CN113301913A - 用于免疫疗法的源自微生物的肽和蛋白质 - Google Patents

Abstract

本公开提供了治疗性肽和包含所述肽的药物组合物，所述治疗性肽和所述药物组合物具有治疗各种人类疾病的效用。在特定方面，所公开的治疗性肽可用作用于调节哺乳动物免疫系统的调节和效应分子以减轻疾病的免疫治疗剂。

Description

用于免疫疗法的源自微生物的肽和蛋白质

相关申请的交叉引用

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技术领域

本公开涉及一种新型肽和包含所述肽的药物组合物，所述肽和药物组合物具有尤其在治疗与哺乳动物适应性和先天性免疫系统相关的疾病和免疫学相关障碍中的应用。在一些实施方案中，本文所述的肽和药物组合物具有在治疗或预防免疫肿瘤学疾病状态诸如原发性和转移性赘生物疾病中的特定应用。

背景技术

炎症和免疫相关疾病是复杂的和通常多个相互联系的生物途径的表现或后果，所述生物途径在正常生理学中对于对伤害或创伤作出反应至关重要，引发从伤害或创伤中修复，并稳固对外来生物体的先天性和/或获得性防御。当这些正常生理途径由于异常调节或过度刺激、因为对自身的反应或因为其组合而导致与反应的强度直接相关的额外伤害或创伤时，疾病或病理发生。

虽然这些疾病的起源通常涉及多步途径并且通常涉及多个生物系统或途径，但是在一个或多个这些途径中的临界点处的干预可以具有改善或治疗效果。治疗干预可以通过对有害过程/途径的拮抗作用或对有益过程/途径的刺激来发生。许多免疫相关疾病是已知的并且已被广泛研究。此类疾病包括炎症性疾病、感染性疾病、免疫缺陷疾病、赘生物疾病等。

癌症是死亡的第二大主要原因，导致美国每四例死亡中就有一例。美国每年有超过一百万人患上癌症，并且据估计在2016年发生了595,690例癌症死亡。由于美国的老年人口越来越多，预计癌症发病的比率将继续增长是合理的。参见美国癌症协会(AmericanCancer Society)。

癌症是一种涉及细胞不受控制的生长(即，分裂)的疾病。有助于癌细胞的不受控制的增殖的一些已知机制包括生长因子独立性、未检测到基因组突变、以及不适当的细胞信号传导。癌细胞忽略正常生长控制的能力可能导致增殖速率增加。虽然癌症的原因尚未牢固建立，但已知一些因素促成癌症或至少使受试者易罹患癌症。此类因素包括特定的遗传突变(例如，关于乳腺癌的BRCA基因突变、关于结肠癌的APC)、暴露于可疑的癌症引发剂、或致癌物质(例如，石棉、UV辐射)以及特定癌症(诸如乳腺癌)的家族倾向。

目前使用各种方式(包括手术、放射疗法和化学疗法)来治疗癌症。治疗的选择将取决于癌症的类型、位置和散布。例如，手术和放射疗法可以用于治疗非实体肿瘤癌，诸如白血病和淋巴瘤。手术和放射疗法的优点之一是能够在一定程度上控制疗法的影响，因而限制毒性到达身体的正常组织。然而，跟随手术和放射疗法的通常是化学疗法，以防御任何剩余或抗放射的癌细胞。化学疗法也是弥散性癌症诸如白血病和淋巴瘤、以及转移灶的最适当治疗。

因为许多化学疗法药剂基于其增殖谱靶向癌细胞，正常增殖的组织诸如胃肠道和骨髓也易受化学疗法的影响。

已经开发许多化学治疗剂用于治疗癌症。然而，并非所有肿瘤都对化学治疗剂等作出反应，尽管最初对化学治疗剂作出反应，但可能会发展出抗性。因此，对有效的抗癌药物的寻求加强，以努力寻找具有更少非特异性毒性的甚至更有效的药剂。

因此，很有需要开发利用哺乳动物免疫系统的各个方面以帮助治疗和预防癌症的另外的和更安全的癌症治疗剂。尽管每年都有新的癌症治疗问世，但这些治疗进一步伴有问题性副作用。

发明内容

本公开通过提供能够调节受试者的免疫应答并以有益的方式利用所述免疫应答来治疗受试者的疾病的新型肽治疗剂，解决了在医学界中的这种重要需求。

本公开提供调节免疫调节细胞(包括但不限于T细胞、效应T细胞和树突细胞)以帮助治疗癌症和其他免疫相关障碍和疾病的微生物肽及其变体。

因此，为了解决上面概述的问题，本公开提供了用于调节哺乳动物免疫系统的调节和效应细胞和分子以治疗疾病的免疫治疗药物组合物。在一些实施方案中，该疾病是癌症。

本文所提供的肽治疗剂可用于治疗与炎症免疫应答和免疫肿瘤学相关的许多疾病。

在一些实施方案中，本公开涉及用于调节哺乳动物免疫系统的调节和效应分子以治疗疾病的免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含：含有在本文中被称为SEQ ID NO:1或SG-3-0020的氨基酸序列的纯化的治疗性蛋白质。本公开涵盖一种蛋白质，其包含与SEQID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白质与SEQ ID NO:1为小于100％相同。在其他实施方案中，治疗性蛋白质包含相对于SEQ ID NO:1中鉴定的氨基酸序列的1、2、3、4或5个氨基酸取代。在又其他实施方案中，与SEQ ID NO:1为小于100％相同的治疗性蛋白质保留了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的全长肽的一种或多种活性。

在一些实施方案中，免疫治疗组合物(或治疗性蛋白质)在体外测定中活化免疫细胞，所述体外测定包括将治疗性蛋白质与免疫细胞一起孵育。在其他实施方案中，免疫细胞是人或啮齿动物免疫细胞。在仍其他实施方案中，啮齿动物免疫细胞是小鼠免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在其他实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞和/或单核细胞。在又其他实施方案中，免疫细胞是树突细胞。

在一些实施方案中，在体外将治疗性蛋白质(或包含所述治疗性蛋白质的组合物)与免疫细胞一起孵育导致免疫细胞的TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、IL-23、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和/或TGF-β的产生或分泌的变化。

在一些实施方案中，免疫细胞选自T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3活化的T细胞(通过与抗CD3免疫球蛋白接触而活化的T细胞)。在一些实施方案中，T细胞的活化包括一种或多种细胞因子的分泌增加。在其他实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自IFN-γ和IL-2。

在一些实施方案中，免疫治疗组合物(或治疗性蛋白质)在体外测定中增加了CD3活化的T细胞的细胞因子分泌。在其他实施方案中，增加的细胞因子分泌是相对于在不存在治疗性肽的情况下CD3活化的T细胞的细胞因子分泌。在仍其他实施方案中，增加的细胞因子分泌是与在不存在治疗性肽的情况下CD3活化的T细胞的细胞因子分泌相比至少5％、10％、20％、25％、30％、40％或50％的增加。在一些实施方案中，增加的细胞因子分泌包括选自IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α的细胞因子的分泌增加。

在一些实施方案中，组合物在施用过组合物的受试者中活化免疫细胞。在其他实施方案中，免疫细胞的活化包括肿瘤微环境中免疫细胞数量的增加。在仍其他实施方案中，肿瘤微环境中免疫细胞数量的增加包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的免疫细胞频率的增加。在又其他实施方案中，TIL包含NK细胞和/或活化的CD8+ T细胞。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

在一个方面，提供了多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2小于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同且与SEQ ID NO:2小于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1小于100％相同的蛋白质。例如，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:1小于100％相同且与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质的核苷酸序列。在又其他实施方案中，编码蛋白质的多核苷酸序列是密码子优化的，使得SEQID NO:2的密码子被修饰以最佳地表达在表达系统中的SEQ ID NO:1，但是其中所述密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:2不是100％相同的。在仍其他实施方案中，表达系统是原核生物或真核生物表达系统。在一些实施方案中，原核生物系统包括大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些实施方案中，本公开的治疗性肽与SEQ ID NO:1所描绘的氨基酸序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，本公开的治疗性肽与SEQ ID NO:1共享100％序列同一性。

在一些实施方案中，本公开的治疗性肽包含与SEQ ID NO:1至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且保留了由SEQ ID NO:1所描绘的氨基酸序列组成的全长肽的一种或多种活性。

在一些实施方案中，本公开的治疗性肽包含与SEQ ID NO:1至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且在施用至有需要的受试者时具有增加IL-2和/或IFN-γ的分泌的功能能力。

在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的治疗性肽在施用过所述肽的受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生。在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1和IL-23。

在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的治疗性肽在施用过所述肽的受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生。在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

在一些实施方案中，本公开的治疗性肽在施用至有需要的受试者时，增加了选自CD4+CD25+、CD4+PD-1+、CD4+ICOS+、CD4+OX40+、CD8+CD25+、CD8+PD-1+、CD8+ICOS+、和CD8+OX40+的一种或多种T细胞。在其他实施方案中，本公开的治疗性肽在施用至有需要的受试者时增加了选自IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α的一种或多种细胞因子的分泌。

在一些实施方案中，所述组合物是配制用于静脉内、皮下、局部或口服施用的药物组合物。在其他实施方案中，所述组合物是配制用于施用至肿瘤微环境中的药物组合物。

在一些实施方案中，将所述组合物配制成液体、固体、半固体、凝胶或乳液。

在一个方面，提供了调节受试者中的体内免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含如所描述的SG-3-0020蛋白或其变体的组合物。

在一些实施方案中，体内免疫应答的调节包括选自以下的一种或多种细胞因子的血液或血浆水平的变化：TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、IL-23、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

在一个方面，提供了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用包含蛋白质的组合物，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述有需要的受试者已经被诊断患有选自以下的疾病或障碍或处于发生选自以下的疾病或障碍的风险：结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌症、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌症、消化系统癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈部癌、胃癌(gastric cancer)、上皮内赘生物、肾癌(kidney cancer)、喉癌、白血病、肝癌、小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌(renal cancer)、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症以及它们中的两种或更多种的任何组合。

在一些实施方案中，将SG-3-0020蛋白或其变体在免疫疗法之前和/或与免疫疗法结合施用至受试者。在其他实施方案中，免疫疗法是抗癌疫苗、过继免疫细胞疗法、靶向免疫检查点调节剂的药剂、溶瘤病毒或BiTE中的一种或多种。在仍其他实施方案中，免疫疗法靶标是以下中的一种或多种：CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性死亡配体1)、BTLA(B和T淋巴细胞衰减子)、LAG-3(淋巴细胞活化基因3)、A2AR(腺苷A2a受体)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3)、B7-H3(B7同源物3；也称为CD276)、VISTA(T细胞活化的V结构域Ig抑制剂)、和IDO(吲哚胺2,3-二氧酶)、或免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，免疫疗法是双PD-1/CTLA-4阻断疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是对具有PDL1+肿瘤的受试者的PDL-1治疗或双PD-1/PD-L1阻断。非限制性实例包括但不限于PD-1和PDL-1拮抗剂，诸如抗体(例如，帕博利珠单抗(pembrolizumab)

纳武单抗

西米普利单抗(cemiplimab)

、阿特珠单抗(atezolizumab)

阿维鲁单抗(avelumab)

、和德瓦鲁单抗(durvalumab)

)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是CTLA4拮抗剂，诸如抗体(例如，伊匹木单抗(ipilumumab)

