应用50μl 2M H2SO4终止。在标准读板仪中在450nm处读板，将特异性抗原中含有噬菌体的孔的OD450除以无关蛋白质中相同噬菌体的信号，计算相对于背景的倍数(FOB)。
可溶性IgG抗体的产生和纯化。在细胞培养通风罩中在无菌条件下将IgG表达载体瞬时转染至哺乳动物HEK293(Life Technologies；293-F；目录号R790-07)悬浮细胞中。在转染前一天，使用Freestyle 293表达培养基(Life Technologies)，将HEK293悬浮细胞在30ml总体积中稀释至0.7x106个细胞/ml。当转染当天，将24μg无菌IgG表达载体DNA在3mlFreestyle 293表达培养基中稀释，并涡旋混合10秒钟。向稀释的DNA中加入24μlFectoPRO转染试剂(Polyplus-transfection，New York，NY)，并涡旋混合10秒钟。将DNA-转染试剂混合物在室温下孵育10分钟。将DNA-转染试剂混合物加入在前一天接种的30ml HEK293悬浮细胞的培养物中。在以130rpm振荡的同时，将转染后HEK293细胞在37℃下在8％CO2中孵育72小时，届时加入15ml新的Freestyle 293表达培养基。将培养物在以130rpm振荡时在37℃和8％CO2下再继续孵育48-72小时。将转染的细胞以1,000x g离心10分钟，将含IgG的上清液转移到新的无菌管中。用0.5ml蛋白A珠粒浆液从澄清的上清液中纯化IgG抗体。将蛋白A珠粒用PBS洗涤3次，在摇动的同时与45mL IgG上清液一起在4℃下孵育1小时。将蛋白A珠+IgG混合物倒入空的2ml色谱柱中，通过重力流加载。柱用3mL补充1mM PMSF的PBS洗涤2次，用1.5mL 0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱，并用60μl 1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析洗脱液。使用Coommassie Plus测定试剂盒(ThermoFisher，目录号23236)，定量测定最终纯化的IgG。
蛋白质的人IgG ELISA。对于生物素化抗原，将ELISA板以10μeμl/孔用100μL/孔neutravidin包被)，用3％PBS中的牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭1小时。将孔用1μg/mL生物素化肽(特异性靶标或无关蛋白质)在室温下孵育1小时，之后用PBS(250μL/孔)洗涤3次，再次用3％BSA/PBS封闭1小时。在将孔用PBS洗涤3x后，加入1μg/ml 3％BSA/PBS中的纯化的IgG抗体，在室温下孵育1小时。将孔用PBS+0.01％Tween(PBS-T)洗涤4次，与1:5,000整批稀释的抗人-IgG-HRP(ThermoFisher，目录号AHI0404)一起在室温下孵育1小时。将孔用PBS-T洗涤3次，在2-3分钟孵育的同时用TMB试剂(100μL/孔)检测HRP缀合的第二抗体。反应用2M H2SO4(50μL/孔)终止，在450nm处读取吸光度，将特异性抗原中的含有IgG的孔的OD450除以无关蛋白质中的相同IgG的信号，来计算FOB。
哺乳动物细胞的人IgG ELISA。将稳定表达靶抗原的HEK293细胞和不表达抗原的HEK293细胞以2.3x106个细胞/mL的浓度(0.15mL/孔)加入V底ELISA板(Phenix，目录号MPG-651101)中。将细胞用3％BSA在室温下封闭30分钟，之后以500x g离心4分钟，取出上清液。将纯化的IgG以1μg/mL(100μL/孔)加入细胞中，在振荡的同时在室温下孵育1小时。将细胞用PBS洗涤2x，每次洗涤之间将板以500x g离心4分钟。在振荡的同时将细胞与整批1:5,000的抗人-HRP一起在室温下孵育1小时，将细胞用PBS洗涤2x，转移到预先封闭的V底板中，再次洗涤。将100μL发光试剂(Piece，目录号37069)加入细胞/孔中，并转移白底ELISA板(NUNC，目录号436110)中。在2分钟孵育后，用发光检测器读板，通过将表达靶抗原的HEK293细胞中含有IgG的孔的相对发光单位(RLU)除以不表达靶抗原的HEK293细胞中相同IgG的RLU，计算FOB。
测试phiC31重组酶功能。按照标准方法制备含有大观霉素抗性p接纳体质粒的感受态TG1细胞。按照标准电穿孔程序(上文所述)，将细胞用p供体或模拟重组对照质粒转化。将转化子接种在含有氨苄西林(100μg/ml)或氯霉素(10μg/ml)的LB培养基中。测定氨苄西林与氯霉素抗性转化子的比率。
结果
使用无启动子CamR基因多顺反子信息的phiC31噬菌体整合酶克隆和体内功能测试。噬菌体编码的丝氨酸整合酶介导短attP和attB DNA位点间的定向调节的位点特异性重组而无宿主因子要求。phiC31丝氨酸整合酶可用来诱导大肠杆菌中两种质粒的重组。在该实施例中，使用phiC31使噬菌粒载体(p供体)中的重链可变结构域(VH)与第二质粒(p接纳体)中的重链恒定结构域(CH)融合。这些载体见图24A。为了使该方法可行，scFv的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域间的接头可含有36bp phiC31整合酶识别位点(attP或attB)，其能够起scFv的肽接头和phiC31整合酶的功能底物两者的作用。
将我们的噬菌粒载体中的模式scFv(抗Her2)的VH和VL间的野生型(Gly4Ser)3接头用phiC31整合酶位点(即attP或attB)置换。在大肠杆菌中产生噬菌体-scFv，并在噬菌体ELISA中以靶抗原Her2或无关对照蛋白质背景，针对功能进行了测试。如图24B-24E中所示，含有attP接头的噬菌体以与含有野生型接头的噬菌体相当的活性与Her2选择性结合(图24B)。以attB位点作为scFv中的接头的噬菌体不能够与其特异性抗原结合。
噬菌粒中的attP位点和接纳体质粒中的attB位点之间成功重组在免疫球蛋白的可变重链结构域和恒定重链结构域铰链连接处产生36个碱基对重组的phiC31位点(attR)(图24A)。此外，在前导序列肽和轻链的可变结构域(VL)间产生36个碱基对重组的phiC31位点(attL)(图24C)。在这些连接处含有attR或attL序列的受测IgG分别以野生型水平表达，并识别其各自的靶抗原(图24D和24E)。
