CN1132931C - 一种产红色素的海洋细菌及利用这种细菌生产红色素的方法 - Google Patents

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本发明提供了一种产红色素的海洋细菌，其保藏号为CGMCC NO.0527。本发明还提供了一种生产天然红色素的方法，包括：培养权利要求1所述的海洋细菌；和从培养物中提取红色素的步骤。本发明还提供了一种红色素。

Description

一种产红色素的海洋细菌及利用这种 细菌生产红色素的方法
技术领域
本发明涉及一种产红色素的海洋细菌菌株及利用这种细菌生产红色素的方法。本发明还涉及一种红色素。
背景技术
色素分为合成色素和天然色素，合成色素不但无营养价值还有不同程度的毒性，有些甚至可致癌，因此在食品和化妆品工业中使用的越来越少，取而代之的是安全性好，并具有一定营养价值和药理功能的天然色素，但目前开发的天然色素种类远不能满足市场的需要。
现有的天然色素大多由植物和低等动物组织提取，由于动植物野生资源有限，栽培或养殖所需要的周期长，原材料的成本高和供应不足，限制了生产的规模。微生物繁殖快，能通过人工培养大量获得，是一类具有较高开发潜力的生物资源，特别是海洋微生物代谢产物的独特和新颖已得到国内外科技界的肯定。
目前国内外都有一些有关微生物发酵产生色素的报道，但在工业生产中应用的很少。陆地真菌红曲霉，生产的色素用作食品添加剂，是目前唯一在市场上使用的用微生物生产的色素。红曲霉培养需要熟稻米作为固体培养基，生长繁殖周期较长，工业化生产较困难，而且单一的天然红色素很难满足市场需要，目前国内化妆品使用的红色素大多为化学合成色素。利用海洋微生物人工培养提取色素，国内外均未报道。不少海洋微生物都能产生色素，但一般色素产生量较少，肉眼观察菌落颜色浅，色素的产生极不稳定，温度、光照、营养都会影响其色素的产生，不能做为生产色素的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种产红色素的海洋细菌。
本发明的另一个目的是提供一种利用本发明的细菌生产红色素的方法。
本发明的再一个目的是提供一种天然红色素。
本发明提供了一种产红色素的海洋细菌，菌株代号S-9801。其形态为杆状或弧杆状，0.5-1.2μm，无芽孢，周生鞭毛，运动型，革兰氏染色阴性，在蛋白胨培养基(每1L海水含氮源0.5％、碳源0.2％)28℃培养24h，形成的菌落近园形，较光滑，鲜红色，色素不溶于培养基。该菌株对石蕊牛奶有胨化作用；葡萄糖氧化反应阳性；氧化酶阴性；触酶阴性。初步鉴定为黄杆菌属(Flavobacterium sp.)
菌株在15℃-35℃的培养温度下均能生长，25℃-28℃为最适生长温度，在这一温度下，菌株液体培养12小时开始产生色素，培养36小时，菌株产生的色素可达最大值。
S-9801菌株在培养液所含的NaCl浓度0-5.0％的范围内均可生长，但培养液的NaCl浓度为0时，菌株生长很差，不能产生色素。NaCl浓度为5.0％时，菌株生长正常，产生的色素量较少。菌株在NaCl浓度1.0-3.0％的范围内生长良好，产生的色素量大，NaCl浓度在这一范围内变化，对菌株生长和色素产量的影响不明显。
菌株在培养液的pH3-9的范围内均可生长，并产生红色素。pH值为9时，菌株生长与其它处理差异不大，但产生的色素量较少，适宜生长pH4-8。
经测定，S-9801菌株适合的人工培养基为蛋白胨或胰蛋白胨5-7g酵母粉1-3g，葡萄糖2-4g，NaCl20-30g，MgCl.6H2O1.1-2.3g，KCl0.15-0.3g，琼脂17g，水1000ml。培养所需温度25℃-28℃，pH4-8。
S-9801菌株适合液体生长，可以通过发酵罐扩大培养，具有占用的空间小，生产规模较易控制的特点，有利于大规模生产。海洋细菌S-9801菌株，生命力强，对营养要求简单，生长范围宽，产生的红色素，对酸、碱、热、光的耐受能力强，经中国医科院药物筛选中心所做的动物毒性试验表明，该色素毒性很低。同时菌株可通过发酵罐液体发酵大量获取，其生长繁殖速度较已有的天然色素生物资源快。红色素色彩鲜艳，作为化妆品使用的天然红色素，具有很好的发展前景。
本发明的海洋细菌S-9801已于2000年12月27日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏中心地址为：北京，中关村，邮政编码：100080。保藏号为：CGMCC NO.0527
本发明还提供了一种生产天然红色素的方法，包括：培养本发明的海洋细菌和从培养物中提取红色素。