)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是BTLA拮抗剂，诸如抗体。在一些实施方案中，检查点抑制剂是LAG-3拮抗剂(例如，IMP701(LAG525))。在一些实施方案中，检查点抑制剂是A2AR拮抗剂(例如，CPI-444)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是TIM-3拮抗剂(例如，MBG453)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是B7-H3拮抗剂，诸如抗体(例如，依诺妥珠单抗(enoblituzumab))。在一些实施方案中，检查点抑制剂是VISTA拮抗剂(例如，JNJ-61610588)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是IDO拮抗剂(例如，吲哚莫德(indoximod))。参见例如，Marin-Acevedo等人,J HematolOncol.11:39(2018)。在一些实施方案中，免疫疗法是过继T细胞疗法，其包括但不限于嵌合抗原受体T细胞(例如，CAR-T细胞)或工程化TCR-T细胞。在一些实施方案中，免疫疗法是双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在一些实施方案中，免疫疗法包括以下中的一种或多种：抗淋巴细胞活化基因3(LAG-3)疗法、抗T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)疗法、抗杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)疗法、抗4-1BB(CD137)激动/刺激疗法、或糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)激动/刺激疗法--每种单独或彼此组合和/或与PD-1、PDL-1、CTLA-4或其他疗法中的一种或多种组合。

在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的治疗性蛋白质在施用过所述肽的受试者中调节至少一种细胞因子的产生。在其他实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中调节至少一种细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、IL-23、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。在仍其他实施方案中，通过测量受试者血液中的一种或多种细胞因子的血液和/或血浆水平来测量对所述至少一种细胞因子的产生的调节。

在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的治疗性蛋白质在施用过所述肽的受试者中增加Th1活化。在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中增加树突细胞成熟。在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中增加CD70表达。在一些实施方案中，免疫治疗药物组合物的肽在施用过所述肽的受试者中增加T_eff的克隆扩增。

在一些实施方案中，将药物组合物配制用于口服施用。在其他实施方案中，将药物组合物配制用于肠胃外施用。在仍其他实施方案中，肠胃外施用是静脉内、皮下或透皮施用。

附图说明

图1提供了调节T细胞和效应T细胞的平衡的说明。

图2A-图2B显示源自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的肽对CD4(图2A)和CD8(图2B)细胞的频率的影响。

图2C-图2D显示源自短双歧杆菌的肽对IL-2(图2C)和IL-17(图2D)细胞的分泌的影响。

图2E显示源自短双歧杆菌的肽对颗粒酶B在CD8细胞上的表达的影响。

图3A-图3C显示治疗性肽诸如SG-3-0020对Tact CD8细胞的频率(图3A)、CD8细胞的颗粒酶B表达(图3B)和IL-2的分泌(图3C)的影响。

图4是人T细胞活化测定的示意图。

图5A显示用于体外活化的人T细胞的方案并且图5B显示用于流式细胞术分析的方案。

图6A-图6D显示治疗性肽诸如SG-3-0020对人T细胞的活化的影响。

图7A和图7B示出了向小鼠肿瘤模型施用治疗性肽诸如SG-3-0020对人的活化的体内研究和示例性结果。

图8示出了AH-1四聚体染色的示例性方案。

图9-图10示出了向小鼠肿瘤模型施用治疗性肽诸如SG-3-0020对人的活化的体内研究和示例性结果。

图11A和图11B显示治疗性肽诸如SG-3-0020对人T细胞的活化的影响。

图12A和图12B显示治疗性肽诸如SG-3-0020对人T细胞的活化的影响。

图13A-图13D显示治疗性肽诸如SG-3-0020对标记活化的影响。

图14显示治疗性肽诸如SG-3-0020对人T细胞中CD-3依赖性效应细胞因子分泌的影响。

图15显示SG-3-0020增加与抗CD28活化组合的活性。

图16A和图16B显示SG-3-0020在体外调节活化的人T细胞的关键免疫基因的表达。图16A是显示与媒介物治疗组相比在SG-3-0020治疗组(10μM)中上调(右)和下调(左)差异表达基因(DEG)的火山图。标记了具有>2倍变化(log2FC＝1)的显著性(p<0.05)的基因。图16B显示免疫肿瘤学相关的DEG的所选实例。

图17显示SG-3-0020与人T细胞结合。SEB是衍生自葡萄球菌肠毒素B的肽并且预期与T细胞结合。B7-1是可能具有与T细胞结合的潜力的衍生自B7-1蛋白质的肽。20-sc是SG-3-0020的加扰版本(scrambled version)(阴性对照)。

具体实施方式

定义

除非本文另外定义，否则本申请使用的科学和技术术语应该具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文所描述的化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学结合使用的术语表以及其技术是本领域熟知和常用的术语表和技术。因此，虽然认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是阐述以下定义是为了便于解释当前公开的受试者。

贯穿本说明书，“包括(comprise)”一词或变化形式(如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”)应被理解为意指包括所陈述的组分或组分的组，但不排除任何其它组分或组分的组。

术语“一个(a)”或“一种(an)”是指一个或多个这种实体，即可以指复数指示物。如此，术语“一个(a)”或“一种(an)”、“一个或多个(one or more)”以及“至少一个(at leastone)”在本文可以互换地使用。另外，除非上下文清楚要求有一个并且只有一个要素，否则不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”修饰的“要素”并不排除存在超过一个/一种要素的可能性。

术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且各自广泛地是指通过肽键结合在一起的氨基酸序列，如普通技术人员的所熟知的。应当理解，该术语不隐含氨基酸聚合物的特定长度。

“信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)是指与蛋白质的N末端部分结合的氨基酸序列，其促进蛋白质的成熟形式从细胞中分泌。细胞外蛋白的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割了。

术语“氨基酸”或“任何氨基酸”是指任何和所有氨基酸，包括天然存在的氨基酸(例如，a-氨基酸)、非自然氨基酸、修饰的氨基酸和非天然氨基酸。其包括D-和L-氨基酸。

如本文所用，“序列同一性(sequence identity)”、“百分比同一性(percentidentity)”、“百分比同源性(percent homology)”或例如包括“与……50％相同的序列”是指序列在逐氨基酸的基础上、或在逐核苷酸的基础上或在比较窗口上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

可以如下进行序列之间的序列相似性或序列同一性(所述术语在本文中可互换使用)的计算。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可以对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。可以使用数学算法来完成序列的比较和确定两个序列之间的同一性百分比。在一些实施方案中，使用已经并入了在GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970,J.Mol.Biol.48:444-453)算法使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的间隙重量和1、2、3、4、5或6.0的长度重量，使用PAM120重量残留表、12的间隙长度罚分和4的间隙罚分来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。

在至少两个核酸或多肽的背景下的短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指多核苷酸或多肽包含与参考多核苷酸或多肽相比具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％序列同一性的序列。

相关的(和衍生的)蛋白质/肽涵盖“变体”蛋白质/肽。变体蛋白质/肽与另一个(即，母体)蛋白质/肽和/或与彼此有少量的氨基酸残基不同。与其所衍生的母体蛋白质/肽相比，变体可以包括一个或多个氨基酸突变(例如，氨基酸缺失、插入或取代)。在一些实施方案中，不同的氨基酸残基的数量为约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50个中的任一者。在一些实施方案中，变体有约1个至约10个氨基酸不同。可替代地或另外，变体与参考蛋白质/肽或核酸可以具有指定程度的序列同一性，例如，如使用序列比对工具(诸如先前讨论的BLAST、ALIGN和CLUSTAL)所确定的。例如，变体蛋白质/肽或核酸与参考序列可以具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体蛋白质/肽或核酸与参考序列不是100％相同的。

如本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本公开的肽、蛋白质或化合物的盐或两性离子形式，其是水溶性或油溶性或可分散的，其适合用于治疗疾病而没有过度毒性、刺激和过敏反应；其与合理的利益/风险比率相称，并且其对它们的预期用途有效。盐可以在化合物的最终分离和纯化期间或单独通过使氨基基团与合适的酸反应来制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-亚萘基磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸酯、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。而且，本公开化合物中的氨基基团可以用甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二甲基；二乙基；二丁基和二戊烷基硫酸盐；癸基、月桂基、肉豆蔻基和甾基氯化物、溴化物和碘化物；以及苄基和苯乙基溴化物来进行季铵化。可以用于形成治疗性可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸，以及有机酸诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的盐可以适当地是例如在酸加成盐和碱性盐中选择的盐。酸加成盐的实例包括氯化物盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱性盐的实例包括盐，其中阳离子选自碱金属阳离子(诸如钠或钾离子)、碱土金属阳离子(诸如钙或镁离子)、以及经取代的铵离子诸如N(R1)(R2)(R3)(R4)+型离子(其中R1、R2、R3和R4通常将独立地表示氢、任选地经取代的C1-6-烷基或任选地经取代的C2-6-烯基)。相关C1-6-烷基基团的实例包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基基团。具有潜在相关性的C2-6-烯基基团的实例包括乙烯基、1-丙烯基和2-丙烯基。药学上可接受的盐的其他实例描述于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第17版,Alfonso R.Gennaro(编辑),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA,1985(以及其更多的最新版本),于“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”,第3版,James Swarbrick(Ed.),Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007,以及于J.Pharm.Sci.66:2(1977)中。而且，对于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的Handbookof Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(Wiley-VCH,2002)。其他合适的碱盐由构成无毒盐的碱形成。代表性实例包括铝、精氨酸、苯乍生、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺(olamine)、钾、钠、氨丁三醇和锌盐。酸和碱的半盐也可以形成例如半硫酸盐和半钙盐。

如本文所用，“单独的分离物”应当被视为意指在与一种或多种其它微生物分离之后主要包含微生物的单个属、物种或品系的组合物或培养物。短语不应当被视为表示微生物被分离或纯化的程度。然而，“单个分离物(individual isolates)”可以基本上仅包括微生物的一个属、物种或菌株。

如本文所用，术语“嵌合”或“重组”在描述核酸序列或蛋白质/肽序列时是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子、或者重新排列至少一个天然核酸或蛋白质/肽序列的一个或多个元件的核酸、或蛋白质/肽序列。例如，术语“重组”可以是指例如通过化学合成或通过基因工程技术操纵核酸的分离的区段形成的序列的两个原本分离的区段的人工组合。

如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，如本领域所熟知的。

术语“培养”是指在液体或固体培养基中在合适的生长条件下使细胞(例如，微生物细胞)群体生长。

如本文所用的术语“分离”、“纯化”、“分开”和“回收”是指例如以含有其的样品的至少90重量％或至少95重量％、或至少98重量％的浓度从与其自然相关的至少一种组分中除去的材料(例如，蛋白质、核酸或细胞)。例如，这些术语可以是指基本上或实质上不含通常伴随的在其天然状态(例如完整的生物系统)中发现的组分的材料。

术语“受试者”是指哺乳动物诸如人、非人灵长类动物、牲畜动物(例如，牛、猪)、伴侣动物(例如，犬、猫)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，该术语是指人受试者。在示例性实施方案中，该术语是指患有胃肠炎症病症的人受试者。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以引入用于生产肽的重组表达载体中以表达肽的细胞或细胞系。包含重组载体的宿主细胞可以被称为“重组宿主细胞”。

如本文所用，术语“改善的”应被视为广泛地涵盖如与对照相比或与所讨论特征相关的已知平均数量相比，疾病状态的鉴定特征的改善，所述特征被本领域技术人员考虑通常关联或指示所讨论的疾病。例如，可以通过如与未治疗的人类比较对用本公开蛋白质治疗的人类的数据进行比较来证明与应用本公开的蛋白质相关的“改善的”功能。在本公开中，“改善”不一定需要数据在统计学上显著(即p<0.05)；相反，证明一个值(例如平均治疗值)与另一个值(例如平均对照值)不同的任何可量化差异可以升高到“改善”的水平。

如本文所用，“抑制(inhibiting)和抑制(suppressing)”和相似术语不应被解释为要求完全抑制(inhibition或suppression)，但是在一些实施方案中这可能是期望的。因此，“抑制免疫应答(inhibited immune response)”或“抑制炎性细胞因子(inhibition ofinflammatory cytokines)”不需要绝对抑制。