为了测试phiC31在我们的系统中的功能，将基因克隆至在构成型大肠杆菌启动子(pCam；pACYC184)控制下的质粒(来源于pCDF-1b；Novagen)，并转化至大肠杆菌菌株TG1中。将无启动子的氯霉素抗性(camR)基因置于相同质粒(p接纳体)的phiC31整合酶attB位点的3’。噬菌粒(p供体)成功整合至p接纳体质粒使大肠杆菌启动子置于p接纳体camR基因的上游，并产生由免疫球蛋白重链和camR基因组成的双顺反子基因对(图25A)。带有这种所得的共整合质粒的细胞从而变成氯霉素抗性的。通过用p供体质粒转化p接纳体TG1菌株，并测量转化至camR的氨苄西林抗性转化子的百分比，来测试大肠杆菌中phiC31介导的整合效率。转化可能只由于成功共整合的结果而发生。在TG1细胞中使用已共整合的质粒，将氯霉素抗性(camR)转化子与氨苄西林抗性(ampR)转化子的比率与camR与ampR转化子比率进行了比较。结果表明phiC31整合酶能够以>90％效率将p供体载体位点特异性重组至p接纳体载体(图25B)。当p供体没有attP位点时，获得无氯霉素抗性集落。
含有M13 gpIII的合成内含子的设计和测试。虽然phiC31介导的重组用来在pMINERVA系统中将VH与CH结构域连接，但scFv中的轻链可变结构域(VL)结构域还可与轻链恒定结构域(CL)整合(图24A)。在真核细胞中，可通过RNA剪接机器，从mRNA有效地除去大的序列。设计了合成内含子，其含有两侧是共有5’和3’剪接位点序列的M13gpIII基因。因此，大肠杆菌中，scFv作为与gpIII基因的遗传融合物在噬菌体M13表面表达，而在哺乳动物细胞中，含有gpIII基因的内含子被切离，得到VL-CL的融合物(图24A)。在不存在适当剪接时，CL将与VL不符合读框，不能产生功能IgG。如图25C中所示，在scFv和gpIII基因之间引入剪接位点不干扰噬菌体产生或功能。在HEK-293细胞中，将来自含内含子的载体的IgG表达与来自不含内含子的原始构建体的表达进行了比较，表明剪接是有效的(图25D；上图)。所测的两种IgG是有功能的，并显示在ELISA中针对靶抗原的相当的活性(图25D，下图)。
双功能启动子的设计和测试：哺乳动物细胞和大肠杆菌中的Pro剪接和Procat表达。使用支持大肠杆菌和哺乳动物两者表达的双功能启动子以使在细菌中产生scFv而在哺乳动物细胞中产生IgG成为可能。测试了两种不同的启动子系统；启动子内含子-剪接系统(Pro剪接)和连环多功能启动子系统(Procat)(图25E-25H)。在Pro剪接系统中，EF1启动子后面是含有内含子的哺乳动物IgG重链分泌信号序列。lac启动子/操纵基因和细菌信号肽包含在哺乳动物内含子内，且细菌信号序列覆盖剪接接纳体位点。因此，大肠杆菌中，自哺乳动物内含子内的细菌lac启动子/操纵基因转录导致细菌周质中scFv的表达，而在哺乳动物细胞中，剪接除去位于内含子中的细菌调节序列，产生哺乳动物信号序列。
在连环启动子系统(Procat)中，哺乳动物启动子的后面是多角体启动子(在昆虫细胞中表达)和细菌启动子。从下游多角体和细菌启动子除去ATG，使得用于细菌、昆虫和哺乳动物表达的第一个ATG fMet起始位点是相同的。在这种情况下，同一信号序列用于所有3种生物。本文开发的Procat使用EF1启动子用于哺乳动物表达、pho启动子用于大肠杆菌表达和IL-2a信号肽用于在两种系统的分泌。以同等水平自两个启动子系统产生展示模式scFv的噬菌体(图25G)。此外，在HEK-293细胞中来自双重启动子系统的IgG产量等于使用仅EF1启动子的产量(图25H-25J)。
因此，通过将所有这些元件组合在一起，pMINERVA系统完全排除了目前将scFv转化至功能IgG抗体需要的耗费劳力的亚克隆和DNA序列证实步骤。
论述
描述于本实施例是通过将抗体片段高通量转化至全长免疫球蛋白G(IgG)分子中(可在标准免疫测定中直接验证)的载体系统。在该实施例中描述的筛选平台适宜与单链可变片段(scFv)一起使用，但也可与本领域已知的任何其它多肽支架一起使用，包括但不限于Fab和酵母展示文库。
pMINERVA系统利用噬菌体整合酶phiC31诱导大肠杆菌中供体和接纳体质粒间的位点特异性重组以产生抗体重链可变结构域(VH)与重链恒定结构域(CH)的融合物，并将调节元件引入可变轻链基因(VL)的上游。重组酶例如Cre和FLP还可用于基因组工程。然而，如本实施例所示，phiC31是优选的，因为在诱导大肠杆菌中两种质粒间重组的效率大于90％。本领域已知的许多其它的丝氨酸整合酶和酪氨酸整合酶(例如BxB1和λ)也可介导单向的位点特异性重组，同样可用于本发明。
phiC31整合酶具有36个碱基对(即等于12个氨基酸)识别序列。pMINERVA系统利用在scFv的接头中和随后重链可变和恒定结构域之间的铰链连接处和信号序列和轻链可变结构域之间这些整合酶连接位点的整合。如本文所示，这12个氨基酸序列不干扰噬菌体产生或IgG表达和特异性重组抗体的功能。在某些情况下，改变所得接头肽成为更柔性的接头序列的attP或attB突变可用来支持有效整合。另外，侧接整合酶连接位点的剪接位点可整合至载体以产生无缝IgG。如本文所示，哺乳动物剪接可用来切除M13 gpIII基因，并使轻链可变结构域(VL)与轻链恒定结构域(CL)融合。内含子剪接进一步显示在哺乳动物细胞中提高重组蛋白的表达。
本文描述了对于大肠杆菌和哺乳动物表达是有效的两个双重表达启动子系统。一个系统利用哺乳动物剪接以切除细菌表达元件，第二个系统使用连环启动子用于哺乳动物、昆虫细胞和大肠杆菌表达。连环启动子系统需要相同的信号肽以在大肠杆菌和哺乳动物细胞中运作。如上述实验所示，IL-2信号序列能够在细菌中起分泌信号的作用。在哺乳动物和细菌系统两种运作的其它信号肽是本领域已知的，并可备选地用于表达。使用人EF1启动子以建造本文所述的双重功能启动子系统，但可使用使得在哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达成为可能的其它启动子(例如CMV启动子)取而代之。连环启动子系统进一步包括多角体启动子，使得昆虫细胞可用作HEK-293细胞的备选物用于高通量IgG生产。
在人IgG1抗体中将现有系统模型化。然而，可构建其它的p接纳体质粒以扩展该系统的效用。可产生含有其它人免疫球蛋白同种型(例如IgG2、IgG3、IgG4和IgM)的接纳体载体以及含有小鼠或兔抗体的恒定结构域的接纳体载体。还可产生3’融合物的不同类型，包括但不限于酶融合物、蛋白质纯化标签、标记和可将蛋白质引向内体的融合物-标签。此外，可构建接纳体和供体质粒两者用于转化至本领域已知的其它嵌合蛋白(例如抗体片段和嵌合抗原受体)和/或自其中转化。
实施例20：双重表达启动子系统
本文所述scFv-IgG重排方法可利用亲和试剂上游的双重表达启动子系统。迄今已成功测试了两个这类双重表达启动子系统：启动子内含子-剪接系统(Pro剪接)和连环多功能启动子系统(Procat)(图26A-26B)。在两个系统中，scFv在大肠杆菌中自lacOP操纵基因/启动子表达。使用CMV或EF1启动子已成功测试了在哺乳动物细胞培养物中自Pro剪接和Procat启动子的表达(图26C-26E)。剪接和共整合不显著影响HEK293细胞中的表达或功能性。