在上述方法中，本发明的菌株的培养在胰蛋白胨(优选0.7％重量)+酵母粉(优选0.3％重量)为氮源，葡萄糖(优选0.3％重量)为碳源，NaCl浓度为1.8％-2.1％(重量)，pH6-7，温度28℃的条件液体培养，产生的色素可达1.5g/L。
从培养物中分离红色素时可将发酵液pH调整至2-4，最好为3左右。这时色素沉降最彻底。在进行提取时，最好使用醇类溶剂，优选用乙醇做溶剂，这样可使色素更安全。
本发明还提供了一种由本发明的海洋细菌生产的红色素。色素干燥粗品为玫瑰红色，纯品为深红色，外界环境在pH12以下为红色，pH值为12或12以上色调变为黄色。色素对光、热具有较好的稳定性。
S-9801菌株产生的色素颜色鲜艳，色素产量大，菌株产生色素的性质较稳定。S-9801野生菌株来自海水，海水的低营养环境造就其对营养要求不严格的特性。
我国是人口大国，食品和化妆品工业所需要的色素量很大，目前使用的色素大多为合成色素，天然色素用量不足10％。其中天然色素种类少，生产规模小，价格贵是主要原因。而天然色素产量低主要又因为生物资源缺乏或成本高。S-9801菌株的发现不但为我国天然色素增加一个新品种，更重要的是该菌株可通过液体发酵罐工业化生产，因此，该发明必将对我国的天然色素工业产生积极的推动作用，同时，这一发现也将为海洋生物资源的利用开辟一条新途径。
具体实施方式
实施例1菌株生长的NaCl浓度、pH范围及培养温度的测定
S-9801菌株以蛋白胨培养液为基本培养液，100ml培养液接入5ml种子液(以下同)，NaCl浓度设0、1.5％、2.0％、3.0％、5.0％5个浓度级；pH值设3、5、7、94个酸碱度，25℃培养，分别在12、24h取样一次，测OD538值。
菌株以蛋白胨培养液为基本培养液，分别在15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、条件下培养，观察产生红色素的时间，然后置适宜的温度下培养，分别于12、24、36、48、60h取样一次，用752型紫外分光光度计，测OD538值，分析菌体培养色素产量达最大的时间。
试验结果表明，S-9801菌株在培养液所含的NaCl浓度0-5.0％的范围内均可生长，但培养液的NaCl浓度为0时，菌株生长很差，不能产生色素。NaCl浓度为5.0％时，菌株生长正常，产生的色素量较少。菌株在NaCl浓度1.0-3.0％的范围内生长良好，产生的色素量大，NaCl浓度在这一范围内变化，对菌株生长和色素产量的影响不明显。
S-9801菌株在培养液的pH 3-9的范围内均可生长，并产生红色素。pH值为9时，菌株生长与其它处理差异不大，但产生的色素量较少。
菌株在15℃-35℃的培养温度下均能生长，25-28℃为最适生长温度，在这一温度下，菌株液体培养12小时即可达到对数生长期，并开始产生色素，培养36小时，菌株产生的色素可达最大值。
表1S-9801菌株在培养液NaCl、pH、不同和培养温度、
          时间不同时产生色素情况表
  NaCl(％)OD538     0       1.5     2.0      3.0        5.00.17    0.99    1.01     0.99       0.48
  PHOD538           3       5      7         90.98    0.97   0.95      0.57
  温度℃产色素时间(h)     15    20      25     28    30      3538    24      12     12    17      20
  培养时间(h)OD538        12     24      36     48     600.50   0.89    1.20   1.20   1.11
实施例2
S-9801菌株的试验室培养和色素粗品的获得
蛋白胨5g酵母粉2g，葡萄糖2g，NaCl21g，MgCl.6H2O1.8g，KCl0.2g，琼脂17g，水1000ml。温度25℃-28℃，调节培养液pH6-7，灭菌，倒入平皿，冷却后接入S-9801菌株，培养24h的新鲜菌苔，再接入胰蛋白胨7g酵母粉3g，葡萄糖3g，NaCl21g，MgCl.6H2O1.8g，KCl0.2g，水1000ml。pH6-7的无菌培养液中，装样量120ml/250ml，150rpm，28℃，振荡培养30分钟左右，细菌开始繁殖，12小时菌株繁殖达指数生长期，并开始产生色素，培养24-36小时后取出，调节发酵液到pH3，离心(5000rpm)10分钟，弃去上清液，沉淀物加入无水乙醇(每1000ml发酵液的沉淀物加入200ml乙醇)充分溶解后保留乙醇溶液，重复3次，合并乙醇溶液，将乙醇经旋转蒸发蒸干，即可获得红色素粗提物。
                                                表2不同pH值对菌体的沉降效果
