KR20230107553A - 헤르페스바이러스 폴리에피토프 백신 - Google Patents

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더 카운실 오브 더 퀸즐랜드 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
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Abstract

본원은 엡스테인 바르 바이러스 감염 및 관련 병리의 예방 및 치료와 관련된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

헤르페스바이러스 폴리에피토프 백신
관련 출원
본 출원은 2020년 10월 7일 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 63/088,766의 이익을 주장하고, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
헤르페스바이러스는 다양한 동물 및 인간 질병과 관련된 진핵 바이러스의 크고 가까운 유비쿼터스 계열을 대표한다. 헤르페스바이러스과는 몇 가지 공통 구조, 예를 들어 이중 가닥, 선형 DNA 게놈 및 20면체 캡시드를 포함하는 비리온을 공유하며, 이는 그 자체가 바이러스 피막의 층 및 지질 이중층(바이러스 외피)으로 둘러싸여 있다. 또한, 헤르페스바이러스는 헤르페스바이러스 비리온의 지질 이중층 외피에서 운반되는 특징적이고 고도로 보존된 당단백질을 포함한다. 이러한 당단백질의 적어도 일부는 바이러스가 세포 표면에 처음 부착되고 이후 세포로 침투하는 역할을 한다.
엡스테인-바르 바이러스(EBV)는 전세계 성인의 >95%를 감염시키는 발암성 감마 인간 헤르페스바이러스이다. 이는 인간에서 가장 변형이 잘 되는 종양 바이러스 중 하나로 여겨지며, 시험관내 무한정 성장하는 림프모세포양 세포주(LCL)로 인간 B 세포를 쉽게 불멸화할 수 있는 유일한 바이러스이다. 1차 EBV 감염은 일반적으로 구인두 또는 상피 세포에서 휴면 중인 B 세포를 감염시켜 구강 분비물을 통해 유아기와 소아기 동안 획득된다(Moss, et al. (2001). "The immunology of Epstein-Barr virus 감염." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356(1408): 475-488). 1차 감염 후, EBV는 B 세포의 강력한 변형 능력을 통해 평생 잠복을 확립하고, 이는 무증상일 수 있다. 그러나, 지연된 1차 감염은 청소년 또는 젊은 성인의 50-70%에서 선열이라고도 알려진 급성 감염성 단핵구증(IM)으로 알려진 증상 질병으로 이어질 수 있다(Macsween, et al. (2003). "Epstein-Barr virus-recent advances." Lancet Infect Dis. 3(3): 131-140; Balfour et al. (2013). "Behavioral, virologic, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students." J Infect Dis. 207(1): 80-88). 대다수의 사례는 우수한 예후로 자가-제한적이지만, 일부 개체에서는 상당한 병적 상태를 유발할 수 있다. 예를 들어, EBV 감염은 잠복 바이러스의 재활성화 또는 재감염을 통해 면역약화되거나 면역억제된 개체에게 상당한 건강 위험을 전달한다. EBV는 고형 장기 또는 조혈 줄기 세포 이식 환자에서 림프증식성 질병의 두드러진 원인이다(Shannon-Lowe, et al. (2017). "Epstein-Barr virus-associated lyphomas." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372(1732)). 또한, EBV는 인간의 상피-, 림프구- 및 평활근-유래 종양과 관련이 있었다. 가장 두드러진 EBV 관련 암의 일부는 버킷 림프종(BL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 호지킨 림프종(HL), 구강모 백반증(OHL), 비인두 암종(NPC), 위 암종(GC), 형질모세포 림프종 및 원발성 삼출액 림프종을 포함한다. 매년 인간에서 모든 악성 종양의 약 200,000개의 새로운 사례가 전 세계적으로 EBV와 연결된다(Cohen, et al. (2011). "Epstein-Barr virus: an important vaccine target for cancer prevention." Sci Transl Med. 3(107): 107fs107). EBV는 또한 자가면역 장애, 예컨대 중추 신경계의 만성 신경 염증 병태인, 다발성 경화증(MS)(Nielsen, et al. (2007). "Multiple sclerosis after infectious mononucleosis." Arch Neurol. 64(1): 72-75; Ascherio, et al. (2012). "The initiation and prevention of multiple sclerosis." Nat Rev Neurol. 8(11): 602-612), 및 류마티스성 관절염과 강하게 관련된다. 드문 경우에, 만성 활동성 엡스테인-바르 바이러스 감염(CAEBV)이 감염의 합병증으로 발전할 수 있으며, 여기서 바이러스는 '활성'을 유지하고, EBV 감염의 증상은 절대 완전히 해결되지 않는다. 최근 연구는, EBV-관련 IM의 병력이 젊은 성인에서의 MS, HL 및 NPC의 증대된 위험을 부여하는 것으로 보고되었음을 보여주었다. EBV는 매년 전 세계적으로 약 143,000명의 암으로 인한 사망과 관련이 있으며, 전 세계적으로 약 250만 명의 MS 환자가 있다(Gru, et al. (2017). "Cutaneous EBV-related lymphoproliferative disorders." Semin Diagn Pathol. 34(1): 60-75). 실제로, 미국 국립보건원(National Institutes of Health)은 EBV를 암 예방에 대한 유의미한 표적으로 지정하였며, 따라서 EBV-관련 질병의 제한 및/또는 예방을 위해서 예방 및/또는 치료적 전략이 모두 요구된다.
현재의 항바이러스 약물이 EBV 대해 효과적인 것으로 간주되지 않는 바, EBV 감염에 대한 치료 옵션은, 특히 면역약화된 개체에서 한정적이다. 예를 들어, EBV-PTLD에 대한 고위험 환자의 선제적 및 1차 치료는 리툭시맙 사용에 의한 B 세포 고갈을 포함한다. 정제 혈장 면역글로불린(IGIV) 및 입양 전이 면역치료의 사용은 일부 성공을 보였으나, 이러한 제품은 인간 혈장으로부터 유래되기 때문에, 대량으로 제조하기 어렵고, 이들의 사용은 감염성 질병의 전파 위험을 수반한다.
수년 동안, EBV-관련 질병에 대한 백신 개발을 향한 상당한 노력에도 불구하고, EBV 감염 또는 EBV-관련 암 예방을 위해 승인 받은 백신이 없었다. EBV 백신을 개발하려는 최근의 시도는 성공적이지 못한 것으로 입증되었다. 이전의 예방적 백신 전략은 중화 항체 반응 또는 CD8+ T 세포 반응을 표적하도록 디자인되었다(Dasari, et al. (2017). "Designing an effective vaccine to prevent Epstein-Barr virus-associated diseases: challenges and opportunities." Expert Rev Vaccines. 16(4): 377-390). 불행하게도, 그러한 EBV 백신은 IM의 비율을 감소시킬 수 있었지만, 무증상 감염을 예방할 수는 없었다(Dasari, et al. (2019). "Prophylactic and therapeutic strategies for Epstein-Barr virus-associated diseases: emerging strategies for clinical development." Expert Rev Vaccines. 18(5): 457-474). 이러한 EBV 백신 전략은 350/220(gp350), B(gB), H(gH), L(gL), EBV gH/gL 복합체와 같은 EBV 외피 당단백질을 잠재적 표적으로서 평가하였다. 그러나, 보호적인 CD8 세포독성 T 세포 반응을 이끌어 내기 위해서는, 발현된 폴리펩티드가 적절하게 처리되고 T 세포에 제시되도록, 바이러스 항원이 외인성-전달 단백질 대신에, (예를 들어, 바이러스 벡터 전달 시스템 사용하여) 핵산 형태로 전달되어야 한다고 제안되었다(Koup and Douek. (2012) "Vaccine Design for CD8 T Lymphocyte Responses." Cold Spring Harb Perspect Med. 2011 Sep; 1(1): a007252.)
대부분의 백신 전달 플랫폼, 특히 약독화(live-attenuated) 백신 및 바이러스 벡터 기반 백신은 어린이, 면역저하 환자 및 임산부의 안전 문제에 대한 몇 가지 규제 우려를 제기하였다. 따라서, EBV 및 EBV-관련 암 및 질병의 치료를 위한 새롭고 개선된 방법 및 조성물에 대한 큰 필요성이 있다.
본원은 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식되고, 헤르페스바이러스 감염 및/또는 암(예를 들어, 본원에 제공된 EBV 항원을 발현하는 암)의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 T 세포 에피토프(예를 들어, EBV 에피토프)에 기초한 헤르페스바이러스-특이적 예방 및/또는 치료적 면역치료의 개발과 관련된 면역원성 폴리펩티드, 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 고려되는 면역원성 폴리펩티드는 헤르페스바이러스 항원으로부터의 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 각각의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 폴리에피토프 단백질은 상기 복수의 CTL 에피토프 중 적어도 2개 사이에 프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 이러한 폴리에피토프 단백질은 외인성 폴리펩티드로서 대상체에게 투여 시 CTL 반응을 이끌어 낼 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 표 1에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
특정 양태에서, 본원은 본원에 기재된 하나 이상의 EBV 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 EBV 에피토프)를 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물(예를 들어, 백신 조성물을 포함하는 예방 또는 치료 조성물)뿐만 아니라, 상기 조성물을 대상체에게 투여함으로써 EBV 감염 및/또는 관련 질병(예를 들어, EBV-관련 암 또는 자가면역 질환)을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전장 EBV 폴리펩티드가 아니다. 예를 들어, 폴리펩티드는 전장 EBV 폴리펩티드의 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개 이하의 연속 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 EBV 에피토프로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 길이가 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개 이하의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아쥬반트를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 헤르페스바이러스에 대한 면역원성 반응을 이끌어 내기 위한 예방 또는 치료 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 폴리펩티드, 예를 들어 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 20에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질(예를 들어, gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합; 및 바람직하게는 gp350)을 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 아쥬반트를 포함한다.
본 발명의 양태는, 본원에 개시된 바와 같이, i) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드; ii) 적어도 하나의 EBV 당단백질; 및 iii) 적어도 하나의 아쥬반트를 포함하는 다가 EBV 백신을 포함한다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 아데노바이러스 벡터이다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 EBV 펩티드, CTL, APC, 핵산 및/또는 항원-결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 약학 조성물을 투여함으로써 대상체에서 EBV 감염 및/또는 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본원은 단리된 면역원성 폴리펩티드, 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질, TLR 아고니스트를 포함하는 적어도 하나의 아쥬반트, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를, 대상체에게 투여하기에 적합한 제형으로 포함하는 헤르페스바이러스 감염(예를 들어, EBV 감염)에 대한 예방적 또는 치료적 치료를 생성하기 위한 방법을 제공하고; 여기서 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 본원은 대상체에서 헤르페스바이러스 감염(예를 들어, EBV 감염)을 예방 또는 치료적으로 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이는 i) 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드가 서열번호 1 내지 20에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 면역원성 폴리펩티드; ii) 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질; 및 iii) 아쥬반트를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 특정 양태에서, 본원은 헤르페스바이러스-특이적 CTL의 증식을 유도하는 방법을 제공하고, 이는 CTL을 포함하는 샘플을, 서열번호 1 내지 20 에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 치료 방법(예를 들어, 본원에 기재된 CTL, APC, 폴리펩티드, 조성물, 항체 또는 핵산의 투여)에 적합한 대상체를 식별하는 방법을 제공하고, 이는 대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 또는 종양 샘플)을 단리하는 단계, 및 샘플에서 본원에 기재된 EBV 에피토프 또는 본원에 기재된 EBV 에피토프를 인코딩하는 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, EBV 에피토프는 샘플을 본원에 제공된 항원 결합 분자와 접촉시킴으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 제공된 치료 방법에 따라 식별된 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 EBV 폴리에피토프 단백질 발현 및 단백질 정제의 SDS-PAGE 겔 분석을 보여준다. EBV폴리20PL-NH(EBV폴리)를 IPTG-유도성 플라스미드를 사용하여 발현하였고; 유도 4시간 후, 유도되지 않은 샘플과 유도된 샘플을 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 발현 수준을 결정하였다(A). EBV폴리 단백질 용해도를 세포 용해물의 상청액 및 펠릿 분획을 비교하여, SDS-PAGE 분석에 의해 평가하였다. EBV폴리 단백질을 봉입체(IB) 형태로 펠릿 분획에서 확인하였다(B). IB를 포함하는 세포 펠릿을 TE 완충액으로 3회 세척하였다. 상청액을 분석하여 단백질 손실을 모니터링하였다(C). 그 후, IB를 가용화시키고, 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼에 로딩하기 전에 가용화된 단백질의 pH를 pH 7.0으로 감소시켰다. 흐름 통과 및 컬럼 세척을 SDS-PAGE 분석에 의해 평가하였다(D). 단백질을 7.5 mM NaOH 및 8M 우레아를 함유하는 완충액으로 용리하였고, 마지막으로 컬럼을 크로마토그램에 나타낸 바와 같이 1M NaOH로 세척하였다(E). 정제된 단백질을 완충액에서 유지하기 위해, 용리된 단백질에 1M 트리스 pH 7.5를 첨가하여 트리스 완충액의 최종 농도가 25 mM이 되도록 하였다. 정제된 EBV폴리 단백질을 25 mM 글리신 pH 3.0 완충액에 대해 투석하고, 무스탕(Mustang) E 막으로 통과시켜 내독소 오염물을 제거한 후, SDS-PAGE에서 분석하였다(F 및 G).
도 2는 세포내 사이토카인 염색(ICS) 검정을 사용한, 시험관내 EBV폴리 단백질 면역원성의 평가를 보여준다. 6명의 상이한 HLA-매핑된 건강한 공여자로부터의 PBMC를 EBV폴리 단백질로 자극하고, ICS에 의한 사이토카인 프로파일 분석 전에 14일 동안 배양하였다.
도 3은 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 amphCpG7909 또는 CpG7909를 포함하는 EBV 백신 제형의 면역원성을 평가하기 위한 실험 디자인의 개략적 표현을 나타낸다. 4개의 백신 제형, 즉 1. amphCpG7909/EBV폴리/EBV gp350(AmpCpG7909V); 2. 가용성 CpG7909/EBV폴리/EBV gp350(CpG7909V); 3. amphCpG7909 단독(AmpCpG7909C); 및 4. 가용성 CpG7909 단독(CpG7909C)을 제조하였다. 인간 HLA 형질전환 마우스의 모든 코호트를 0일차에 50 μL(총 100 μL)로 꼬리 밑 부분의 각 측부에 피하로 면역화하였고, 분석을 위해 각각의 부스터 접종 전에 혈액 샘플을 채취하고, 21일차 및 42일차에 추가 부스터 주사를 투여하였다. 49일차에 마우스를 희생시키고, 분석을 위해 혈액, 림프절 및 비장을 수확하였다.
도 4는 비장 세포에서 생체외 및 기억 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 비장 세포 현탁액을 수확(49일차) 비장으로부터 제조하고, HLA B35(HPV 및 LPE), HLA A2(CLG 및 GLC), HLA A24(TYG 및 PYL) 및 HLA B8(FLR 및 RAK) 제한 펩티드로 골지 플러그(golgi plug) 및 골지 스톱(golgi stop)의 존재 하에 개별적으로 자극하였다. 기억 반응을 결정하기 위해, 비장 세포의 세포 현탁액을 위에 언급된 바와 같이 EBV폴리 펩티드로 시험관내 자극하였다. 세포를 IL2의 존재 하에 10일 동안 배양하였다. T 세포 특이성을 ICS 검정을 사용하여 평가하였다. 막대 그래프는 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서, amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신 또는 대조군(아쥬반트 단독)에 대한 CD8+ T 세포 반응의 IFNγ+의 백분율로 정량화된 생체외(A) 및 기억(B) 평균 T 세포 반응을 나타낸다. 파이 차트는 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서, IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 생체외(상단 패널) 및 기억(하단 패널) EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 총 백분율을 나타낸다(C 및 D). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05; **,P < 0.01; ns= 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트(student t test)에 의해 결정됨).
도 5는 비장 세포에서 생체외 및 기억 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 생체외 gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 평가하기 위해, 골지 플러그 및 골지 스톱의 존재 하에 펩믹스(PepMix)TM로 비장 세포 현탁액을 자극하였다. EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포 반응을 결정하기 위해, 49일차에 비장 세포를 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여, gp350-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 10일 동안 확장시켰다. 세포를 IL2의 존재 하에 10일 동안 배양한 후, 펩믹스TM로 자극하여 IFN-γ 단독 또는 IFN-γ, TNF 및 IL2를 생산하는 이들의 능력을 평가하였다. 생체외(상단 패널) 및 기억(하단 패널) 평균 T 세포 반응을 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서, amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신 및 대조군(아쥬반트 단독)에 대한 CD4+ T 세포 반응의 IFNγ+의 백분율로 정량화하였다(A 및 B). 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 생체외(상단 패널) 및 기억(하단 패널) EBVgp350-특이적 CD4+ T 세포의 총 백분율을 나타낸다(C 및 D). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05; **,P < 0.01; ***,P < 0.001; ns= 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 6은 시험관내 자극 후 EBV gp350-특이적 CD8+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 49일차에 비장 세포를 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여, gp350-특이적 CD8+ T 세포를 10일 동안 확장시킨 후, 골지 플러그 및 골지 스톱의 존재 하에 펩믹스TM EBV로 자극하였다. 평균 T-세포 반응을 대조군(아쥬반트 단독), 또는 amphCpG7909 또는 CpG7909 EBV 백신 제형으로 면역화된 인간 HLA B35 및 A24 형질전환 마우스에서 CD8+ T 세포 반응을 생산하는 IFN-γ의 백분율로 정량화하였다. 막대 그래프는 면역화된 HLA B35 및 A24 마우스에서 평균 CD8+ T 세포 반응(즉, IFN-γ 생산)을 보여준다(A 및 B). 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD8+ T 세포를 보여준다(C 및 D). 오차 막대는 평균 **, P < 0.01; ns= 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 7은 서혜부 림프절에서 EBV-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 보여준다. 단일 세포 현탁액을 인간 HLA B35 및 A2 형질전환 마우스로부터 수득된 48일차 서혜부 림프절로부터 제조하였고, 세포를, HLA B35(HPV 및 LPE) 또는 HLA A2(GLC 및 CLG) 제한 에피토프로 자극시킨 후, IFN-γ 또는 IFN-γ, TNF 및 IL2를 생산하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. amphCpG7909-EBV 백신 또는 가용성 CpG7909-EBV 백신 또는 대조군(아쥬반트 단독)으로 면역화된 마우스 HLA B35 및 A2로부터의 자극된 CD8+ T 세포의 평균 T-세포 반응은 막대 그래프에 도시된다(A 및 B). 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다(C 및 D). 유사하게는, gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 펩믹스TM EBV로 자극된 서혜부 림프절 세포에서 평가하였다. 막대 그래프는 HLA B35 및 A2 마우스에서 각각의 제형에 대한 평균 T 세포 반응(IFN-γ+-생산 CD4+ T 세포 반응의 백분율)을 보여준다(E 및 F). 대표적인 파이 차트는 HLA B35 및 A2 마우스에서 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포의 총 백분율을 보여준다(G 및 H). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05; **,P < 0.01; ns= 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 8은 액와 림프절에서 EBV-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 보여준다. 제조된 단일 세포 현탁액을 인간 HLA B35 및 A2 형질전환 마우스로부터 수득된 49일차 액와 림프절로부터 제조하였고, 세포를 HLA(HPV 및 LPE) 또는 HLA A2(GLC 및 CLG) 제한 에피토프로 자극시킨 후, IFN-γ 또는 IFN-γ, TNF 및 IL2를 생산하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. amphCpG7909-EBV 백신 또는 가용성 CpG7909-EBV 백신 또는 대조군(아쥬반트 단독)으로 면역화된 마우스 HLA B35 및 A2로부터의 자극된 CD8+ T 세포의 평균 T-세포 반응은 막대 그래프에 도시된다(A 및 B). 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다(C 및 D). 마찬가지로, gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 펩믹스TM EBV로 자극된 액와 림프절 세포에서 평가하였다. 막대 그래프는 HLA B35 및 A2 마우스에서 각각의 제형에 대한 평균 T 세포 반응(IFN-γ+-생산 CD4+ T 세포 반응의 백분율)을 보여준다(E 및 F). 대표적인 파이 차트는 HLA B35 및 A2 마우스에서 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포의 총 백분율을 보여준다(G). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05; **,P < 0.01; ns= 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 9는 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서, amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 항체 분비 혈장 및 기억 B 세포 반응의 평가를 보여준다. 49일차 비장 세포를 ELISpot 검정을 사용하여, 생체외 EBVgp350-특이적 항체를 분비하는 이들의 능력(항체 분비 B 세포/ 3 X 105 비장 세포의 빈도)에 대해 평가하였다(A). 또한, R848(레시퀴모드(resiquimod)) 및 마우스 재조합 IL2로 자극된 비장 세포(2.5 X 104)에서 기억 B 세포 반응을 분석하여, gp350-특이적 항체를 분비하는 이들의 능력을 결정하였다(B). 오차 막대는 평균 ± SEM *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001, ****, P < 0.0001 ns = 유의미하지 않음(스튜던트t 테스트에 의해 결정됨)을 나타낸다.
도 10은 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 항체 반응의 평가를 보여준다. 선 그래프는 21, 28, 42 및 49일차에 amphCpG7909-EBV 백신 제형, 가용성 CpG7909-EBV 백신 제형 또는 아쥬반트-단독 대조군으로 면역화된 형질전환 마우스의 혈청 샘플에서 EBV gp350-특이적 항체 역가를 보여준다.