实施例21：其它p接纳体质粒的研发
在该实施例中，产生了一组p接纳体质粒例如用于pMINERVA系统(例如如本文所述)。在该实施例中pMINERVA系统的形式利用phiC31整合酶在细菌使供体噬菌粒与独特的接纳体质粒重组以有效地产生IgG表达载体，pMINERVA(图27)。在哺乳动物细胞中，内在细胞剪接机制然后可除去pMINERVA的细菌组分，得到功能IgG分子。用双功能的连环启动子系统(例如如本文所述)，scFv可作为与M13 gpIII外被蛋白的融合物或在整合之前作为可溶性蛋白质在大肠杆菌中和在整合后在哺乳动物细胞中作为完整IgG分子表达。
实验设计和结果
pMINERVA系统具有独特的灵活性，允许构建不同的3’融合物以扩展该系统的效用。融合物的类型可包括例如IgG分子不同的同种型、酶融合物、蛋白质纯化标签、CAR-T和可将蛋白质引向内体的融合物-标签。可采用例如标准分子生物学方法构建3’融合物标签。3’融合物构建体的非限制性实例见图28A。功能性的测试可遵循每个标签类型的已确立的方案。在一个实例中，可将编码scFv的p接纳体载体转化至编码IgG的pMINERVA整合载体中(图28B)。
其它的p接纳体载体的测试。含有具有人IgG1恒定结构域(hCH)p接纳体、兔恒定结构域(rCH)或含C端FLAG标签的兔恒定结构域(rCH-FLAG)之一的p接纳体的NEB5αF’菌株大肠杆菌细胞用含有抗Her2 p供体噬菌粒的噬菌体(具有人VH、VL和CLκ结构域)转导。自p接纳体表达的phiC31整合酶催化噬菌粒中的attP位点和p接纳体质粒中的attB位点间重组。在3小时回收时间后，将细胞接种在含氯霉素(其选择共整合)的板中。从氯霉素抗性集落提取质粒DNA，在用SYBR safe染色的1％琼脂糖凝胶上分析。整合载体的大小约为17千碱基。证实了载体正确的共整合(图29)，产生了预期大小的质粒。还对载体进行了测序以证实正确整合。
为了测定整合载体是否能够产生所需的IgG，将HEK-293Freestyle细胞(ThermoFisher)用整合载体瞬时转染，使用蛋白A树脂从培养上清液纯化IgG。在非还原(图30A)或还原(图30B)条件下通过SDS-PAGE分析纯化的抗体。完全人抗体和人-兔杂合嵌合体两者均得以表达。
以靶抗原Her2的滴定浓度(.01-1μg/ml)为背景，通过ELISA分析纯化的IgG(在1μg/ml的浓度下)(图31)。当与HRP缀合的蛋白A用作第二抗体以检测IgG时，完全人抗Her2IgG1抗体(H-H)显示与兔杂合嵌合体(H-R和H-R-FLAG；图31A)相当的活性。在第二个实验中，HRP缀合的抗人多克隆抗体用作第二抗体以检测IgG。由于IgG的可变结构域和轻链来源于人，所以兔嵌合抗体显示抗人第二抗有一定交叉反应(图31B)。最后，当HRP缀合的抗兔多克隆抗体用作第二抗体用于检测时，两种兔嵌合抗体显示良好信号，与完全人IgG有最低交叉反应(图31C)。
还以靶抗原Her2的滴定浓度(.01-1μg/ml)为背景通过ELISA分析了纯化的IgG(在1μg/ml的浓度下)。HRP缀合的抗FLAG多克隆抗体用作第二抗用于检测IgG。仅含C端FLAG标签的人-兔杂合嵌合体(H-R-FLAG)在ELISA中显示信号，正如所预期的(图32)。
p接纳体变体
在一个实例中，可构建多种标签类型的p接纳体质粒(例如图28A所列的前5个标签类型)。预期可分别构建例如小鼠、兔、牛和人免疫球蛋白的5个主要类别(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的Fc区的p接纳体质粒。重链多肽中的差异可允许这些免疫球蛋白在不同类型的免疫应答和在免疫应答的特定阶段起作用。造成这些差异的多肽蛋白质序列一般可存在于Fc片段中。在有5个不同类型的重链同时，有两个主要的轻链类型：kappa(κ)和lambda(λ)。不同的同种型可显示不同的结构和效应子性质，例如，依赖补体的细胞毒性(CDC)和依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。这些性质可能是在选择用于特定治疗性抗体的主干中的关键性质。例如，在人中，有4种IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(按血清中递减浓度的顺序编号)。不同亚类间的差异一般小于不同类别间的差异。
其它实施方案
本说明书提及的所有出版物、专利申请和专利通过引用结合到本文中。
虽然本发明联合具体实施方案进行了描述，但应了解它能够有更多的修改。因此，本申请欲涵盖总体上遵循本发明原则的本发明的任何变动、应用或修改，包括与本领域内已知的或常规实践范围内的本公开内容的偏离。
序列表
<110> 艾希奥美公司
<120> 用于产生嵌合多肽的方法和组合物
<130> 50881-008WO3
<150> US 62/220,060
<151> 2015-09-17
<150> US 62/174,994
<151> 2015-06-12
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<221> 其它特征
<222> (84)..(84)
<223> N 为C、T、G 或A
<400> 36
tcatcggtcg tataatttgt ggaaggagga ggccaccatg ccccaactgg ggtaaccttt 60
gggctccccg ggcgcgtact gaantataca aaa 93
<210> 37
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gtggggtgcc agggcgtgcc 60
cttgggctcc ccgggcgcgt aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca 120
ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc 180
aatgtaacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag 240
aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaaggct 300
catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtggtcac 360
ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac 420
cacgacgatt tccggcagtt t 441