PH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
OD538 1.45 1.45 1.49 1.46 1.45 1.29 0.78 0.44 0.34 0.18 0.10 0.056
从表中可以看出，pH值在3～4时，菌体的沉降效果最好。
采用氯仿直接萃取法和调pH值使菌体沉降再用乙醇提取法，均可获得色素粗品，前一种方法操作简单，发酵液直接加入氯仿即可提取，每1000ml发酵液最高可获得色素粗品1.3g，但氯仿用量大，同时氯仿的毒性也较大；后一种方法需要将发酵液调适当pH值使菌体沉降后离心，再用乙醇提取，操作稍复杂，但节约溶剂，乙醇毒性较小，菌体沉降后提取较完全，每1000ml发酵液最高可获得色素粗品1.5g，因此用乙醇提取法更为合适。
红色素粗提物经100℃湿热处理1h，干燥处理2h，其颜色与40℃干燥处理差异不大，吸光度损失率分别为0和7.1％。粗提色素置自然光下10d，或紫外光处理不超过1h，吸光度值未见发生变化，紫外光处理超过1小时，吸光度损失率为6.7％。色素经中国医学科学院药物研究所急性毒性测试，腹腔注射LD50为670.04mg/kg，灌胃给药的毒性显著低于腹腔注射，最小致死量大于2000mg/kg，毒性很低。实施例3色素在不同溶剂中的溶解和不同pH对色素色调的影响：
经乙醇提取的红色素取0.2g，分别用20ml的乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、氯仿溶解，溶解液40℃烘干后，分别用乙醇定溶至20ml，测OD538值，观察其溶解的难易程度。适量色素用乙醇溶解，分别用NaOH和HCl调节pH分别为3、5、9、11、12，以pH7作为对照，观察色素色调的变化。
表3红色素用不同溶剂溶解后的OD值与不同pH值下的色调变化
  pH色调     3    5    7    9    10    11    12红   红   红   红   红    红    黄
  溶剂OD538     甲醇    乙醇     丙酮   乙醚    氯仿0.57    0.50     0.48   0.39    0.37
结果表明，在pH2-11的范围内，红色素很稳定。红色素在乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙醚、5种溶剂中均能溶解，但溶解程度不同，根据不同溶剂溶解后的OD538测定，其溶解度从大到小的顺序为甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿。
实施例4
色素的分离纯化
(1)将一定量色素粗提物经硅胶柱层析，正己烷湿法装柱，干法上样。用正己烷及氯仿∶甲醇梯度洗脱(50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶0)，收集色素部分洗脱液，蒸干溶剂；
(2)进一步将样品溶于少许氯仿∶甲醇(1∶1)上Sephadex LH-2柱，氯仿∶甲醇(1∶1)洗脱，流速1ml/min，收集色素洗脱液，浓缩；
(3)制备薄层，硅胶H铺板，氯仿∶正己烷∶甲醇(5∶5∶1)作为展开剂。展开后用刀片切除红色条带，用60℃甲醇研磨浸泡切除下的硅胶，反复进行3次，合并后过滤，浓缩，称重。薄层点样检查纯度；
(4)重结晶，浓缩色素提取物溶于5ml甲醇中，在60℃时缓慢加入2ml水，4℃冰箱过夜，抽滤。得到色素结晶，60℃，10h真空干燥，称重。
(5)HPLC分析：C18柱，甲醇∶水(2∶1)洗脱，检测波长534nm、254nm。流速1ml/min。以检测样品纯度。
经紫外、红外和核磁共振测定分析色素结构，初步认为该色素为共轭吡咯类色素。

Claims (6)

1.一种产红色素的海洋细菌黄杆菌属(Flavobacterium sp.)S-9801，其保藏号为CGMCC NO.0527。
2.一种生产天然红色素的方法，包括：培养权利要求1所述的海洋细菌；和从培养物中提取红色素。
3.按照权利要求2所述的方法，其中，所述的海洋细菌是在胰蛋白胨为氮源，葡萄糖为碳源，NaCl浓度为1.8％-2.1％(重量)的条件下进行的。
4.按照权利要求2所述的方法，其中，从培养物中提取红色素是通过首先将发酵液pH调整至2-4，然后使用醇类溶剂进行提取。
5.按照权利要求2所述的方法，其中，从培养物中提取红色素是通过首先将发酵液pH调整至3，然后使用乙醇为溶剂进行提取。
6.一种由权利要求1所述的海洋细菌产生的红色素。
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