因此，如本文所用，术语“增加”或“减少”或语法等价物表示相对于参考(例如基线)测量值的值，所述参考测量结果诸如在本文所述的可比条件下取得的测量值(例如在开始本文所述的治疗之前在同一受试者中的测量值，或在不存在治疗的情况下在一名对照受试者(或多名对照受试者)中的测量值)。在一些实施方案中，合适的对照是基线测量值，诸如在开始本文所述的治疗之前在同一受试者中的测量值、或者在没有本文所述的处理的情况下在一名对照受试者(或多名对照受试者)中的测量值。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比赋予治疗受试者治疗效果的治疗剂(例如，本公开的肽、多肽或蛋白质)的量。这种治疗效果可以是客观的(即，通过一些测试或标志物测量)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感受到效果)。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指诸如通过改善与疾病相关的症状和/或还减轻疾病症状的严重性或频率，可有效治疗或改善相关疾病或病症和/或表现出可检测的治疗或预防作用的治疗剂或组合物的量。通常在可以包含多个单位剂量的剂量方案中施用治疗有效量。对于任何特定的治疗剂，治疗有效量(和/或有效计量方案内的适当单位剂量)可以变化，例如，取决于施用途径、或与其他治疗剂的组合。可替代地或另外地，任何特定受试者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可能取决于各种因素，包括所治疗的疾病的特定形式；病症或预先病症的严重性；所用具体治疗剂的活性；所用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所用具体治疗剂的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢率；治疗的持续时间；和医学领域中所熟知的相似因素。本公开利用治疗有效量的新型肽以及包含所述新型肽的组合物来治疗各种疾病，诸如各种癌症。在一些实施方案中，治疗有效量的所施用的肽或包含所述肽的组合物将降低所述癌症的发生率。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗”(treat)或“治疗”(treating))是指根据因为部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟特定疾病、障碍和/或病症(例如，慢性或复发性免疫应答和胃肠道(GI)炎症)的一种或多种症状或特征的发作、降低其严重性和/或降低其发生率而实现期望效果的治疗方案的治疗剂(例如，本公开的肽、多肽或蛋白质)的任何施用；在一些实施方案中，根据治疗方案的治疗剂的施用与期望效果的实现相关。此治疗可以是针对未出现相关疾病、病症和/或病状的病征的受试者和/或针对出现疾病、病症和/或病状的早期病征的受试者。可替代地或另外，此治疗可以是针对出现相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定病征的受试者。在一些实施方案中，治疗可以是针对已经被诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可以是针对已知具有与产生相关疾病、病症和/或病状的风险的增加在统计学上相关的一种或多种易感因素的受试者。

“药物”意味着组合物、试剂、方法等能够产生药物效果，并且所述组合物能够安全地施用至受试者。“药物效果”并不限制，可以暗示组合物、试剂或方法能够在至少一名受试者(诸如哺乳动物受试者，例如人)中，在至少5％的受试者群体中，在至少10％、在至少20％、在至少30％、在至少50％的受试者中等刺激所需的生化、遗传、细胞、生理学或临床效果。

“药学上可接受的”意指被联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典(U.S.Pharmacopoeia)或其它普遍认可的药典中列出的可安全用于动物并且更具体地可安全用于人类。“药学上可接受的媒介物”或“药学上可接受的赋形剂”是指与本文所述的肽一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。

“预防”意指为了预防疾病或病症或其至少一种症状所采取的措施。

“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指获得疾病或障碍的风险的降低(即，导致疾病的至少一种临床症状不在可能暴露于或易患所述疾病但尚未经历或显示出所述疾病的症状的受试者中发生，或导致症状发生的严重性小于没有治疗的情况)。“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”可以是指延迟疾病或障碍的发作。

“预防的有效量”意指化合物(即，如本文所述的肽)的量，所述量当施用至受试者用于预防疾病或病症时足以实现对所述疾病或病症的这种预防或者足以防止所述疾病或病症的至少一种症状的发生或者实现以比没有施用所述化合物的情况更低水平的严重性发生所述症状。“预防有效量”可以根据化合物、疾病及其严重性、以及待治疗的受试者的年龄、重量等而变化。

本文所提供的治疗性药物组合物可以衍生自或包含一种或多种天然产品。然而，在一些实施方案中，治疗性药物组合物它们本身不在自然界中存在。此外，在一些实施方案中，与自然界中可能存在的任何单独的天然存在的对应物或组合物组分相比，治疗性药物组合物具有明显不同的特性。也就是说，在一些实施方案中，与可能天然存在的组合物的任何单一单独组分相比，本文所提供的药物组合物(其包含治疗有效量的纯化的蛋白质或肽)具有赋予作为整体的组合物明显不同的特性的至少一种结构和/或功能性质。法院已确定，包含天然产品的组合物是法定主题，所述组合物与可能天然存在的任何单独组分相比具有明显不同的特性。因此，所公开的治疗性药物组合物作为整体具有明显不同的特性。在本文所提供的数据和实例中示出了这些特性。

术语“T细胞介导的疾病”意指T细胞直接或间接介导或以其他方式促进哺乳动物的发病率的疾病。如果B细胞被例如由T细胞分泌的淋巴因子刺激，则T细胞介导的疾病可能与但不限于细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应、以及甚至与B细胞相关的效应相关。

本文阐述了本公开的细节。尽管与本文所描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是现在将对说明性方法和材料进行描述。本公开的其它特征、目的和优点将从本说明书和权利要求书中显而易见。

治疗性多肽和对应的多核苷酸

已证明双歧杆菌(一种共生细菌)促进抗肿瘤免疫力和促进抗程序化细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)功效。实际上，细菌引发了抗PD-L1的加和效应，并增加了树突细胞上的MHC-II。参见Sivan等人(2015.Science.350(6264):1084-1089)。

进行研究以鉴定和表征可以促进活化免疫细胞并可以促进破坏肿瘤细胞的源自双歧杆菌的组合物，例如由双歧杆菌表达的蛋白质或其片段。例如，如图1所示，本公开的治疗性组合物可以改变效应T细胞(T_eff)与调节T细胞(T_reg)的比率。增加T_eff:T_reg细胞的比率可以防止肿瘤细胞从免疫监测中逃逸，从而导致受试者免疫系统破坏肿瘤细胞。在一些实施方案中，本公开的组合物还可以活化从幼稚骨髓细胞的树突细胞成熟，进一步促进受试者免疫系统的抗肿瘤活性。

因此，对由双歧杆菌基因组或其片段编码的多肽体外测试例如它们刺激幼稚CD4+和CD8+ T细胞(Th0)分化成CD4+和CD8+活化的T细胞(T_act)的能力。例如，将幼稚T细胞与感兴趣的双歧杆菌多肽一起孵育导致具有CD25+/FoxP3-表型的CD4+和/或CD8+ T细胞的数量增加表明双歧杆菌多肽增加了T_eff:T_reg的比率。通过治疗的幼稚鼠脾细胞的细胞因子IL-2和IL-17分泌以及颗粒酶B表达的增加提出了这种增加的T_eff:T_reg比率的进一步证据。另外，可以进行研究以显示所公开的肽活化树突细胞(DC)的能力。通过例如TNF、IL-1β和/或MHCI的表达增加可以证明DC的活化。

这种体外表征导致鉴定出本文称为SG-3-0020的蛋白质。显示SG-3-0020在与从幼稚小鼠中分离的脾细胞一起孵育时增加了活化的CD4和CD8细胞的频率(参见实施例1和图2A-图2B)。下面在表1中提供了SG-3-0020的氨基酸序列及其编码核苷酸序列。术语“SG-3-0020”和“SEQ ID NO:1”在本文中可互换使用。

表1：SG-3-0020及其编码核酸序列

在下面实施例2和实施例3中描述的随后实验显示SG-3-0020在体外增强了人T细胞的活化，并增加了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)隔室内的NK细胞和活化的CD8+ T细胞频率(参见图6A和图6B)。具体地，显示SG-3-0020通过T细胞调节影响适应性免疫力。在实施例2中，用抗CD3抗体刺激从5名单独的人供体中获得的纯化的T细胞，并将其在具有或没有SG-3-0020的情况下孵育。SG-3-0020的存在导致CD4+和CD8+细胞中的表面PD-1表达都增加。此外，将活化的T细胞与SG-3-0020一起孵育导致IFN-γ、IL-2、IL-10、TNF-α分泌增加。在SG-3-0020的存在下(与在没有SG-3-0020的情况下的活化的T细胞相比)也观察到T细胞的增加，所述T细胞是：CD4+CD25+、CD4+ICOS+、CD4+OX40+、CD8CD25+、CD8+ICOS+和CD8+OX40+(数据未显示)。

还进行了体内研究，并表明SG-3-0020的肿瘤旁施用增加了肿瘤微环境(TME)的免疫活化。每日两次(b.i.d.)的肿瘤旁注射导致TIL隔室中的NK细胞和活化的CD8+ T细胞频率增加(图7B)。

上面的研究表明，SG-3-0020及其具有可比较的生物活性的变体可有效调节受试者的免疫系统，并且因此可能作为治疗癌症和/或减少肿瘤体积和/或肿瘤生长的治疗剂是可行的。

肽变体

如前面提到的，可以在本文所公开的治疗性蛋白质(例如，SG-3-0020)的结构中进行修饰和/或改变。因此，本公开考虑了这些蛋白质的序列的变化和因此编码其的核酸，其中它们仍然能够保留关于本公开的预防和治疗方面的大量活性。

A.经修饰的肽

SG-3-0020的某些氨基酸可以被取代成在蛋白质/肽结构中的其它氨基酸而不会明显损失的与结构(诸如抗体的抗原结合区域、底物分子上的结合位点、受体等等)的相互作用结合能力。因此，这些蛋白质/肽可以是SG-3-0020(例如SEQ ID NO:1)的生物功能等价物。氨基取代可能是或可能不是保守的取代。因此，“保守的”变化不会破坏肽的生物活性，因为结构变化不是冲击蛋白质执行其设计的功能(诸如由与另一部分相互作用导致的功能)的能力的一种变化。

根据本公开的SG-3-0020的变体可以是相对于SEQ ID NO:1具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的蛋白质。可替代地陈述，所述变体可以与SEQ ID NO:1至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％相同。在一些实施方案中，本公开的肽具有SEQ ID NO:1的1、2、3、4或5个N-或C-末端残基的缺失。可替代地或另外地，相对于SEQ ID NO:1，存在1、2、3、4或5个氨基酸的内部缺失。

本文考虑了SG-3-0020的保守修饰的变体。“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同氨基酸序列的核酸、或具有一个或多个保守取代的氨基酸序列。保守取代的实例是将以下组之一的氨基酸交换成同一组的另一种氨基酸(参见美国专利号5,767,063；Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105-132)。(1)疏水性：正亮氨酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影响链定位的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe；(7)小氨基酸：Gly、Ala、Ser。因此，关于氨基酸的术语“保守取代”表示一种或多种氨基酸被另一个生物学上类似的残基替代，其中所述取代通常不影响蛋白质的功能性质。在一些实施方案中，本公开提供了相对于SEQ ID NO:1中鉴定的氨基酸序列具有至少一种非天然存在的保守氨基酸取代的蛋白质。

还考虑了治疗性蛋白质的修饰。例如，在蛋白质C-和/或N-末端可能存在乙酰基(Ac)和/或酰胺基团。在一些实施方案中，蛋白质可以“环化”，参考其中多肽分子的一部分与多肽分子的另一部分例如通过形成二硫化物桥或其他类似键连接以形成闭环的反应。SG-3-0020蛋白质或其变体可以通过接头与另一个分子(例如蛋白质(例如，BSA或Fc结构域)或稳定基团(诸如PEG分子))连接。如本文所用的“接头部分”广义上是指能够将两个肽单体亚单元连接(linking)或连接(joining)以形成二聚体的化学结构。

在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未经修饰的肽增加肽在水性溶液中的溶解度。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未经修饰的肽降低肽在水性溶液中的溶解度。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未修饰的肽增加肽在极性溶剂中的溶解度。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未修饰的肽降低肽在极性溶剂中的溶解度。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未经修饰的肽增加肽在非极性溶剂中的溶解度。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于未修饰的肽降低肽在非极性溶剂中的溶解度。

