CN113307737A - Ⅱ类组织相容性复合体表达增强化合物及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达增强化合物、其制备方法及应用，本申请通过实验验证，所述化合物对Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达增强效果显著，对增强Ⅱ类组织相容性复合体肿瘤新生抗原呈递促进肿瘤组织CD4+T细胞侵润效果显著，单独或与现有免疫治疗手段药物联用对肿瘤生长抑制效果显著。

Description

Ⅱ类组织相容性复合体表达增强化合物及制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术，特别是涉及一种Ⅱ类组织相容性复合体表达增强化合物及制备方法与应用。
背景技术
组织相容性复合体有两类：Ⅰ类组织相容性复合体(MHC classⅠ)和Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)。组织相容性复合体负责将抗原包括病原产生的抗原和癌症产生的肿瘤新生抗原(neo-antigen)呈递给机体免疫识别从而诱导机体发挥抗病原免疫和抗肿瘤免疫应答。其中Ⅰ类组织相容性复合体(MHC classⅠ)将病原抗原或肿瘤新生抗原呈递给CD8+T细胞识别并诱导CD8+T细胞发挥免疫应答反应；Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)将病原抗原或肿瘤新生抗原呈递给CD4+T细胞识别并诱导CD4+T细胞发挥免疫应答反应。
Ⅰ类组织相容性复合体(MHC classⅠ)和Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达是机体有效呈递病原抗原或肿瘤新生抗原发挥免疫反应的基础。以癌症为例，现有癌症免疫治疗(Cancer Immunotherapy)包括细胞过继疗法(比如CAR-T等)、免疫筛查点疗法(比如PD1/PDL1、CTLA4等免疫筛查点抗体)和肿瘤新生抗原疫苗(Neo-antigen vaccines)，并在临床一部分病人中取得了良好治疗效果，但多数病人却对现有疗法没有治疗反应。最近的研究数据发现在肿瘤免疫治疗手段发挥有效治疗肿瘤的效应中，除了呈递肿瘤新生抗原的Ⅰ类组织相容性复合体(MHC classⅠ)及其调控的CD8+T细胞外，同样需要呈递肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)及其调控的CD4+T细胞。使用激活呈递肿瘤新生抗原的相容性复合体Ⅱ(MHC classⅡ)及其调控的CD4+T细胞的药物，一方面可以单独实现抗肿瘤效应，另一方面通过联合现有免疫治疗手段提高免疫疗法对肿瘤的治疗效果；同时，肿瘤更容易被彻底根除，也不太可能对用于治疗病人的肿瘤免疫治疗手段产生耐药性。
已有系列化合物比如DNA甲基转移酶抑制剂5-azacytidine(AZA)和Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶(class I HDAC)抑制剂entinostat可以增强Ⅰ类组织相容性复合体表达，并应用于增强Ⅰ类组织相容性复合体肿瘤新生抗原呈递激活CD8+T细胞免疫应答，从而有效增强现有免疫治疗手段的治疗效果。然而增强Ⅱ类相容性复合体表达的药物，却仍然是个空白。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达增强化合物，并提供了其制备方法与制药应用。
技术方案：本申请公开了式Ⅰ所示的化合物或药学上可接受的盐，
Figure BDA0003075468560000011
式中，Y是共价键经取代或未经取代的直链烃基；R1-R6独立地为经取代或未经取代的烷基。
其中，R1-R6相同或不同；直链烃基是亚烷基，即-(CH2)x-，其中一个或多个(优选一个)亚甲基任选地被连接基取代；X是正整数(例如，在1和10之间)、优选在1和6之间并且更优选1。
进一步的，所述取代基团为不成环或成环基团，构成取代基团骨架的原子选自碳原子、氮原子、硫原子、氧原子。R1-R6合适的连接基团包括酮(-C(O)-)、烯烃、炔烃、亚苯基、醚(-O-)、硫醚(-S-)或胺-N-。
进一步优选的，Y是-CH2-。
进一步优选的，R1-R5是甲基。
进一步优选的，R6优选为经取代或未经取代的烷基或衍生物，具体优选自-CH2-O-CO-C6H5、-CH2-O-CH3、-CH3、-CH2-S-CH3、-CH2-O-CH2-COOH、-CH2-OCH2C6H3(3,5-OH)、-CH2-O-CO-C6H2(3,4,5-OH)、4-吡啶基哌嗪。
最优选的，所述化合物选自以下化合物：
Figure BDA0003075468560000021
Figure BDA0003075468560000031
本申请还公开了所述化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以异植物醇为原料合成化合物B：异植物醇在酸或盐存在下，以高锰酸钾氧化得化合物A，再以甲基三苯基溴化膦和强碱与化合物A反应，得化合物B；所述酸包括盐酸、硫酸、醋酸，所述强碱包括正丁基锂、二异丙基胺基锂、六甲基硅基氨基锂、六甲基硅基氨基钠、六甲基硅基氨基钾。
Figure BDA0003075468560000032
(2)化合物B制备得到化合物C：先后以9-硼双环(3,3,1)-壬烷和双氧水的NaOH溶液与化合物B反应，得化合物C；
Figure BDA0003075468560000033