도 11은 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 항체 동형의 평가를 보여준다. 막대 그래프는 amphCpG7909-EBV 백신 제형, 가용성 CpG7909-EBV 백신 제형으로 면역화된 형질전환 마우스로부터의 혈청 샘플에서 EBV gp350-특이적 항체 동형, IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 역가를 보여준다.
도 12는 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 중화 항체 반응을 보여준다. 간략하게는, B 세포 증식 검정을 사용하여 항-EBV-중화 항체 반응을 평가하기 위해 모은 혈청 샘플(21, 28, 42 및 49일차)에 대해 분석을 수행하였다. 막대 그래프는 amphCpG7909-EBV 백신 제형, 가용성 CpG7909-EBV 백신 제형, 또는 대조군(아쥬반트-단독)으로 백신 접종된 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 50% EBV-특이적 중화 항체 역가를 나타낸다.
도 13은 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 CpG1018을 포함하는 EBV 백신 제형의 면역원성을 평가하기 위한 실험 디자인의 개략적 표현을 제시한다. 2개의 백신 제형, 즉, 1. CpG1018/EBV폴리/EBV gp350(EBV 백신); 및 2. CpG1018 단독(위약)을 제조하였다. 인간 HLA B35 형질전환 마우스를 0일차에 100 μL로 꼬리 밑 부분에서 피하로 면역화하였고, 분석을 위해 각각의 부스터 접종 전에 혈액 샘플을 채취하고, 21일차 및 42일차에 추가 부스터 주사를 투여하였다. 49일차에 마우스를 희생시키고, 분석을 위해 혈액 및 비장을 수확하였다.
도 14는 비장 세포에서 생체외 및 기억 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 비장 세포 현탁액을 수확(49일차) 비장으로부터 제조하고, HLA B35(HPV 및 LPE) 펩티드로 골지 플러그 및 골지 스톱의 존재 하에 자극하였다. 기억 반응을 결정하기 위해, 비장 세포의 세포 현탁액을 HPV 및 LPE 펩티드로 시험관내 자극하였다. 세포를 IL2의 존재 하에 10일 동안 배양하였다. T 세포 특이성을 ICS 검정을 사용하여 평가하였다. 막대 그래프는 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서, CpG1018로 제형화된 EBV 백신 또는 CpG1018 단독(위약)에 대한 CD8+ T 세포 반응의 IFNγ+의 백분율로 정량화된 생체외(상단 패널) 및 기억(하단 패널) 평균 T 세포 반응을 나타낸다(A 및 C). 대표적인 FACS 플롯 및 파이 차트는 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서, IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 생체외 및 기억 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 총 백분율을 나타낸다(B 및 D). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05; **,P < 0.01을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 15는 비장 세포에서 생체외 및 기억 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 생체외 gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 평가하기 위해, 비장 세포 현탁액을 골지 플러그 및 골지 스톱의 존재 하에서 펩믹스TM로 자극하였다. EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포 반응을 결정하기 위해 49일차에 비장 세포를 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여, gp350-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 10일 동안 확장시켰다. 세포를 IL2의 존재 하에 10일 동안 배양한 후, 펩믹스TM로 자극하여, IFN-γ 단독 또는 IFN-γ, TNF 및 IL2를 생산하는 이들의 능력을 평가하였다. 생체외(상단 패널) 및 기억(기억) 평균 T 세포 반응을 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 CpG1018로 제형화된 EBV 백신 또는 CpG1018 단독(위약)에 대한 CD4+ T 세포 반응의 IFN-γ+의 백분율로서 정량화하였다(A 및 C). FACS 플롯 및 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 생체외(상단 패널) 및 기억(하단 패널EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포의 총 백분율을 나타낸다(B 및 D). 오차 막대는 평균 ± SEM *,P < 0.05를 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 16은 시험관내 자극 후 EBV gp350-특이적 CD8+ T 세포 반응의 평가를 보여준다. 49일차 비장 세포를 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여, gp350-특이적 CD8+ T 세포를 10일 동안 확장시킨 후, 골지 플러그 및 골지 스톱의 존재 하에 펩믹스TM EBV로 자극하였다. 평균 T-세포 반응을 CpG1018을 이용한 EBV 백신 또는 CpG1018(위약) 제형으로 면역화된 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 IFN-γ 생산 CD8+ T 세포 반응의 백분율로 정량화하였다. 막대 그래프는 면역화된 HLA B35 마우스에서 평균 CD8+ T 세포 반응(즉, IFN-γ 생산)을 보여준다(A). FACS 플롯 및 파이 차트는 IFN-γ, TNF 및/또는 IL2의 임의의 조합을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD8+ T 세포를 나타낸다(B). 오차 막대는 평균 *, P < 0.05를 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 17은 CpG1018로 제형화된 EBV 백신 또는 CpG1018 단독(위약)에 의해 유도된 배 중심(Germinal Center)(GC) B, TFH 및 EBV gp350-특이적 항체 분비 B 세포 반응의 특성화를 보여준다. GC B 세포 반응을 평가하기 위해, 비장 세포를 PE 접합된 항-B220, FITC 접합된 항-GL7 및 APC 접합된 항-CD95로 염색하였다(A). TFH 세포를 평가하기 위해, 비장 세포를 PerCP 접합된 항-CD8, BV786 접합된 항-CD4, CxCR5 및 PD-1 표면 마커로 염색하였다(B). gp350-특이적 항체 분비 B 세포를 평가하기 위해, 49일차 비장 세포를, ELISpot 검정을 사용하여, 생체외 EBVgp350-특이적 항체를 분비하는 이들의 능력(항체 분비 B 세포/3 X 105 비장 세포의 빈도)에 대해 평가하였다(C). 또한, R848(레시퀴모드) 및 마우스 재조합 IL2로 자극된 비장 세포(5 X 105)의 기억 B 세포 반응을 분석하여, gp350-특이적 항체를 분비하는 이들의 능력을 결정하였다(D). 오차 막대는 평균 ± SEM *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001, ****, P < 0.0001 ns = 유의미하지 않음을 나타낸다(스튜던트 t 테스트에 의해 결정됨).
도 18은 CpG1018로 제형화된 EBV 백신 또는 CpG1018 단독에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 항체 동형의 평가를 보여준다. 선 그래프는 21, 28, 42 및 49일차에 CpG1018(V) 또는 CpG1018 아쥬반트-단독(C)으로 면역화된 HLA B35 형질전환 마우스로부터의 혈청 샘플에서 EBV gp350-특이적 항체 동형, IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 역가를 보여준다.
도 19는 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 CpG1018로 제형화된 EBV 백신에 의해 유도된 EBV gp350-특이적 중화 항체 반응을 보여준다. 간략하게는, B 세포 증식 검정을 사용하여, 항-EBV-중화 항체 반응을 평가하기 위해 모은 혈청 샘플(21, 28, 42 및 49일차)에 대해 분석을 수행하였다. 막대 그래프는 CpG1018을 이용한 EBV 백신 제형 또는 대조군(아쥬반트-단독)으로 백신 접종된 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 50% EBV-특이적 중화 항체 역가를 나타낸다(A). 대표적인 FACS 플롯은 감염되지 않은 PBMC, EBV 바이러스로 감염된 PBMC, CpG1018-EBV 백신 제형으로 백신 접종된 마우스로부터의 연속 희석 혈청으로 처리된 바이러스(1:2 및 1:512) 또는 대조군(아쥬반트-단독)(1:2)에서 증식하는 B 세포의 백분율을 보여준다(B).
개요
EBV 백신 개발에 적용되는 주요 전략은 1차 감염 및 잠복기를 예방하여 EBV-관련 악성 종양의 발병을 예방하는 것이었다. 이러한 초기 백신 연구 중 일부는, 기존 항체가 많은 바이러스 병원체에 대한 1차 방어선을 제공하기 때문에, 중화 항체 표적으로서, 주요 바이러스 당단백질 gp350을 표적화하였다. gp350을 표적화하는 복수의 강력한 중화 항체는 감염된 인간 혈액에 존재하며, 신생아 감염을 예방할 수 있고, 이는 EBV 백신 개발에서 gp350을 매력적인 후보로 만든다. 그러나, 젊은 성인의 1상/2상 임상 시험에서 AS04로 제형화된 가용성 재조합 gp350을 사용한 백신 접종은, IM 증상의 발생률이 감소되었으나, EBV 감염(예를 들어, 무증상 감염)을 예방하지 못했다(Sokal, et al. (2007). "Recombinant gp350 vaccine for infectious mononucleosis: a phase 2, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate the safety, immunogenicity, and efficacy of an Epstein-Barr virus vaccine in healthy young adults." J Infect Dis. 196(12): 1749-1753; Dasari, et al. (2019). "Prophylactic and therapeutic strategies for Epstein-Barr virus-associated diseases: emerging strategies for clinical development." Expert Rev Vaccines. 18(5): 457-474). 신장 이식을 기다리는 아동들에서 테스트된 다른 백신 제형은 PTLD로부터 대상체를 보호하는 데 실패하였다((Rees, et al. (2009). "A phase I trial of Epstein-Barr virus gp350 vaccine for children with chronic kidney disease awaiting transplantation." Transplantation. 88(8): 1025-1029). 또 다른 백신 연구에서는, EBV 잠복 단백질(EBNA-3A)의 HLA B0801 CD8+ T 세포 에피토프를 사용하여, 백신이 감염을 예방할 수 없음을 보여주었다(Burrows, et al.(1990). "An Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T-cell epitope present on A- and B-type transformants." J Virol. 64(8): 3974-3976; Elliott, et al. (2008). "Phase I trial of a CD8+ T-cell peptide epitope-based vaccine for infectious mononucleosis." J Virol. 82(3): 1448-1457). 따라서, 이러한 관찰은 EBV 백신 효능을 개선하기 위해 생성되어야 하는 면역 반응의 종류에 대해 의문을 제기한다. 전임상 시험관내 및 생체내 모델 및 임상 관찰은 감염에 대한 면역 조절을 발휘하는 주요 면역 구획으로서 세포독성 림프구를 제안한다. 체액성 및 세포성(예를 들어, 세포독성 림프구) 반응 둘 모두를 유도하도록 디자인된 백신 제형은 체액성 또는 세포-매개 반응을 단독으로 유도하도록 디자인된 백신보다 더 나은 보호를 제공해야 한다. 백신 항원(들)을 선택하고 최적의 면역 반응을 유도할 때, EBV의 수명 주기 및 다양한 관련 질병에서의 유전자 발현 프로파일이 고려되어야 한다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 최적화된 바이러스-특이적 면역 반응의 광범위한 레퍼토리를 유도할 수 있는 백신은 바이러스-관련 병인에 대해 보다 효과적인 보호를 제공할 가능성이 있다. 본원은 gp350 세포외 도메인을 포함하는 EBV gp350 및 이의 단편을 개시한다. 상기 EBV 당단백질 및 이의 단편은 중화 항체, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응에 대한 표적으로서 작용할 수 있다. 또한, 본원은 적어도 하나의 EBV T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 개시한다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 EBV의 고도로 보존된 면역 우세 항원(EBNA1, LMP2a, EBNA 3A, EBNA3B, EBNA3C, BMLF1, BZLF1, BRLF1)으로부터 다중 HLA 클래스 I 제한된 CD8+ T-세포 에피토프(예를 들어, EBV폴리)를 암호화하도록 디자인된다. 더욱이, EBV-특이적 항원의 광범위한 레퍼토리에 대해 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 모두 유도할 수 있는 백신은 더 효과적인 보호를 제공할 가능성이 있다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에서, EBV-특이적 체액성 및 세포-매개 반응을 유도하기 위해, 본원은 EBV gp350 펩티드(또는 이의 단편) 및 EBV-에피토프 폴리에피토프 폴리펩티드(예를 들어, EBV폴리)를 모두 포함하는 신규한 다가 백신을 처음으로 기재한다. 본원에 개시된 바와 같이 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식되는 T 세포 에피토프(예를 들어, EBV 에피토프)에 기초한 헤르페스바이러스-특이적 예방 및/또는 치료적 면역치료의 개발과 관련된 이러한 폴리펩티드, 조성물 및 방법이 EBV 감염, 암(예를 들어, 본원에 제공된 EBV를 발현하는 암) 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본원은, 본원에 기재된 하나 이상의 EBV 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 EBV 에피토프)를 포함하는 면역원성 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 이러한 펩티드를 인식하는 CTL, 상기 펩티드를 제시하는 APC 및/또는 상기 펩티드에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자를 함유하는 조성물(예를 들어, 백신 조성물과 같은 치료 조성물)뿐만 아니라 상기 조성물을 대상체에게 투여함으로써 EBV 감염, 암 및/또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 또한, 본원에 제공된 방법에 따라 치료에 적합한 대상체를 식별하는 방법을 제공한다.
정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모았다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는 것"은 약학 작용제 또는 조성물을 대상체에게 제공하는 것을 의미하며, 비제한적으로 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함한다. 이러한 작용제는 예를 들어 본원에 기재된 펩티드, 본원에 제공된 항원-제시 세포 및/또는 본원에 제공된 CTL을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "수용자(recipient)"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에서 질병을 "치료하는 것" 또는 질병을 갖는 대상체를 "치료하는 것"은 질병의 적어도 하나의 증상이 감소되거나 악화되는 것을 방지하도록, 대상체가 약학적 치료, 예를 들어 약물의 투여를 받게 하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 병태를 "예방"하는 치료제는 장애 또는 병태의 발병 전에 통계적 샘플에 투여될 때, 치료되지 않은 대조군 샘플에 비해 치료된 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 감소시키거나, 치료되지 않은 대조군 샘플에 비해 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병을 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "약학적으로 허용가능한"은, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제나 합병증 없이 합당한 이익/위험 비율에 상응하여, 견실한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 작용제, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 하나의 장기 또는 신체의 일부로부터 또 다른 장기 또는 신체의 일부로 작용제를 운반하거나 전달하는 것과 관련된 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 재형의 다른 성분과 호환가능하며 환자에게 해롭지 않다는 의미로 "허용가능"해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 (1) 당류, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유(safflower oil), 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 약학적 제형에 사용되는 기타 무독성 호환 물질을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지 구성요소와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본원에 제공된 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드와 상호교환가능하다.
용어 "벡터"는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 구성요소 사이에서 전파 및/또는 전달될 수 있는 수단을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포손 및 인공 염색체 등을 포함하며, 이들은 숙주 세포의 염색체로 통합할 수 있거나 그럴 수 없거나, 자율적으로 복제할 수 있거나 그럴 수 없다.
펩티드
본원은 세포독성 T 림프구(CTL)에 의해 인식되고, 헤르페스바이러스 감염(예를 들어, EBV 감염), 암(예를 들어, 본원에 제공된 EBV 에피토프를 발현하는 암) 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 헤르페스바이러스 에피토프를 포함하는 펩티드를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 헤르페스바이러스 항원(예를 들어, 및 EBV 항원)으로부터의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 면역원성 폴리펩티드는 헤르페스바이러스 항원으로부터의 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프 각각의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 면역원성 폴리펩티드는 EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2, LMP2a, BMLF1, BZLF1, 또는 BRLF1과 같은 고도로 보존된 면역 우세 항원으로부터의 HLA 클래스 I 제한된 CD8+ T-세포 에피토프를 포함한다. 에피토프는 HLA A*03, HLA A11, HLA A*0201, HLA A*1101, HLA A*2301, HLA A*3002, HLA B27, HLA B35.08/B35.01, HLA B*44:0, HLA B57*03, HLA B*0702, HLA B*0801, HLA B*1501, HLA B*3501, HLA B*3508, HLA B*4001, HLA B*4402, HLA B*4402, HLA B*4403, HLA B*4405, HLA B*5301, HLA B*5701, 또는 HLA B*5801로부터 선택되는 HLA 클래스 I 특이성 중 어느 하나에 의해 제한될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 에피토프는 표 1에 열거된 EBV 에피토프이다.
표 1: 예시적인 EBV 에피토프
Figure pct00001
밑줄 처리된 아미노산은 프로테아좀 유리 서열을 나타내고, 이는 EBV 에피토프의 일부로서 선택적으로 제시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 면역원성 펩티드는 전장 EBV 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 EBV 바이러스 폴리펩티드의 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15 또는 10개 미만의 연속 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 확인된 프로테아좀 유리 서열을 선택적으로 보유하거나 보유하지 않는, 표 1에 열거된 EBV 에피토프 중 2개 이상을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 표 1에 열거된 EBV 에피토프 중 2개 이상을 포함한다. 비제한적 예로서, 상기 폴리에피토프 펩티드 서열은, 각각의 에피토프가 프로테아좀 유리 아미노산 서열(예를 들어, 알라닌 및 아스파르트산( AD) 또는 라이신(K) 또는 아르기닌(R))을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 링커에 의해 연결되는, 그러한 방식으로 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 표 1에 열거된 에피토프를 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 또는 이들 모두를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 폴리에피토프 폴리펩티드, 폴리에피토프 폴리펩티드를 생성하는 방법 및 폴리에피토프 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 예는 문헌 [Dasari et al., Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2016) 3, 16058]에서 확인할 수 있고, 이는 전문이 참조로 포함된다.
특정 양태에서, 본원은 펩티드-특이적 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 HLA 클래스 I 및 클래스 II-제한된 EBV 펩티드 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프)를 포함하는 면역원성 펩티드의 풀을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드의 풀은 표 1에 열거된 에피토프를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 또는 이들 모두(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 표 1에 열거된 에피토프), 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 풀은 표 1에 제시된 적어도 하나의 EBV 에피토프, 즉 서열번호 1-20에 제시된 EBV 에피토프 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 면역원성 펩티드의 풀은 서열번호 1-20에 제시된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 에피토프를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 또는 20개 전부를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 펩티드 풀은 서열번호 1-20에 제시된 EBV 펩티드 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함한다. 면역원성 펩티드 및 이의 풀은 펩티드-특이적 T 세포(예를 들어, 펩티드-특이적 세포독성 T-세포 및/또는 CD4+ T 세포)의 증식을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드의 서열은 1개 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보존적 서열 변형을 제외한 EBV 바이러스 폴리펩티드 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 T-세포 수용체(TCR), 및 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 상에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 사이의 상호작용에 유의미하게 영향을 미치지 않거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 의도된다. 상기 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가(예를 들어, 펩티드의 N 또는 C 말단에 대한 아미노산의 부가) 및 결실(예를 들어, 펩티드의 N 또는 C 말단으로부터의 아미노산의 결실)을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 펩티드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 TCR 결합의 유지에 대해 테스트될 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같이, 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 변형이 항체에 도입될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 핵산 서열 또는 제1 및 제2 아미노산 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-동일 서열은 무시될 수 있음). 이어서, 해당하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며, 이는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있다.
또한, 본원은 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 자연에서 연결되지 않은 별개의 펩티드에 연결된 본원에 제공된 펩티드(들)(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프를 포함하는 것)를 포함한다. 예를 들어, 별개의 펩티드는 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 다른 EBV 에피토프를 포함하는 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 다른 바이러스 및/또는 감염성 질병으로부터의 에피토프를 포함하는 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드는 암-관련 에피토프를 인코딩하는 펩티드에 연결된다.
본원에 제공된 키메라 또는 융합 펩티드는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은, 예를 들어 결찰을 위한 블런트(blunt)-단부 또는 스태거-단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절하게 부착 말단의 파일링-인(filling-in)하는 것, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리 및 효소적 결찰을 사용함으로써, 통상적인 기술에 따라 프레임-내에서(in-frame) 함께 결찰될 수 있다. 유사하게는, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 생성하기 위해 후속적으로 어닐링되고 재-증폭될 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992 참조). 또한, 이미 융합 모이어티를 인코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용 가능하다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 펩티드(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프를 포함하는 펩티드)를 제시하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유류 세포이다. 세포는 항원-제시 세포(APC)(예를 들어, 항원 제시 T-세포, 수지상 세포, B 세포, 대식세포 또는 항원 제시 세포, 예컨대 aK562 세포)일 수 있다. 본원에 기재된 펩티드를 제시하는 세포는 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 흡수를 조장하기 위해 세포에 펄스를 가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 제공된 펩티드를 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 펩티드로 세포에 펄스를 가하는 것을 포함하는, 항원-제시 세포(APC)를 제조하는 방법을 제공한다. 항원 제시 세포를 제조하기 위한 예시적인 방법은 WO2013088114에서 확인할 수 있으며, 이의 전문이 본원에 포함된다.