在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于在人体生理pH下的未经修饰的肽增加在人生理pH下的肽的净电荷。在一些实施方案中，修饰本公开的肽以相对于在人体生理pH下的未经修饰的肽降低在人生理pH下的肽的净电荷。

在一些实施方案中，本文所述的肽可能具有翻译后修饰(PTM)。蛋白质PTM在体内发生，并且可以通过共价添加官能团或蛋白质、蛋白水解切割调节亚基或降解整个蛋白质来增加蛋白质组的功能多样性。根据本公开制备的分离的蛋白质可以在体内或在体外进行一次或多次PTM。修饰的类型取决于其中蛋白质被表达的宿主细胞，并且包括但不限于磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化(例如，S-亚硝基化)、甲基化、乙酰化(例如，N-乙酰化)、脂质化(豆蔻酰化、N-豆蔻酰化、S-棕榈酰化、法尼基化、S-异戊烯化、S-棕榈酰化)并且蛋白质水解可能影响正常细胞生物学和发病机制的几乎所有方面。如本文所公开的分离的和/或纯化的SG-3-0020蛋白质或其变体或片段可以包含一种或多种上述翻译后修饰。

对于上述SG-3-0020的每种变体，本领域普通技术人员可以根据本文所公开的测定(例如，T细胞活化测定或评估对肿瘤体积的影响的体内测定)评估和比较生物活性。

使用包含SG-3-0020或其变体的组合物的免疫疗法

在一些实施方案中，包含本公开的多肽或肽(例如，SG-3-0020和/或其变体)的组合物可用于有需要的受试者的免疫疗法。“免疫疗法”是指通过在受试者中诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或障碍。设计用于引出或扩大免疫应答的免疫疗法被称为活化免疫疗法。设计用于减少或抑制免疫应答的免疫疗法被称为抑制免疫治疗。例如用于恶性肿瘤、自身免疫反应和慢性感染的成功免疫治疗剂依赖于开发新方法用于诱导或控制免疫应答的有效手段。

T细胞

稳固哺乳动物中的免疫应答的关键步骤是活化可以识别与疾病或障碍相关的抗原的适当的T细胞组。T细胞可以分化为辅助T细胞、调节T细胞、细胞毒性T细胞或记忆T细胞。CD4+和CD8+ T细胞构成大多数T细胞。CD4+辅助T细胞识别MHC-II限制性外源抗原，其已在抗原呈递细胞(诸如树突细胞(DC))中的细胞内体途径中被捕获和处理，然后被复合到高尔基体隔室中的MHC-II上以形成抗原-MHC-II复合物。在细胞表面上表达的该复合物可以诱导CD4+效应T细胞的活化。

CD4+ T细胞可以被活化并分化成不同的效应子亚型，包括T辅助1(Th1)、T辅助2(Th2)、T辅助17(Th17)、卵泡辅助T细胞(Tfh)、诱导型T调节细胞(iTreg)和调节1型细胞(Tr1)。CD4+ T细胞(Th细胞)产生白细胞介素，其进而帮助活化免疫系统的其他分支。例如，Th细胞产生白细胞介素-4(IL-4)和IL-5(其辅助B细胞生产抗体)；IL-2(其活化CD4+和CD8+T细胞)。白细胞介素-12(IL12)和干扰素γ(IFNγ)是引发下游信号传导级联以产生Th1细胞的关键细胞因子。IL12进而诱导自然杀伤细胞(NK)以产生IFNγ。由于识别MHC-II限制抗原的Th细胞在细胞毒性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞的活化和克隆扩增中起主要作用，因此响应于抗原而活化辅助T细胞的初始事件对于诱导针对该抗原的有效免疫应答的诱导至关重要。

CD8+ T细胞(细胞毒性T淋巴细胞)对于免疫防御细胞内病原体和肿瘤监测很重要。当所需的蛋白质/肽以为了在细胞表面上作为加工过的蛋白质/肽(其与MHC-I抗原复合)呈现的这样的方式通过细胞被传递时，活化CD8+细胞。尽管释放穿孔素、颗粒酶和粒溶作用(granulysis)，但是CD8+细胞毒性T细胞破坏了感染的靶细胞。

调节T细胞(T_reg)主要功能是抑制Th细胞的潜在有害活性。T_reg可以表达FOX蛋白质家族的成员叉头盒(forkhead box)P3(FOXP3)，其在调节性T细胞的发育和功能中发挥调节途径的主要调节剂的功能。T_reg通常参与降低免疫应答。在癌症的情形中，过量的T_reg活性可以防止免疫系统破坏癌细胞。

树突细胞

除了T细胞在免疫应答中发挥的关键作用外，树突细胞(DC)同样重要。DC是专业的抗原呈递细胞，其处理抗原材料并将其在细胞表面上呈现至T细胞。DC在维持对自身抗原的耐受方面和在活化先天性和适应性免疫力方面具有关键的调节作用(Banchereau等人,1998,Nature 392:245-52；Steinman等人,2003,Annu.Rev.Immunol.21:685-711)。

DC源自造血骨髓祖细胞，其最初转化为未成熟的树突细胞。未成熟的树突细胞持续对病原体的周围环境取样，这通过模式识别受体(诸如toll样受体(TLR))向下。抗原呈递细胞(APC)(诸如DC和巨噬细胞)在活化先天性和适应性免疫力以及在维持免疫耐受性方面起着重要作用。

当DC遇到促炎症刺激物诸如微生物产物时，通过上调细胞表面表达的抗原肽加载的MHC分子和共刺激分子来引发细胞的成熟过程。在成熟和归巢至局部淋巴结之后，DC通过形成免疫突触建立与T细胞的接触，其中T细胞受体(TCR)和共刺激分子集聚在由粘附分子包围的中心区域(Dustin等人,2000,Nat.Immunol.1:23-9)。一旦在DC的存在下被活化，例如CD8+ T细胞可以自主增殖几代并且在没有进一步抗原刺激的情况下获得细胞毒性功能(Kaech等人,2001,Nat.Immunol.2:415-22；van Stipdonk等人,2001,Nat.Immunol.2:423-9)。因此已经提出，由DC提供的肽-MHC复合物(信号1)和共刺激分子(信号2)的水平和持续时间对于确定抗原特异性T细胞应答的幅度和命运是至关重要的(Lanzavecchia等人,2001,Nat.Immunol.2:487-92；Gett等人,2003,Nat.Immunol.4:355-60)。

DC使用识别保守微生物结构诸如脂多糖(LPS)的TLR，以通过活化核因子-κB(NF-κB)信号传导途径来促进DC成熟(Akira等人,2004,Nat.Rev.Immunol.4:499-51 1)。诱导对肿瘤免疫的努力试图促进DC成熟和共刺激作为增强抗肿瘤免疫力的手段。

非常多的注意也集中在促炎症信号传导上，但关于抑制炎症和使炎症消退的机制的认识很少。TLR引发的免疫应答的幅度和持续时间由促炎症信号传导的强度和持续时间和通过信号转导途径的调节来规定。由于TLR诱导的对转录因子NF-κB的活化对于大量促炎症基因的转录是至关重要的，因此使用多种机制以在多个水平上对TLR信号传导进行负面调节，以保护受试者免受过度免疫应答(诸如脓毒性休克)并在长期微生物暴露(诸如肠道微环境)的情境下维持免疫稳态。

细胞因子

细胞因子是由细胞释放的对细胞之间的相互作用和通信具有特定作用的小分泌蛋白。细胞因子是通用名称；其他名称包括淋巴因子(由淋巴细胞制成的细胞因子)、单核因子(由单核细胞制成的细胞因子)、趋化因子(具有趋化活性的细胞因子)和白细胞介素(由一种白细胞制成并作用于其他白细胞的细胞因子)。细胞因子可以作用于分泌它们的细胞(自分泌作用)、作用于附近细胞(旁分泌作用)、或在一些情形中作用于远处细胞(内分泌作用)。存在促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子两者。Zhang等人,“Cytokines,Inflammationand Pain,”Int.Anesthesiol.Clin.,第45(2)卷:27-37(2007年春季)。细胞因子通常刺激造血谱系细胞的增殖或分化或者参与身体的免疫和炎症反应机制。

细胞因子批判性地参与多种免疫细胞功能的调节(Curtsinger等人,2003,J.Exp.Med.197:1141-51；Valenzuela等人,2002,J.Immunol.169:6842-9)。如上所述，各种免疫细胞表型以它们分泌的细胞因子为特征。细胞因子通常被归类为促炎症或抗炎症。

白细胞介素是一种介导免疫应答的细胞因子家族。免疫应答的中心是T细胞，其产生许多细胞因子并在对抗原的适应性免疫力中起作用。由T细胞产生的细胞因子已被归类为1型和2型(Kelso等人,1998.Immun.Cell Biol.76:.00-317)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，并且涉及炎症反应、病毒免疫力、细胞内寄生虫免疫力和同种异体移植物排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并且参与体液反应、蠕虫免疫力和过敏反应。

促炎症细胞因子

促炎症细胞因子是在细胞信号传导中重要的并促进全身炎症的细胞因子。它们主要由活化的巨噬细胞产生，并参与炎症反应的上调。促炎症细胞因子由编码用于翻译的小介体分子的基因，所述小介体分子在上调后诱导反应。白细胞介素-1(IL-1)、ΙL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、CD40L、肿瘤坏死因子(TNF)诸如TNF-α、γ-干扰素(IFN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、MCP-1、TNF相关的凋亡诱导配体、RANK-配体和TALL-1/BAFF被很好地表征为促炎症细胞因子。炎症的特征在于促炎症和抗炎症细胞因子之间的相互作用。在一些实施方案中，本公开的肽的施用伴随着促炎症细胞因子的增加。

抗炎症细胞因子

抗炎症细胞因子是控制促炎症细胞因子反应的一系列免疫调节分子。因此，这些分子调节并帮助降低由促炎症细胞因子产生的促炎症反应。IL-4、IL-10、IL-13，IFN-α(IFN)和转化生长因子-β(TGF-β)被认为是抗炎症细胞因子。在一些实施方案中，本公开的肽的施用伴随着抗炎症细胞因子的降低。

据了解，关于细胞因子的作用存在强的相互作用。例如，一种细胞因子的促炎症活性可以被另一种细胞因子的抗炎症活性衰减或消除。

本公开预期多肽和/或其它化合物或其组合物可以用于治疗癌症和各种免疫相关的疾病和病症，诸如T细胞介导的疾病，包括以炎症细胞渗透到组织中、刺激T细胞增殖、抑制T细胞增殖、增加或降低的血管渗透性、或其抑制为特征的那些。

癌症

整体抑制的T细胞功能已在许多癌症受试者中进行了描述，其是开发临床有效的癌症免疫疗法的主要障碍。抑制抗肿瘤免疫应答在很大程度上与呈现有癌症的受试者中存在的抑制因子有关。“赘生物障碍”是与细胞增殖相关、特别是与赘生物相关的任何障碍。“赘生物”或“瘤”是可能为良性或恶性的异常组织肿块。几乎所有良性肿瘤都被包封，并且是非侵入性的。相比之下，恶性肿瘤几乎从未被包封并通过浸润性破坏性生长侵袭相邻的组织。这种浸润性生长可能跟随着肿瘤细胞植入与原始肿瘤不连续的位点。

赘生物或赘生物障碍可以是癌症。如本文所用的“癌症”是指细胞的不受控制的生长，其干扰身体器官和系统的正常功能。血液癌症(诸如白血病)能够超越受试者中正常的造血隔室，从而导致贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式的造血失败；最终导致死亡。

从其原始位置和种子活力器官迁移的癌症最终可能通过受累器官的功能恶化导致受试者死亡。转移是癌细胞的一个区域，不同于由癌细胞从原发性肿瘤扩散到身体的其他部位而导致的原发性肿瘤位置。在诊断原发性肿瘤肿块的时候，可以监测受试者中转移的存在。除了监测具体的症状外，还经常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层摄影(CT)扫描、血液和血小板计数、肝功能测定、胸X射线和骨骼扫描来检测转移。