(3)化合物C制备得到化合物D：以对甲苯磺酰氯和碱与化合物C反应，得化合物D；所述碱包括三乙胺、吡啶、乙基二异丙基胺等三烷基胺和碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱。
Figure BDA0003075468560000034
(4)通过化合物B、C或D制备得到式Ⅰ所示的化合物。
具体的，本申请优选化合物1-8的制备方法如下：
以化合物C合成化合物(1)：
Figure BDA0003075468560000035
以苯甲酰氯和碱与化合物C反应，得化合物(1)，其中，碱包括三乙胺、吡啶、乙基二异丙基胺等三烷基胺和碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱。
以化合物D合成化合物(2)：
Figure BDA0003075468560000036
以甲醇钠与化合物D反应，得化合物(2)。
以化合物B合成化合物(3)：
Figure BDA0003075468560000041
在金属催化剂存在下，以氢气与化合物B反应，得化合物(3)，其中，金属催化剂包括Pt及其盐、Pd及其盐、镍及其盐、钯碳、Raney镍。
以化合物D合成化合物(4)：
Figure BDA0003075468560000042
以甲硫醇钠与化合物D反应，得化合物(4)。
以化合物C合成化合物(5)：
Figure BDA0003075468560000043
以NaH和溴乙酸乙酯与化合物C反应得中间产物，然后与LiOH作用，分离可得化合物(5)。
以化合物D合成化合物(6)：
Figure BDA0003075468560000044
以3,5-二羟基苯甲醇与化合物D反应，得化合物(6)。
以化合物C合成化合物(7)：
Figure BDA0003075468560000045
以三苯基膦，偶氮二甲酸二乙酯和没食子酸与化合物C反应，得化合物(7)。
以化合物D合成化合物(8)：
Figure BDA0003075468560000046
以1-(4-吡啶基)哌嗪和化合物D反应，得化合物(8)。
本申请还公开了一种药物组合物，其包括上述化合物，以及药学上可接受的载体
本申请还公开了所述化合物或药物组合物在制备Ⅱ类组织相容性复合体(MHCclassⅡ)表达增强和肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
进一步的，所述药物增强Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)抗原呈递、激活抗肿瘤CD4+T细胞免疫应答。
本申请还公开了所述化合物或药物组合物在制备肿瘤新生抗原自呈递肿瘤疫苗中的应用。
本申请还公开了所述化合物联合抗PD-1抗体治疗肿瘤中的应用。
优选的，所述肿瘤为乳腺癌。
本申请化合物部分具有足够的官能团，并因此可与多种无机碱、无机酸和有机酸中的任何一种反应以形成盐。通常用于形成酸加成盐的酸是无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲基烷磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸，苯甲酸、乙酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸酯、甲酸盐、异丁酸盐、辛酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、亚硝酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁烯-1,4-二甲酸盐、环氧-1,6-二甲酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐，二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
碱加成盐包括衍生自无机碱的盐，例如铵或碱或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。因此，用于制备本发明盐的此类碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
本申请所公开的化合物是Ⅱ类组织相容性复合体表达和CD4+T细胞的增强剂。以现有肿瘤免疫治疗中PD-1抗体为例，化合物本身具有和PD-1抗体可比的抗癌活性；当PD-1抗体与化合物组合施用时的活性大于单独施用时的活性时，增强PD-1抗体的抗癌活性。因此，本发明化合物可单独或联合现有肿瘤免疫治疗手段以治疗癌症受试者。当作为分离的药物组合物施用时，可同时或在不同时间施用化合物或本发明和现有肿瘤免疫治疗手段，前提是保留化合物的增强作用。
给受试者施用的化合物和肿瘤免疫治疗手段的量将取决于疾病或状况的类型和严重程度以及受试者的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性。它还将取决于癌症的程度、严重程度和类型。熟练的技术人员将能够根据这些和其他因素来确定适当的剂量。
所公开的化合物通过任何合适的途径施用，包括例如以胶囊、片剂或片剂口服或通过肠外施用。肠外给药可包括例如全身给药，例如通过肌肉内、静脉内、皮下或腹腔内注射。根据待治疗癌症的类型，还可以口服(例如，膳食)、局部、通过吸入(例如，支气管内、鼻内、口服吸入或滴鼻)或直肠施用所述化合物。口服或肠外给药是首选的给药方式。
所公开的化合物可与作为用于现有免疫治疗手段治疗癌症的药物组合物的一部分的可接受的药物载体一起施用给受试者。根据所选给药途径(例如溶液、乳剂、胶囊)，待给药化合物的配方将有所不同。合适的药物载体可包含不与化合物相互作用的惰性成分。