<210> 38
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Leu Phe Thr Val Pro Gly Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ser His Val Gly
1 5 10 15
Cys Gly Gly Val Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Ser Asn Gly Glu
20 25 30
Lys Asn His Trp Leu Tyr His Arg Tyr Ile Pro Met Ala Ser Arg Thr
35 40 45
Phe Gly Ile Ser Val Ser Cys Ser Met Tyr Leu Pro Asp Arg Ser Ala
50 55 60
Gly Tyr Tyr Gly Leu Phe Lys Asp Arg Lys Glu Lys Ala Gln Val Leu
65 70 75 80
Ser Gly Leu Tyr Ser His Ser Cys Pro Pro Asp Glu Cys Ser Ser Gly
85 90 95
Ile Pro Tyr Gly Asn Glu Arg Arg Ala Gly Asp Met Gly Cys Ser Pro
100 105 110
Leu Leu His Arg Phe Pro Ala Asn Asn Val Phe Ile Ala Leu Glu Ile
115 120 125
Pro Arg Arg Phe Pro Ala Val
130 135
<210> 39
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Phe Leu Arg Phe Leu Ala Phe Cys Trp Pro Phe Ala His Met Trp Gly
1 5 10 15
Ala Arg Ala Cys Pro Trp Ala Pro Arg Ala Arg Lys Glu Ala Lys Met
20 25 30
Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp His
35 40 45
Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr Tyr
50 55 60
Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe Leu Lys Thr Val Lys
65 70 75 80
Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile His Ile Leu Ala Arg
85 90 95
Leu Met Asn Ala His Pro Glu Phe Arg Met Ala Met Lys Asp Gly Glu
100 105 110
Leu Val Leu Trp Asp Ser Val His Pro Cys Tyr Thr Val Phe His Glu
115 120 125
Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu Tyr His Asp Asp Phe
130 135 140
Arg Gln Phe
145
<210> 40
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Phe Tyr Gly Ser Trp Pro Phe Ala Gly Leu Leu Leu Thr Cys Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Arg Ala Leu Gly Leu Pro Gly Arg Val Arg Lys Leu Lys Trp
20 25 30
Arg Lys Lys Ser Leu Asp Ile Pro Pro Leu Ile Tyr Pro Asn Gly Ile
35 40 45
Val Lys Asn Ile Leu Arg His Phe Ser Gln Leu Leu Asn Val Pro Ile
50 55 60
Thr Arg Pro Phe Ser Trp Ile Leu Arg Pro Phe Arg Pro Arg Lys Ile
65 70 75 80
Ser Thr Ser Phe Ile Arg Pro Leu Phe Thr Phe Leu Pro Ala Met Leu
85 90 95
Ile Arg Asn Ser Val Trp Gln Lys Thr Val Ser Trp Tyr Gly Ile Val
100 105 110
Phe Thr Leu Val Thr Pro Phe Ser Met Ser Lys Leu Lys Arg Phe His
115 120 125
Arg Ser Gly Val Asn Thr Thr Thr Ile Ser Gly Ser
130 135 140
<210> 41
<211> 661
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 60
actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctagcggcc cgccccaact 120
ggggtaacct ttgagttctc tcagttgggg atgacccagg gtgttgttac cggtgttgat 180
acctatgccg gtgcatatga tcgtcagagc cctgaacgtg aaaatagcag cgcagcaagt 240
ccggcaaccc agcgtagcgc aaatgaacat aaagcagccg atctgcagcg tgaagttgaa 300
cgtgatggtg gtcgttttcg ttttgttggt cattttagcg aagcaccggg tacaagcgca 360
tttggcaccg cagaacgtcc ggaatttgaa cgtattctga atgaatgtcg tgcaggtcgt 420
ctgaacatga ttattgttta tgatgtgagc cgttttagcc gtctgaaagt tatggatgca 480
attccgattg ttagcgaact gctggcactg ggtgttacca ttgttagcac ccaagaaggt 540