本公开的方法可以用于治疗或预防人类中的赘生物障碍，包括但不限于癌症，诸如肉瘤、癌、纤维瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤和胶质瘤。癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌症、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌症、消化系统癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头部和颈部癌症、胃癌(gastric cancer)、上皮内赘生物、肾癌(kidneycancer)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(小细胞和非小细胞)、淋巴瘤(包括霍奇金和非霍奇金)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌(renal cancer)、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、以及其他癌和肉瘤。

“患有癌症的受试者”是已经被诊断患有癌症的受试者。在一些实施方案中，受试者具有以实质性肿块肿瘤为特征的癌症类型。如果存在的话，实质性肿瘤肿块可以是原发性肿瘤肿块。原发性肿瘤肿块是指组织中的由该组织的正常细胞的转化产生的癌细胞的生长。在大多数情况下，通过存在可以通过视觉或触诊方法发现的囊肿、或者通过组织的形状、质地或重量的不规则来鉴定原发性肿瘤肿块。

一些原发性肿瘤不可触及，并且仅可以通过医学成像技术诸如X射线或通过针抽吸来检测。使用这些近来的技术在早期检测中更常见。组织内的癌细胞的分子和表型分析将通常确认癌症是否对组织是内源的，或者如果病灶是否是由于来自另一个部位的转移。

据估计，几乎一半的所有目前诊断的癌症将用一些形式的癌症药物进行治疗。然而，许多形式的癌症，包括黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和膀胱癌未对癌症药物的治疗有良好的反应。事实上，只有约5-10％的癌症可以仅使用癌症药物治愈。这些包括一些形式的白血病和淋巴瘤、睾丸癌、绒毛膜癌、Wilm肿瘤、尤因氏肉瘤、神经母细胞瘤、小细胞肺癌和卵巢癌。仍然有其他癌症(包括乳腺癌)的治疗需要与癌症药物结合的手术或放射疗法的组合。参见Bratzler和Peterson。

肿瘤环境通常对免疫攻击而言是顽固的。在癌症免疫疗法中理想的是使肿瘤环境更少顽固，以便增加肿瘤内CTL或其他效应T细胞的活性并改善治疗的总体功效。如本文所用，“功效”是指化学治疗和/或免疫组合物或其组合治疗获得所需作用或结果的能力。

已经证明一些人类癌症患者在赘生物细胞上发育出对抗原的抗体和/或T淋巴细胞反应。还已显示在肿瘤的动物模型中，增强免疫应答可能导致该特定赘生物的排斥或消退。增强混合淋巴细胞反应(MLR)中的T淋巴细胞反应的分子在体内增强对瘤的免疫应答方面具有效用。可以在治疗上使用增强MLR(或以激动剂的方式影响相同受体的小分子激动剂或抗体)中的T淋巴细胞增殖反应的分子来治疗癌症。抑制MLR中淋巴细胞反应的分子在瘤形成期间在体内起作用以抑制对赘生物的免疫应答；此类分子可以由赘生物细胞它们本身表达，或者它们的表达可以通过其他细胞中的赘生物来诱导。此类抑制分子(与抗体、小分子拮抗剂或其他手段)的拮抗作用增强免疫介导的肿瘤排斥。

SG-3-0020和及其变体的生产或合成

SG-3-0020蛋白以及其任何取代变体可以使用本领域普通技术人员容易知道的重组技术来产生。例如，可以将编码治疗性蛋白质的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:2)亚克隆到用于转化适当宿主细胞(例如大肠杆菌BL21细胞)的表达载体中，并且可以培养所述细胞以允许细胞生长和蛋白质表达。然后可以再次使用本领域普通技术人员容易知道的各种方法纯化表达的蛋白质。通常，“纯化”将是指特定蛋白质/肽组合物已经进行分级以除去非蛋白质组分和各种其他蛋白质、多肽或肽，并且该组合物基本上保持了其活性，如可以通过蛋白质测定(如下文所述，或者如本领域普通技术人员对于所需的蛋白质、多肽或肽所知道的)来评估的。

在一些实施方案中，宿主细胞可以是至少一种生物体。在一些实施方案中，生物体可以是但不限于原核生物(例如，真细菌、古细菌)或真核生物(酵母)。

可获得许多细胞系和培养物来用作宿主细胞，并且它们可以例如通过美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)获得，美国模式培养物保藏所是一个用作为活的培养物和遗传物质归档的组织。可以基于载体骨架和期望的结果由本领域技术人员确定适当的宿主。例如，可以将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞中以复制许多载体。可用于载体复制和/或表达的细胞类型包括但不限于细菌，诸如大肠杆菌(例如，大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC编号31537)以及大肠杆菌W3110(F-、λ、原养型、ATCC编号273325)、DH5α、JM109和KC8，芽孢杆菌诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；以及其他肠杆菌科，诸如鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种，以及许多可商购获得的细菌宿主诸如

感受态细胞和SOLOPACK^TM金细胞(

La Jolla)。在一些实施方案中，细菌细胞诸如大肠杆菌被特别考虑作为宿主细胞。

用于复制和/或表达载体的真核生物宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自各种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可获得的，并且将对本领域技术人员而言是已知的。类似地，病毒载体可以与真核生物或原核生物宿主细胞(特别是允许复制或表达载体的一种宿主细胞)结合使用。

从给定的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)中，技术人员将知道如何采用序列并利用密码子优化算法来产生核苷酸序列。密码子优化算法基于表达宿主的密码子使用偏好来选择给定氨基酸的适当密码子。许多密码子优化算法还考虑了其他因素，诸如mRNA结构、宿主GC含量、核糖体进入位点。密码子优化算法和基因合成服务提供商的一些实例是：GenScript:www.genscript.com/codon-opt.html；ThermoFisher:www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gen e-synthesis/geneoptimizer.html；and Integrated DNA Technologies:www.idtdna.com/CodonOpt。然后合成核苷酸序列并将其克隆到适当的表达载体中。

在使用术语“基本上纯化的”的情况下，这将是指其中特定蛋白质、多肽或肽形成组合物的主要组分的组合物，诸如构成组合物中的肽的约50％或更多。在优选的实施方案中，基本上纯化的肽将构成组合物中的肽的超过60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至更多。

如应用于本公开的被“纯化至同质”的肽、多肽或蛋白质意指肽、多肽或蛋白质具有其中肽、多肽或蛋白质是基本上纯化的或不含其他蛋白质/肽和生物组分的纯度水平。例如，纯化的肽、多肽或蛋白质将通常充分不含其他蛋白质/肽组分，从而可以成功地进行降解测序。

鉴于本公开，用于定量蛋白质、多肽或肽的纯化程度的方法对于本领域技术人员而言将是已知的。这些包括例如确定级分的特定蛋白质活性，或者通过凝胶电泳评估级分内的多肽数量。

虽然优选用于一些实施方案，但没有蛋白质、多肽或肽总是以其最纯化的状态提供的一般要求。实际上，预期较少基本上纯化的蛋白质、多肽或肽虽然富集于所需的肽组合物中，但是相对于自然状态在一些实施方案中将具有效用。

表现出较低程度的相对纯化的方法可能在肽产物的总回收率或保持表达的肽的活性方面具有优点。在一些实施方案中，无活性产物在一些实施方案中也具有效用，例如，在通过抗体产生确定抗原性方面。

在其他实施方案中，可以使用富集肽的制剂代替纯化的制剂。在本文件中，每当使用纯化的时，也可以使用富集的。制剂不仅可以通过纯化方法富集，而且还可以通过细菌(当与野生型相比时)的过度表达或过度产生肽来富集。这可以使用重组方法或通过选择将从野生型细胞诱导肽的表达的条件来完成。

在替代性实施方案中，通过本领域普通技术人员容易知道的方法，可以化学合成SG-3-0020蛋白或其变体。

表达系统

本文提供的是用于生产本公开的蛋白质的组合物和方法以及含有编码所述蛋白质的多核苷酸序列的表达载体和具有所述表达载体的宿主细胞。本公开的蛋白质可以通过常规重组方法(例如培养用含有编码本文所述的治疗性蛋白质的核酸的表达载体转化或转染的细胞)来制备。许多表达系统可以用于生产如上所讨论的肽。基于原核生物和/或真核生物的系统可以用于与本公开一起使用，以产生核酸序列、或其同源多肽、蛋白质和肽。许多此类系统是商业和广泛可用的。表达系统包括但不限于昆虫细胞/杆状病毒系统和诱导型哺乳动物表达系统，预期通过本公开的方法产生的蛋白质、多肽或肽可以是“过度表达的”。例如，蛋白质、多肽或肽可以相对于其在细胞中的天然表达以增加的水平表达。

因此，还提供了生产任何本文所述的蛋白质的方法，并且所述方法包括在适合于表达所需蛋白质的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收所需的蛋白质。然后可以将回收的蛋白质分离和/或纯化，以用于体外和体内方法以及配制成药学上可接受的组合物。在一些实施方案中，将蛋白质在原核生物细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、链霉菌属(Streptomyces)物种(例如，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、青紫链霉菌(S.lividans)、白色链霉菌(S.albus)、或委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae))、或芽孢杆菌属(Bacillus)物种(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))中表达。在一些实施方案中，将蛋白质在真核生物细胞中表达，诸如酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或昆虫细胞(例如，sf9、sf21、Tni和S2)。在一些实施方案中，蛋白质的分离和纯化包括一个或多个步骤，以将内毒素减少至供在人类或其他动物中治疗使用可接受的水平。

本文还提供了包含编码本公开的蛋白质的多核苷酸序列的表达载体。可以使用标准重组技术获得编码本公开的蛋白质的多核苷酸序列。所需的编码多核苷酸序列可以从源细菌(即短双歧杆菌)的基因组DNA中扩增。可替代地，可以使用核苷酸合成器来合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制并表达异源(外源)多核苷酸的重组载体中。本领域可用和已知的许多载体可以用于本公开的目的。选择适当的载体将主要取决于待插入载体中的核酸的大小、和待用载体转化的特定宿主细胞。每个载体含有各种组分，取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达、或两者)及其与其所在的特定宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于：复制的起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。

一般来讲，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点、以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常使用pBR322、pUC、pET或pGEX载体转化大肠杆菌，所述载体是源自大肠杆菌物种的质粒。此类载体含有编码氨苄西林(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并因此提供了用于鉴定转化细胞的容易手段。这些载体以及它们的衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可以含有或被修饰以含有可以被微生物生物体用于表达内源性蛋白质的启动子。

本公开的表达载体可以包含启动子、位于上游(5')的未翻译调节序列，并且与编码蛋白质的核苷酸序列可操作地连接使得启动子调节该编码序列的转录。原核生物启动子通常落入两个类别：诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化(例如营养素的存在或不存在、或者温度变化)在其控制下引发编码多核苷酸的转录水平增加的启动子。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是熟知的，并且技术人员可以根据所需的表达水平选择启动子。适合与原核生物宿主一起使用的启动子包括大肠杆菌启动子诸如lac、trp、tac、trc和ara；由大肠杆菌识别的病毒启动子，诸如如λ和T5启动子；以及衍生自T7噬菌体的T7和T7lac启动子。具有包含T7启动子的载体的宿主细胞例如被工程化以表达T7聚合酶。此类宿主细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)、Lemo21(DE3)和NiCo21(DE3)细胞。适合与酵母宿主一起使用的启动子包括启动子诸如酵母醇脱氢酶1(ADH1)启动子、酵母磷酸甘油酸酯激酶(PGK1)启动子、以及翻译延伸因子EF-1α启动子。在一些实施方案中，其中宿主细胞是多形汉逊酵母细胞，启动子是MOX启动子。在一些实施方案中，启动子是在化学或环境因素的控制下的诱导型启动子。