有益效果：本申请首次公开了一种Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达增强化合物结构、其制备方法及应用，实验化合物对Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)表达增强效果显著，实验化合物对增强Ⅱ类组织相容性复合体肿瘤新生抗原呈递促进肿瘤组织CD4+T细胞侵润效果显著，单独或与现有免疫治疗手段药物联用对肿瘤生长抑制效果显著。
附图说明
图1是用溶媒、化合物1(100ng/ml)处理肿瘤4T1细胞系48小时后编码肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)关键基因H2-Ab1基因表达的图表；
图2是用溶媒、化合物2(100ng/ml)处理肿瘤4T1细胞系48小时后编码呈递肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)关键基因H2-Ab1基因表达的图表；
图3是用溶媒、化合物3(100ng/ml)处理肿瘤4T1细胞系48小时后编码呈递肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)关键基因H2-Ab1基因表达的图表；
图4是用溶媒、化合物4(100ng/ml)处理肿瘤4T1细胞系48小时后编码肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)关键基因H2-Ab1基因表达的图表；
图5是用溶媒或化合物3(单次5mg/g)处理的Bal/c小鼠体重随时间的百分比变化的图表；
图6是用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织呈递肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)复合体表达的图表；
图7是用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织CD4+T细胞组化结果；
图8是用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织效应CD4+T细胞(Th1)标志物T-bet基因表达水平图表；
图9是用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织抑制性CD4+T细胞(Treg1)标志物FOXP3基因表达水平图表；
图10是用溶媒、化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠随时间(以天为单位)的平均肿瘤体积的图表；
图11是用溶媒、化合物3(单次5mg/g)、PD-1抗体(4次每隔两天一次10ug/g)、或化合物3(单次5mg/g)联合PD-1抗体(4次每隔两天一次10ug/g)治疗的荷瘤小鼠随时间(以天为单位)的平均肿瘤体积的图表。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
中间体化合物的制备：
化合物A结构式及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000061
在三颈烧瓶中加入异植物醇(1.0equiv)，硫酸镁(5.0equiv)，随后加入溶剂丙酮。在冰水浴中一边搅拌一边加入高锰酸钾(3.0equiv)，在一个小时内加完。将反应在室温下搅拌12小时后，用丙酮过滤、洗涤，旋转蒸发，得到粗产物酮A。
化合物B结构式及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000062
氮气保护下，在反应管中加入甲基三苯基溴化膦(1.2equiv)，加入溶剂THF，随后在零度下加入正丁基锂(1.4equiv)，反应两个小时后加入上步产物酮A(1.0equiv),反应十二个小时后，用乙酸乙酯过滤、洗涤，旋转蒸发，分离得到产物B。
化合物C结构式及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000071
氮气保护下，在反应管中加入产物B(1.0equiv)，加入溶剂THF，随后加入9-硼双环(3,3,1)-壬烷(1.5equiv)，油浴加热至66℃，反应六个小时后加入30％H2O2和3M NaOH，反应两个小时后用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到产物醇C。
化合物D结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000072
氮气保护下，在反应管中加入产物C(1.0equiv)，溶剂吡啶，随后加入对甲苯磺酰氯(1.1equiv)，反应六个小时后用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到产物D。
化合物E结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000073
氮气保护下，在反应管中加入化合物C(1.0equiv)，加入溶剂THF，随后加入NaH(1.1equiv)，溴乙酸乙酯(1.1equiv)，反应十二个小时后加入饱和氯化铵淬灭，用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物E。
实施例1
化合物(1)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000074
氮气保护下，在反应管中加入产物C(1.0equiv)，溶剂吡啶，随后加入苯甲酰氯(1.1 equiv)，反应六个小时后用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物(1)。