gtttttcgtc agggtaatgt tatggatctg attcatctga ttatgcgtct ggatgcaagc 600
cataaagaaa gcagcctgaa aagcgcaaaa atcctggata ccaaaaacct gcagcgcgaa 660
c 661
<210> 42
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Lys Met Arg Arg Ser Ala Arg Lys Arg Phe Gln Leu Ser Pro Asn Lys
1 5 10 15
Leu Thr Thr Gly Arg Ile Phe Val Ile Glu Ile Phe Arg Ser Arg Pro
20 25 30
Pro Gln Leu Gly Pro Leu Ser Ser Leu Ser Trp Gly Pro Arg Val Leu
35 40 45
Leu Pro Val Leu Ile Pro Met Pro Val His Met Ile Val Arg Ala Val
50 55 60
Asn Val Lys Leu Ala Ala Gln Gln Val Arg Gln Pro Ser Val Ala Gln
65 70 75 80
Met Lys Ile Lys Gln Pro Ile Cys Ser Val Lys Leu Asn Val Met Val
85 90 95
Val Val Phe Val Leu Leu Val Ile Leu Ala Lys His Arg Val Gln Ala
100 105 110
His Leu Ala Pro Gln Asn Val Arg Asn Leu Asn Val Phe Met Asn Val
115 120 125
Val Gln Val Val Thr Leu Leu Phe Met Met Ala Val Leu Ala Val Lys
130 135 140
Leu Trp Met Gly Phe Arg Leu Leu Ala Asn Cys Trp His Trp Val Leu
145 150 155 160
Pro Leu Leu Ala Pro Lys Lys Val Phe Phe Val Arg Val Met Leu Trp
165 170 175
Ile Phe Ile Leu Cys Val Trp Met Gln Ala Ile Lys Lys Ala Ala Lys
180 185 190
Ala Gln Lys Ser Trp Ile Pro Lys Thr Cys Ser Ala Asn
195 200 205
<210> 43
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Lys Asp Val Asp Arg His Val Arg Gly Ser Asn Phe His His Asn Glu
1 5 10 15
Ile Arg Ser Leu Pro Gly Val Phe Phe Glu Leu Ser Arg Phe Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Gly Arg Pro Asn Trp Gly Asn Leu Val Leu Ser Val Gly Asp
35 40 45
Asp Pro Gly Cys Cys Tyr Arg Cys Tyr Leu Cys Arg Cys Ile Ser Ser
50 55 60
Glu Pro Thr Lys Gln Arg Ser Lys Ser Gly Asn Pro Ala Arg Lys Arg
65 70 75 80
Ser Ser Arg Ser Ala Ala Ser Thr Trp Trp Ser Phe Ser Phe Cys Trp
85 90 95
Ser Phe Arg Ser Thr Gly Tyr Lys Arg Ile Trp His Arg Arg Thr Ser
100 105 110
Gly Ile Thr Tyr Ser Glu Met Ser Cys Arg Ser Ser Glu His Asp Tyr
115 120 125
Cys Leu Cys Glu Pro Phe Pro Ser Glu Ser Tyr Gly Cys Asn Ser Asp
130 135 140
Cys Arg Thr Ala Gly Thr Gly Cys Tyr His Cys His Pro Arg Arg Cys
145 150 155 160
Phe Ser Ser Gly Cys Tyr Gly Ser Asp Ser Ser Asp Tyr Ala Ser Gly
165 170 175
Cys Lys Pro Arg Lys Gln Pro Glu Lys Arg Lys Asn Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Lys Pro Ala Ala Arg
195
<210> 44
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Asn Glu Thr Leu Ile Gly Thr Glu Val Pro Thr Phe Thr Ile Met Lys
1 5 10 15
Asp His Tyr Arg Ala Tyr Phe Leu Ser Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Pro Thr Gly Val Thr Phe Glu Phe Ser Gln Leu Gly Met
35 40 45
Thr Gln Gly Val Val Thr Gly Val Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr Asp
50 55 60
Arg Gln Ser Arg Glu Arg Glu Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr
65 70 75 80
Gln Arg Ser Ala His Glu Asp Lys Ala Ala Asp Leu Gln Arg Glu Val
85 90 95
Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu Ala
100 105 110
Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu Arg
115 120 125
Ile Leu Asn Glu Cys Arg Ala Gly Arg Leu Asn Met Ile Ile Val Tyr