进一步有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等人,1985)；和pGEX载体，用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白供以后纯化和分离或切割。其他合适的融合蛋白是与β-半乳糖苷酶、泛素等的那些融合蛋白。

用于在原核生物和真核生物宿主细胞中表达的合适载体是本领域已知的。

本公开的载体可以进一步包含信号序列，所述信号序列允许翻译的重组蛋白被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)。对于不识别和加工对异源多肽而言天然的信号序列的原核生物宿主细胞，信号序列被例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PeIB、OmpA和MBP的原核生物信号序列取代。用于真核生物表达系统的熟知的信号序列包括但不限于白细胞介素-2、CD5、免疫球蛋白κ轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素。

如本文所述的蛋白质(例如，SG-3-0020)可以被表达为融合蛋白或多肽。常用的融合伴侣包括但不限于人血清白蛋白和可结晶的片段、或IgG的恒定结构域、Fc。组氨酸标签或FLAG标签也可以用于简化重组蛋白从表达介质或重组细胞裂解物的纯化。可以将融合伴侣融合到感兴趣的蛋白质的N-和/或C-末端。

用于将重组DNA(即表达载体)引入宿主细胞中使得DNA可作为染色体外元件或作为染色体整合体被复制、从而产生具有感兴趣的表达载体的宿主细胞的方法是熟知的。转染方法对于普通技术人员而言是已知的，例如通过CaPO₄和电穿孔。取决于所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等人,同上所述的使用氯化钙的钙处理、或电穿孔通常用于含有大量细胞壁屏障的原核生物或其他细胞。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已经在美国专利号4,399,216中有描述。可以根据以下文献的方法进行转化到酵母中：Van Solingen等人,J.Bact,130:946(1977)以及Hsiao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)。将DNA引入细胞中的其它方法包括：核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合、或使用聚阳离子(例如聚凝胺、聚鸟氨酸)引入。对于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人,Methods inEnzymology.185:527-537(1990)以及Mansour等人,Nature,336:348-352(1988)。

因此，本文提供的是如上所述并包含编码感兴趣的治疗性蛋白质序列(例如，SEQID NO:1)的多核苷酸的重组载体或表达载体。所述多核苷酸可以是SEQ ID NO:2。此外，本公开提供了包含载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是如上详述的真核生物或原核生物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核生物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌、乳乳杆菌、天蓝色链霉菌、青紫链霉菌、白色链霉菌、或委内瑞拉链霉菌、或枯草芽孢杆菌。

包含治疗性肽的药物组合物

提供了组合物，其包含如本文所述的肽。在实施方案中，本文所述的组合物是适合用于人施用并且在施用至有需要的人时表现出治疗效果的药物组合物。本公开的药物组合物可以包含治疗有效量的在药学上可接受的载体中的治疗性肽。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指适合用于酌情施用至动物(例如人类)的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员已知药物组合物或另外的活性成分的制备，如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990所例示的，所述文献通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人类)施用，应当理解的是，制剂应符合无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物标准办公室(FDA Officeof Biological Standards)所要求的标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类的材料以及它们的组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑了其在治疗组合物或药物组合物中的使用。

本公开的组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气溶胶的形式施用，以及其对于施用途径诸如注射而言是否需要无菌。本公开的肽可以口服或直肠施用，但也可以鞘内地、鼻内地、皮下地、粘膜内地、通过吸入(例如气溶胶吸入)、通过注射、或通过输注或连续输注、局部地、局部灌注、直接沐浴靶细胞、经由导管、经由灌洗或通过其他方法或前述的任何组合施用，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990，通过引用并入本文)。

可以将本公开的肽配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基基团形成的那些、或者与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如醋酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。

在其中组合物呈液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)以及它们的组合。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)；通过在载体(例如液体多元醇或脂质)中的分散体维持所需的粒度；通过使用表面活性剂(例如羟丙基纤维素)；或此类方法它们的组合来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选的是包括等渗剂，例如糖、氯化钠或它们的组合。

在特定实施方案中，制备本公开的肽组合物用于通过途径诸如口服摄入施用。在这些实施方案中，固体组合物可以包含例如溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊(例如，硬或软壳明胶胶囊)、延迟释放胶囊、持续释放配制品、颊组合物、锭剂、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片或它们的组合。口服组合物可以直接掺入饮食食物中。用于口服施用的优选载体包括惰性稀释剂、可同化的可食用载体或它们的组合。在本公开的其他方面，可以将口服组合物制备为糖浆或酏剂。糖浆或酏剂，并且可以包括例如至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、防腐剂或它们的组合。

在一些实施方案中，口服组合物可以包含一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂以及它们的组合。在一些实施方案中，组合物可以包含以下中的一种或多种：粘合剂，例如黄芪树胶、阿拉伯橡胶树、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、桔子调味剂等；或前述它们的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，其还可以含有载体诸如液体载体。各种其他材料可以作为涂料存在或以其他方式修改剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。

适合用于其他施用模式的另外配制品包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常是含有药物，用于插入直肠。插入之后，栓剂软化、熔化或溶解在体腔中。一般来讲，对于栓剂，传统载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或它们的组合。在一些实施方案中，栓剂可以由含有例如约0.5％至约10％、以及优选地约1％至约2％范围内的活性成分的混合物形成。

在一些实施方案中，提供适合用于肠胃外施用的组合物。可注射配制品包含与以下组合的一种或多种所描述的化合物：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液或可以在使用之前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，其可以含有糖、醇、氨基酸、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。本发明的药物组合物中可以采用的适合的水性和非水性载剂的实例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物、植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。

这些药物组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等)，可以确保预防微生物对所描述化合物的作用。也可能需要在组合物中包括控制张度的药剂，诸如糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的药剂(诸如单硬脂酸铝以及明胶)可以实现可注射药物形式的延长的吸收。

通过将所需量的活性化合物根据需要与上文枚举的其它成分的各种组合一起掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和/或其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤液体介质中产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。如果需要，应适当地缓冲液体介质，并在用足够的盐水或葡萄糖注射之前首先使液体稀释剂等渗。还考虑了用于直接注射的高浓缩组合物的制备，其中展望使用DMSO作为溶剂，以导致极快速的渗透，从而将高浓度的活性剂递送到小区域。

组合物应在制造和存储条件下保持稳定，并保存免受微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应最低限度地保持在安全水平，例如小于0.5ng/mg蛋白质/肽。

在一些实施方案中，组合物包含纯化的肽，所述纯化的肽包含如上所述的SEQ IDNO:1所描绘的氨基酸序列或其变体、由它们组成或基本上由它们组成。

包含治疗性肽的组合疗法

包含治疗性肽的本文所提供的药物组合物可以与其他治疗疗法和/或药物组合物组合。例如，患有免疫相关疾病或障碍或癌症的受试者可能已经服用由他们的医生开处方的药物来治疗所述病症。在实施方案中，本文所提供的药物组合物能够与受试者的现有药物结合施用。

例如，本文所提供的治疗性肽可以与以下中的一种或多种组合：5-氨基水杨酸化合物、抗炎剂、抗生素、抗体(例如靶向炎症细胞因子的抗体，例如靶向TNF-α的抗体)，诸如阿达木单抗、pegol、戈利木单抗、英夫利昔单抗和赛妥珠单抗(certolizumab))、抗细胞因子剂、抗炎症细胞因子剂、类固醇、皮质类固醇、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤和巯嘌呤)、维生素和/或专门的饮食。在一些实施方案中，本公开的治疗性肽与检查点抑制剂一起施用，所述检查点抑制剂诸如靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、LAG-3、A2AR、TIM-3、B7-H3、VISTA或IDO的药剂。此类药物包括但不限于帕博利珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗和伊匹木单抗。本文所提供的治疗性肽可以与自体细胞免疫疗法(例如，sipuleucel-T)组合。在一些实施方案中，其他治疗疗法和/或药物组合物可以选自癌症免疫疗法，诸如活化NK细胞并增强抗体依赖性细胞的细胞毒性的单克隆抗体；癌症疫苗具有或没有刺激癌症-抗原特异性体液免疫应答的佐剂的癌症疫苗；化学治疗剂诸如卡铂和/或米托坦；激素诸如肾上腺皮质类固醇或氟甲睾酮；或改变受试者对癌症的反应而不是通过癌细胞的直接细胞毒性的生物反应改良剂，诸如促红细胞生成素或GM-CSF。在Bratzler和Peterson中公开了治疗疗法、药物组合物/药物的广泛但非限制性列表。

在一些实施方案中，在将所公开的治疗性肽与一种或多种另外的治疗剂组合时实现了协同效应。

在一些实施方案中，在免疫疗法之前或期间，一种或多种肿瘤或赘生物组织被广泛切除。在一些实施方案中，在免疫疗法之前或期间广泛切除一种或多种肿瘤导致疾病进展的放缓或停止。在一些实施方案中，在免疫疗法之前或期间广泛切除一种或多种肿瘤导致肿瘤消退或消除。

在一些实施方案中，疾病进展的放缓包括肿瘤生长或扩增速度的减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，肿瘤消退包括肿瘤数量、肿瘤大小或肿瘤体积减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

可以使用允许评估肿瘤或病灶大小的任何程序。非限制性实例包括数字直肠检查、内窥镜检查(例如，结肠镜检查)和成像(例如，PET、MRI、ERUS、DRE、CT)。参见例如，McKeown等人J Cancer.2014；5(1):31–43。在一些实施方案中，可以使用RECIST评估肿瘤负担(例如，RECIST版本1或版本1.1)。参见例如，Eisenhauer等人,Eur.J.Cancer.45(2):228-47(2009)。

还已经开发了用于评价免疫疗法的标准。非限制性实例包括免疫相关的反应标准(irRC)(参见Wolchok等人Clin Cancer Res.2009年12月1日；15(23):7412-20)和实体瘤中的免疫反应标准(iRECIST)标准(参见Seymour等人Lancet Oncol.2017年3月；18(3):e143–e152)。还参见Thallinger等人Wien Klin Wochenschr.2018；130(3):85–91。

除了活化NK细胞和内源树突细胞以及增加IFN之外，具有抗原特异性体液和细胞介导的免疫应答也可有助于治疗癌症。一些癌细胞是抗原性的并因此可以被免疫系统靶向。在一个方面，本公开的肽或者本公开的肽加上一种或多种癌症药物对于刺激对癌症的免疫应答特别有用。如本文所用的“癌症抗原”是与肿瘤或癌细胞表面相关并且当在抗原呈递细胞诸如树突细胞的表面上表达时能够引起免疫应答的化合物，诸如肽。在一些方面，抗原通过MHC分子在APC上呈现。可以使用重组技术或从头合成已知抗原由粗制癌细胞提取物或通过部分纯化抗原来制备癌症抗原，诸如以癌症疫苗呈现的那些或用于制备癌症免疫疗法的那些。在一些方面，使用从其他生物体分离的蛋白质或与所述蛋白质共享一定程度的同源性的合成蛋白质制备癌症免疫疗法。

已经鉴定出可以在体外和在体内杀死肿瘤靶标的不同细胞类型：自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)和活化的巨噬细胞。NK细胞可以杀死肿瘤细胞，而不预先对特定的抗原致敏，并且活性不需要由靶细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)编码的I类抗原的存在。NK细胞被认为参与初生肿瘤的控制和转移性生长的控制。与NK细胞相比，CTL可以仅在对肿瘤抗原致敏之后以及当靶抗原在也表达MHC I类的肿瘤细胞上表达时才杀死肿瘤细胞。CTL被认为是移植的肿瘤和DNA病毒引起的肿瘤的排斥中的效应细胞。LAK细胞是与NK和CTL群体不同的无效淋巴细胞的子集。一旦被活化，活化的巨噬细胞可以以非抗原依赖性也非MHC限制性的方式杀死肿瘤细胞。活化的巨噬细胞被认为降低它们浸润的肿瘤的生长速率。体外测定已经鉴定出其他免疫机制，诸如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性反应和通过抗体加上补体的裂解。然而，这些免疫效应机制被认为在体内不如NK、CTL、LAK和巨噬细胞的功能重要。