实施例2
化合物(2)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000075
氮气保护下，在反应管中加入化合物D(1.0equiv)，溶剂吡啶，随后加入甲醇钠(1.5equiv)，反应十二个小时后，用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物(2)。
实施例3
化合物(3)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000081
在反应管中加入Raney Ni(约2g)，然后真空后通入氢气。将产物B(1.0equiv)的甲醇溶液用导管导入，保持氢气压力反应5小时。过滤后蒸干溶剂，分离得到化合物(3)。
实施例4
化合物(4)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000082
氮气保护下，在反应管中加入化合物D(1.0equiv)，溶剂吡啶，随后加入甲硫醇钠(1.5equiv)，反应十二个小时后，用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物(4)。
实施例5
化合物(5)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000083
在反应管中加入化合物E(1.0equiv)，加入溶剂THF和H2O(1:1)，随后加入LiOH(2.0equiv)，反应六个小时后，用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物(5)。
实施例6
化合物(6)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000084
氮气保护下，在反应管中加入化合物D(1.0equiv)，加入溶剂THF，随后加入NaH(1.1equiv)，3,5-二羟基苯甲醇(1.1equiv)，反应十二个小时后加入饱和氯化铵淬灭，用乙酸乙酯萃取，干燥、蒸干，分离得化合物(6)。
实施例7
化合物(7)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000085
氮气保护下，在反应管中加入化合物C，溶剂THF，随后加入三苯基膦(1.5equiv)，偶氮二甲酸二乙酯(1.5equiv)，没食子酸(1.1equiv)，反应十二个小时后，用乙酸乙酯洗涤，干燥、旋转蒸发，分离得到化合物(7)。
实施例8
化合物(8)结构及其制备方法如下：
Figure BDA0003075468560000091
氮气保护下，在反应管中加入产物D(1.0equiv)，加入溶剂THF，1-(4-吡啶基)哌嗪(2.1equiv)，反应十二个小时后用乙酸乙酯萃取，干燥、旋转蒸发后，分离得到化合物(8)。
本申请化合物的应用研究
一、实验材料
1、细胞系
本文中所用到的细胞均列于表2-1细胞系：
表2-1细胞系
Figure BDA0003075468560000092
2、实验动物及饲养相关材料
本文实验所使用Balb/c小鼠购买自河南斯克贝斯生物科技有限公司，许可证号：SCXK(豫)2020-0005；本课题组的所有实验小鼠均饲养于南京师范大学动物实验中心的SPF(specific pathogen free)级实验房内。根据饲养要求，所有实验小鼠的饲养密度小于或等于5只每笼，室温保持在20-25摄氏度的范围间，湿度保持在50％上下，自动光控(12h明/12h暗)。小鼠的饲料和垫料均购自京江宁区青龙山动物繁殖场。
3、实验试剂
(1)细胞培养所用试剂均列于表2-2细胞培养试剂
表2-2细胞培养试剂
Figure BDA0003075468560000093
Figure BDA0003075468560000101
(2)生化实验所用试剂均列于表2-3生化实验试剂
表2-3生化实验试剂
Figure BDA0003075468560000102
(3)小鼠实验所用试剂均列于表2-4小鼠实验试剂
表2-4小鼠实验试剂
Figure BDA0003075468560000103
(4)本文中所用到的抗体均列于表2-5抗体
表2-5抗体
Figure BDA0003075468560000104
(5)本文中所用到的药品试剂均列于表2-6药品试剂
表2-6药品试剂
Figure BDA0003075468560000105
Figure BDA0003075468560000111
(6)本文实验所用到的引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，具体序列信息如下表2-7引物所列
表2-7引物
Figure BDA0003075468560000112
4、实验仪器
(1)Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司
(2)UB-7PH计，南京恒联生物科技有限公司
(3)EASYPET3自动助吸器，德国Eppendorf公司
(4)XD-202型显微镜，南京江南永新光学有限公司
(5)SW-CJ-IF型超净工作台，苏州集团苏州安泰空气技术有限公司
(6)台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司
(7)BECKMAN Microfuge 16台式离心机,美国BECKMAN公司
(8)VOTTEX-2涡旋振荡器，南京恒联生物科技有限公司
(9)HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司