130 135 140
Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Val Met Asp Ala Ile Pro Ile
145 150 155 160
Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu Gly Val Thr Ile Val Ser Thr Gln Glu
165 170 175
Gly Val Phe Arg Gln Gly Asn Val Met Asp Leu Ile His Leu Ile Met
180 185 190
Arg Leu Asp Ala Ser His Lys Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys Ile
195 200 205
Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gln Arg Glu
210 215
<210> 45
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 60
actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctagcggcc gccccaactg 120
gggtaacctt tgggctcccc gggcgcgtaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg 180
atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc 240
agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac 300
cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat 360
gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag 420
tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag 480
tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta 540
<210> 46
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Lys Met Arg Arg Ser Ala Arg Lys Arg Phe Gln Leu Ser Pro Asn Lys
1 5 10 15
Ile Thr Thr Gly Arg Ile Phe Val Ile Glu Ile Phe Arg Ser Arg Pro
20 25 30
Pro Gln Leu Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Ser Asn Gly Glu
35 40 45
Lys Asn His Trp Ile Tyr His Arg Tyr Ile Pro Met Ala Ser Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Ile Ser Val Ser Cys Ser Met Tyr Leu Pro Asp Arg Ser Ala
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Gly Leu Phe Lys Asp Arg Lys Glu Lys Ala Gln Val Leu
85 90 95
Ser Gly Leu Tyr Ser His Ser Cys Pro Pro Asp Glu Cys Ser Ser Gly
100 105 110
Ile Pro Tyr Gly Asn Glu Arg Arg Ala Gly Asp Met Gly Cys Ser Pro
115 120 125
Leu Leu His Arg Phe Pro Ala Asn Asn Val Phe Ile Ala Leu Glu Ile
130 135 140
Pro Arg Arg Phe Pro Ala Val Ser Thr His Ile Phe Ala Arg Cys Gly
145 150 155 160
Val Leu
<210> 47
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Lys Asp Val Asp Arg His Val Arg Gly Ser Asn Phe His His Asn Glu
1 5 10 15
Ile Arg Ser Leu Pro Gly Val Phe Phe Glu Leu Ser Arg Phe Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Gly Arg Pro Asn Trp Gly Asn Leu Trp Ala Pro Arg Ala Arg
35 40 45
Lys Glu Ala Lys Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp
50 55 60
Ile Ser Gln Trp His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gly Ser Val
65 70 75 80
Ala Gln Cys Thr Tyr Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe
85 90 95
Leu Lys Thr Val Lys Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile
100 105 110
His Ile Leu Ala Arg Leu Met Asn Ala His Pro Glu Phe Arg Met Ala
115 120 125
Met Lys Asp Gly Glu Leu Val Ile Trp Asp Ser Val His Pro Cys Tyr
130 135 140
Thr Val Phe His Glu Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu
145 150 155 160
Tyr His Asp Asp Phe Arg Gln Phe Leu His Ile Tyr Ser Gln Asp Val