본원에 기재된 펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 체계에 의해 세포 또는 조직 원천으로부터 단리될 수 있고/있거나, 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있고/있거나, 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드는 본 발명의 펩티드(들)을 인코딩하는 뉴클레오티드의 발현에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주에서 이종 펩티드의 발현, 펩티드의 화학적 합성 및 시험관내 번역에 대한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.]; [Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.]; [Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501]; [Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187;] [Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957]; 및 [Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing]에 추가로 기재되어 있고, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
핵산 분자
본원은 본원에 기재된 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 비제한적으로, 본원은 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 서열번호 22-41에 제시된 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열번호 22-41에 제시된 핵산 서열의 각각을 포함한다. 그러한 일부 실시양태에서, 핵산은 서열번호 42에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 개시된 핵산을 대상체에게 투여함으로써 암(예를 들어, EBV-관련 암), EBV 감염 및/또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 핵산은, 예를 들어 전체 세포, 세포 용해물에 존재하거나, 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 분자를 함유하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 기반 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 하나의 종류는 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적인 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터, 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정 벡터는 유전자 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본원은 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 제공된 핵산을 전사하고, 이에 따라 본원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 펩티드를 발현한다. 핵산 분자는 세포의 게놈에 통합될 수 있거나, 염색체외(extrachromosomal)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 백신의 일부이다. 일부 실시양태에서, 백신은, 비제한적으로 박테리아 벡터 및/또는 바이러스 벡터를 포함하여, 벡터에서 대상체에게 전달된다. 박테리아 벡터의 예는, 비제한적으로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(BCG), 살모넬라 타이피무리움 변종(Salmonella Typhimurium ssp.), 살모넬라 타이피 변종(Salmonella Typhi ssp.), 클로스트리디움 종(Clostridium sp.) 스포어(spore), 에스체리치아 콜리 니슬 1917(Escherichia coli Nissle 1917), 에스체리이차 콜리 K-12/LLO, 리스테리아 모노시토젠(Listeria monocytogene) 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)를 포함한다. 바이러스 벡터의 예는, 비제한적으로 백시니아, 아데노바이러스, RNA 바이러스(레플리콘) 및 복제-결함 유사 아비폭스(avipox), 포울폭스(fowlpox), 카나리폭스(canarypox), MVA 및 아데노바이러스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 함유하는 세포를 제공한다. 세포는, 예를 들어 원핵생물, 진핵생물, 포유류, 조류, 뮤린 및/또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시양태에서 세포는 APC(예를 들어, 항원 제시 T 세포, 수지상 세포, B 세포 또는 aK562 세포)이다. 본 방법에서, 본원에 기재된 핵산은, 예를 들어 전달 시약과 함께 전달 비히클 없이 핵산으로서 세포에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 당업계에 알려진 임의의 핵산 전달 방법이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 적합한 전달 시약은, 비제한적으로, 예를 들어 미러스 트랜짓(Mirus Transit) TKO 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 폴리양이온(예를 들어, 폴리라이신), 아테로콜라겐, 나노플렉스 및 리포솜을 포함한다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 리포솜은 핵산을 세포 또는 대상체에 전달하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 리포솜은 일반적으로 중성 또는 음전하를 띄는 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함하는, 표준 소포-형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 원하는 리포솜 크기 및 혈류에서 리포솜의 반감기와 같은 요인의 고려에 의해 좌우된다. 예를 들어, 문헌 [Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467] 및 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 및 5,019,369에 기재된 바와 같이, 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 알려져 있으며, 이들의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
항체
일부 양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 EBV-감염 또는 EBV-항원 제시 세포 또는 암 세포의 혈장 막에서 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 단백질). 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에서의 아미노산 서열을 갖는 에피토프를 포함하는 EBV 단백질과 같이, 본원에 제공된 펩티드 중 하나의 특정 에피토프에 결합하며, 예를 들어, EBV 단백질은 전장 EBV 단백질이 아니다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 세포외 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 표 1에 열거된 에피토프이다. 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있고, 예를 들어 뮤린, 키메라, 인간화 또는 완전 인간일 수 있다. 항체는 전장 면역글로불린 분자, scFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv, 카멜리드 항체 또는 디설파이드 연결된 Fv일 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 항체는 중화 항체이다.
다클론성 항체는 펩티드 면역원(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 아미노산 서열)으로 적합한 대상체(예를 들어, 마우스)을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 면역원은 본원에 제공된 표적 단백질의 세포외 에피토프를 포함한다. 면역화된 대상체에서 펩티드 항체 역가는 고정된 펩티드를 사용하는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 원하는 경우, 항원에 대해 지시된 항체는 포유동물로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리될 수 있고, IgG 분획을 수득하기 위해 단백질 A 크로마토그래피와 같은, 잘 알려진 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
면역화 후 적절한 시점에, 예를 들어 항체 역가가 가장 높을 때, 항체-생산 세포가 대상체로부터 수득될 수 있고, 표준 기술, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에 의해 본래 기재된 하이브리도마 기술(또한 Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; 및 Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75 참조), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today. 4:72), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 또는 트리오마 기술을 사용하여 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 단클론성 항체 하이브리도마를 제조하기 위한 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses. Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36 참조). 간략하게는, 불멸 세포주(전형적으로 골수종)는 상기한 바와 같이 면역원으로 면역화된 포유동물로부터의 림프구(전형적으로 비장 세포)에 융합되고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝하여 펩티드 항원에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 식별한다.
단클론성 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 것에 대한 대안으로서, 재조합 결합(combinatorial) 면역글로불린 라이브러리를 적절한 펩티드(예를 들어, 표 1의 에피토프를 포함하는 펩티드)로 스크리닝하고, 이에 따라 펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리함으로써 본원에 기재된 표적 단백질에 결합하는 단클론성 항체가 수득될 수 있다.
추가로, 본원에 제공된 표적 단백질 및/또는 본원에 제공된 표적 단백질의 세포외 에피토프에 대해 특이적인 재조합 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화 단클론성 항체는, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 키메라 및 인간화 단클론성 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 미국 특허 번호 5,565,332; 문헌 [Better et al. (1988) Science. 240:1041-1043]; [Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]; [Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218]; [Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005]; [Wood et al. (1985) Nature 314:446-449]; 및 [Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)]; [Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques. 4:214]; [Winter]의 미국 특허 5,225,539; 문헌 [Jones et al. (1986) Nature. 321:552-525]; [Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534]; 및 [Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 사용하는, 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에 제공된 표적 단백질 및/또는 본원에 제공된 세포외 에피토프에 대해 특이적인 인간 단클론성 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 보유하는 형질전환 또는 염색체이식(transchromosomal) 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci)를 함유하는 "HuMAb 마우스"(Lonberg, N. et al. (1994) Nature. 368(6474): 856 859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내며, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 이식유전자는 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도 인간 IgGκ 단클론성 항체를 생성한다(이전 Lonberg, N. et al. (1994); reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology. 113:49 101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci. 764:536 546). HuMAb 마우스의 제조는 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research. 20:6287 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology. 5: 647 656]; [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720 3724]; [Choi et al. (1993) Nature Genetics. 4:117 123]; [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830]; [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920]; [Lonberg et al., (1994) Nature. 368(6474): 856 859]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology. 113:49 101]; [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology. 6: 579 591]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93]; [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536 546]; [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851]에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429; 및 5,545,807을 추가로 참조하라.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이하의 해리 상수로 표 1에 열거된 에피토프에 결합할 수 있다. 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함하여, 당업계에 알려져 있다. 또한, 항체의 결합 동역학(예를 들어, 결합 친화도)은 비아코어(Biacore) 분석과 같이 당업계에 알려진 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서 항체는 항체-약물 접합체의 일부이다. 항체-약물 접합체는 세포독성제 또는 항바이러스제와 같은 생물학적 활성제에 연결된 항체(예를 들어, 표 1에 열거된 단백질에 결합하는 항체)를 포함하는 치료 분자이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성제는 화학적 링커를 통해 항체에 연결된다. 이러한 링커는 디설파이드, 하이드라존, 펩티드 또는 티오에테르를 포함하여, 임의의 안정한 화학적 모티프를 기반으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이고, 생물학적 활성제는 항체가 혈장 막 표적 단백질에 결합할 때 항체로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단 불가능한 링커이다.
일부 실시양태에서, 항체-약물 접합체는 세포독성제에 연결된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, EBV-감염 세포를 사멸시킬 수 있는 임의의 세포독성제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE, DM-1, 메이탄시노이드, 독소루비신 유도체, 아우리스타틴, 칼케아미신, CC-1065, 아두오카마이신 또는 안트라사이클린이다.
일부 실시양태에서, 항체-약물 접합체는 항바이러스제에 연결된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, EBV 복제를 억제할 수 있는 임의의 항바이러스제가 사용된다. 일부 실시양태에서, 항바이러스제는 간사이클로비르, 발간사이클로비르, 포스카넷, 시도포비르, 아사이클로비르, 포르미비르센, 마리바비르, BAY 38-4766 또는 GW275175X이다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 백신을 제공한다.
세포
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 EBV 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 제시하는 MHC를 이들의 표면에서 발현하는 항원-제시 세포(APC)(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 EBV 에피토프를 제시하는 APC)를 제공한다. 일부 실시양태에서, MHC는 클래스 I MHC이다. 일부 실시양태에서, MHC는 클래스 II MHC이다. 일부 실시양태에서, 클래스 I MHC는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-g, HLA-K 또는 HLA-L인 α 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 클래스 II MHC는 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 또는 HLA-DRA인 α 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 클래스 II MHC는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 또는 HLA-DRB인 β 쇄 폴리펩티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 항원-제시 T 세포, 수지상 세포 또는 인공 항원-제시 세포(예를 들어, aK562 세포)이다. 처리에 사용하기 위한 수지상 세포는 환자 샘플로부터 PBMC를 채취하고, 이들을 플라스틱에 부착함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 단핵구 집단은 달라붙고, 다른 모든 세포는 씻어낼 수 있다. 그 후, 부착 집단은 IL-4 및 GM-CSF로 분화되어, 단핵구 유래 수지상 세포를 생산한다. 이러한 세포는 IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α(이는, 수지상 세포의 표면 상의 중요한 공동-자극 분자를 상향 조절함)를 첨가함으로써 성숙될 수 있으며, 그 후, 본원에 제공된 하나 이상의 펩티드를 이용해 형질도입된다.
일부 실시양태에서, APC는 aK562 세포와 같은 인공 항원-제시 세포이다. 일부 실시양태에서, 인공 항원-제시 세포는 CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현하도록 조작된다. aK562 세포를 포함하는 예시적인 인공 항원-제시 세포는 미국 특허 공개 번호 2003/0147869에 기재되어 있고, 이는 참조로 본원에 포함된다.
특정 양태에서, 본원은 본원에 기재된 적어도 하나의 EBV 에피토프를 인코딩하는 핵산, 및/또는 본원에 기재된 적어도 하나의 EBV 에피토프를 포함하는, 펩티드 또는 펩티드의 풀과, APC를 접촉시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 하나 이상의 EBV 에피토프를 제시하는 APC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, APC는 방사선조사(irradiated)된다.
특정 양태에서, 본원은 MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 EBV 에피토프를 포함하는 펩티드)를 인식하는 TCR(예를 들어, αβ TCR 또는 γδ TCR)을 발현하는 T 세포(예를 들어, CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 클래스 I MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드를 인식하는 TCR을 발현하는 CD8 T 세포(CTL)이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 클래스 II MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드를 인식하는 CD4 T 세포(헬퍼 T 세포)이다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 하나 이상의 EBV 에피토프를 인식하는 T 세포(예를 들어, CTL)의 증식을 생성, 활성화 및/또는 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CTL을 포함하는 샘플(즉, PBMC 샘플)은 본원에 제공된 APC(예를 들어, 클래스 I MHC 복합체 상에 본원에 기재된 EBV 에피토프를 포함하는 펩티드를 제시하는 APC)와 함께 배양물에서 항온처리된다. APC는 T 세포가 수득되는 대상체에 대해 자가 유래일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포를 함유하는 샘플은 본원에 제공된 APC와 함께 2회 이상 항온처리된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 적어도 하나의 사이토카인, 예를 들어 IL-4, IL-7 및/또는 IL-15의 존재 하에 APC와 함께 항온처리된다. APC를 사용하여 T 세포의 증식을 유도하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2015/0017723에서 제공되고, 이는 참조로 본원에 포함된다. 대안적으로, 상기 T 세포의 증식을 생성, 활성화 및/또는 유도하는 것은, CTL을 포함하는 샘플(즉, PBMC 샘플)을, 표 1에 제시된 CTL에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 펩티드(예를 들어, 펩티드의 풀)와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CTL을 포함하는 샘플은 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는 펩티드 풀과 접촉하게 된다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 T 세포 및/또는 APC를 포함하는 조성물(예를 들어, 치료 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 대상체에게 유효량의 조성물을 투여함으로써 대상체에서 암, EBV 감염 및/또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용된다. T 세포 및/또는 APC는 대상체에 대해 자가 유래이거나 자가 유래가 아닐 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 APC는 대상체에게 투여되기 전에 세포 은행에 저장된다.
약학 조성물
일부 양태에서, 본원은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된, 본원에 기재된 폴리에피토프 펩티드 또는 CTL 또는 이의 제제를 함유하는 조성물(예를 들어, 백신 조성물과 같은 약학 조성물)뿐만 아니라 상기 약학 조성물을 투여하는 방법을 제공한다.
당단백질은 바이러스 진입에 중요하며, 숙주 세포 거동을 수정할 수 있다. EBV 게놈은 13개의 당단백질에 대한 유전자를 인코딩하며, 이들 중 12개는 생산적인, 용해성 복제 주기 동안에만 발현되고, 이들 중 1개는 잠복기 동안에도 발현될 수 있다.
표 2: EBV 당단백질
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가장 풍부한 EBV 당단백질은 B 림프구에 대한 EBV의 부착을 담당하는 단백질인 gp350이다. B 세포 표면에 부착된 후, EBV는 당단백질, gB, gHgL 복합체 및 gp42에 의해 매개되는 세포막과 이의 외피의 융합을 통해 세포에 진입한다. 또한, EBV 당단백질은 숙주 세포를 조작할 수 있다. 예를 들어 BILF1은 세포 표면에서 HLA 클래스 I 분자의 발현을 하향 조절할 수 있어, 리소좀에서 내재화 및 분해에 대해 이들을 표적화하고; BARF1은 조혈 줄기 세포가 대식세포 또는 다른 관련 세포 종류로 분화하는 것을 차단할 수 있는 가용성 콜로니 자극 인자 1(CSF-1) 수용체로서 작용할 수 있으며; gp42는 HLA 클래스 II/펩티드 복합체와 상호작용할 수 있어, CD4+ T 세포에 의한 바이러스 진입 및 인식 모두에 영향을 미친다. 따라서, 본원에 개시된 백신 및/또는 약학 조성물은 표 2로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스 당단백질 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 백신 및/또는 약학 조성물은 gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 가장 바람직하게는, 백신 및/또는 약학 조성물은 EBV 에피토프-함유 폴리에피토프 단백질 및 gp350 폴리펩티드의 조합을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 백신 및/또는 약학 조성물은 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아쥬반트"는 시험관내 또는 생체내에서 조성물에 대한 면역학적 반응을 변형시키거나 향상시키는 면역학적 또는 약리학적 작용제를 광범위하게 지칭한다. 예를 들어, 아쥬반트는 시간이 지남에 따라 항원의 존재를 증가시키고, 항원-제시 세포 항원을 흡수하는 것을 돕고, 대식세포와 림프구를 활성화시키고, 사이토카인 생산을 지원할 수 있다. 면역 반응을 변경함으로써, 아쥬반트는 투여 효과 또는 안전성을 증가시키기 위해 더 적은 투여량의 면역 상호 작용제 또는 제제를 허용할 수 있다. 예를 들어, 아쥬반트는 T 세포 고갈을 방지할 수 있으므로, 특정 면역 상호 작용제 또는 제제의 유효성 또는 안전성을 증가시킬 수 있다. 아쥬반트의 예는, 비제한적으로 면역 조절 단백질, 아쥬반트 65, α-GalCer, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 포스페이트, β-글루칸 펩티드, 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), CpG DNA, GPI-0100, 지질 A 및 이의 변형된 버전(예를 들어, 일인산화 지질 A, 리포다당류, 리포반트, 몬타니드, N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, Pam3CSK4, 퀼 A 및 트레할로스 디마이콜레이트)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 아쥬반트는, CpG 모티프, 바람직하게는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)와 같은 CpG DNA를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 아쥬반트는 양친매성 CpG DNA를 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 상기 CpG DNA-함유 아쥬반트는, 톨-유사 수용체 9(인간 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상 세포 및 B 세포 포함)를 발현하는 세포를 촉발하여 선천적 면역 반응을 개시하고, 전문 항원-제시 세포의 기능을 개선하며, 체액 및 세포-매개 백신-특이적 면역 반응의 생성을 촉진할 수 있다. CpG ODN은 당업계에 알려져 있고, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 특히 B 세포 및 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 대한 구조적 특징 및 활성을 기반으로 식별될 수 있다. 본원에 기재된 본 EBV 에피토프-함유 백신 조성물에서 아쥬반트 구성성분(들)으로서 사용될 수 있는 당업계에 알려진 CpG ODN은, 예를 들어 문헌 [Berry et al., Infection and Immunity 72(2):1019-1028 (2004)], [Maeyama et al., PLOS ONE 9(2):e88846 (2014)], [Cheng et al., Front Immunol. 2016; 7: 284 (2016)], [Vollmer et al., Advanced Drug Delivery Reviews 61(3):195-204 (2009)], [Ma et al., Science 365(6449):162-168 (2019)], 및 [Liu et al., Nature 507(7493):519-522 (2014)]에 기재되어 있고, 이들 모두 참조로 본원에 포함된다.
인간 B 세포 자극(예를 들어, 세포 증식, CD80 및 CD86 발현, 면역글로불린 생산 및 IL-6 분비)은 하나 이상의 CpG 모티프를 갖고, 폴리G 모티프가 없는 뉴클레아제-저항성 포스포로티오에이트-변형된 백본을 보유하는 ODN으로 달성될 수 있다. 강력한 B 세포 자극 외에도, Th-1 반응을 유도하는 CpG ODN은 B 클래스(K 형으로도 알려짐)에 속하며, IL-12를 생산하는 수지상 세포의 능력을 향상시키고, TH1 방향으로 T 세포 반응을 편향시키는 데 도움을 준다. 인터페론-α를 분비하기 위한 자연 살해(NK) 세포 및 인간 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성화는 A 클래스(D 형으로도 알려짐)의 CpG ODN에 의해 유도될 수 있다. C 클래스 CpG ODN은 B 세포 및 NK 세포 활성화 및 IFN-α 생산을 자극할 수 있는 것에 의해 A 및 B 클래스 둘 모두의 특성을 조합한다.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본원에 기재된 작용제를 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 회합(association)시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기재된 작용제를 액체 담체, 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 후, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서 제형의 구성성분은 T 세포 활성화를 개선하기 위해 예방 및/또는 치료적 면역치료가 림프절에 전달되도록 변형될 수 있다. 예를 들어 비제한적으로, 본원에 기재된 작용제는 알부민-결합 담체(예를 들어, 지질 모이어티 또는 친유성 미부(tail))와 직접적으로 또는 간접적으로 접합됨으로써, 작용제를 자연적으로 혈청 알부민을 축적하는 림프절에 전달할 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본원에 개시된 조성물의 효과는 CD8+ T 림프구에 항원을 제시하여 CTL 반응을 개시하는 수지상 세포(DC)가 림프절에 풍부하기 때문에 림프절에 대한 표적화로 개선된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 EBV 당단백질; 본원에 기재된 바와 같은 아쥬반트; 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나는 알부민-결합 모이어티(예를 들어, 알부민-결합 지질 또는 친유성 미부)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 면역원성 펩티드(또는 이의 풀)는 알부민-결합 지질에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 아쥬반트는 알부민-결합 지질에 접합된다. 가장 바람직하게는, 아쥬반트는 알부민-결합 지질과 접합된 CpG ODN이다. 이러한 "알부민 히치하이킹(albumin hitchhiking)" 접근법은 당업계에 알려져 있고 접합된 작용제(예를 들어, 백신 구성성분)를 제조하는 예는, 문헌 [Liu et al. (2014). "Structure-based Programming of Lymph Node Targeting in Molecular Vaccines." Nature. 2014 Mar 27; 507(7493): 519-522]; [Moynihan, et al. (2016). "Eradication of large established tumors in mice by combination immunotherapy that engages innate and adaptive immune responses." Nat Med. 22(12): 1402-1410]; [Moynihan, et al. (2018). "Enhancement of Peptide Vaccine Immunogenicity by Increasing Lymphatic Drainage and Boosting Serum Stability." Cancer Immunol Res. 6(9): 1025-1038]; [Ma, et al. (2019). "Enhanced CAR-T cell activity against solid tumors by vaccine boosting through the chimeric receptor." Science. 365(6449): 162-168]에서 확인할 수 있고, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, CpG ODN 아쥬반트 구성성분에 접합된 지질은, 예를 들어 콜레스테롤 또는 모노아실 또는 디아실 지질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 본원은 단리된 면역원성 폴리펩티드, 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질, TLR 아고니스트를 포함하는 적어도 하나의 아쥬반트 및 약학적으로 허용가능한 부형제를, 대상체에 투여하기에 적합한 제형으로 조합하는 것을 포함하는, 헤르페스바이러스 감염(예를 들어, EBV 감염)에 대한 예방적 또는 치료적 치료를 생성하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 면역원성 폴리펩티드는 표 1에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 헤르페스바이러스 당단백질은 EBV로부터 유래되고, gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 가장 바람직하게는, 당단백질은 EBV gp350이다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 TLR9 아고니스트를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 아쥬반트는 본원에 기재된 바와 같은 CpG ODN을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학 조성물은, 본원에 기재된 하나 이상의 작용제를, 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 당, 알코올, 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제(bacteriostat), 의도된 수용자의 혈액으로 제형을 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있는, 사용 직전 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과의 조합으로 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
선택된 투여 경로와 상관없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 작용제 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 약학적으로-허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
치료 방법
일부 양태에서, 본원은 대상체에서 헤르페스바이러스 감염(예를 들어, EBV 감염)을 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 적어도 하나 또는 이들의 조합; 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질; 및 본원에 개시된 바와 같은 아쥬반트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함한다. 가장 바람직하게는 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, CTL 에피토프의 각각은 HLA A*03, HLA A11, HLA A*0201, HLA A*1101, HLA A*2301, HLA A*3002, HLA B27, HLA B35.08/B35.01, HLA B*44:0, HLA B57*03, HLA B*0702, HLA B*0801, HLA B*1501, HLA B*3501, HLA B*3508, HLA B*4001, HLA B*4402, HLA B*4402, HLA B*4403, HLA B*4405, HLA B*5301, HLA B*5701 또는 HLA B*5801로부터 선택되는 HLA 클래스 I 특이성 중 어느 하나에 의해 제한된다. 이러한 CTL 에피토프는 EBV 항원 EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2, LMP2a, BMLF1, BZLF1 또는 BRLF1 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 EBV 감염, 암 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 대상체에서 EBV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료되는 대상체는 면역 약화되거나, 그렇지 않으면 면역 억제된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 T 세포 결핍을 갖는다. 대상체는 X-연관 림프구증식 질병(XLP)을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 대상체는 양성 반응성 감염, 예컨대 감염성 단핵구증, 구강모 백반증, 및/또는 만성 활동성 EBV 감염을 가질 수 있거나 가질 위험이 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 HIV에 감염되었고/되었거나, AIDS를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조직, 장기 및/또는 골수 이식을 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역억제 약물을 투여받고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 화학치료를 받았고/받았거나, 받고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 리툭시맙의 사용에 의한 것과 같은 B-세포 고갈을 겪었고/겪었거나, 겪고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 방사선 치료를 받았고/받았거나, 받고 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 바이러스 복제를 억제하는 항-바이러스 약물을 투여받는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 간사이클로비르, 발간사이클로비르, 포스카넷, 시도포비르, 아사이클로비르, 포르미비르센, 마리바비르, BAY 38-4766 또는 GW275175X를 투여받는다.