(10)Veriti PCR扩增仪，美国Bio-Rad公司
(11)StepOnePlusTM Real-Time PCR仪，美国Bio-Rad公司
(12)BD FACSVerseTM流式细胞仪，美国BD Biosciences公司
(13)BCD-328EDPT冰箱，青岛海尔股份有限公司
(14)BCD-539WT低温冰箱，青岛海尔股份有限公司
(15)DW-86L626超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司
(16)游标卡尺，南京苏测计量仪器
(17)TY-80S脱色摇床，普阳科学仪器
(18)细胞培养箱，赛默飞世尔，Thermo Fisher Scientific
(19)DHG-9141A干燥箱，南京恒联生物科技有限公司
(20)Leica荧光显微镜，莱卡
(21)FM70制冰机，美国格兰特
(22)85-1C磁力搅拌器，上海理达仪器厂
(23)生物安全柜，赛默飞世尔，Thermo Fisher Scientific
(24)HVE-50高压灭菌锅，日本HIRAYAMA有限公司
(25)石蜡切片机，莱卡
(26)微波炉，广东格兰仕集团
5、实验耗材
(1)10μL、100μL、1000μL吸头，10μL、100μL、1000μL的DNase-/RNase-free的吸头，江苏海门佳卫玻仪厂
(2)0.2mL DNase-/RNase-free PCR管、1.5mL DNase-/RNase-free平盖离心管，美国Axygen
(3)1.5mL和2mL普通离心管，江苏海门佳卫玻仪厂
(4)2mL外旋细胞冻存管，康宁(Corning)
(5)100mm、60mm细胞培养皿、96孔细胞培养板，南京善清博生物科技有限公司(SORFA)
(6)10mL移液管，15mL、50mL离心管，南京善清博生物科技有限公司(SORFA)
(7)一次性PE手套，江苏海门佳卫玻仪厂
(8)一次性无粉乳胶手套，江苏海门佳卫玻仪厂
(9)黏附载玻片，江苏世泰实验器材有限公司
6、溶液配方
(1)0.5％乙醇：5mL的无水乙醇加入至950mL的双蒸水中，混匀。
(2)95％乙醇：475mL的无水乙醇加入至25mL的双蒸水中，混匀。
(3)90％乙醇：450mL的无水乙醇加入至50mL的双蒸水中，混匀。
(4)80％乙醇：400mL的无水乙醇加入至100mL的双蒸水中，混匀。
(5)75％乙醇：375mL的无水乙醇加入至125mL的双蒸水中，混匀。
(6)70％乙醇：350mL的无水乙醇加入至150mL的双蒸水中，混匀。
(7)50％乙醇：250mL的无水乙醇加入至250mL的双蒸水中，混匀。
(8)25％乙醇：125mL的无水乙醇加入至375mL的双蒸水中，混匀。
(9)3％H2O2：10mL的30％H2O2加入至90mL双蒸水中，混匀。
(10)0.01M枸橼酸溶液(pH＝6.0)：用天平精密称量4.2g枸橼酸粉末，溶于2L双蒸水中，在磁力搅拌器上搅拌混匀后，用pH计调至pH＝6.0。
(11)4％多聚甲醛(PFA)：用天平精密称量2.0g多聚甲醛，倒入烧杯中，加入沸腾的双腾水至45mL，再加入5mL 10*PBS溶液，混匀。如不易溶解可加少许NaOH溶液助溶。
(12)75％冰乙醇：375mL的冰无水乙醇(-20度)加入至125mL的双蒸水中，混匀后保存在-20度。
(13)肿瘤组织消化液：向10mL DMEM培养液中加入2mL FBS和100μL PS，混匀后用PBS稀释4倍，再按照胶原酶IV：混合溶液＝1:10加入胶原酶IV，混合均匀后，放置于冰上待用。
二、实验方法
1、细胞复苏
(1)从用液氮中取出冻存的细胞，立即放入37度的水浴锅中融化一分钟；
(2)在生物安全柜中用1000μL移液枪吸出细胞悬液，转移至1.5mL离心管中，900xg,离心1min，弃去上清；
(3)在离心管中加入1mL完全培养基，重悬细胞并吹打均匀后，转移至已经预先加好8-10mL完全培养基的100mm培养皿中，轻轻晃动使细胞分布均匀，置于37度，5％CO2培养箱中静置培养，次日清晨观察细胞生长情况，并更换培养液。
细胞传代
待细胞处于对数生长期，长至整个细胞培养皿90％时，进行传代培养。细胞培养前需对实验所需试剂进行70％酒精消毒和30min紫外灭菌。
(1)取出待传代的细胞，在生物安全柜中，吸去培养皿中旧的培养基，沿培养皿侧壁加入1mLPBS清洗细胞，然后吸除PBS。
(2)沿培养皿侧壁加入1mL胰酶，水平翻转培养皿以确保胰酶均匀覆盖细胞层，然后弃去胰酶，将培养皿置于37℃细胞培养箱消化，适当时间后取出用倒置显微镜观察细胞是否完全分散(适当时间指正好使细胞皱缩变圆变亮，间隙增大的时间，一般为2-5min,MCF10A细胞为10-12min)；
(3)取出培养皿并向培养皿加入1mL的细胞培养基终止胰酶的消化作用，用1000μL移液枪反复吹打分散细胞，将细胞悬液转移至1.5mL离心管，1000xg离心1min。
(4)吸去上清，向离心管中加入1mL的细胞培养基，重新悬浮细胞沉淀。
(5)细胞计数：根据情况将细胞稀释10-100倍，吹打均匀后，取10μL加入血球计数板，在显微镜下进行肉眼计数上下左右四个小室内细胞总数，重复三次，计算其平均值X，根据公式原管1mL中细胞总数＝X/4*稀释倍数*104计算出细胞总数；
(6)根据后一步实验需要取出适量的细胞悬液加入细胞培养皿，再加入一定量的完全培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
2、细胞冻存
(1)配制1mL细胞冻存液(90％FBS+10％DMSO)；
(2)按照上方细胞传代步骤(1)-(3)操作；
(3)用刚配制好的细胞冻存液重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至冻存管中，标记好冻存者姓名，细胞名称和冻存时间等相关信息；