165 170 175
Ala Cys
<210> 48
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asn Glu Thr Leu Ile Gly Thr Glu Val Pro Thr Phe Thr Ile Met Lys
1 5 10 15
Asp His Tyr Arg Ala Tyr Phe Leu Ser Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Pro Thr Gly Val Thr Phe Gly Leu Pro Gly Arg Val Arg
35 40 45
Lys Leu Lys Trp Arg Lys Lys Ser Leu Asp Ile Pro Pro Leu Ile Tyr
50 55 60
Pro Asn Gly Ile Val Lys Asn Ile Leu Arg His Phe Ser Gln Leu Leu
65 70 75 80
Asn Val Pro Ile Thr Arg Pro Phe Ser Trp Ile Leu Arg Pro Phe Arg
85 90 95
Pro Arg Lys Ile Ser Thr Ser Phe Ile Arg Pro Leu Phe Thr Phe Leu
100 105 110
Pro Ala Met Leu Ile Arg Asn Ser Val Trp Gln Lys Thr Val Ser Trp
115 120 125
Tyr Gly Ile Val Phe Thr Leu Val Thr Pro Phe Ser Met Ser Lys Leu
130 135 140
Lys Arg Phe His Arg Ser Gly Val Asn Thr Thr Thr Ile Ser Gly Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Thr Tyr Ile Arg Lys Met Trp Arg Val
165 170
<210> 49
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
tggggtcagg gcaccctggt taccgttagc agtgccccaa ctggggtaac ctttgagttc 60
tctcagttgg gggacatcca gatgacccag agcccgagc 99
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Gly Val
1 5 10 15
Thr Phe Glu Phe Ser Gln Leu Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ser
<210> 51
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
attgcactaa gtcttgcact tgtcacgaat tcgggggtgc cagggcgtgc ccttgggctc 60
cccgggcgcg tagctagc 78
<210> 52
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu Val Thr Asn Ser Gly Val Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ala Leu Gly Leu Pro Gly Arg Val Ala Ser
20 25
<210> 53
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
tggggtcagg gcaccctggt taccgttagc agtgccccaa ctggggtaac ctttgggctc 60
cccgggcgcg tagctagc 78
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Gly Val
1 5 10 15
Thr Phe Gly Leu Pro Gly Arg Val Ala Ser
20 25

Claims (19)

1.一种将单链可变片段(scFv)转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.第一载体，其包含编码包含scFv的第一多肽的第一多核苷酸，所述scFv包含轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，编码所述接头区的所述第一多核苷酸的部分包含第一位点特异性重组基序；
ii.第二载体，其包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和
iii.重组酶，其能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组，和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下部分的嵌合多肽的重组载体：
i.所述轻链可变结构域或所述重链可变结构域，和
ii.所述第二多肽或其部分；
其中所述嵌合多肽不是scFv。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第二载体和/或所述第一载体包含编码至少一种结合部分恒定区的多核苷酸，所述结合部分恒定区例如为CH1、CH2、CH3或CL结构域。
3.根据权利要求2的方法，其中所述第二载体和所述第一载体的每一种都包含编码至少一种结合部分恒定区的多核苷酸，所述结合部分恒定区例如为CH1、CH2、CH3或CL结构域。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述嵌合多肽选自IgG、Fab、F(ab')2和Fab'。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第二载体和/或所述第一载体是质粒或噬菌粒。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第一载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中当在所述第一细胞类型中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合，其中所述蛋白质片段优选包含病毒外被蛋白，例如M13gpIII，并且优选另外包含细菌信号肽。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第一多核苷酸含有包含内含子调节元件的内含子，其中所述内含子调节元件在原核细胞中控制所述第一多肽或其部分的表达。