또한, 본원은 대상체에게 본원에 제공된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의의 자가면역 질환, 바람직하게는 EBV-관련 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 자가면역 질환의 예는, 예를 들어 사구체 신염, 관절염, 확장성 심근병증 유사 질병, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 크론병, 전신성 홍반, 만성 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 스틸병, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 접촉 피부염, 다발근염, 경피증, 결절성 결절동맥주위염, 류마티스성 열, 심상성 백반증, 베체트병, 하시모토병, 에디슨병, 피부근염, 중증 근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스병, 빈혈 페르니시오사(perniciosa), 불임병, 천포창, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 활동성 만성 간염, 에디슨병, 항-인지질 증후군, 아토피성 알레르기, 자가면역성 위축성 위염, 알코르하이드라(achlorhydra) 자가면역, 셀리악병, 쿠싱 증후군, 피부근염, 원판상 홍반성 루푸스, 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 하시모토 갑상선염, 특발성 부신 위축, 특발성 혈소판 감소증, 인슐린-의존성 당뇨병, 람베르트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 루포이드 간염, 림프구 감소증, 혼합 결합 조직 질환, 유천포창(pemphigoid), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 수정체성 포도막염, 결절성 다발동맥염, 다선성 자가증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 레이노 증후군(Raynaud's syndrome), 재발성 다발연골염, 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 제한된 피부경화증(또는 크레스트 증후군), 교감성 안염, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염, 갑상선중독증(thyrotoxicosis), b형 인슐린 저항성, I형 당뇨병, 궤양성 대장염 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 류마티스성 관절염(RA), 소아 특발성 관절염(JIA), 염증성 장 질병(IBD), 셀리악병 및 1형 당뇨병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
MS의 치료는 모든 종류 및 진행 패턴의 치료를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 본 발명의 바람직한 실시양태는 재발-경감 MS(RRMS), 2차-진행성 MS(SPMS), 1차-진행성 MS(PPMS) 및/또는 진행성-재발 MS(PRMS)의 치료를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 전신 자가면역 질환(SAD)을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 이러한 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스 및/또는 쇼그렌 증후군을 치료하는 데 사용된다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 IBD를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 크론병(국소 장 질병, 예를 들어, 비활성 및 활성 형태), 셀리악병(예를 들어, 비활성 또는 활성 형태) 및/또는 궤양성 대장염(예를 들어, 비활성 및 활성 형태)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은, 과민성 대장 증후군, 현미경적 대장염, 림프구성-형질세포성 장염, 복강 질병, 교원성 결장염, 림프구성 대장염, 호산구성 장염, 불확정 대장염, 감염성 대장염(바이러스성, 세균성 또는 원생동물, 예를 들어, 아메바성 대장염)(예를 들어, 클로스트리디움 디피실 대장염), 거짓막성(pseudomembranous) 대장염(괴사성 대장염), 허혈성 염증성 장 질병, 베체트병, 유육종증, 피부경화증, IBD-관련 이형성증, 이형성증 관련 종괴 또는 병변, 및/또는 원발성 경화성 담관염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. EBV는 전-암성 림프구증식 질병(LPD) 및 인간 종양과 병인학적으로 연관되며, 매년 전 세계적으로 발생하는 최대 200,000건의 새로운 암 사례의 원인이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 EBV와 관련된 임의의 암성 또는 전-암성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 본원에 제공된 하나 이상의 EBV 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 EBV 에피토프)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 인간 개체군의 대다수는 EBV에 대해 혈청양성인 바, 이는 평생 잠복기를 확립할 수 있고, 1차 감염 후 간헐적 재활성화를 가질 수 있으며, 대부분의 감염된 개체에서 제한된 임상 증상을 갖는다. 특히, EBV는 B 세포 시스템 내에서 잠복 감염으로서 지속되며, 이의 질병 중 몇몇은 B 세포 기원으로서, 예를 들어, 면역약화된, 호지킨 림프종(HL), 버킷 림프종(BL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포 림프종(PBL), 및 원발성 삼출액 림프종(PEL)의 B 세포 림프구증식 장애(B-LPD)이다. EBV는 또한 잠복 감염을 보유할 수 있는 다른 세포 틈새에서 발생하는 종양, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 LPD 및 악성 림프종, 비인두 암종(NPC), 상피 기원의 위 암종 및 평활근육종과 연관된다. 따라서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은, 비제한적으로 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장관, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함한다. 또한, 암은 구체적으로 하기 조직학적 종류일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 필로매트릭스(pilomatrix) 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암; 악성 가스트리노마(gastrinoma); 담관암종; 간세포 암종; 결합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암; 선낭 암종; 선종 폴립(adenomatous polyp)의 선암; 선암, 가족성 대장 용종증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포 선암; 유두 선암; 색소혐성(chromophobe) 선암; 애시도필(acidophil) 암종; 호산성 선암; 호염기성 암종; 투명 세포 선암; 과립 세포 암종; 여포성 선암; 유두 및 여포성 선암; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 모양 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암; 피지 선암; 이구 선암; 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두 낭샘암종; 유두 장액 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 선암; 인환 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증형 암종; 유방 파제트병(mammary paget's disease); 선포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암 w/편평상피 화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 포막종; 악성 과립막 세포 종양; 및 악성 로블라스토마(roblastoma); 세르톨리 세포(sertoli cell) 암종; 악성 레이딕 세포(leydig cell) 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종(paraganglioma); 악성 유방외 곁신경절종; 크롬 친화 세포종; 글리오만지오사르코마(glomangio sarcoma); 악성 흑색종; 무멜라닌 흑색종; 표재 확산(superficial spreading) 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아성 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮐러관(mullerian) 혼합 종양; 신아종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 브렌너(brenner) 종양; 악성 엽상 종양; 윤활막 육종; 악성 중피종; 난소고환종; 배아성 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막 암종; 악성 중콩팥종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시(kaposi's) 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관 육종; 골육종; 피질 주위 골육종; 연골 육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골 육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성 법랑질 모세포종(ameloblastoma); 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 별아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경 모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 소림프구성 악성 림프종; 미만성 거대 세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상 식육종(mycosis fungoides); 비호지킨 림프종 및 관련 신생물; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장질환; 백혈병; 림프구성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병. 보다 바람직하게는, 치료될 수 있는 상기 암은, 비인두형의 미분화 암종(UNCT); 비인두 암종(NPC); 비-각질화 및 각질화 아형을 포함하는 비인두 암종(NPC), UNCT 및 선암을 포함하는 위 암종; 풍토성, 산발적, 및 AIDS-관련 아형을 포함하는 버킷 림프종; B-림프구증식 질병(B-LPD), 예컨대 이식 후 B-LPD 및 HIV-관련 B-LPD; 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 예컨대 HIV-관련 DLBCL, 농흉-관련 림프종(PAL), 및 별도 명시가 없는 한 DLBCL; 만성 활성 엡스테인-바르 바이러스 감염(CAEBV), 외부 결절 T/NK 림프종 및 공격적 NK 림프종을 포함하는 T 및 NK-세포 림프구증식 질병(T/NK LPD); 결절 림프구-우세 호지킨 림프종(NLPHL); 및 결절 경화 cHL, 혼합된 세포질 cHL, 림프구 고갈 cHL, 림프구 풍부 cHL, 및 HIV-관련 cHL을 포함하는 모든 아형의 전형적 호지킨 림프종(cHL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 항-암 화합물을 투여받는다. 예시적인 항-암 화합물은, 비제한적으로 알렘투주맙(캄패스(Campath)®), 알리트레티노인(판레틴(Panretin)®), 아나스트로졸(아리미덱스(Arimidex)®), 베바시주맙(아바스틴(Avastin)®), 벡사로텐(타르그레틴(Targretin)®), 보르테조밉(벨카데(Velcade)®), 보수티닙(보설리프(Bosulif)®), Brentuximab vedotin(Adcetris)®), 카보잔티닙(코메트리크(Cometriq)™), 카르필조밉(카이프롤리스)(Kyprolis)™), 세툭시맙(에르비툭스(Erbitux)®), 크리조티닙(잘코리(Xalkori))®), 다사티닙(스프리셀(Sprycel)®), 데닐류킨 디프티톡스(온탁(Ontak)®), 에르로티닙 하이드로클로라이드(타르세바(Tarceva)®), 에베롤리무스(아피니토르(Afinitor)®), 엑세메스탄(아로마신(Aromasin)®), 풀베스트란트(파슬로덱스(Faslodex)®), 게피티닙(이레사(Iressa)®), 이브리투모맙 티욱세탄(제발린(Zevalin)®), 이마티닙 메실레이트(글리벡(Gleevec)®), 이필리무맙(예르보이(Yervoy)™), 라파티닙 디토실레이트(타이케르브(Tykerb)®), 레트로졸(페마라(Femara)®), 닐로티닙(타시그나(Tasigna)®), 오파투무맙(아르제라(Arzerra)®), 파니투무맙(벡티빅스(Vectibix)®), 파조파닙 하이드로클로라이드(보트리엔트(Votrient)®), 페르투주맙(페르제타(Perjeta)™), 프랄라트렉세이트(폴로타인(Folotyn)®), 레고라페닙(스티바르가(Stivarga)®), 리툭시맙(리툭산(Rituxan)®), 로미뎁신(이스토닥스(Istodax)®), 소라페닙 토실레이트(넥사바르(Nexavar)®), 수니티닙 말레이트(수텐트(Sutent)®), 타목시펜, 템시롤리무스(토리셀(Torisel)®), 토레미펜(파레스톤(Fareston)®), 토시투모맙 및 131I-토시투모맙(벡사르(Bexxar)®), 트라스투주맙(헤르셉틴(Herceptin)®), 트레티노인(베사노이드(Vesanoid)®), 반데타닙(사프렐사(Caprelsa)®), 베무라페닙(젤보라프(Zelboraf)®), 보리노스태트(졸린자(Zolinza)®) 및 Ziv-아플리베르셉트(잘트랩(Zaltrap)®)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 화학치료제를 투여받는다. 상기 화학요법제의 예는, 비제한적으로 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민 및 에틸렌이민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말I 및 칼리케아미신 오메갈1; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라르나이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘 및 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 디포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 독세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 배위 복합체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 면역치료제를 투여받는다. 면역치료는 대상체의 면역계를 사용하여 암을 치료하는 치료, 예를 들어 암 백신, 사이토카인, 암-특이적 항체의 사용, T 세포 치료 및 수지상 세포 치료를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 면역 조절 단백질을 투여받는다. 면역 조절 단백질의 예는, 비제한적으로 B 림프구 화학유인제("BLC"), C-C 모티프 케모카인 11("에오탁신-1"), 호산성 화학쏠림 단백질 2("에오탁신-2"), 과립구 집락-자극 인자("G-CSF"), 과립구 대식세포 집락-자극 인자("GM-CSF"), 1-309, 세포간 부착 분자 1("ICAM-1"), 인터페론 감마("IFN-감마"), 인터루킨-1 알파("IL-1 알파"), 인터류킨-1 베타("IL-1 베타"), 인터류킨 1 수용체 안타고니스트("IL-1 ra"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-4("IL-4"), 인터류킨-5("IL-5"), 인터류킨-6("IL-6"), 인터류킨-6 가용성 수용체("IL-6 sR"), 인터류킨-7("IL-7"), 인터류킨-8("IL-8"), 인터류킨-10("IL-10"), 인터류킨- 11("IL-11"), 인터류킨-12의 서브 유닛 베타("IL-12 p40" 또는 "IL-12 p70"), 인터류킨-13("IL-13"), 인터류킨-15("IL-15"), 인터류킨-16("IL-16"), 인터류킨-17("IL-17"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2("MCP-1"), 대식세포 집락-자극 인자("M-CSF"), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인("MIG"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2("MIP-1 알파"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 4("MIP-1 베타"), 대식세포 염증성 단백질-1-델타("MIP-1 델타"), 혈소판-유래 성장 인자 서브유닛 B("PDGF-BB"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5, 활성화 시 조절, 정상 T 세포 발현 및 분비(Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted)("RANTES"), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1("TIMP-1"), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 2("TIMP-2"), 종양 괴사 인자, 림포톡신-알파("TNF 알파"), 종양 괴사 인자, 림포톡신-베타("TNF 베타"), 가용성 TNF 수용체 1형("sTNFRI"), sTNFRIIAR, 뇌 유래 신경영양 인자("BDNF"), 염기성 섬유모세포 성장 인자("bFGF"), 뼈 형성 단백질 4("BMP-4"), 뼈 형성 단백질 5("BMP-5"), 뼈 형성 단백질 7("BMP-7"), 신경 성장 인자("b-NGF"), 표피 성장 인자("EGF"), 표피 성장 인자 수용체("EGFR"), 내분비샘 유래 혈관 내피 성장 인자("EG-VEGF"), 섬유모세포 성장 인자 4("FGF-4"), 케라틴세포 성장 인자("FGF-7"), 성장 분화 인자 15("GDF-15"), 신경아교세포유래 신경영양 인자("GDNF"), 성장 호르몬, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자("HB-EGF"), 간세포 성장 인자("HGF"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1("IGFBP-1"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2("IGFBP-2"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3(" IGFBP-3"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4("IGFBP-4"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6("IGFBP-6"), 인슐린-유사 성장 인자 1("IGF-1"), 인슐린, 대식세포 집락-자극 인자("M-CSF R"), 신경 성장 인자 수용체("NGF R"), 뉴로트로핀-3("NT-3"), 뉴로트로핀-4("NT-4"), 피골세포형성(Osteoclastogenesis) 억제성 인자("오스테오프로테게린(Osteoprotegerin)"), 혈소판-유래 성장 인자 수용체("PDGF-AA"), 포스파티딜리노시톨-글리칸 생합성("PIGF"), Skp, 컬린(Cullin), F-박스 함유 복합체("SCF"), 줄기 세포 인자 수용체("SCF R"), 형질전환 성장 인자 알파("TGF알파"), 형질전환 성장 인자 베타-1("TGF 베타 1"), 형질전환 성장 인자 베타-3("TGF 베타 3"), 혈관 내피 성장 인자("VEGF"), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2("VEGFR2"), 혈관 내피 성장 인자 수용체 3("VEGFR3"), VEGF-D 6씨킨(6Ckine), 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO("Axl"), 베타셀룰린("BTC"), 점막-관련 상피 케모카인("CCL28"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 27("CTACK"), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 16("CXCL16"), C-X-C 모티프 케모카인 5("ENA-78"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 26("에오탁신-3"), 과립구 화학쏠림 단백질 2("GCP-2"), GRO, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 14("HCC-l"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 16("HCC-4"), 인터류킨-9("IL-9"), 인터류킨-17 F("IL-17F"), 인터류킨-18-결합 단백질("IL-18 BPa"), 인터류킨-28 A("IL-28A"), 인터류킨 29("IL-29"), 인터류킨 31("IL-31"), C-X-C 모티프 케모카인 10("IP-10"), 케모카인 수용체 CXCR3("I-TAC"), 백혈병 억제성 인자("LIF"), 라이트, 케모카인(C 모티프) 리간드("림포탁틴(Lymphotactin)"), 단핵구 화학유인제 단백질 2("MCP-2"), 단핵구 화학유인제 단백질 3("MCP-3"), 단핵구 화학유인제 단백질 4("MCP-4"), 대식세포-유래 케모카인("MDC"), 대식세포 이동 억제성 인자("MIF"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 20("MIP-3 알파"), C-C 모티프 케모카인 19("MIP-3 베타"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 23("MPIF-1"), 대식세포 자극 단백질 알파 쇄("MSP알파"), 뉴클레오좀 조립 단백질 1-유사 4("NAP-2"), 분비된 인단백질 1("Osteopontin"), 폐 및 활성화-조절된 사이토카인("PARC"), 혈소판 인자 4("PF4"), 스트로마 세포-유래 인자-1 알파("SDF-1 알파"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 17("TARC"), 흉선-발현된 케모카인("TECK"), 흉선 기질 림포포이에틴("TSLP 4- IBB"), CD 166 항원("ALCAM"), 분화 클러스터 80("B7-1"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 17("BCMA"), 분화 클러스터 14("CD14"), 분화 클러스터 30("CD30"), 분화 클러스터 40("CD40 리간드"), 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1(담즙 당단백질)("CEACAM-1"), 사멸 수용체 6("DR6"), 데옥시티미딘 키나제("Dtk"), 1형 막 당단백질("엔도글린"), 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-3("ErbB3"), 내피-백혈구 부착 분자 1("E-셀렉틴"), 아폽토시스 항원 1("Fas"), Fms-유사 티로신 키나제 3("Flt-3L"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 1("GITR"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 14("HVEM"), 세포간 부착 분자 3("ICAM-3"), IL-1 R4, IL-1 RI, IL-10 R베타, IL-17R, IL-2R감마, IL-21R, 리소좀 막 단백질 2("LIMPII"), 호중성 젤라티나제-관련 리포칼린("리포칼린-2"), CD62L("L-셀렉틴"), 림프 내피(Lymphatic endothelium)("LYVE-1"), MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련 서열 A("MICA"), MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련 서열 B("MICB"), NRGl-베타l, 베타-형 혈소판-유래 성장 인자 수용체("PDGF R베타"), 혈소판 내피 세포 부착 분자("PECAM-1"), RAGE, 간염 A 바이러스 세포 수용체 1("TIM-1"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 IOC("TRAIL R3"), 트랩핀(Trappin) 단백질 트랜스글루타미나제 결합 도메인("트랩핀-2"), 우로키나제 수용체("uPAR"), 혈관 세포 부착 단백질 1("VCAM-1"), XEDAR, 액티빈 A, 아구티-관련 단백질("AgRP"), 리보뉴클레아제 5("안지오제닌"), 안지오포이에틴 1, 안지오스타틴, 카텝신 S, CD40, 크립틱 패밀리(Cryptic family) 단백질 IB("크립토(Cripto)-1"), DAN, 딕콥프(Dickkopf)-관련 단백질 1("DKK-1"), E-캐드헤린(Cadherin), 상피 세포 부착 분자("EpCAM"), Fas 리간드(FasL 또는 CD95L), Fcg RIIB/C, FoUi스타틴(FoUistatin), 갈렉틴(Galectin)-7, 세포간 부착 분자 2("ICAM-2"), IL-13 Rl, IL-13R2, IL-17B, IL-2 Ra, IL-2 Rb, IL-23, LAP, 뉴런 세포 부착 분자("NrCAM"), 플라스미노겐 활성자 억제제- 1("PAI-1"), 혈소판 유래 성장 인자 수용체s("PDGF-AB"), 레시스틴(Resistin), 간질 세포-유래 인자 1("SDF-1 베타"), sgpl30, 분비된 프리즐드(Secreted frizzled)-관련 단백질 2("ShhN"), 시알산-결합 면역글로불린-형 렉틴("시글렉(Siglec)-5"), ST2, 형질전환 성장 인자-베타 2("TGF 베타 2"), Tie-2, 트롬보포이에틴("TPO"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 10D("TRAIL R4"), 골수 세포 상 발현된 트리거링 수용체 1("TREM-1"), 혈관 내피 성장 인자 C("VEGF-C"), VEGFRl, 아디포넥틴, 아딥신("AND"), 알파-태아단백질("AFP"), 안지오포이에틴-유사 4("ANGPTL4"), 베타-2-마이크로글로불린("B2M"), 기저 세포 부착 분자("BCAM"), 탄수화물 항원 125("CA125"), 암 항원 15-3("CA15-3"), 암배아 항원("CEA"), cAMP 수용체 단백질("CRP"), 인간 표피 성장 인자 수용체 2("ErbB2"), 폴리스타틴(Follistatin), 모낭-자극 호르몬("FSH"), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1("GRO 알파"), 인간 융모성 생식선 자극호르몬("베타 HCG"), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체("IGF-1 sR"), IL-1 sRII, IL-3, IL-18 Rb, IL-21, 렙틴, 매트릭스 메탈로매트릭스 메탈로프로테이나제-1("MMP-1"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2("MMP-2"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-3("MMP-3"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-8("MMP-8"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-9("MMP-9"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-10("MMP-10"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-13("MMP-13"), 신경 세포 부착 분자("NCAM-1"), 엔탁틴(Entactin)("니도겐(Nidogen)-1"), 신경 특이적 에놀라제("NSE"), 온코스타틴 M("OSM"), 프로칼시토닌, 프로락틴, 전립선 특이적 항원("PSA"), 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 9("시글렉-9"), ADAM 17 엔도펩티다제("TACE"), 티로글로불린, 메탈로프로테이나제 억제제 4("TIMP-4"), TSH2B4, 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인-함유 단백질 9("ADAM-9"), 안지오포이에틴 2, 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 멤버 13/ 산성 류신-풍부 핵 인단백질 32 패밀리 멤버 B("APRIL"), 뼈 형성 단백질 2("BMP-2"), 뼈 형성 단백질 9("BMP-9"), 보체 성분 5a("C5a"), 카텝신 L, CD200, CD97, 체메린(Chemerin), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 6B("DcR3"), 지방산-결합 단백질 2("FABP2"), 섬유모세포 활성화 단백질, 알파("FAP"), 섬유모세포 성장 인자 19("FGF-19"), 갈렉틴-3, 간세포 성장 인자 수용체("HGF R"), IFN-알파/베타 R2, 인슐린-유사 성장 인자 2("IGF-2"), 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체("IGF-2 R"), 인터류킨-1 수용체 6("IL-1R6"), 인터류킨 24("IL-24"), 인터류킨 33("IL-33", 칼리크레인(Kallikrein) 14, 아스파라기닐 엔도펩티다제("레구메인(Legumain)"), 산화된 저-밀도 지질단백질 수용체 1("LOX-1"), 만노스-결합 렉틴("MBL"), 네프릴리신(Neprilysin)("NEP"), 노치 호몰로그(Notch homolog) 1, 전좌-관련(드로소필리아(Drosophila))("노치(Notch)-1"), 신아종 과발현("NOV"), 오스테오액티빈, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1("PD-1"), N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제("PGRP-5"), 세르핀 A4, 분비된 프리즐드 관련 단백질 3("sFRP-3"), 트롬보모둘린, 톨-유사 수용체 2("TLR2"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 10A("TRAIL Rl"), 트랜스페린("TRF"), WIF-lACE-2, 알부민, AMICA, 안지오포이에틴 4, B-세포 활성화 인자("BAFF"), 탄수화물 항원 19-9("CA19-9"), CD 163, 클러스테린, CRT AM, 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 14("CXCL14"), 시스테인 C, 데코린(Decorin)("DCN"), 딕콥프-관련 단백질 3("Dkk-3"), 델타-유사 단백질 1("DLL1"), 페투인 A, 헤파린-결합 성장 인자 1("aFGF"), 엽산 수용체 알파("FOLR1"), 푸린, GPCR-관련 유형 단백질 1("GASP-1"), GPCR-관련 유형 단백질 2("GASP-2"), 과립구 집락-자극 인자 수용체("GCSF R"), 세린 프로테아제 헵신("HAI-2"), 인터류킨-17B 수용체("IL-17B R"), 인터류킨 27("IL-27"), 림프구-활성화 유전자 3("LAG-3"), 아포지질단백질 A-V("LDL R"), 펩시노겐 I, 레티놀 결합 단백질 4("RBP4"), SOST, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸("신데칸(Syndecan)-1"), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 13B("TACI"), 외인계 응고억제제(Tissue Factor Pathway Inhibitor, "TFPI"), TSP-1, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 10b("TRAIL R2"), TRANCE, 트로포닌 I, 우로키나제 플라스미노겐 활성자("uPA"), 캐드헤린 5, CD144로도 알려진 2형 또는 VE-캐드헤린(혈관 내피)("VE-캐드헤린"), WNTl-유도성-신호전달 경로 단백질 1("WISP-1") 및 핵인자 κ B의 수용체 활성화("RANK")를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 또한 면역 체크포인트 억제제를 투여받는다. 면역 체크포인트 억제제는 암 세포가 면역 반응을 예방하거나 하향 조절하기 위해 생산할 수 있는 체크포인트를 억제하는 것을 광범위하게 지칭한다. 면역 체크포인트 단백질의 예는, 비제한적으로 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 또는 VISTA를 포함한다. 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질에 결합하여 억제하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 면역 체크포인트 억제제의 예는, 비제한적으로 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 및 STI-A1010을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물(예를 들어, 본원에 제공된 백신 조성물)은 암 및/또는 EBV 감염을 예방하기 위해 예방적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 백신은 종양 세포 확장을 억제하기 위해 투여된다. 백신은 환자에서 암 세포 또는 EBV 감염 세포의 검출 전 또는 후에 투여될 수 있다. 종양 세포 확장의 억제는 종양 세포의 성장을 방지, 중지, 둔화시키거나, 이의 사멸을 지칭하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 APC를 포함하는 백신의 투여 후, 전염증성 반응이 유도된다. 전염증성 면역 반응은 전염증성 사이토카인 및/또는 케모카인, 예를 들어 인터페론 감마(IFN-γ) 및/또는 인터류킨 2(IL-2)의 생산을 포함한다. 전염증성 사이토카인 및 케모카인은 당업계에 잘 알려져 있다.