(4)按照4度30min，-20度2h，-80度1w，液氮的顺序冻存细胞。
3、细胞的给药处理
将实验化合物和溶解于DMSO或胎牛血清，用药终溶度为100ng/mL。在细胞传代后24小时后给药后继续培养48小时，检测。
4、实验化合物细胞水平活性评价
用cck8(Cell Counting Kit-8)检测细胞活性评价肿瘤细胞生长抑制评价新型化合物的体外抗癌作用。用组织相容性复合体标志基因H2Ab-1等表达评价新型化合物对肿瘤细胞组织相容性复合体增强作用。
5、小鼠肿瘤模型和给药
移植同源乳腺癌细胞(即4T1细胞)成瘤的小鼠模型：从商业途径购买的6周龄的Balb/c雌性小鼠，采用剪趾法将小鼠标记。每只左侧第三个乳房垫注射1百万个4T1细胞。肿瘤形成后(体积约为50～100mm3)开始用单次50mg实验化合物和4次(每两天一次)0.1mg0PD-1抗体(购买于BioXcell公司)单独或联合通过腹腔给药途径治疗肿瘤，使用溶媒处理为对照。在试验过程中，每天监测动物的毒性迹象，包括体重减轻。
6、实验化合物小鼠肿瘤模型活性评价
药物处理后每周给每笼小鼠更换垫料1-2次，添换鼠粮和饮用水1-2次。从注射4T1细胞后开始，每次称重时，每只小鼠均进行触诊，检查小鼠乳房是否会出现结节状的触感，即乳腺肿瘤。记录开始触摸到乳腺肿瘤的时间，并且开始每周两次记录小鼠的肿瘤的长和宽，根据公式肿瘤体积＝长/2*宽2计算并且记录每只小鼠每个时间点的肿瘤体积。肿瘤的长和宽都是使用游标卡尺进行测量。小鼠20周龄后进行安乐死或自然死亡后，将荷瘤小鼠的乳腺肿瘤和肺组织解剖出来，肿瘤组织用PBS清洗一遍后，吸水纸擦净。所有肿瘤组织和肺组织均用锡纸包裹好，并标记小鼠编号、处理方式和日期，存于-80度。用肿瘤生长抑制试验评价了新型化合物的抗癌作用，用流式方法检测新型化合物对肿瘤中组织相容性复合体增强作用，用免疫组化评价新型化合物对T细胞的效应，用Treg标志基因FOXP3和Th1标志基因T-bet评价新型化合物对增强效应T细胞的作用。
7、RNA提取—Trizol法
A：细胞RNA提取(全过程使用RNAase-free的枪头和离心管)
(1)取长满至90％-100％的细胞，弃去培养液，1mL PBS洗一遍，弃去PBS，加1mL胰酶消化，将细胞尽量完全吹打下来，收集至1.5mL离心管内，再用PBS洗一遍，1000xg离心后，弃去PBS。
(2)加入1mL Trizol(100mm培养皿的细胞量)重悬细胞沉淀，室温静置5min。
(3)加入200μL氯仿，涡旋混匀，静置5min。
(4)将混合溶液于4度，13000xg离心15分钟，离心结束后出现分层，从上往下为无色水样上层，乳白色中间层，红色酚氯仿层。转移无色透明的水样上层于新的离心管内(约500μL)。
(5)再加入500μL异丙醇，充分混匀后静置5min。
(6)将混合溶液于4度，13000xg离心10分钟，弃去上清，保留白色沉淀，即RNA。
(7)用300μL 70％乙醇重悬清洗沉淀两次，每次离心13000xg，2min。
(8)弃去上清，在超净工作台内开盖吹风5-10min，使乙醇挥发干净，加入30μLRNA-free的水溶解RNA，测量RNA浓度。
B：组织RNA提取(全过程使用RNAase-free的枪头和离心管)
(1)在1.5mL离心管中加入100μL Trizol，研磨组织至发白，再补加900μL Trizol。
(2)室温孵育5min，4度12000xg离心15min。将上清转移至新的离心管内。
(3)加入200μL氯仿，剧烈摇晃3min，再室温孵育3min，然后4度12000xg离心15min。
(4)离心结束后出现分层，从上往下为无色水样上层，乳白色中间层，红色酚氯仿层。将无色水样上层转移至新的离心管内(约500μL)。
(5)再加入500μL异丙醇，充分混匀后静置10min。
(6)4度1200xg离心10min，弃去上清，保留白色沉淀，即RNA。
(7)加入500μL 75％冰乙醇洗涤，涡旋后，室温7500xg离心5min，弃上清。
(8)重复步骤(7)。
(9)在超净工作台内开盖吹风5-10min，使乙醇挥发干净，加入30μL RNA-free的水溶解RNA，测量RNA浓度。
8、RNA逆转录
(1)按下方表2-8RNA逆转录为cDNA体系加入所需试剂(全程需使用RNAase-free的枪头)，混合均匀后，瞬时离心20秒，放入PCR仪中进行逆转录反应，反应程序是：50℃，15min；85℃，5sec。反应结束后，cDNA存放于-20度。
表2-8 RNA逆转录为cDNA体系
Figure BDA0003075468560000151
9、实时定量PCR
(1)在八连排管中按下方表2-9q-PCR体系加入所需试剂，混合均匀后，瞬时离心20秒，放入实时定量PCR仪中。
Figure BDA0003075468560000152
(2)实时定量PCR仪的反应程序按照下方表2-10q-PCR反应程序进行
表2-10 q-PCR反应程序
Figure BDA0003075468560000153
10、流式细胞术
(1)在60mm盘中将适当大小的肿瘤组织剪碎，用4mL现配的肿瘤组织消化液重悬组织碎末，并转移至50mL离心管中，37度摇床180rpm消化2小时。(2)将消化液过200目筛网，接于2mL离心管中，室温1000xg离心5min，弃上清。
(3)用现配的500μL 5％FACS Buffer重悬沉淀并集中至一管，室温1000xg离心5min，弃上清，再次用500μL 5％FACS Buffer洗一次，弃上清。
(4)500μL 5％FACS Buffer重悬沉淀，细胞计数，取1*106个肿瘤细胞溶于500μL5％FACS Buffer(此步换至1.5mL离心管)，另多准备三管细胞用于做空白和染单个抗体的对照管。