9.一种试剂盒或组合物，其包含：
(a)第一载体，其包含编码包含scFv的第一多肽的第一多核苷酸，所述scFv包含轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，编码所述接头区的所述第一多核苷酸的部分包含第一位点特异性重组基序；
(b)第二载体，其包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；以及
可选的
(c)重组酶，其能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组；
其中所述第一载体和所述第二载体的重组形成重组载体，所述重组载体编码包含以下部分的嵌合多肽：
i.所述轻链可变结构域或所述重链可变结构域，和
ii.所述第二多肽或其部分；
其中所述第一载体和/或所述第二载体包含编码至少一种结合部分恒定区的多核苷酸，所述结合部分恒定区例如为CH1、CH2、CH3或CL结构域。
10.根据权利要求9的试剂盒或组合物，其中所述第二载体和所述第一载体的每一种都包含编码至少一种结合部分恒定区的多核苷酸，所述结合部分恒定区例如为CH1、CH2、CH3或CL结构域。
11.根据权利要求9或10的试剂盒或组合物，其中所述第一载体包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达，所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达。
12.根据权利要求9至11中任一项的试剂盒或组合物，其中当在所述第一细胞类型中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合，其中所述蛋白质片段优选包含病毒外被蛋白，例如M13 gpIII，并且优选另外包含细菌信号肽。
13.根据权利要求9至12中任一项的试剂盒或组合物，其中所述第一多核苷酸含有包含内含子调节元件的内含子，其中所述内含子调节元件在原核细胞中控制所述第一多肽或其部分的表达。
14.一种载体，所述载体包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码包含scFv的第一多肽，所述scFv包含轻链可变结构域、接头区和重链可变结构域，编码所述接头区的所述第一多核苷酸的部分包含第一位点特异性重组基序，所述载体还包含编码至少一种结合部分恒定区的多核苷酸，所述结合部分恒定区例如为CH1、CH2、CH3或CL结构域，并且所述载体还包含彼此相邻定位的多个不同的调节元件，其中所述调节元件之一在第一细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达，并且所述调节元件的另一个在第二细胞类型中控制所述第一多肽或其部分的表达。
15.根据权利要求14的载体，其中当在所述第一细胞类型中表达时所述第一多肽或其部分与蛋白质片段融合，其中所述蛋白质片段优选包含病毒外被蛋白，例如M13 gpIII，并且优选另外包含细菌信号肽。
16.一种将单链可变片段(scFv)转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括
(a)提供以从5’到3’的顺序包含以下的第一载体，
第一哺乳动物表达控制基序，
第一大肠杆菌表达控制基序，
编码scFv的重链可变区(VH)的序列，
第一位点特异性重组基序，
编码scFv的轻链可变区(VL)的序列，
5’哺乳动物剪接位点(Mam5’SS)，
融合展示蛋白序列，
3’哺乳动物剪接位点(Mam3’SS)，和
编码轻链恒定区(CL)的序列，和
(b)提供以从5’到3’的顺序包含以下的第二载体，
第二哺乳动物表达控制基序，
第二位点特异性重组基序，和
编码多肽的序列；和
(c)在重组酶存在下使第一载体和第二载体接触，
其中所述重组酶使第一载体和第二载体以位点特异性方式组合形成整合载体，其中所述整合载体表达与CL融合的VL和与所述多肽融合的单独VH，
从而在表达时将scFv转化至嵌合多肽。
17.一种将第一多肽转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，其中所述第一多核苷酸的第一多肽编码区包含第一位点特异性重组基序；
ii.包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下的嵌合多肽的重组载体：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
18.一种将第一多肽转化至嵌合多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供：
i.包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一载体，所述第一多核苷酸含有包含第一位点特异性重组基序的内含子；
ii.包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸的第二载体；和
iii.能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；和
(b)用所述重组酶使所述第一载体和所述第二载体重组，从而形成编码包含以下的嵌合多肽的重组载体：
i.所述第一多肽或其部分，和
ii.所述第二多肽或其部分。
19.一种将第一多肽转化至至少两种嵌合多肽之一的方法，所述方法包括：
(a)提供第一载体，其包含编码包含第一位点特异性重组基序和备选位点特异性重组基序的第一多肽的第一多核苷酸，和
i.第二载体，其包含第二位点特异性重组基序和编码第二多肽的第二多核苷酸；和能够使所述第一位点特异性重组基序与所述第二位点特异性重组基序重组的重组酶；或
ii.第三载体，其包含不同于所述第一位点特异性重组基序的第三位点特异性重组基序和编码备选多肽的备选多核苷酸；和能够使所述备选位点特异性重组基序与所述第三位点特异性重组基序重组的备选重组酶；和
(b)使所述第一载体
i.与所述第二载体用所述重组酶进行重组，从而形成编码包含所述第一多肽或其部分和所述第二多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体；和/或
ii.与所述第三载体用所述备选重组酶进行重组，从而形成编码包含所述第一多肽或其部分和所述备选多肽或其部分的嵌合多肽的重组载体。
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