공동 요법은 후속 치료가 투여될 때 투여된 제1 작용제의 치료 효과가 완전히 사라지지 않는, 그러한 방식으로 활성 화합물의 순차적, 동시 및 개별 및/또는 공동-투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 작용제는 제1 작용제와 공동-제형화되거나, 별도의 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
본원에서 제공되는 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 달라질 수 있다.
선택된 용량 수준은 사용되는 특정 작용제의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 또는 대사 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 화합물과 병용하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 치료에 적합한 대상체를 식별하는 방법(대상체에게 본원에 제공된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 EBV 감염 및/또는 암을 치료하는 방법)을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 샘플, 조직 샘플, 종양 샘플)을 단리하는 단계, 및 예를 들어 ELISA 검정, 웨스턴 블롯 분석, FACS 검정, 형광 현미경 검정, 에드만(Edman) 분해 검정 및/또는 질량 분석 검정(예를 들어, 단백질 서열분석)을 사용하여 샘플에서 표 1에 열거된 EBV 에피토프의 존재를 검출하 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, EBV 에피토프의 존재는 EBV 에피토프를 인코딩하는 핵산을 검출함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, EBV 에피토프를 인코딩하는 핵산은 핵산 프로브, 핵산 증폭 검정 및/또는 서열분석 검정을 사용하여 검출된다.
본원에 제공된 방법에 사용될 수 있는 핵산 증폭 검정의 예는, 비제한적으로 중합효소 연쇄 반응(PCR), LATE-PCR, 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification, SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 자체-지속 서열 복제(3SR), Qβ 레플리카제 기반 증폭, 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 복구 연쇄 반응(RCR), 부메랑 DNA 증폭(boomerang DNA amplification, BDA) 및/또는 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA)을 포함한다.
일부 실시양태에서 증폭 반응의 산물은 샘플 내 박테리아의 존재 및/또는 정체의 지표로서 검출된다. 일부 실시양태에서, 증폭 산물은 증폭 반응의 완료 후에 검출된다(즉, 종점 검출). 종점 검출 방법의 예는 겔-전기영동 기반 방법, 프로브-결합 기반 방법(예를 들어, 분자 비콘, HPA 프로브, 라이트 온/라이트 오프(lights on/lights off) 프로브) 및 이중 가닥 DNA 결합 형광-염료 기반 방법(예를 들어, 에티디움 브로마이드, SYBR-그린)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 산물은 증폭 반응에서 생성될 때 검출된다(즉, 실시간 검출). 실시간 검출 방법의 예는 프로브-결합 기반 방법(예를 들어, 분자 비콘, TaqMan 프로브, 스콜피온 프로브, 점등/소등 프로브) 및 이중 가닥 DNA 결합 형광-염료 기반 방법(예를 들어, 에티디움 브로마이드, SYBR-그린)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응의 산물은 서열분석에 의해 (예를 들어, 본원에 기재된 서열분석 검정의 사용을 통해) 검출 및/또는 식별된다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열의 검출은 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 프로브와 핵산 서열을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출가능하게 표지된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 형광 모이어티로 (직접 또는 간접적으로) 표지된다. 본원에 제공된 방법에 유용한 형광 모이어티의 예는, 비제한적으로 알로피코시아닌, 플루오레세인, 피코에리트린, 페리디닌-클로로필 단백질 복합체, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750, 알렉사 플루오르 790, GFP, RFP, YFP, EGFP, mPlum, mCherry, mOrange, mKO, EYFP, mCitrine, 비너스(Venus), YPet, 에메랄드(Emerald), 세루리안(Cerulean) 및 CyPet를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 분자 비콘 프로브, 분자 토치 프로브, TaqMan 프로브, SDA 프로브, 스콜피온 프로브, HPA 프로브 또는 라이트 온/라이트 오프 프로브이다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열분석(예를 들어, 전체 게놈 서열분석, 전사체 서열 및/또는 표적 유전자 서열분석)에 의해 검출된다.
본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 서열분석 처리의 예는, 비제한적으로 사슬 종료 서열분석, 대규모 병렬 시그니처 서열분석, 이온 반도체 서열분석, 폴로니 서열분석, 일루미나 서열분석, 결찰에 의한 서열분석, 합성에 의한 서열분석, 파이로서열분석, 단일-분자 실시간 서열분석, SOLiD 서열분석, DNA 나노볼 서열분석, 헬리스코프 단일 분자 서열분석, 단일 분자 실시간 서열분석, 454 서열분석, 나노포어 서열분석, 터널링 전류 DNA 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 치료 방법을 사용하여 (예를 들어, 본원에 제공된 약학 조성물을 대상체에게 투여함으로써) 식별된 대상체를 치료하는 것을 추가로 포함한다.
실시예
실시예 1: 백신 전략
안전성 문제를 극복하고 보호를 개선하기 위해, 본원에 개시된 예시된 EBV 백신을 재조합 EBV 폴리에피토프(EBV폴리), gp350 단백질 및 인간 호환성 아쥬반트(들)을 사용해 개발하여, 감염의 잠복 단계 및 용해 단계 둘 모두에서 발현되는 여러 EBV의 항원에 대한 EBV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 중화 항체 반응을 유도하였다.
EBV폴리는 8개의 EBV 항원(EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2A, BRLF1, BMLF1 및 BZLF1)으로부터 유래된 20개의 연속한 최소 CD8+ T 세포 에피토프로 구성된 인공 폴리에피토프 단백질이다. 이러한 에피토프는 인간 MHC 클래스 I 대립 유전자의 광범위한 적용 범위를 제공하기 위해 여러 항원으로부터 선택된다. EBV폴리에 내장된 각 에피토프의 면역원성을 강화하기 위해, 프로테아좀 유리 아미노산 서열(K, R 또는 AD)을 각 에피토프의 카복시 말단에 부가하였다. 이 EBV폴리 접근법은 발암 가능성을 가진 여러 재조합 항원을 함유하는 복잡한 백신을 개발할 필요 없이 여러 항원에 대한 세포독성 CD8+ T 세포 반응을 동시에 유도할 수 있게 한다.
또한 백신 제형에는 CD4+, CD8+ T 세포 반응 및 중화 항체 반응을 표적화하는 재조합 EBV gp350 단백질이 포함된다. EBV gp350-특이적 중화 항체는 바이러스 감염에 대한 1차 방어선을 제공하며, CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 바이러스 감염 세포의 제거를 도울 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 EBV폴리와 gp350 펩티드의 조합이 놀라운 효능을 갖는 백신 조성물을 생성함을 확인하였다.
재조합, 단백질-기반, 서브유닛 백신이 안전한 백신 접근법으로 간주되었지만, 이들은 때때로 면역원성이 불량하고, 하나 이상의 면역자극제(예를 들어, 아쥬반트)의 공동-투여를 필요로 한다. 알루미늄 하이드록시드, MF59 및 모노포스피릴 지질 A(MPL)와 같은 제한된 수의 면역자극제만이 허가된 인간 백신에 사용되었다. 이러한 작용제는 방어적인 체액성 면역 반응의 강력한 유도제이다. 그러나, EBV와 같은 복잡한 병원체는 체액 및 세포-매개 면역 반응 모두의 유도를 필요로 한다. 이러한 요건을 충족시키기 위해, 차세대 면역자극제가 필요하다. 최근에, 메틸화되지 않은 시토신-포스페이트-구아닌(CpG) 모티프를 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드인, 모티프가 다수의 백신 제형에서 체액 및 세포-매개 면역 반응 둘 모두를 유도하기 위해 사용되었다. 다만, 면역자극제로서 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 사용하는 데 있어 주요 난제는, 생체내에서 CpG 모티프를 림프 기관의 면역 세포로 표적화시키는 효율적인 전달 시스템의 부재이다. 이들의 낮은 분자량과 높은 용해도로 인해, CpG ODN은 몇 시간 내에 림프절을 통해 수세(flush)되는 경향이 있으며, 선천적 면역 세포에 아주 잠시 노출되어 차선적인 면역 반응을 유도한다. 이러한 난제를 극복하기 위해, CpG ODN을 알부민-결합 지질과 접합시켜, 양친매성으로 만들고, 면역자극제 및 백신 항원을 림프절에 생체내에서 효율적으로 표적화할 수 있게 하여, 문헌 [Moynihan, et al. (2016). "Eradication of large established tumors in mice by combination immunotherapy that engages innate and adaptive immune responses." Nat Med. 22(12): 1402-1410]; [Moynihan, et al. (2018). "Enhancement of Peptide Vaccine Immunogenicity by Increasing Lymphatic Drainage and Boosting Serum Stability." Cancer Immunol Res. 6(9): 1025-1038]; [Ma, et al. (2019). "Enhanced CAR-T cell activity against solid tumors by vaccine boosting through the chimeric receptor." Science. 365(6449): 162-168]에 언급된 바와 같이, 강력한 면역 반응을 유도함으로써, 차세대 면역자극 CpG ODN이 개발되었고, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전신 투여 후, 지질 접합체는 내인성 알부민에 결합하고, 이는 접합체가 빠르게 혈류로 들어가는 것을 방지하고, 대신 림프 및 배액 림프절로 향하게 하며, 이때 이들은 항원 제시 세포에 의한 알부민 여과로 인해 축적된다.
표 3
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실시예 2: EBV 폴리에피토프 단백질 구성물 디자인, 단백질 발현, 정제 공정 개발 및 시험관내 면역원성 평가
각각의 에피토프의 카복실 말단을 프로테아좀 유리 아미노산 서열(AD 또는 K 또는 R)에 의해 연결하는, 그러한 방식으로 EBV폴리 단백질 서열을 디자인하였다. (표 1 참조.) 프로테아좀 유리 아미노산 서열은 항원 제시 세포에 의한 폴리에피토프 단백질의 프로테아좀 처리를 향상시킴으로써, CD8+ T 세포 에피토프의 면역원성을 개선한다(Dasari, et al. (2014). "Induction of innate immune signatures following polyepitope protein-glycoprotein B-TLR4&9 agonist immunization generates multifunctional CMV-specific cellular and humoral immunity." Hum Vaccin Immunother. Apr; 10(4): 1064-1077). 높은 수준의 EBV폴리 단백질 발현을 달성하기 위해, 최적화된 대장균(E. coli) 코돈(서열번호 42)을 사용하여 EBV폴리 구성물의 아미노산 서열을 DNA 서열로 번역하였고, EBV폴리 단백질-인코딩 DNA 서열을 합성으로 구성하고, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라니시드(IPTG) 유도성 플라스미드, 피제이익스프레스(pJexpress) 404(미국 캘리포니아 소재의 아텀 바이오(Atum Bio))로 클로닝하였다. 합성적으로 디자인된 EBV폴리 구성물을 화학적으로 적격인 대장균 DH5 α 세포로 형질전환시킨 후, 유도성 발현 플라스미드를 단리하고 정제하였다.
화학적으로 적격인 BL21-코돈플러스(codonPlus)(DE3) RP 대장균 세포(미국 캘리포니아 소재의 어질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 유도성 EBV폴리 발현 벡터로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 암피실린(LB-Amp 100 μg/mL)이 보충된 루리아 베르타니(Luria Bertani)(LB) 한천 위에 플레이팅하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 단리된 콜로니를 골라서 100 μg/mL 암피실린(TB-Amp 액체배지(broth))을 함유하는 테리픽 액체배지(Terrific broth)의 10 ml에 접종하고, 진탕기에서 37℃ 및 200 rpm으로 밤새 성장시켰다. 밤새 성장시킨 배양물의 소량을 50 mL의 TB-Amp 액체배지에 접종하고, 12시간 동안 성장시켰다. 50 mL 배양물의 약 1%를 3리터의 TB-Amp 액체배지로 옮기고, 광학 밀도에 의해 측정된 바와 같이, 성장이 600 nm에서 0.6에 도달할 때까지 항온처리하였다. 1 mM/mL의 IPTG를 배양물에 첨가하고 25℃에서 5시간 동안 항온처리함으로써 EBV폴리 단백질 발현을 유도하였다. 유도 단계의 종료 시, 배양물을 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 수확하고, 세포 펠릿을, 프로테아제 억제제 칵테일(독일 만하임 소재의 로슈(Roche))로 보충된 100 mL의 용해 완충액(25mM 트리스 pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5% 트리톤엑스(TritonX) 100, 0.5 mg/mL 리소자임)에서 재-현탁하고, 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 초음파 분해에 의해 세포 용해시켰다. 각각의 주기 사이에 10분의 휴식 시간을 두고 6개의 8분 주기(1초 켜기 및 끄기) 동안 얼음 위에서 초음파 분해를 수행하였다. 용해물을 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액 및 펠릿 분획을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하고, 유도되지 않은 샘플 및 유도된 샘플을 비교하였다. EBV폴리 발현 벡터는 높은 수준의 EBV폴리 단백질을 생산하였다(도 1A 참조). 그러나, 선형 CD8+ T 세포 에피토프의 높은 소수성 특성으로 인해, 유도된 EBV폴리 단백질은, 세포 용해물로부터의 펠릿 분획 및 상청액을 비교할 때, 봉입체(IB)의 형태로 응집되었다. (도 1B 참조.) 유도된 배양물 매 3 L로부터, 가용화를 위해 약 2 그램의 펠릿(습윤 중량)을 수득하였다. 모든 IB 세척, 가용화 및 정제 단계를 냉장실에서 수행하였다. 숙주 세포 단백질 및 DNA 오염을 제거하기 위해, IB를 TE 완충액(25 mM 트리스 및 5 mM EDTA pH 7.5)으로 3회 세척하였다. 균질한 현탁액을 만들기 위해, IB를 TE 완충액에서 현탁하고, 10분 동안 초음파 처리(1초 켜고 끄기 주기)한 후, 용액을 30분 동안 교반하면서 4℃에서 항온처리하였다. 매 세척 종료 시, 용액을 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 모든 세척으로부터 얻은 상청액을 SDS-PAGE 겔에서 분석하여, EBV 단백질 손실을 평가하였다. (도 1C 참조.) 그 후, IB를 4℃에서 밤새 교반하면서 100 mM NaH2PO4, 10 mM 트리스, 5 mM DTT, 8M 우레아, pH 9.5 완충액에 가용화하였다. 가용성 단백질을 30분 동안 13,000rpm에서 원심분리에 의해 정화한 후, 가용화된 단백질의 pH를 pH 7.0으로 감소시켰다.
가용화된 EBV폴리 단백질을 정제하기 위해, 20 mL의 페닐 세파로스 매트릭스(지이 헬스케어(GE healthcare))를 사용하였다. 단백질 로딩 전에, 페닐 세파로스 컬럼을 1M NaOH로 세척하고, 컬럼 pH를 증류수로 중화한 후, 가용화 완충액(10 mM 트리스, 50 mM NaH2Po4, 5 mM DTT, 0.5 M NaCl, 8 M 우레아 pH 7.0)로 평형화하였다. 150 mL의 샘플을 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 10 컬럼 부피(CV)로 완충액 A에서 완충액 B(0에서 100%)로 세척하였다. (도 1D 참조)
ㆍ 완충액 A(10 mM 트리스, 50 mM NaH2Po4, 0.5 M NaCl, 8 M 우레아 pH 7.0);
ㆍ 완충액 B(10 mM 트리스, 50 mM NaH2Po4, 8 M 우레아 pH 7.0).
완충액 B 농도가 100%에 도달한 후, 컬럼에 결합된 EBV폴리 단백질을 7.5 mM NaOH 및 8M 우레아(3CV)를 함유한 완충액으로 용리시켰다. EBV폴리 단백질-양성 용리액을 총 22 mL로 수집한 후, 1M 트리스 pH 7.5로 완충시켜, 25 mM 트리스 pH 7.5의 최종 농도를 얻었다. (도 1E 참조.) EBV폴리 단백질 pH를 HCl을 사용하여 7.6에서 3.0으로 감소시켰다. 정제된 EBV폴리 단백질을 25 mM 글리신 완충액, pH 3.0에 대해 투석하였다. 투석 후 단백질을 25 mL에서 9 mL로 농축한 후, 무스탕E 막(미국 뉴욕 소재의 팔 코포레이션(PALL Corporation))을 통해 통과시켜, 내독소 오염물을 제거하였다. 모든 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분석하여, EBV폴리 단백질이 박테리아 발현 시스템을 사용하여 성공적으로 발현되고 균질성으로 정제되었음을 증명하였다. (도 1, F 및 G 참조)
실시예 3: 시험관내 EBV폴리 면역원성의 평가
EBV 폴리에피토프 단백질의 면역원성을 결정하기 위해, 6명의 HLA-매핑된 EBV-혈청양성인, 건강한 공여자로부터, 약 6 x 106 PBMC를 37℃에서 1시간 동안 25 μg의 EBV폴리 단백질로 자극하였다. 자극 후 세포를 10% FCS로 보충된 RPMI로 세척하고, 항온처리로 되돌렸다. 세포를 14일 동안 배양하여 T 세포가 확장하게 하였고; 배양물을 2, 5, 8 및 11일차에 RPMI 및 인간 재조합 IL2를 함유하는 배지로 보충하였다.