除了活化NK细胞和内源树突细胞以及增加IFN水平之外，与癌症疫苗结合使用本公开的肽提供了改善的抗原特异性体液和细胞介导的免疫应答。这样的增强可以允许使用具有降低的抗原剂量的疫苗来实现相同的有益效果。

利用治疗性肽治疗的方法

提供了用于治疗、预防或改善疾病或病症的至少一种症状的方法，所述方法包括：将治疗或预防有效量的如本文所述的肽施用至有需要的受试者，即具有疾病或病症或者疾病或病症的至少一种症状、或有发展疾病或病症或者疾病或病症的至少一种症状的风险的受试者。

肽的施用可以在受试者中预防、降低疾病或病症的严重性或消除疾病或病症的至少一种症状。受试者可以是动物。受试者可以是哺乳动物。受试者可以是人类受试者。

在一些实施方案中，疾病或病症是癌症，例如本文所述的任何癌症。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性甲状腺炎。在一些实施方案中，疾病或病症是霍奇金淋巴瘤。

在本文所提供的方法的一些实施方案中，将包含治疗性肽的药物组合物配制用于施用至胃肠内腔、或配制用于在肠、回肠末端或结肠中延迟释放。在本文所提供的方法的一些实施方案中，包含治疗性肽的药物组合物用肠溶包衣配制。

在本文所提供的方法的一些实施方案中，包含治疗性肽的药物组合物可以治疗施用过组合物的受试者中的癌症。在本文所提供的方法的一些实施方案中，包含治疗性肽的药物组合物可以导致在施用过组合物的受试者中诱导免疫细胞的至少一种促炎症细胞因子(例如，TNF-α和/或IL-23)的产生增加。在本文所提供的方法的一些实施方案中，包含治疗性肽的药物组合物可以在施用过组合物的受试者中抑制免疫细胞的至少一种促炎症细胞因子(例如，IL-10)。

在本文方法的一些实施方案中，第二治疗剂或预防剂与本文所述的肽结合同时或顺序地施用。在一些实施方案中，肽和第二药剂协同地作用以治疗或预防疾病、或病症或症状。在其他实施方案中，肽和第二药剂加和地作用以治疗或预防疾病或病症或症状。

治疗瘤的临床参数

施用包含本公开的肽的组合物导致受试者/受试者的细胞的生物反应。在一些实施方案中，施用本公开的一种或多种肽导致受试者或从其中分离的细胞表现出以下中的一者或多者：IL-10表达的降低、炎症(促炎症)细胞因子的增加、TNF-α的增加、抗炎症细胞因子的降低、对致耐受性树突细胞扩增的限制、IL-10:TNF的比率的降低、IL-12表达的增加、Th1活化的增加或促进、TNF的增加、树突细胞成熟的增加或增强、CD70表达的增加、T细胞活化的增加、T细胞活化的增加连同经由CD27的共刺激、CD80和/或CD86表达的增加、T细胞活化的增加或增强、T细胞活化的增加连同经由CD28的共刺激、MHC I和/或MHC II表达的增加、借助于MHC参与的抗原呈递的增加而增加或增强T细胞活化、T_reg细胞数量的降低、防止T_reg细胞的克隆扩增和/或促进T_eff细胞的克隆扩增、T_act细胞数量的增加、CTL细胞数量的增加、赘生物组织的大小和/或体积的减小、防止赘生物组织或细胞的转移、诱导赘生物细胞的凋亡、赘生物细胞凋亡速率的增加、一个或多个组织中赘生物肿块数量的下降、赘生物病灶大小的减小、以及T_act、T_eff/mem和/或CTL细胞的克隆扩增的增加。在一些实施方案中，向受试者施用本公开的一种或多种肽导致在受试者中(例如，在受试者的细胞诸如T细胞中)选自以下的一种或多种基因的表达降低：转录信号转导子和活化子1(STAT1)、干扰素调节因子1(IRF1)、分化簇96(CD96)、母体对抗生存因子同源物3(mothers againstdecapentaplegic homolog 3，SMAD3)、C-X-C基序趋化因子受体6(CXCR6)、转录因子7(TCF7)、淋巴细胞抗原9(LY9)、C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)、颗粒酶K(GZMK)、干扰素刺激的外切核酸酶基因20(ISG20)、和信号传导淋巴细胞活化分子F7(SLAMF7)。在一些实施方案中，向受试者施用本公开的一种或多种肽导致在受试者中(例如，在受试者的细胞诸如T细胞中)的选自以下的一种或多种基因表达的增加：双特异性磷酸酶6(DUSP6)、组织蛋白酶L(CTSL)、IL-9、IL-2、IL-10、IL-24、IL-21和IL-3。

在一些实施方案中，向受试者施用本公开的一种或多种肽导致在受试者血浆中的选自以下的一种或多种基因表达的增加：DUSP6、CTSL、IL-9、IL-2、IL-10、IL-24、IL-21和IL-3。

在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致受试者的寿命增加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周。在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致受试者的寿命增加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个月。在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致受试者的寿命增加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50年。

在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致一个或多个瘤的体积降低了所述一个或多个瘤的体积的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或98％。

在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致一个或多个赘生物病灶的大小减少了所述一个或多个赘生物病灶的大小的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或98％。

在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致赘生物的一个或多个负面副作用降低了至少5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％；其中所述负面副作用包括恶心、疼痛、不适、呕吐、腹泻、眩晕、食欲丧失、神经疼痛、癫痫发作、意识的周期性丧失、丧失或缺乏不卧床运动、丧失或缺乏身体协调、以及丧失或缺乏视觉。

在一些实施方案中，向受试者施用包含肽的组合物导致与一个或多个瘤接触的T_reg和T_eff细胞的克隆群体的转变，其中相对于T_reg群体，T_eff群体增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30倍。

微生物培养

提供了用于生产本文所述的肽的方法。所述方法包括在其中肽从编码它的外源多核苷酸表达的条件下培养如上所述的宿主细胞。

短双歧杆菌(ATCC 15700)是SEQ ID NO:2(其编码SEQ ID NO:1)的起源。根据常规设备和用于下面实施例的肽合成方法化学地合成具有SEQ ID NO:1的序列的SG-3-0020蛋白。

以下实例旨在说明而非限制本公开。

实施例

实施例1.SG-3-0020对鼠幼稚脾细胞的刺激的影响。

本实施例描述了初始筛选测定，以鉴定可以活化效应T细胞(具体地，特征部分在于CD4⁺CD25⁺FoxP3^-表型的CD4效应T细胞和特征部分在于CD8⁺CD25⁺FoxP3^-表型的CD8效应细胞)的双歧杆菌来源的肽。从幼稚雄性C57BL/6小鼠(Taconic，8-14周龄)分离的脾细胞被重新悬浮于平底96孔板中的完全RPMI(含有10％FBS加1％青霉素/链霉素的RPMI)中至最终8x10⁵个细胞/孔的数量。然后在每种肽(10μm于水中)或卵白蛋白肽氨基酸323-339(

于水中)、水(Th0 min H₂O)、单独地抗CD3抗体(Th0 min)的存在下用

抗CD3抗体或者用1μg/ml抗CD3加IL-12(10ng/ml)加5μg/ml抗IL-4抗体(阳性对照以产生Th1细胞)来刺激细胞。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育48h。参见图2A、图2B和图2C。

通过多色流式细胞术确定通过FoxP3的不存在和高CD25表达限定的活化(T_act)CD4(图2A)和CD8(图2B)T细胞的水平。然后，将T细胞的水平归一化为当用OV_323-339阴性对照肽治疗脾细胞时的T细胞水平。参见通过Luminex分析定量培养上清液中的IL-2(图2C)和IL-17(图2D)水平。通过流式细胞术分析了在门控的CD8 FoxP3^-T细胞上的颗粒酶B表达的水平。参见图2E。条表示通过Kruskall-Wallis用未经校正的Dunn检验的平均值±SD.(相对于Th0+H₂O)。

双歧杆菌来源的SG-3-0020增强与CD4+和CD8+ T细胞活化相关的细胞表面标记谱(CD25+/FoxP3-)的体外表达(图2A和图2B)、促进T效应细胞细胞因子分泌(IL-2和IL-17)(图2C和图2D)和促进CD8 T细胞中的关键效应分子(颗粒酶B)的诱导(图2E)的能力表明SG-3-0020或其变体可以促进T细胞的扩增或增加的活性，这进而又可以促进肿瘤细胞杀伤。

还使用上述方法进行剂量反应研究，其中用增加剂量的SG-3-0020(1μm、5μm或10μm)治疗小鼠幼稚脾细胞。进行流式细胞术分析以测量效应CD8 T细胞(CD8⁺、CD25⁺、FoxP3)的频率、在效应CD8 T细胞上的颗粒酶B表达、IL-2表达。如图3A、图3B和图3C所示，观察到SG-3-0020的剂量反应，从而支持使用SG-3-0020作为活性免疫调节剂，其可以促进T细胞的扩增或增加的活性，这进而又可以促进肿瘤细胞杀伤。

实施例2.SG-3-0020对人T细胞活化的影响。

进行研究以证明SG-3-0020活化人T细胞并通过T细胞调节影响适应性免疫力的能力。从5名单独的人供体中获得PBMC。从冷冻的PBMC中纯化T细胞(EasySep^TM人T细胞分离试剂盒(目录号17951，StemCell Technologies)。在图4中提供了方案的概述。根据图5A中提供的方案进行人T细胞的体外活化。在图5B中提供了用于流式细胞术分析的方案。总之，将纯化的T细胞与抗CD3抗体一起、与SG-3-0020一起或与抗CD28抗体(作为对照)一起孵育。图6A、图6B、图6C和图6D中提供的结果表明，将T细胞与SG-3-0020一起孵育增加了在CD4+和CD8+细胞上的PD-1表达(图6A)。此外，将T细胞与SG-3-0020一起孵育增加了IL-2和IFN-γ的分泌(图6B)。SG-3-0020在抗CD3抗体的存在下在纯化的T细胞系统中在5/5供体中展示了细胞因子刺活化性(图6C和图6D；图12A和图12B)。这些数据证明了SG-3-0020增强了人T细胞的活化。在有或没有共疗法的情况下，这种活化可以在体内增强针对肿瘤的免疫作用。

实施例3.SG-3-0020对体内免疫细胞调节的影响

进行体内研究，以研究SG-3-0020施用对例如免疫细胞活化和肿瘤大小的影响并在CT26荷瘤Balb/c小鼠中测试SG-3-0020的不同施用途径及其对免疫调节的影响。该小鼠模型是新免疫治疗药物的临床前测试的最广泛使用的小鼠模型之一(Grosso和Jure-Kunkel,2013,Cancer Immun,13:5)。

用SG-3-0020或PBS向小鼠静脉内注射(i.v.)、腹膜内地(i.p.)、肿瘤旁地(p.t.)给药。对于比较，用CD80-Fc或IgG1-Fc静脉内注射给药。在第7天，通过流式细胞术分析肿瘤样品的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组成/活化。在该实验中使用的方案示于图7A中。

图7B显示了SG-3-0020TIL免疫活化。例如，有NK细胞、CD8+CD25+细胞、CD8+Ki67+细胞和CD8+OX40+细胞的增加，所有均表示免疫细胞活化增加，这可能会对肿瘤生长和/或活力进行打击。