(5)用锡纸包裹住离心管管身，每管加入4μL MHC I和4μL MHC II抗体，空白管不加抗体，2个单染管只加一种抗体，混匀，冰上孵育30min。
(6)室温1000xg离心5min，弃上清，800μL 5％FACS Buffer重悬沉淀，放于冰上待用。
(7)流式细胞仪打开预热，每个样品再过一次200目筛网，接于流式管中，上机。
11、免疫组化
(1)所有小鼠肿瘤在解剖完后即刻剪下合适大小浸泡在现配的4％PFA中固定，送至公司进行石蜡包埋，本文所有石蜡包埋实验均由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。
(2)石蜡切片。切片前将蜡块置于4度预冷。将包埋好的蜡块夹在切片机的蜡块夹内，使蜡块切面与切片刀刃平行后旋紧。将切片厚度调为16微米，进行切片，直至切出的切片含有较大快肿瘤组织后，将切片厚度调为5微米，继续切片，5-6片为一组，轻轻地拉开切片，挑起放置于37度0.5％的乙醇中，切片会漂浮在液面上，并慢慢舒展开来，用黏附载玻片挑起，使切片上的组织均位于拨片上，用铅笔做好标记，载玻片置于37度2-3天烘干。
(3)切片烘干后，用二甲苯脱蜡，每次浸泡于二甲苯中室温静置10min，两次。
(4)水化：100％乙醇5min两次，90％乙醇5min一次，75％乙醇5min一次，50％乙醇5min一次，25％乙醇5min一次。
(5)将载玻片放在小盒子中，加入PBS于摇床上清洗5min。
(6)倒去PBS，加入ddH2O，于摇床上清洗1min。
(7)取出载玻片，每个切片上滴加一滴3％H2O2，室温孵育30min。
(8)倾去3％H2O2，用ddH2O于摇床上清洗三次，每次3min。
(9)将载玻片浸入0.01M枸橼酸Buffer(pH＝6.0)中，微波炉加热至沸腾，拿出冷却5min，再替换一半的0.01M枸橼酸Buffer(pH＝6.0)，放入微波炉加热至沸腾，重复4-5次。
(10)冷却后，用PBS于摇床上清洗两次，每次5min。
(11)取出玻片，用吸水纸小心的擦去PBS，滴加试剂A(免疫组化试剂盒中提供，试剂A为5％BSA封闭液，用时提前取出复温)，室温在摇床上缓慢摇动孵育30min。
(12)倾去试剂A，用DAO笔沿切片周围画一圈，按一抗：PBS＝1:100配好一抗溶液，滴加至每片切片上，约20微升每片。玻片置于湿盒中，4度摇床过夜孵育。
(13)次日取出湿盒，复温30min，PBS清洗3次，每次5min。
(14)用吸水纸小心的擦去PBS，滴加试剂B(免疫组化试剂盒中提供，试剂B为生物素的羊抗兔二抗)，室温于摇床上低速摇动孵育30min。
(15)PBS清洗3次，每次5min
(16)用吸水纸小心的擦去PBS，滴加试剂C(免疫组化试剂盒中提供，试剂C为SABC，三抗)，室温于摇床上低速摇动孵育30min。
(17)PBS清洗4次，每次5min。
(18)DAB显色：取1mL ddH2O，加入试剂盒中ABC试剂各一滴(DAB显色试剂盒)，混匀后滴加至切片上，室温静置显色10min。
(19)用ddH2O摇床上清洗3次，每次5min。
(20)苏木精复染：滴加苏木素染液，染色20秒，放入PBS中返蓝30秒，用蒸馏水洗净。
(21)用ddH2O摇床上清洗2次，每次15min。
(22)脱水：50％乙醇浸泡5min一次，70％乙醇浸泡3min一次，80％乙醇浸泡2min一次，90％乙醇浸泡2min一次，95％乙醇浸泡5min一次，100％乙醇浸泡10min一次，100％乙醇浸泡15min一次，100％乙醇：二甲苯＝1:1溶液浸泡10min，二甲苯(旧)浸泡15min，二甲苯(新)浸泡30min。
(23)封片：用中性树胶滴加在切片上，每片约20微升，用大小配套的盖玻片盖压。
(24)干燥：60度烘箱烘干或者自然晾干。
(25)荧光显微镜下用白光拍照。
三、实验结果
1、本申请化合物在体外对Ⅱ类组织相容性复合体的表达增强活性。
用溶媒、实施例1-4制备所得化合物1(100ng/ml)、化合物2(100ng/ml)、化合物3(100ng/ml)、化合物4(100ng/ml)处理肿瘤4T1细胞系48小时后编码肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)关键基因H2-Ab1基因表达，结果分别如图1-4所示，根据图示可见，本申请化合物显著增强肿瘤细胞中Ⅱ组织相容性复合体标志基因H2-Ab1的表达。
2、对荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠体重的影响和作用。
用溶媒或化合物3(单次5mg/g)处理的Bal/c小鼠体重随时间的百分比变化的图表如图5所示，根据图示可见，化合物3不影响小鼠体重。
3、增强荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中Ⅱ组织相容性复合体。
用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织(肿瘤4T1细胞系)呈递肿瘤新生抗原的Ⅱ类组织相容性复合体(MHC classⅡ)复合体表达的图表如图6所示，根据图示可见，化合物3显著增强荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中Ⅱ类组织相容性复合体阳性细胞，不影响Ⅰ类组织相容性复合体阳性细胞数量。
4、增强荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中T细胞的募集。