건강한 혈청양성 공여자로부터의 EBV-특이적 CD8+ T 세포의 시험관내 확장 후, 세포를 4시간 동안 37℃ 및 6.5% CO2에서 FITC, 골지플러그™ 및 골지스톱™(미국 캘리포니아 소재의 BD 바이오사이언스)에 접합된 인간 CD107a 항체의 존재 하에 HLA 일치 펩티드의 0.2 μg/mL로 자극시켰다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, 퍼시픽 블루(Pacific Blue)TM-접합 항-CD4 및 PerCPCy5.5-접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)TM 키트(미국 캘리포니아 소재의 BD 바이오사이언스)를 사용하여 세포를 고정하고, 투과가능하게 하였다. 그 후, 세포를 PE-접합 항 IL-2, APC-접합 항 TNF 및 AF700-접합 항 IFN-γ와 함께 항온처리하여, 세포내 사이토카인 분비를 결정하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조(FlowJo)TM 소프트웨어(미국 오리건 소재의 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company))를 사용하여 데이터를 분석하였다. 따라서, EBV 폴리 단백질로 EBV-혈청양성 공여자 PBMC를 자극한 후, EBV-특이적 CD8+ T 세포의 확장을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 탈과립 마커(CD107a)를 발현하고, ICS에 의해 여러 사이토카인(즉, INFγ, TNF 및 IL2)을 분비하는 상기 확장된 EBV-특이적 CD8+ T 세포의 능력을 평가할 수 있다.
결과
본 실험으로부터 얻은 데이터는, EBV폴리 단백질이, 6명의 공여자 모두로부터, EBV폴리 단백질에 포함된 여러 에피토프에 제한된, EBV-특이적 CD8+ T 세포의 확장을 유도할 수 있었음을 보여준다. 대다수의 확장된 세포가 탈과립화(CD107a) 및 여러 사이토카인(INFγ, TNF 및 IL2)을 분비하는 이들의 기능을 입증하였다. (도 2 참조).
실시예 4: 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스에서 amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신의 면역원성 평가를 위한 실험 디자인의 개략적 표현
EBV에 대한 숙주 면역 반응에 대한 다수의 연구는 B 및 T 세포 면역 반응 모두가 EBV 감염에 대한 보호 및 EBV-관련 질병의 통제에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. 따라서, 체액 및 세포-매개 면역 반응 모두를 유도할 수 있는 백신 제형은 EBV-관련 합병증에 대해 더 나은 보호를 제공할 수 있다. EBV에 대한 강력한 체액 및 세포-매개 면역 반응을 생성하기 위해, 100 μl 부피로 투여량당 EBV gp350(10 μg) 및 EBV폴리 단백질(40 μg)을 양친매성-CpG7909(1.2 nmol) 또는 가용성 CpG7909(1.2 nmol)와 혼합함으로써, 백신 제형을 제조하였다. 100 μL 부피로 투여량당 지질-접합 CpG7909(amphCpG7909)(1.2 nmol) 또는 가용성 CpG7909(1.2 nmol)를 혼합함으로써 아쥬반트-단독 대조군 제형을 제조하였다.
인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스는 마우스 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 데 결핍되어 있으며, 통상적으로 발현되는 인간 HLA 클래스 I 분자의 이식유전자를 함유한다. EBV 백신에 대한 면역원성 반응을 평가하기 위해, 각각의 HLA 이식유전자에 대한 두 그룹의 마우스를 1.2 nmol amphCpG7909 또는 1.2 nmol CpG7909로 제형화된 40 μg의 EBV폴리 및 10 μg의 gp350 단백질을 포함하는 3회 투여량으로 면역화시켰다. 또 다른 두 그룹의 마우스에 1.2 nmol AmpCpG7909 또는 1.2 nmol CpG7909를 3회 투여량으로 주사하여, 위약(아쥬반트-단독 대조군) 그룹으로서 이용하였다. 모든 주사(백신 그룹 n=6 및 대조군 n=4)를 0일차에 꼬리 밑 부분의 각 측부에 50 μl(총 100 μl)를 피하로 투여하였고; 동일한 백신 또는 대조군 제형으로 21일 및 42일차에 부스터 접종하였다. 마우스를 21, 28 및 42일차에 꼬리 채혈하였고, 최종적으로 49일차에 희생시켰으며; 혈액, 비장, 서혜부 림프절 및 액와 림프절을 수집하여 ICS 검정, gp350 ELISpot, ELISA 및 중화 항체 검정을 사용하여 EBV-특이적 체액 및 세포-매개(예를 들어, T 세포) 반응을 평가하였다. (도 3 참조).
실시예 5: 여러 사이토카인을 생산하는 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포를 평가하기 위한 세포내 사이토카인 염색
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 3의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 각각 0.2 μg/mL의 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP"), HLA A2(서열번호 5 "GLC" 및 서열번호 7 "CLG"), HLA A24(서열번호 10 "TYG" 및 서열번호 16 "PYL") 및 HLA B8(서열번호 4 "FLR" 및 서열번호 8 "RAK") 제한된 펩티드로 자극하여, 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에, 시험관내에서 4시간 동안 EBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 결정하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여, 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화 후 유도된 기억 CD8+ T 세포 반응을 평가하기 위해; HLA B35, A2, A24 및 B8 비장 세포를 수확하고, 배양물을 제조하고(7 x 106 비장 세포), 0.2 μg/mL의 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP"), HLA A2(서열번호 5 "GLC" 및 서열번호 7 "CLG"), HLA A24(서열번호 10 "TYG" 및 서열번호 16 "PYL") 및 HLA B8(서열번호 4 "FLR" 및 서열번호 8 "RAK") 제한된 펩티드로 시험관내 자극하였다. 기억 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포를 추가로 확장하기 위해, 세포를 24웰 플레이트에서 10일 동안 37℃, 10% CO2에서 배양하고, 2, 5 및 8일차에 IL-2로 보충하였다. 10일차에, 확장된 T 세포를 에피토프 펩티드 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP"), HLA A2(서열번호 5 "GLC" 및 서열번호 7 "CLG"), HLA A24(서열번호 10 "TYG" 및 서열번호 16 "PYL") 및 HLA B8(서열번호 4 "FLR" 및 서열번호 8 "RAK") 제한된 펩티드로 자극한 후, T 세포 특이성 및 다기능성(polyfunctionality)을 상기한 바와 같이 다중매개변수 ICS 검정을 사용하여 평가하였다.
결과
amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신을 이용한 면역화는, 가용성 CpG7909 또는 아쥬반트 단독 대조군 그룹으로 제형화된 EBV 백신과 생체외 비교하여, HLA B35, A24 및 B8 인간 HLA 형질전환 마우스에서 유의미하게 더 많은 양의 IFNγ-분비, EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. (도 4A 참조). 흥미롭게도, 시험관내 확장된 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 세포들과 유사한 관찰이 기록되었다. IFN-γ를 생산하는 EBV 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 가용성 CpG7909 제형 또는 아쥬반트-단독 대조군 제형으로 제형화된 EBV 백신과 비교하여, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 백신 접종된 HLA B35, A2 및 B8 마우스에서 유의미하게 더 높았다. (도 4B). 다기능성 T 세포는 바이러스 감염을 통제하는 데 중대한 역할을 한다. 따라서, 백신-유도된 EBV-특이적 CD8+ T 세포를 여러 사이토카인을 분비하는 이들의 능력에 대해서도 평가하였다. 특히, 생체외 분석은, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 백신 접종된 HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스가, 가용성 CpG7909 또는 아쥬반트-단독 대조군으로 제형화된 EBV 백신으로 백신 접종된 마우스와 비교하여, 삼중-양성(즉, 3 기능; IFNγ, TNF 및 IL2) 및 이중-양성(즉, 2 기능, IFNγ 및 TNF) EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 더 많은 개체군을 유도하였음을 밝혀내었다. (도 4C 참조). 또한, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신은 HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스에서 EBV-특이적 기억 CD8+ T 세포 반응을 더 높은 빈도로 유도했으며, 이들 세포의 대부분은 3개(IFNγ, TNF 및 IL2) 또는 2개(IFNγ 및 TNF)의 생산이 가능하였다. (도 4D 참조).
실시예 6: 여러 사이토카인을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포를 평가하기 위한 세포내 사이토카인 염색
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 3의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 엡스테인-바르 바이러스(HHV4)(제품 코드: PM-EBV-GP350/GP340; JPT 펩티드 테크놀로지스 게엠바하(JPT Peptide Technologies GmbH), 독일 베를린 소재; 본원에 참조로 포함됨)의 외피 당단백질 GP350/GP340(스위스-프로트 아이디(Swiss-Prot ID): P03200)를 통한 펩티드 스캔(11 aa 중첩을 갖는 15 mers)로부터 유래된 224 펩티드의 풀, gp350 펩믹스TM EBV의 0.2 μg/mL로 자극하여, 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에, 시험관내 4시간 동안, EBV-특이적 CD4+ T 세포 반응을 검출하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포 반응을 결정하기 위해, 상기한 바와 같이 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여 gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포를 확장시켰다. 배양물을 IL2 보충과 함께 10일 동안 성장시켰다. 10일차에 확장된 T 세포를 펩믹스TM EBV로 자극하고, T 세포 특이성을 상기한 바와 같이 다중매개변수 ICS 검정을 사용하여 평가하였다.
결과
amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신을 이용한 면역화는 가용성 CpG7909 또는 아쥬반트 단독 대조군 그룹으로 제형화된 EBV 백신과 비교하여 HLA B35 및 A2 마우스에서 생체외 IFNγ 분비 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 더 높은 비율로 유도한 한편, 가용성 CpG7909로 제형화된 백신은 HLA A24 및 B8 마우스에서 생체외 IFNγ 분비 EBV gp350 특이적 CD4+ T 세포 반응을 더 높은 비율로 유도하였다. (도 5A 참조). 또한, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신은 가용성 CpG7909를 이용한 EBV 백신 제형과 비교하여 HLA B35, A2 및 B8 마우스에서 IFN-γ-생산 EBV-특이적 CD4+ T 세포의 더 큰 확장을 촉발시켰다. 그러나 A24 마우스에서 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신은 IFN-γ 생산 EBV-특이적 CD4+ T 세포의 더 높은 확장을 촉발하였다. (도 5B 참조). 유사한 경향이 여러 사이토카인 검정에서 관찰되었고; amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 HLA B35 및 A2 마우스는 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 마우스와 비교하여, 더 높은 빈도의 gp350-특이적 CD4+ T 세포를 입증하였으나; 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 HLA A24 및 B8 마우스에서 상이한 경향이 관찰되었는데, 이는 amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신과 비교하여 여러 사이토카인을 생산하는 gp350-특이적 CD4+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도했기 때문이다. 흥미롭게도, 총 빈도에는 차이가 있지만, 생체외 여러 사이토카인은 amphCpG7909 또는 CpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 마우스로부터의 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포의 대부분이 삼중 양성(IFNγ, TNF 및 IL2) 또는 이중 양성(IFNγ 및 TNF)임을 밝혀내었다. (도 5C 참조). 추가로, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신은 또한 HLA B35, A2 및 B8 마우스에서 EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포를 더 큰 비율로 유도한 한편, 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신은 HLA B8 마우스에서 더 높은 gp350 기억 CD4+ T 세포를 촉발하였다. 놀랍게도, HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스에서 두 제형 모두로부터 더 큰 비율의 확장된 EBV gp350-특이적 CD4+가 IFN-γ 및 TNF의 두 가지 사이토카인을 분비하는 능력을 입증하였다. (도 5D 참조).
실시예 7: 시험관내 확장 후 EBV gp350-특이적 CD8 + T 세포 반응의 평가
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 3의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 엡스테인-바르 바이러스(HHV4)(제품 코드: PM-EBV-GP350/GP340; JPT 펩티드 테크놀로지스 게엠바하, 독일 베를린 소재; 본원에 참조로 포함됨)의 외피 당단백질 GP350/GP340(스위스-프로트 아이디: P03200)를 통한 펩티드 스캔(11 aa 중첩을 갖는 15 mers)로부터 유래된 224 펩티드의 풀, gp350 펩믹스TM EBV의 0.2 μg/mL로 자극하여, 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에, 시험관내 4시간 동안, EBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 검출하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스로부터 얻은 비장 세포로 gp350-특이적 CD8+ T 세포 분석을 수행하였지만; 검출가능한 수준의 gp350-특이적 CD8+ T 세포는 HLA B35 및 A24 마우스에서만 관찰되었다. 흥미롭게도, 펩믹스TM EBV를 사용한 시험관내 자극은 EBV-amphCpG7909 백신 또는 가용성 CpG7909를 포함하는 백신으로 면역화된 HLA B35 및 A24 마우스로부터 gp350-특이적 CD8+ T 세포의 확장을 초래하였다. (도 6, A 및 B 참조). 그러나, 가용성 CpG7909를 포함하는 EBV 백신 제형은 HLA B35 및 A24 마우스에서 EBV-amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신과 비교하여 gp350-특이적 CD8+ T 세포를 높은 빈도로 유도하였다. 특히, 두 제형 모두 HLA B35 및 A24 마우스에서 3개(IFN-γ, IL2 및 TNF) 또는 2개의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF)을 생산할 수 있는 확장된 gp350-특이적 CD8+ T 세포를 유의미한 백분율로 유도한다. (도 6, C 및 D 참조).
실시예 8: 서혜부 림프절에서 EBV-특이적 CD4 + 및 CD8 + T 세포 반응의 평가
HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스에서 얻은 서혜부 림프절에서 EBV-특이적 면역 반응의 분석을 의도하였으나, 서혜부 림프절 발달은 HLA B35 및 A2 마우스에서만 관찰되었다. 서혜부 림프절에서 면역 반응을 평가하기 위해, 상기한 바와 같이 백신 접종 및 희생 후 49일차에 단일 세포 현탁액을 제조하였다. (도 3의 개략도 참조). 그 후, 세포를 EBV HLA B35 제한 펩티드(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP"), HLA A2(서열번호 5 "GLC" 및 서열번호 7 "CLG") 또는 펩믹스TM EBV로 4시간 동안 시험관내 자극하여 IFN-γ 또는 여러 사이토카인(IFN-γ, TNF 및 IL2)의 조합을 분비하는 이들의 능력을 테스트하였다.
결과
서혜부 림프절 세포로부터, HLA B35 및 A2 마우스 모두에서, amphCpG7909 EBV 백신은 가용성 CpG7909 또는 아쥬반트 단독 대조군으로 제형화된 EBV 백신에 비해 IFN-γ 생산, EBV폴리-특이적, CD8+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도하였다. (도 7, A 및 B 참조) 특히, 가용성 CpG7909-EBV 백신과 비교하여, amphCpG7909-EBV 백신 제형은 여러 사이토카인을 생산할 수 있는 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도하였다. 이들 세포의 대다수는 3개(IFN-γ, TNF 및 IL2) 또는 2개의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF)을 생산하고 있었다. (도 7, C 및 D 참조). amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신은 또한 HLA B35 및 A2 마우스에서 가용성 CpG7909를 포함하는 EBV 백신과 비교하여, IFN-γ를 생산한 gp350-특이적 CD4+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도하였다. (도 7, E 및 F 참조). 또한, 여러 사이토카인(IFN-γ 및 TNF)을 생산한 gp350-특이적 CD4+ T 세포의 빈도는 HLA B35 및 A2 마우스에서 가용성 CpG7909 제형과 비교하여 amphCpG7909를 포함하는 EBV 백신으로 백신 접종된 마우스에서 현저하게 더 높았다. (도 7, G 및 H 참조)
실시예 9: 액와 림프절에서 EBV-특이적 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 평가
HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스로부터 얻은 액와 림프절에서 EBV-특이적 면역 반응의 분석을 의도하였으나, 액와 림프절 발달은 HLA B35 및 A2 마우스에서만 관찰되었다. 액와 림프절에서 면역 반응을 평가하기 위해, 단일 세포 현탁액을 상기한 바와 같이 백신 접종 및 희생 후 49일차에 제조하였다. (도 3의 개략도 참조). 그 후, 세포를 EBV HLA B35 제한 펩티드(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP"), HLA A2(서열번호 5 "GLC" 및 서열번호 7 "CLG") 또는 펩믹스TM EBV로 4시간 동안 시험관내 자극하여, IFN-γ 또는 여러 사이토카인(IFN-γ, TNF 및 IL2)의 조합을 분비하는 이들의 능력을 테스트하였다.
결과
HLA B35 및 A2 마우스 모두에서, amphCpG7909를 포함하는 EBV 백신은 가용성 CpG7909, EBV 백신 또는 아쥬반트-단독 대조군과 비교하여, IFN-γ-생산, EBV폴리-특이적, CD8+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도하였다. (도 8, A 및 B 참조) 특히, amphCpG7909를 포함하는 EBV 백신은 또한, HLA B35 및 A2 마우스에서 2개(IFN-γ 및 TNF) 또는 3개의 사이토카인(IFN-γ, IL2 및 TNF)을 분비하는 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 대다수의 능력을 부스팅하였다. (도 8, C 및 D 참조) 유사하게는, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신은 또한, HLA B35 마우스에서 가용성 CpG7909, EBV 백신 제형과 비교하여, IFN-γ를 생산하는 gp350-특이적 CD4+ T 세포를 더 높은 빈도로 유도하였지만; 검출가능한 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포는 HLA A2 마우스의 액와 림프절에서 관찰되지 않았다. (도 8, E 및 F 참조) 추가로, 3개 또는 2개의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF)을 생산한 gp350-특이적 CD4+ T 세포의 빈도는, 가용성 CpG7909 제형과 비교하여, amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 백신 접종된 HLA B35 마우스에서 현저하게 더 높았다. (도 8G 참조).
종합하면, 상기 결과는 amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신이 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신과 비교하여, 비장, 서혜부 및 액와 림프절에서 강력한 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 및 gp350-특이적 CD4+ T 세포를 유도했음을 나타낸다.
실시예 10: EBV gp350-특이적 항체 분비 B 세포 반응의 평가
인간 HLA B35, A2, A24, B8 형질전환 마우스를 도 3에 개략된 바와 같이 면역화하였다. 희생 시, 비장 세포를 준비한 후, ELISpot 검정을 사용하여 EBV-gp350 특이적 항체를 분비하는 이들의 능력을 평가하였다.
gp350-특이적 항체 분비 혈장 B 세포 반응을 측정하기 위해, PVDF ELISpot 플레이트를 70% 에탄올로 처리하였다. 그 후, 플레이트를 증류수로 5회 세척하고, 100 μL/웰 EBV gp350 단백질(25 μg/mL) 또는 항-IgG 항체(15 μg/mL)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 10% 혈청을 함유하는 DMEM으로 차단하고, 300,000개 세포/웰을, 각각의 마우스로부터 3회로, 첨가한 후, 5% CO2를 갖는 37℃의 가습 항온처리기에서 18시간 동안 항온처리하였다. 세포를 제거하고, 플레이트를 세척하였다. HRP에 접합된 검출 항체 항-IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, 세척하였다. 스트렙타비딘-ALP를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고 BCIP®/NBT(미국 미주리 소재의 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich))를 함유하는 기질 용액으로 발색이 두드러질 때까지 처리하였다. 플레이트를 물로 세척하여 발색을 중단시키고, 플레이트를 밤새 건조를 위해 보관하였다.
기억 B 세포 반응을 측정하기 위해, 24웰 플레이트에서 5일 동안 TLR7/8-아고니스트, R848(레시퀴모드) 및 재조합 마우스 IL-2를 포함하는 혼합물로 비장 세포(2.5 X 104)를 활성화시켰다. ELISpot를 상기한 바와 같이 수행하였다. ELISpot 판독기에서 스팟 개수를 계수하였다.
결과
amphCpG7909 또는 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신을 이용한 HLA B35, A24 및 B8 마우스의 면역화는, 유사한 수준의 gp350-특이적, 항체-분비, 혈장 B 세포를 유도하였지만; HLA A2 형질전환 마우스에서는 유의미한 증가가 관찰되었다. (도 9A 참조). 또한, 기억 B 세포 반응을 휴면 B 세포의 생체외 다클론성 자극에 의해 평가하였다. 혈장 B 세포에서 유의미한 차이가 없었지만, amphCpG7909 백신으로 제형화된 EBV 백신은 EBV-gp350-특이적 기억 B 세포를 더 높은 빈도로 유도하였다. (도 9B 참조)
실시예 11: EBV gp350-특이적 항체 반응의 평가
인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스를 도 3 및 상기한 바와 같이 면역화하였다. 혈액 샘플을 21, 28, 42 및 49일차에 수집하고, 혈청을 분리하여 총 gp350-특이적 면역글로불린(Ig) 반응을 평가하였다.