还进行了四聚体染色(AH1表位)(在图8中提供的方案)并且显示SG-3-0020施用也具有积极效果，支持该蛋白质用于癌症免疫疗法的治疗潜力(参见图10)。

使用CT26小鼠模型进行了类似实验，初步结果表明施用作为单一疗法的SG-3-0020导致肿瘤体积的减小(数据未显示)。

实施例4.SG-3-0020对小鼠T细胞的影响

将96孔培养板在200mcL中用抗CD3(0.1mcg/mL)预包被。将板在4℃下孵育过夜。在将细胞铺板之前将板用PBS洗涤三次(将Balb/c脾细胞通过EasySep^TM#19851进行T细胞分离)。将细胞以100-200K/孔在200mcL的AIM-V的最终体积中铺板。将肽(10mcM)或2mcg/mL抗CD28添加到细胞中。将细胞在37℃下孵育48小时。

将孵育的细胞用于流式细胞术分析。SG-3-0020增加了T细胞活化标记的表达和从小鼠脾脏分离的CD4和CD8 T细胞的增殖(图11A)。

将上清液用于MSD分析。SG-3-0020增加了通过从小鼠脾脏中分离的T细胞的效应细胞因子的分泌。(图11B)

实施例5.SG-3-0020对与抗CD3抗体一起孵育的细胞的影响

在有或没有0.1mcg/mL抗CD3的情况下，在孵育48小时之后确定在肽(10mcM)或抗CD28(10mcg/mL)的存在下在T细胞和PBMC上的活化标记表达。通过流式细胞术分析数据(图13A-图13D)。

确定在有或没有0.1mcg/mL抗CD3的情况下在孵育48小时之后在肽(10mcM)或抗CD28(10mcg/mL)的存在下在T细胞上的细胞因子分泌。通过MSD(图14)分析数据。

在肽(10mcM)的存在下用ImmunoCult^TM人CD3/CD28 T细胞活化剂活化人T细胞，并在孵育48小时之后通过MSD分析细胞因子分泌。SG-3-0020显示出与抗CD28活化组合的活性增加(图15)。SG-3-0020介导的作用需要在分离的T细胞和PBMC两者上的抗CD3的活化。

实施例6.SG-3-0020调节关键免疫基因的表达

将T细胞从5名单独的血液供体中分离并如先前所述活化。RNA表达水平通过NanoString nCounter Human PanCancer免疫分析来确定。原始数据使用内置阳性对照和管家基因进行归一化(nCounter表达数据分析指南，NanoString)。SG-3-0020在体外调节活化的人T细胞的关键免疫基因的表达(图16A和图16B)。观察到以下基因的表达降低：转录信号转导子和活化子1(STAT1)、干扰素调节因子1(IRF1)、分化簇96(CD96)、母体对抗生存因子同源物3(SMAD3)、C-X-C基序趋化因子受体6(CXCR6)、转录因子7(TCF7)、淋巴细胞抗原9(LY9)、C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)、颗粒酶K(GZMK)、干扰素刺激的外切核酸酶基因20(ISG20)、和信号传导淋巴细胞活化分子F7(SLAMF7)。对于双特异性磷酸酶6(DUSP6)、组织蛋白酶L(CTSL)、IL-9、IL-2、IL-10、IL-24、IL-21和IL-3，观察到表达的增加。

实施例7.SG-3-0020与人T细胞结合

测试了SG-3-0020噬菌体与靶细胞(幼稚T细胞、活化的T细胞)的结合。

噬菌体结合和生物素化肽结合

将生物素化肽储液(1mM)用1x PBS+2％BSA稀释至1uM(X 1,000倍)。将150mcL的噬菌体(多价显示)与70mcL的1x PBS+2％BSA混合。将溶液在室温下旋转1小时。

将细胞(幼稚T细胞(约13x10⁶个细胞)或活化的T细胞(约16x10⁶个细胞))解冻。然后将细胞在4℃下以1,500离心5分钟，并且吸出上清液。通过移液用5mL的1x PBS+2％BSA洗涤细胞沉淀物。重复此操作使得将沉淀物离心并洗涤总共3次。

将细胞沉淀物用1050mcL的1x PBS+2％BSA重悬，并且将100mcL噬菌体(来自antibodies-online Inc的M13噬菌体G8P衣壳抗体-FITC(目录号：ABIN 125966))添加到96-孔板的孔中(噬菌体结合)。将150mcL的稀释的生物素化肽添加到96孔板的孔中(生物素化肽结合)。将100mcL重悬浮的细胞添加到孔中进行噬菌体结合，并将50mcL重悬浮的细胞添加到孔中进行生物素化的肽结合。

将细胞放在振荡器上并在4℃下孵育2小时进行结合，并且然后在4℃下以1,500离心5min。丢弃上清液。通过移液用250mcL的1x PBS+2％BSA洗涤细胞沉淀物。将细胞用200mcL的1x PBS+2％BSA重悬进行噬菌体结合，并且然后分开进行洗脱和流式细胞术。将细胞用100mcL的1x PBS+2％BSA重悬进行生物素化肽结合，并在4℃下以1,500离心5min。

噬菌体的洗脱

将细胞用250mcL的1x PBS洗涤进行洗脱。将140mcL的7.18M三乙胺(TEA)添加到10mL H₂O中使成为0.1M TEA。用100mcL新鲜制备的0.1M TEA进行洗脱。这通过添加100mcL的1M TRIS pH 8.0立即中和。

噬菌体的滴度(输入和洗脱)

将噬菌体稀释10倍(阻断的输入和洗脱)(10mcL噬菌体溶液+90mcL的2xYT)。将溶液从10^-1至10^-10系列稀释10倍。添加100mcL冰冷的TG1细胞并在室温下孵育5min。10mcL从10^-5至10^-10中取出用于输入噬菌体并从10^-1至10^-6中取出用于洗脱噬菌体。将噬菌体在15cm2x YT+Carb+2％葡萄糖琼脂平板上划线，并在30℃下孵育过夜。

图17显示了编码WT SG-3-0020的多价显示噬菌体对未刺激的细胞和抗CD3刺激的细胞的结合的滴度结果。与空的噬菌体相比，滴度结果也显示出SG-3-0020、SEB和加扰的SG-3-0020与活化的T细胞的结合更多。

实施例9.SG-3-0020对肿瘤内T细胞的影响

BALB/c雄性小鼠(n＝5-6/组，8周龄)被皮下接种了CT26结肠癌细胞。以2.5mg/kg每天在PBS中肿瘤旁地施用SG-B。用对应体积的PBS注射对照小鼠。在第13天(AH1染色)或第7天(Ki67、CD25、OX40染色)，将切割的肿瘤用PBS洗涤，使用解剖刀分割成较小的片段，并使用Miltenyi肿瘤解离试剂盒和GentleMACS Octo解离因子进一步解离成单细胞悬浮液。通过预分离过滤器过滤消化的肿瘤，用PBS洗涤，并且然后用于基于流式细胞术的分析。将T淋巴细胞门控为CD4+或CD8+，并且然后通过由Mann-Whitney检验计算的FlowJo10.5.3.p值分析表面标记表达。

通过引用合并

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入。

然而，提及任何本文引用的参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请不被视为并不应被视为承认或任何形式的建议它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

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SEQUENCE LISTING

<110> 第二基因组有限公司（Second Genome, Inc.）

<120> 用于免疫疗法的源自微生物的肽和蛋白质

<130> 47192-0015WO1

<150> US 62/788,950

<151> 2019-01-06

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 1

Met Leu Ser Thr Lys Lys Thr Lys Thr His Asp His Tyr Pro Cys Gly

1 5 10 15

Arg Met Arg Asp Pro Gly Trp His Asp Trp Arg Ala Cys Leu Thr His

20 25 30

Gln Gly Ile Glu Glu Asp Glu Trp Pro Val

35 40

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 2

atgttgagta ccaagaagac caagacccac gaccactacc cgtgcggccg catgcgcgac 60

cccggctggc acgactggcg cgcctgtctc acccaccaag gcatcgagga ggatgaatgg 120

ccggtc 126

Claims (68)

1.一种用于调节哺乳动物免疫系统的调节和效应分子以治疗疾病的免疫治疗药物组合物，包含：

a)纯化的治疗性肽，所述纯化的治疗性肽包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

b)药学上可接受的载体。

2.一种药物组合物，包含：

a)治疗性肽，所述治疗性肽包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

b)药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中调节至少一种细胞因子的产生。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中调节至少一种细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、IL-23、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1和IL-23。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中增加Th1活化。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中增加树突细胞成熟。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中增加CD70表达。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中增加T_eff的克隆扩增。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物被配制用于口服施用。

19.根据权利要求1和3-18中任一项所述的药物组合物，其中所述肽可治疗的疾病是赘生物。

20.根据权利要求1和3-19中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病选自：基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌症、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌症、消化系统癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症以及它们中的两种或更多种的任何组合。

21.一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：

a)向所述受试者施用免疫治疗药物组合物，所述免疫治疗药物组合物包含：

i.纯化的治疗性肽，所述纯化的治疗性肽包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

ii.药学上可接受的载体。

22.一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括：

a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：

i.治疗性肽，所述治疗性肽包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

ii.药学上可接受的载体。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中调节至少一种细胞因子的产生。

29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中调节至少一种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、IL-23、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生。

31.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中诱导至少一种促炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1和IL-23。

32.根据权利要求21-31中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生。

33.根据权利要求21-32中任一项所述的方法，其中所述肽在施用过所述肽的受试者中抑制至少一种抗炎症细胞因子的产生，其中所述至少一种细胞因子选自IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β。

34.根据权利要求21-33中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中增加Th1活化。

35.根据权利要求21-34中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中增加树突细胞成熟。

36.根据权利要求21-35中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中增加CD70表达。

37.根据权利要求21-36中任一项所述的方法，其中所述肽在所述受试者中增加T_eff的克隆扩增。

38.根据权利要求21-37中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗药物组合物配被制用于口服施用。

39.根据权利要求21-38中任一项所述的方法，其中所述疾病是赘生物。

40.根据权利要求21-39中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。

41.根据权利要求21-40中任一项所述的方法，其中所述疾病是选自以下的至少一种：基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌症、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌症、消化系统癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或泌尿系统癌症。

42.一种分离的肽，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

43.一种组合物，包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的分离的肽。

44.一种包含外源多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

45.根据权利要求44所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。

46.根据权利要求44或45所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含与SEQ ID NO:1具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

47.根据权利要求44-46中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约97％序列同一性的氨基酸序列。

48.根据权利要求44-47中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约98％序列同一性的氨基酸序列。

49.根据权利要求44-48中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

50.根据权利要求44-49中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的蛋白质包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

51.根据权利要求44-50中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸还编码宿主细胞特异性信号序列。

52.根据权利要求44-51中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸还编码异源启动子。

53.根据权利要求52所述的宿主细胞，其中所述异源启动子是组成型启动子。

54.根据权利要求52所述的宿主细胞，其中所述异源启动子是诱导型启动子。

55.根据权利要求44-54中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。

56.根据权利要求44-56中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核生物细胞。

57.根据权利要求44-56中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：大肠杆菌细胞、乳乳杆菌细胞、天蓝色链霉菌细胞、青紫链霉菌细胞、白色链霉菌细胞、委内瑞拉链霉菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。

58.根据权利要求44-57中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核生物细胞。

59.根据权利要求44-58中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

60.根据权利要求44-58中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞、、黑曲霉菌细胞、或多形汉逊酵母细胞。

61.一种产生蛋白质的方法，所述方法包括：在足以表达所编码的蛋白质的条件下培养根据权利要求44-60中任一项所述的宿主细胞。

62.一种表达载体，所述表达载体包含：多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQ IDNO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

63.根据权利要求62所述的表达载体，其中所编码的蛋白质包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。

64.根据权利要求62或62所述的表达载体，其中所编码的蛋白质包含与SEQ ID NO:1具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

65.根据权利要求62-64中任一项所述的表达载体，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约97％序列同一性的氨基酸序列。

66.根据权利要求62-65中任一项所述的表达载体，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约98％序列同一性的氨基酸序列。

67.根据权利要求62-66中任一项所述的表达载体，其中所编码的蛋白质包含与SEQ IDNO:1具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

68.根据权利要求62-67中任一项所述的表达载体，其中所编码的蛋白质含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

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