用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织CD4+T细胞组化结果如图7所示，根据图示可见，化合物3可以显著增强荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中CD4+T细胞的募集但并不影响CD8+T细胞的募集。
5、增强荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中以T-bet表达为标志的效应CD4+T细胞(Th1)的作用。
用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织效应CD4+T细胞(Th1)标志物T-bet基因表达水平图表如图8所示，根据图示可见，化合物3可以显著提高荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中T-bet表达。
6、抑制荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中以FOXP3表达为标志的抑制型CD4+T细胞(Treg)的作用。
用溶媒或化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠肿瘤组织抑制性CD4+T细胞(Treg1)标志物FOXP3基因表达水平图表如图9所示，根据图示可见，化合物3可以显著抑制荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤组织中FOXP3表达。
7、在荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠中抑制肿瘤的活性。
用溶媒、化合物3(单次5mg/g)治疗的荷瘤小鼠随时间(以天为单位)的平均肿瘤体积的图表如图10所示，根据图示可见，化合物3在荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠中具有显著抑制肿瘤的活性。
8、化合物(3)和抗PD-1抗体单用或联用在荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠中抑制肿瘤的活性。
用溶媒、化合物3(单次5mg/g)、PD-1抗体(4次每隔两天一次10ug/g)、或化合物3(单次5mg/g)联合PD-1抗体(4次每隔两天一次10ug/g)治疗的荷瘤小鼠随时间(以天为单位)的平均肿瘤体积的图表如图11所示，根据图示可见，化合物(3)和抗PD-1抗体单用或联用在荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠中具有显著抑制肿瘤的活性，化合物(3)单用抑制肿瘤活性优于抗PD-1抗体单用，施用化合物(3)显著提高抗PD-1抗体的抑制肿瘤的效果。

Claims (10)

1.如式Ⅰ所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003075468550000011
式中，Y是共价键经取代或未经取代的直链烃基；R1-R6独立地为经取代或未经取代的烷基；其中，直链烃基是亚烷基；所述取代基团为不成环或成环基团，构成取代基团骨架的原子选自碳原子、氮原子、硫原子、氧原子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，Y是-CH2-。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1-R5是甲基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6为经取代或未经取代的烷基或衍生物，优选自-CH2-O-CO-C6H5、-CH2-O-CH3、-CH3、-CH2-S-CH3、-CH2-O-CH2-COOH、-CH2-OCH2C6H3(3,5-OH)、-CH2-O-CO-C6H2(3,4,5-OH)、4-吡啶基哌嗪。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下化合物：
Figure FDA0003075468550000012
Figure FDA0003075468550000021
6.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以异植物醇为原料合成化合物B：异植物醇在酸或盐存在下，以高锰酸钾氧化得化合物A，再以甲基三苯基溴化膦和强碱与化合物A反应，得化合物B；
Figure FDA0003075468550000022
(2)化合物B制备得到化合物C：先后以9-硼双环(3,3,1)-壬烷和双氧水的NaOH溶液与化合物B反应，得化合物C；
Figure FDA0003075468550000023
(3)化合物C制备得到化合物D：以对甲苯磺酰氯和碱与化合物C反应，得化合物D；
Figure FDA0003075468550000024
(4)通过化合物B、C或D制备得到式Ⅰ所示的化合物。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物，以及药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述化合物或权利要求7所述药物组合物在制备Ⅱ类组织相容性复合体表达增强和肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
9.权利要求1所述化合物或权利要求7所述药物组合物在制备肿瘤新生抗原自呈递肿瘤疫苗中的应用。
10.权利要求1所述化合物联合抗PD-1抗体在治疗肿瘤中的应用。
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