혈청 총 항-gp350 항체를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하였다. 간략하게는, 면역흡착제 96-웰 플레이트를 50 μL의 재조합 EBV gp350 단백질(포스페이트 완충 식염수에 희석된 gp350 단백질의 2.5 μg/mL)로 코팅하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBST)로 세척한 후, 5% 탈지유로 차단하였다. 연속 희석된 혈청 샘플(21일차 또는 28일차)을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. PBST로 세척한 후, 플레이트를 (총 항체 반응을 결정하기 위해) HRP-접합된 양 항-마우스 Ig 항체와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 이 플레이트를 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액과 함께 10분 동안 항온처리한 후, 1N HCl을 첨가하여 발색을 중단시켰다. ELISA 판독기를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
결과
amphCpG7909로 제형화(amphCpG7909V) 또는 가용성 CpG7909로 제형화(CpG7909V)된 EBV 백신을 이용한 HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스의 면역화는, 아쥬반트-단독 대조군 마우스(amphCpG7909C 또는 CpG7909C)와 비교할 때, 21일차(단일 시동 용량(priming dose), 부스터 투여 전)에 검출가능한 수준의 gp350-특이적 항체 반응을 유도하였지만; 항체 역가는 가용성 CpG7909와 비교하여 amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 HLA A2, A24 및 B8 마우스에서 약간 더 높았다. 두 백신 접종된 그룹 모두에서, 21 및 42일차에 부스터 투여 후, EBV gp350-특이적 항체 역가가 유의미하게 증가하였다(각각 28 및 49일차). amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신을 이용한 면역화는 HLA B35, A2, A24 마우스에서 가용성 CpG7909를 포함하는 EBV 백신과 비교하여 28일차 및 49일차에 더 높은 gp350-특이적 항체 역가를 초래하였지만, HLA B8 마우스에서 특히 28일에 차이가 관찰되지 않았다. 또한, ampCpG7909 또는 가용성 CpG7909로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 마우스에서 42일차에 gp350-특이적 항체 역가의 감소 경향이 있었다. (도 10 참조).
실시예 12: EBV gp350-특이적 항체 동형의 평가
증식하는 헬퍼 T 세포(즉, CD4+ T 세포)는, 두 가지 주요 아형; T-헬퍼 1형 및 T-헬퍼 2형 세포(각각 Th1 및 Th2 세포)로 분화되는 이펙터 T 세포로 발달한다. Th1 세포는 증가된 세포 매개 반응을 야기하며, 주요 이펙터 세포는 대식세포, CD8+ T 세포, IgG B 세포 및 IFN-γ CD4+ T 세포이고, 주요 이펙터 사이토카인은 IFN-γ 및 IL-2이다. 반면에, Th2 세포는 체액성 면역 반응을 야기한다. Th2 면역의 주요 이펙터 세포는 호산구, 호염기구, 비만 세포, B 세포 및 IL-4/IL-5 CD4 T 세포이고; 이들의 이펙터 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 및 IL-25이다. 마우스에서, Th1-의존성 면역글로불린 G(IgG) 서브클래스는 IgG2a, IgG2b 및 IgG3을 포함하는 반면에, Th2 반응은 IgG1의 발현을 자극한다. 따라서, IgG 서브클래스는 근본적 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)의 지표일 수 있다.
따라서, 면역화된 인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스로부터의 혈청(21, 28, 42 및 49일차 혈액 샘플로부터 분리됨)을 ELISA에 의해 항체 동형 역가에 대해 평가하였고, 헬퍼 T 세포 면역 반응의 종류에 대한 이해를 제공한다. 간략하게는, 재조합 gp350으로 코팅된 면역흡착제 96-웰 플레이트를 상기한 바와 같이 처리하고, (항체 동형을 결정하기 위해) HRP-접합된 염소 항-마우스 IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 항체와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, TMB 기질 용액과 함께 10분 동안 항온처리에 이어서 1N HCl을 이용하고, ELISA 판독기를 사용하여 분석하였다.
결과
amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신을 이용한 마우스의 면역화는 HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스에서 28 및 49일차에 검출가능한 수준의 IgA를 유도하였고, 항체 역가는 가용성 CpG7909를 포함하는 EBV 백신 제형 또는 아쥬반트-단독 대조군에 의해 유도된 수준보다 분명히 더 높았다. 유사하게는, 28 및 49일차에 항체 동형 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 역가는 HLA B35, A2, A24 및 B8 마우스에서 가용성 CpG7909 제형 또는 아쥬반트-단독 대조군과 비교하여 amphCpG7909-EBV 백신으로 백신 접종된 마우스에서 더 높았다. 42일차까지 두 백신 그룹 모두에서 항체 동형 역가가 감소하는 경향이 있었다. 가장 풍부한 항체 동형은 IgG2b, IgG1 및 IgG3이었으며, 이는 두 EBV 백신(즉, amphCpG79090 또는 가용성 CpG7909 포함)이 Th1 및 Th2 형 반응을 유도하는 능력을 갖는 것을 나타낸다. (도 11 참조).
실시예 13: EBV-특이적 중화 항체 반응의 평가
인간 HLA B35, A2, A24 및 B8 형질전환 마우스를 도 3 및 상기한 바와 같이 면역화하였다. 21, 28, 42 및 49일차에 수집된 혈액 샘플로부터 분리된 혈청을 모아서 EBV 유도 B 세포 증식 검정을 사용하여 EBV를 중화시키는 이의 능력을 평가하였다.
간략하게는, 모은 혈청 샘플을 56℃에서 30분 동안 열로 불활성화하였다. 그 후, 샘플을 96웰 'U' 바닥 웰 플레이트에서 25 μL 부피로 2배 희석(1:2에서 1:4096 희석)으로, 2회 연속 희석하였다. EBV의 B95-8 단리물(바이러스)을 희석된 혈청 샘플에 25 μL 부피(총 50 μL/웰)로 첨가하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 셀트레이스TM 바이올렛(CellTraceTM Violet)(미국 매사추세츠 소재의 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 표지된 EBV-혈청음성 공여자로부터의 PBMC(50 μL/웰 중 100,000개 세포)를 첨가한 후, 37℃ 및 6.5% CO2에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 세척하고, 37℃ 및 6.5% CO2에서 5일 동안 항온처리하여, EBV 혈청음성 공여자로부터 B 세포의 감염 및 증식을 허용하였다. 5일차에, 세포를 라이브/데드TM 근적외선, APC 항-인간 CD3, PE-cy5 항-인간 CD19로 염색하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
EBV 중화 검정은 amphCpG7909로 제형화된 EBV 백신이 HLA B35, A2 및 A24 마우스에서 가용성 CpG7909 제형 또는 아쥬반트 단독 대조군과 비교하여 21, 28 및 49일차에 더 높은 항-EBV 중화 항체를 명확하게 유도한 반면, 가용성 CpG7909를 이용한 EBV 백신 제형은 HLA B8 마우스에서 더 높은 중화 항체 역가를 유도하였음을 보여주었다. (도 12 참조). 또한, amphCpG7909로 면역화된 마우스에서 유도된 강력한 gp350-특이적 항체-분비 B 세포 반응(도 9), 항-gp350 항체 반응(도 10) 및 다중 gp350-특이적 항체 동형(도 11)은 항-항체 EBV 중화 항체 역가를 중화시키는 것과 상관관계가 있었다.
실시예 14: 인간 HLA B35 형질전환 마우스에서 CpG1018로 제형화된 EBV 백신의 면역원성 평가를 위한 실험적 디자인의 개략적 표현
아쥬반트 CpG1018은 최근 인간 헤프리사브(Heplisav)-B® 백신에 사용하기 위해 미국 FDA에 의해 승인되었고 개발되었으며, 이는 박테리아 및 바이러스 유전 물질을 모방하는 DNA의 합성 형태인 시토신 포스포구아닌(CpG) 모티프로 구성된다. CpG1018은 서열: 5' TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A 3'(서열번호 46)을 갖는 22-mer 올리고데옥시뉴클레오티드이다. CpG1018 아쥬반트는 다양한 병원체에 대한 다양한 전임상 및 임상 평가에서 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 유도하는 것으로 나타났다. CpG1018이 인간 용도로 승인된 후, EBV-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 이의 능력이 결정되었다. EBV에 대한 강력한 체액 및 세포-매개 면역 반응을 생성하기 위해, EBV gp350(10 μg) 및 EBV폴리 단백질(40 μg)을 CpG1018(50 μg)과, 투여량당 100 μl의 부피로 혼합함으로써 백신 제형을 제조하였다. CpG1018(50 μg)을 투여량당 100 μL의 부피로 혼합함으로써 아쥬반트-단독 대조군 제형을 제조하였다.
인간 HLA B35 형질전환 마우스는 마우스 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 데 결함이 있고, 통상적으로 발현되는 인간 HLA 클래스 I 분자의 이식유전자를 함유한다. EBV 백신에 대한 면역원성 반응을 평가하기 위해, 두 그룹의 마우스를, CpG1018 단독(대조군 그룹) 또는 CpG1018로 제형화된, EBV폴리 및 gp350 단백질(EBV 백신)을 포함하는 3회 투여량으로 면역화하였다. 모든 주사(백신 그룹 n= 6 및 대조군 n= 4)를 0일차에 꼬리 밑 부분에서 100 μl를 피하로 투여하였고; 동일한 백신 또는 대조군 제형으로 21일 및 42일차에 부스터 접종하였다. 마우스를 21, 28 및 42일차에 꼬리 채혈하였고, 최종적으로 49일차에 희생시켰으며; 혈액 및 비장을 수집하여, ICS 검정, gp350 ELISpot, ELISA 및 중화 항체 검정을 사용하여 EBV-특이적 체액 및 세포-매개(예를 들어, T 세포) 반응을 평가하였다. (도 13 참조).
실시예 15: 여러 사이토카인을 생산하는 EBV폴리-특이적 CD8 + T 세포를 평가하기 위한 세포내 사이토카인 염색
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 13의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35, 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 각각 0.2 μg/mL의 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP") 제한된 펩티드로 자극하여, 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에, 시험관내에서 4시간 동안 EBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 결정하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
CpG1018로 제형화된 EBV 백신으로 면역화 후 유도된 기억 CD8+ T 세포 반응을 평가하기 위해; HLA B35 비장 세포를 수확하고, 배양물을 제조하고(7 x 106 비장 세포) 0.2 μg/mL의 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP") 제한된 펩티드로 시험관내 자극하였다. 기억 EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포를 추가로 확장하기 위해, 세포를 24웰 플레이트에서 10일 동안 37℃, 10% CO2에서 배양하고, 2, 5 및 8일차에 IL-2로 보충하였다. 10일차에, 확장된 T 세포를 에피토프 펩티드 HLA B35(즉, 서열번호 1 "HPV" 및 서열번호 11 "LPEP") 제한된 펩티드로 자극한 후, T 세포 특이성 및 다기능성을 상기한 바와 같이 다중매개변수 ICS 검정을 사용하여 평가하였다.
결과
CpG1018로 제형화된 EBV 백신을 이용한 면역화는, 아쥬반트 단독 대조군 그룹과 비교하여, HLA B35 마우스에서 유의미하게 더 많은 양의 IFNγ-분비, EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. (도 14A 참조). 다기능성 T 세포는 바이러스 감염을 통제하는 데 중대한 역할을 한다. 따라서, 백신-유도된 EBV-특이적 CD8+ T 세포를 여러 사이토카인을 분비하는 이들의 능력에 대해서도 평가하였다. 특히, 생체외 분석은, CpG1018로 제형화된 EBV 백신으로 백신 접종된 HLA B35 마우스가, CpG1018 단독으로 처리된 마우스와 비교하여, 이중-양성(즉, 2 기능; IFNγ 및 TNF) EBV폴리-특이적 CD8+ T 세포의 더 많은 개체군을 유도하였음을 밝혀내었다. (도 14B 참조). 추가로, CpG1018로 제형화된 EBV 백신은 또한 EBV-특이적 기억 CD8+ T 세포 반응을 더 높은 빈도로 유도했으며, 이들 세포의 대부분은 3개(IFNγ, TNF 및 IL2) 또는 2개(IFNγ 및 TNF 또는 TNF 및 IL2)의 생산이 가능하였다. (도 14, C 및 D 참조).
실시예 16: 여러 사이토카인을 생산하는 EBV gp350-특이적 CD4 + T 세포를 평가하기 위한 세포내 사이토카인 염색
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 13의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 엡스테인-바르 바이러스(HHV4)(제품 코드: PM-EBV-GP350/GP340; JPT 펩티드 테크놀로지스 게엠바하, 독일 베를린 소재; 본원에 참조로 포함됨)의 외피 당단백질 GP350/GP340(스위스-프로트 아이디: P03200)를 통한 펩티드 스캔(11 aa 중첩을 갖는 15 mers)로부터 유래된 224 펩티드의 풀, gp350 펩믹스TM EBV의 0.2 μg/mL로 자극하여, 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에 시험관내에서 EBV-특이적 CD4+ T 세포 반응을 검출하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포 반응을 결정하기 위해, 상기한 바와 같이 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 펩믹스TM EBV로 시험관내 자극하여, gp350-특이적 CD4+ T 세포를 확장시켰다. 배양물을 IL2 보충과 함께 10일 동안 마찬가지로 성장시켰다. 10일차에 확장된 T 세포를 펩믹스TM EBV로 자극하고, T 세포 특이성을 다중매개변수 ICS 검정을 사용하여 평가하였다.
결과
CpG1018로 제형화된 EBV 백신을 이용한 면역화는, 아쥬반트 단독 대조군 그룹과 비교하여, HLA B35에서 생체외 IFNγ 분비 EBV gp350-특이적 CD4+ T 세포 반응을 더 높은 비율로 유도하였다. (도 15A 참조). 유사한 경향이 여러 사이토카인 검정에서 관찰되었으며; CpG1018로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 HLA B35 마우스는, CpG1018 단독으로 처리된 마우스와 비교하여, 더 높은 빈도로 gp350-특이적 CD4+ T 세포가 여러 사이토카인을 생산함을 입증하였고, 이들 세포의 대부분이 이중 양성이었고, 삼중 양성(IFNγ, TNF 및 IL2) 또는 이중 양성(IFNγ 및 TNF)이었다. (도 15B 참조). 추가로 CpG1018로 제형화된 EBV 백신은 또한, EBV gp350-특이적 기억 CD4+ T 세포를 더 큰 비율로 유도하였으며, 확장된 EBV gp350-특이적 CD4+의 대다수가 3개의 사이토카인(IFN-γ, IL2 및 TNF) 또는 2개의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF 또는 TNF 및 IL2)을 분비하는 이들의 능력을 입증하였다. (도 15, C 및 D 참조).
실시예 17: 시험관내 확장 후 EBV gp350-특이적 CD8 + T 세포 반응의 평가
본원에 기재된 바와 같이(또한 도 13의 개략도 참조), 면역화된 인간 HLA B35, 형질전환 마우스를 49일차에 희생시키고, 단일 세포 현탁액을 비장 세포로부터 제조하였다. 이들 세포를 엡스테인-바르 바이러스(HHV4)(제품 코드: PM-EBV-GP350/GP340; JPT 펩티드 테크놀로지스 게엠바하, 독일 베를린 소재; 본원에 참조로 포함됨)의 외피 당단백질 GP350/GP340(스위스-프로트 아이디: P03200)를 통한 펩티드 스캔(11 aa 중첩을 갖는 15 mers)로부터 유래된 224 펩티드의 풀, gp350 펩믹스TM EBV의 0.2 μg/mL로 자극하였다. 세포를 IL2의 존재 하에 10일 동안 배양하였다. EBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 검출하기 위해, 세포를 5시간 동안 골지플러그TM 및 골지스톱TM의 존재 하에, 시험관내에서 4시간 동안 EBV gp350 펩믹스로 자극하였다. 세포를 2회 세척한 후, 라이브/데드TM 근적외선, FITC-접합 항-CD4 및 PerCP5.5 접합 항-CD8과 함께 항온처리하였다. BD 사이토픽스/사이토펌TM 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과가능하게 한 후, PE-접합 항-IFN-γ, PE-Cy7 접합 항-TNF 및 APC 접합 항-IL2 PE와 함께 항온처리하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
특히, 펩믹스™ EBV를 이용한 시험관내 자극은 CpG1018 단독으로 처리된 마우스와 비교하여, CpG1018로 제형화된 EBV 백신으로 면역화된 HLA B35 마우스로부터 gp350-특이적 CD8+ T 세포를 생산하는 IFNγ의 유의미하게 더 높은 확장을 초래하였다. 특히, 유의미한 백분율의 확장된 gp350-특이적 CD8+ T 세포는 3개(IFN-γ, IL2 및 TNF) 또는 2개의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF)을 생산할 수 있다. (도 16, A 및 B 참조)
실시예 18: 배 중심(GC) B 세포, T FH 세포 및 EBV gp350-특이적 항체 분비 B 세포 반응 평가
인간 HLA B35 형질전환 마우스를 도 13에 개략된 바와 같이 면역화하였다. 희생 시, 비장 세포를 준비한 후, ICS를 사용해 GC B 세포, TFH 세포 반응 및 ELISpot 검정을 사용하여 EBV gp350-특이적 항체 분비 혈장, 및 기억 B 세포에 대해 평가하였다.
GC B 세포 반응을 평가하기 위해 비장 세포를 PE 접합 항-B220, FITC 접합 항-GL7 및 APC 접합 항-CD95로 염색하였다.
TFH 세포 반응을 평가하기 위해 비장 세포를 PerCP 접합 항-CD8, BV786 접합 항-CD4 및 CxCR5 및 PD-1 표면 마커로 염색하였다. 세포를 BD FACSCanto II에서 획득하고, 플로우조 소프트웨어(트리 스타(Tree Star))를 사용하여 데이터를 분석하였다.
생체외 gp350-특이적 항체 분비 세포를 측정하기 위해, PVDF ELISpot 플레이트를 70% 에탄올로 처리하였다. 그 후, 플레이트를 증류수로 5회 세척하고, 100 μL/웰 EBV gp350 단백질(25 μg/mL) 또는 항-IgG 항체(15 μg/mL)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 10% 혈청을 함유하는 DMEM으로 차단하고, 300,000개 세포/웰을, 각 마우스로부터 3회로 첨가한 후, 5% CO2를 갖는 37℃의 가습 항온처리기에서 18시간 동안 항온처리하였다. 세포를 제거하고, 플레이트를 세척하였다. HRP에 접합된 검출 항체 항-IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, 세척하였다. 스트렙타비딘-ALP를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고, BCIP®/NBT(미국 미주리 소재의 시그마 알드리치)를 함유하는 기질 용액으로 발색이 두드러질 때까지 처리하였다. 플레이트를 물로 세척하여 발색을 중단시키고, 플레이트를 밤새 건조를 위해 보관하였다.
기억 B 세포 반응을 측정하기 위해, 24웰 플레이트에서 5일 동안 TLR7/8-아고니스트, R848(레시퀴모드) 및 재조합 마우스 IL-2를 포함하는 혼합물로 비장 세포(2.5 X 104)를 활성화시켰다. ELISpot를 상기한 바와 같이 수행하였다. ELISpot 판독기에서 스팟 개수를 계수하였다.
결과
비장에서 GC B 및 TFH 세포 반응의 평가는 CpG1018로 제형화된 EBV 백신이 CpG1018 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 GC B 및 TFH 세포 반응을 유의미하게 더 높은 빈도로 유도하였음을 나타내었다. (도 17, A 및 B)
CpG1018로 제형화된 EBV 백신을 이용한 HLA B35 마우스의 면역화는 위약 그룹 마우스와 비교하여 gp350-특이적, 항체-분비, 혈장 및 기억 B 세포 반응을 유의미하게 더 높은 수준으로 유도하였다. (도 17, C 및 D)
실시예 19: EBV gp350-특이적 항체 동형의 평가
면역화된 인간 HLA B35 형질전환 마우스로부터의 혈청(21, 28, 42 및 49일차 혈액 샘플로부터 분리됨)을 ELISA에 의해 항체 동형 역가에 대해 평가하고, 헬퍼 T 세포 면역 반응의 종류에 대한 이해를 제공한다. 간략하게는, 재조합 gp350으로 코팅된 면역흡착제 96-웰 플레이트를 상기한 바와 같이 처리하고, (항체 동형을 결정하기 위해) HRP-접합된 염소 항-마우스 IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 항체와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, TMB 기질 용액과 함께 10분 동안 항온처리에 이어서 1N HCl을 이용하고, ELISA 판독기를 사용하여 분석하였다.
결과
CpG108로 제형화된 EBV 백신을 이용한 마우스의 면역화는 49일차에 검출가능한 수준의 IgA를 유도하였다. 또한, 21일차 및 42일차에 부스터 투여 후, 28일차 및 49일차에 항체 동형 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 역가는 CpG1018-EBV 백신으로 백신 접종된 마우스에서 위약 그룹과 비교하여 더 높았다. 가장 풍부한 항체 동형은 IgG2b, IgG1 및 IgG3이었고, 이는 CpG1018을 갖는 EBV 백신이 Th1 및 Th2 형 반응을 유도하는 능력을 갖는 것을 나타낸다. (도 18 참조).
실시예 20: EBV-특이적 중화 항체 반응의 평가
인간 HLA B35 형질전환 마우스를 도 13 및 상기한 바와 같이 면역화하였다. 21, 28, 42 및 49일차에 수집된 혈액 샘플로부터 분리된 혈청을 모아서 EBV 유도된 B 세포 증식 검정을 사용하여 EBV를 중화시키는 이의 능력을 평가하였다.
간략하게는, 모은 혈청 샘플을 56℃에서 30분 동안 열로 불활성화하였다. 그 후, 샘플을 96웰 'U' 바닥 웰 플레이트에서 25 μL 부피로 2배 희석(1:2에서 1:4096 희석)으로, 2회 연속 희석하였다. EBV의 B95-8 단리물(바이러스)을 희석된 혈청 샘플에 25 μL 부피(총 50 μL/웰)로 첨가하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 셀트레이스TM 바이올렛(미국 매사추세츠 소재의 서모 피셔 사이언티픽)으로 표지된 EBV-혈청음성 공여자로부터의 PBMC(50 μL/웰 중 100,000개 세포)를 첨가한 후, 37℃ 및 6.5% CO2에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 세척하고, 37℃ 및 6.5% CO2에서 5일 동안 항온처리하여, EBV 혈청음성 공여자로부터 B 세포의 감염 및 증식을 허용하였다. 5일차에, 세포를 라이브/데드TM 근적외선, APC 항-인간 CD3, PE-cy5 항-인간 CD19로 염색하였다. BD FACSCantoTM II에서 세포를 획득하고, 플로우조TM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
EBV 중화 검정은 CpG1018로 제형화된 EBV 백신이 아쥬반트 단독 대조군과 비교하여 21, 28 및 49일차에 분명히 더 높은 항-EBV-중화 항체를 유도하였음을 보여주었다. 그러나, 21 및 42일차의 부스터 투여 후, 28 및 49일차에 CpG1018로 제형화된 EBV 백신은 EBV 중화 항체 역가의 각각 4배 및 32배 증가를 유도하였다 (도 19, A 및 B 참조).
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 서열 수탁 번호는 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 것 이들의 전문이 참조로 본원에 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선할 것이다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE COUNCIL OF THE QUEENSLAND INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH <120> HERPESVIRUS POLYEPITOPE VACCINES <130> QAH-02425 <140> <141> <150> PCT/IB2021/000689 <151> 2021-10-06 <150> 63/088,766 <151> 2020-10-07 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 1 His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 2 Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Ala Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 3 Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 4 Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 5 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu Ala Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 6 Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 7 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Leu Thr Met Val Ala 65 70 75 80 Asp Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Arg Ala Thr Ile Gly Thr Ala 85 90 95 Met Tyr Lys Ala Asp Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Lys Leu 100 105 110 Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr Lys Ile Glu Asp 115 120 125 Pro Pro Phe Asn Ser Leu Ala Asp Val Ser Phe Ile Glu Phe Val Gly 130 135 140 Trp Lys Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe Met Gly Val Lys 145 150 155 160 Gln Asn Gly Ala Leu Ala Ile Asn Thr Phe Arg Pro Tyr Leu Phe Trp 165 170 175 Leu Ala Ala Ile Arg Ala Tyr Ser Ser Trp Met Tyr Ser Tyr Ala Asp 180 185 190 Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Ala Asp Arg Arg Ile Tyr Asp 195 200 205 Leu Ile Glu Leu Arg Val Glu Ile Thr Pro Tyr Lys Pro Thr Trp Ala 210 215 220 Asp 225 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 22 catccagttg gtgaagcaga ctactttgaa taccgt 36 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 23 tcctcttgca gctcgtgtcc gctgagcaag attgcagat 39 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 24 cgtccgccga tcttcatccg tcgtttgaaa 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 25 tttctgcgcg gtcgcgcgta cggcttgcgt 30 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 26 ggtctgtgca ccctggtggc catgctggcg gac 33 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 27 gaggagtgtg atagcgagct cgaaatcaaa cgctataag 39 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 28 tgcctgggtg gccttctgac gatggttgct gac 33 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 29 cgtgcgaagt ttaagcaact gctgcgc 27 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 30 gccaccattg gtacggcaat gtataaagct gac 33 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 31 acctatggcc cggttttcat gtgtctgaag 30 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 32 ctgccggagc cgctgccgca gggtcaactg accgcataca ag 42 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 33 attgaggacc cgccgttcaa tagcctggcg gac 33 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 34 gtgagcttca ttgaatttgt cggctggaaa 30 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 35 gaagagaatt tgctggactt cgtccgcttc atgggcgtga aa 42 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 36 cagaacggtg ctctggcaat caacacgttt cgt 33 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 37 ccgtacctgt tctggctggc ggccattcgt 30 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 38 gcgtatagca gctggatgta cagctatgcc gat 33 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 39 cgtgtccgcg cgtacaccta ctccaaagcg gat 33 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 40 cgtcgtatct acgatctgat cgagctgcgt 30 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 41 gttgaaatta ccccgtataa acctacttgg gcggat 36 <210> 42 <211> 678 <212> DNA <213> Epstein-Barr virus <400> 42 atgcatccag ttggtgaagc agactacttt gaataccgtt cctcttgcag ctcgtgtccg 60 ctgagcaaga ttgcagatcg tccgccgatc ttcatccgtc gtttgaaatt tctgcgcggt 120 cgcgcgtacg gcttgcgtgg tctgtgcacc ctggtggcca tgctggcgga cgaggagtgt 180 gatagcgagc tcgaaatcaa acgctataag tgcctgggtg gccttctgac gatggttgct 240 gaccgtgcga agtttaagca actgctgcgc gccaccattg gtacggcaat gtataaagct 300 gacacctatg gcccggtttt catgtgtctg aagctgccgg agccgctgcc gcagggtcaa 360 ctgaccgcat acaagattga ggacccgccg ttcaatagcc tggcggacgt gagcttcatt 420 gaatttgtcg gctggaaaga agagaatttg ctggacttcg tccgcttcat gggcgtgaaa 480 cagaacggtg ctctggcaat caacacgttt cgtccgtacc tgttctggct ggcggccatt 540 cgtgcgtata gcagctggat gtacagctat gccgatcgtg tccgcgcgta cacctactcc 600 aaagcggatc gtcgtatcta cgatctgatc gagctgcgtg ttgaaattac cccgtataaa 660 cctacttggg cggattaa 678 <210> 43 <211> 886 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile 1 5 10 15 His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu 20 25 30 Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val 35 40 45 Thr Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp 50 55 60 Phe Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu 85 90 95 Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro 100 105 110 Ile Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val 115 120 125 Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala 130 135 140 Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile 145 150 155 160 Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala 165 170 175 Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln 180 185 190 Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp 195 200 205 Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly 210 215 220 Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro 225 230 235 240 Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro 245 250 255 Gly Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser 260 265 270 Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn 275 280 285 Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val 290 295 300 Phe Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr 305 310 315 320 Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val 325 330 335 Thr Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp 340 345 350 Ala Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu 355 360 365 Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala 370 375 380 Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro 385 390 395 400 Lys Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr 405 410 415 His Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro 420 425 430 Thr Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu 435 440 445 Pro Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr 450 455 460 Gly Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly 465 470 475 480 Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp 485 490 495 Asn Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro 500 505 510 Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr 515 520 525 Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro 530 535 540 Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser 545 550 555 560 Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys 565 570 575 Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser 580 585 590 Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr 595 600 605 Pro Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gln Ala Asn 610 615 620 Ala Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr 625 630 635 640 Ser Gln Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gln His Asn 645 650 655 Ile Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn 660 665 670 Pro Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met 675 680 685 Pro Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr Gln 690 695 700 Val Thr Pro Ala Ser Ile Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro 705 710 715 720 Ala Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gln Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser 725 730 735 Ser Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro 740 745 750 Pro Gln Asn Ala Thr Ser Pro Gln Ala Pro Ser Gly Gln Lys Thr Ala 755 760 765 Val Pro Thr Val Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly 770 775 780 Gly Lys His Thr Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr 785 790 795 800 Thr Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg Tyr Asn Ala 805 810 815 Thr Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp 820 825 830 Thr Phe Thr Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Gln Ala Thr Val Pro Val 835 840 845 Pro Pro Thr Ser Gln Pro Arg Phe Ser Asn Leu Ser Asp Cys Ala Phe 850 855 860 Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser His Thr Tyr Thr Thr Pro Pro Tyr Asp 865 870 875 880 Asp Ala Glu Thr Tyr Val 885 <210> 44 <211> 2661 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 atggaggcag ccttgcttgt gtgtcagtac accatccaga gcctgatcca tctcacgggt 60 gaagatcctg gttttttcaa tgttgagatt ccggaattcc cattttaccc cacatgcaat 120 gtttgcacgg cagatgtcaa tgtaactatc aatttcgatg tcgggggcaa aaagcatcaa 180 cttgatcttg actttggcca gctgacaccc catacgaagg ctgtctacca acctcgaggt 240 gcatttggtg gctcagaaaa tgccaccaat ctctttctac tggagctcct tggtgcagga 300 gaattggctc taactatgcg gtctaagaag cttccaatta acgtcaccac cggagaggag 360 caacaagtaa gcctggaatc tgtagatgtc tactttcaag atgtgtttgg aaccatgtgg 420 tgccaccatg cagaaatgca aaaccccgtg tacctgatac cagaaacagt gccatacata 480 aagtgggata actgtaattc taccaatata acggcagtag tgagggcaca ggggctggat 540 gtcacgctac ccttaagttt gccaacgtca gctcaagact cgaatttcag cgtaaaaaca 600 gaaatgctcg gtaatgagat agatattgag tgtattatgg aggatggcga aatttcacaa 660 gttctgcccg gagacaacaa atttaacatc acctgcagtg gatacgagag ccatgttccc 720 agcggcggaa ttctcacatc aacgagtccc gtggccaccc caatacctgg tacagggtat 780 gcatacagcc tgcgtctgac accacgtcca gtgtcacgat ttcttggcaa taacagtatc 840 ctgtacgtgt tttactctgg gaatggaccg aaggcgagcg ggggagatta ctgcattcag 900 tccaacattg tgttctctga tgagattcca gcttcacagg acatgccgac aaacaccaca 960 gacatcacat atgtgggtga caatgctacc tattcagtgc caatggtcac ttctgaggac 1020 gcaaactcgc caaatgttac agtgactgcc ttttgggcct ggccaaacaa cactgaaact 1080 gactttaagt gcaaatggac tctcacctcg gggacacctt cgggttgtga aaatatttct 1140 ggtgcatttg cgagcaatcg gacatttgac attactgtct cgggtcttgg cacggccccc 1200 aagacactca ttatcacacg aacggctacc aatgccacca caacaaccca caaggttata 1260 ttctccaagg cacccgagag caccaccacc tcccctacct tgaatacaac tggatttgct 1320 gatcccaata caacgacagg tctacccagc tctactcacg tgcctaccaa cctcaccgca 1380 cctgcaagca caggccccac tgtatccacc gcggatgtca ccagcccaac accagccggc 1440 acaacgtcag gcgcatcacc ggtgacacca agtccatctc catgggacaa cggcacagaa 1500 agtaaggccc ccgacatgac cagctccacc tcaccagtga ctaccccaac cccaaatgcc 1560 accagcccca ccccagcagt gactacccca accccaaatg ccaccagccc caccccagca 1620 gtgactaccc caaccccaaa tgccaccagc cccaccttgg gaaaaacaag tcctacctca 1680 gcagtgacta ccccaacccc aaatgccacc agccccacct tgggaaaaac aagccccacc 1740 tcagcagtga ctaccccaac cccaaatgcc accagcccca ccttgggaaa aacaagcccc 1800 acctcagcag tgactacccc aaccccaaat gccaccggcc ctactgtggg agaaacaagt 1860 ccacaggcaa atgccaccaa ccacacctta ggaggaacaa gtcccacccc agtagttacc 1920 agccaaccaa aaaatgcaac cagtgctgtt accacaggcc aacataacat aacttcaagt 1980 tcaacctctt ccatgtcact gagacccagt tcaaacccag agacactcag cccctccacc 2040 agtgacaatt caacgtcaca tatgccttta ctaacctccg ctcacccaac aggtggtgaa 2100 aatataacac aggtgacacc agcctctatc agcacacatc atgtgtccac cagttcgcca 2160 gcaccccgcc caggcaccac cagccaagcg tcaggccctg gaaacagttc cacatccaca 2220 aaaccggggg aggttaatgt caccaaaggc acgccccccc aaaatgcaac gtcgccccag 2280 gcccccagtg gccaaaagac ggcggttccc acggtcacct caacaggtgg aaaggccaat 2340 tctaccaccg gtggaaagca caccacagga catggagccc ggacaagtac agagcccacc 2400 acagattacg gcggtgattc aactacgcca agaccgagat acaatgcgac cacctatcta 2460 cctcccagca cttctagcaa actgcggccc cgctggactt ttacgagccc accggttacc 2520 acagcccaag ccaccgtgcc agtcccgcca acgtcccagc ccagattctc aaacctctcc 2580 gactgcgcct ttaggcgtaa cttgtctaca tcccatacct acaccacccc accatatgat 2640 gacgccgaga cctatgtata a 2661 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 47 Leu Pro Glu Pro 1

Claims (76)

  1. 헤르페스바이러스 항원으로부터의 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 각각의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드로서,
    폴리에피토프 단백질이 상기 복수의 CTL 에피토프 중 적어도 2개 사이에 프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하고,
    폴리에피토프 단백질이 외인성 폴리펩티드로서 대상체에게 투여 시, CTL 반응을 유도할 수 있고,
    폴리펩티드가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 면역원성 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열이 AD, K 및/또는 R을 포함하는, 면역원성 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 면역원성 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는, 면역원성 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    에피토프의 각각이 HLA A*03, HLA A11, HLA A*0201, HLA A*1101, HLA A*2301, HLA A*3002, HLA B27, HLA B35.08/B35.01, HLA B*44:0, HLA B57*03, HLA B*0702, HLA B*0801, HLA B*1501, HLA B*3501, HLA B*3508, HLA B*4001, HLA B*4402, HLA B*4402, HLA B*4403, HLA B*4405, HLA B*5301, HLA B*5701 또는 HLA B*5801로부터 선택되는 HLA 클래스 I 특이성 중 어느 하나에 의해 제한되는, 면역원성 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서,
    에피토프가 엡스테인-바르 바이러스(EBV) 항원 EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2, LMP2a, BMLF1, BZLF1, 또는 BRLF1 중 어느 하나로부터 유래되는, 면역원성 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 면역원성 폴리펩티드를 포함하고, 하나 이상의 면역원성 당단백질, 또는 이의 단편을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    면역원성 당단백질이 헤르페스바이러스로부터 유래되는, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    면역원성 당단백질이 EBV로부터 유래되는, 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    면역원성 당단백질이 당단백질 350(gp350), 당단백질 B(gB), 당단백질 H(gH), 당단백질(gL), gHgL 복합체, 당단백질 42(gp42), 이들의 임의의 단편 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    면역원성 당단백질이 gp350 또는 이의 임의의 단편을 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    아쥬반트가 톨-유사 수용체(TLR) 아고니스트, 양이온성 항균 펩티드(CAMP), 아쥬반트 65, α-GalCer, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 포스페이트, β-글루칸 펩티드, CpG DNA, GPI-0100, 지질 A, 일인산화 지질 A(MPL), 리포다당류, 리포반트(Lipovant), 몬타니드(Montanide), N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, Pam3CSK4, 퀼 A(quil A), 또는 트레할로스 디마이콜레이트 중 적어도 하나를 포함하는, 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    아쥬반트가 TLR9 아고니스트를 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    아쥬반트가 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 포함하는, 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    아쥬반트가 CpG ODN인, 약학 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 양친매성 CpG ODN인, 약학 조성물.
  19. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    gp350을 포함하고, CpG ODN 아쥬반트를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  20. 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는, 다가 백신.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는, 단리된 핵산.
  22. 제21항에 있어서,
    서열번호 22-41로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  23. 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 제21항 또는 제22항의 단리된 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  24. 제23항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  25. 실질적으로 비-응집 형태로 면역원성 폴리펩티드를 유지하는 조건 하에서 면역원성 폴리펩티드를 정제하기 위한 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 면역원성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법.
  26. i. 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드가 서열번호 1 및 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 면역원성 폴리펩티드;
    ii. 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질; 및
    iii. 적어도 하나의 아쥬반트
    를 포함하는, 헤르페스바이러스에 대해 대상체에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 예방 또는 치료 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 12-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 조성물.
  28. 제26항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는, 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드의 에피토프의 각각이 HLA A*03, HLA A11, HLA A*0201, HLA A*1101, HLA A*2301, HLA A*3002, HLA B27, HLA B35.08/B35.01, HLA B*44:0, HLA B57*03, HLA B*0702, HLA B*0801, HLA B*1501, HLA B*3501, HLA B*3508, HLA B*4001, HLA B*4402, HLA B*4402, HLA B*4403, HLA B*4405, HLA B*5301, HLA B*5701 또는 HLA B*5801로부터 선택되는 HLA 클래스 I 특이성 중 어느 하나에 의해 제한되는, 조성물.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드의 에피토프의 각각이 EBV 항원 EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2, LMP2a, BMLF1, BZLF1, 또는 BRLF1 중 어느 하나로부터 유래되는, 조성물.
  32. 제26항에 있어서,
    당단백질이 EBV로부터 유래되는, 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  34. 제26항에 있어서,
    아쥬반트가 TLR 아고니스트를 포함하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서,
    TLR 아고니스트가 ODN을 포함하는, 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    아쥬반트가 CpG ODN인, 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    아쥬반트가 지질에 접합된 CpG ODN인, 조성물.
  38. i. 서열번호 21에 제시된 면역원성 폴리펩티드;
    ii. 적어도 하나의 EBV 당단백질; 및
    iii. 적어도 하나의 아쥬반트
    를 포함하는, 다가 EBV 백신.
  39. 제38항에 있어서,
    EBV 당단백질이 gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나로부터 선택되는, 다가 EBV 백신.
  40. 제38항에 있어서,
    EBV 당단백질이 gp350 또는 이의 단편인, 다가 EBV 백신.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 TLR 아고니스트를 포함하는, 다가 EBV 백신.
  42. 제41항에 있어서,
    아쥬반트가 CpG ODN인, 다가 EBV 백신.
  43. 제42항에 있어서,
    아쥬반트가 지질에 접합된 CpG ODN인, 다가 EBV 백신.
  44. 헤르페스바이러스 감염에 대한 예방적 또는 치료적 치료를 생성하기 위한 방법으로서,
    상기 방법이 단리된 면역원성 폴리펩티드, 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질, TLR 아고니스트를 포함하는 적어도 하나의 아쥬반트 및 약학적으로 허용가능한 부형제를, 대상체에게 투여하기에 적합한 제형으로 조합하는 단계를 포함하고;
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 1 및 11에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 22-41에 제시된 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 것인, 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 22-41에 제시된 핵산 서열의 각각을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 것인, 방법.
  47. 면역원성 폴리펩티드가 서열번호 42에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 것인, 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤르페스바이러스 당단백질이 EBV로부터 유래된 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    헤르페스바이러스 당단백질이 gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 TLR9 아고니스트를 포함하는 것인, 방법.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 ODN을 포함하는 것인, 방법.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 CpG ODN인, 방법.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 지질에 접합된 CpG ODN인, 방법.
  55. i. 복수의 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드가 서열번호 1 및 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 면역원성 폴리펩티드;
    ii. 적어도 하나의 헤르페스바이러스 당단백질; 및
    iii. 아쥬반트
    를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 헤르페스바이러스 감염을 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위한 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  57. 제55항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는 것인, 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 폴리펩티드가 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    에피토프의 각각이 HLA A*03, HLA A11, HLA A*0201, HLA A*1101, HLA A*2301, HLA A*3002, HLA B27, HLA B35.08/B35.01, HLA B*44:0, HLA B57*03, HLA B*0702, HLA B*0801, HLA B*1501, HLA B*3501, HLA B*3508, HLA B*4001, HLA B*4402, HLA B*4402, HLA B*4403, HLA B*4405, HLA B*5301, HLA B*5701 또는 HLA B*5801로부터 선택되는 HLA 클래스 I 특이성 중 어느 하나에 의해 제한되는 것인, 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    에피토프가 EBV 항원 EBNA1, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP2, LMP2a, BMLF1, BZLF1, 또는 BRLF1 중 어느 하나로부터 유래된 것인, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    20-50 μg의 면역원성 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    40 μg의 면역원성 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    당단백질이 gp350, gB, gH, gL, gHgL 복합체, gp42, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 방법.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    당단백질이 gp350, 또는 이의 단편인, 방법.
  65. 제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 TLR 아고니스트를 포함하는 것인, 방법.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 포함하는 것인, 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 CpG ODN인, 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트가 지질에 접합된 CpG ODN인, 방법.
  69. CTL을 포함하는 샘플을, 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 헤르페스바이러스-특이적 CTL의 증식을 유도하는 방법.
  70. 제69항에 있어서,
    샘플을, 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나, 또는 이의 조합을 포함하는 펩티드의 풀(pool)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제69항에 있어서,
    샘플을, 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는 펩티드의 풀과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제69항에 있어서,
    CTL을 포함하는 샘플을, 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 제시하는 항원-제시 세포(APC)와 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    APC가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열 중 적어도 하나, 또는 이의 조합을 포함하는 복수의 펩티드를 제시하는 것인, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    APC가 서열번호 1-20에 제시된 CTL 에피토프 아미노산 서열의 각각을 포함하는 복수의 펩티드를 제시하는 것인, 방법.
  75. 클래스 I MHC 상에 제시된, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 항원-제시 세포(APC).
  76. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드, 또는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을, 항원-제시 세포와 항온처리하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 EBV 펩티드를 제시하는 APC를 제조하는 방법.
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