CN113292469B - 一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法 - Google Patents

一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用β‑葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法。本发明的提取方法包括如下步骤：(1)将红法夫酵母的菌体用碱液处理后，离心弃上清，得到中间菌体；(2)在中间菌体中加入β‑葡聚糖酶与几丁质酶的混合液进行酶解处理后，萃取得到虾青素。采用本发明的提取方法能最大限度的提取红法夫酵母胞内的虾青素，并且对环境无污染。

Description

一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素 的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法。
背景技术
虾青素是一种具有极强抗氧化性能及抗肿瘤、增强免疫等生理功能的类胡萝卜素，而红法夫酵母中含有大量的天然虾青素，因此，此菌种有望实现工业化发酵生产天然虾青素。
现有技术中公开的提取红法夫酵母中虾青素的方法有：酸解法、机械法和酶解法。酸解法提取虾青素后，虾青素在其条件下并不稳定。机械法提取虾青素时，存在设备难以放大等问题。而酶解法由于具有作用条件温和，对环境污染小等优势引起了学者们的广泛关注。但是现有技术酶解法提取的虾青素的得率有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虾青素得率高，且对环境无污染的提取红法夫酵母胞内虾青素的方法。尤其涉及一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法，包括如下步骤：
(1)将红法夫酵母的菌体用碱液处理后，离心弃上清，得到中间菌体；
(2)在中间菌体中加入β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液进行酶解处理后，萃取得到虾青素。
作为优选，碱液处理的步骤为：将红法夫酵母的菌体加入到碱液中，在 30～40℃条件下，处理10～20min；
红法夫酵母的菌体与碱液的质量体积比为1g：12～14mL；
碱液的pH为11～12。
作为优选，碱液为NaOH溶液。
作为优选，离心的转速为10000～12000r/min，离心的时间为2～3min。
作为优选，β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液中β-葡聚糖酶与几丁质酶的体积比为2～3:1。
作为优选，酶解处理时，β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的加入体积与红法夫酵母菌体的质量比为12～14mL：1g。
作为优选，酶解的温度为40～45℃；酶解的时间为45～60min；酶解时的 pH为6～7。
作为优选，萃取的方法为超临界CO2萃取。
作为优选，萃取的温度为23～25℃；萃取的压力为38～40MPa；萃取的时间为40～45min。
作为优选，萃取时以甲醇为夹带剂；
甲醇的体积分数为2～3％。
本发明利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法，与现有技术相比具有如下优点：
(1)本申请的酶解破壁与碱解破壁相辅相成，破壁条件温和，破壁完全，能更有效的将虾青素从红法夫酵母中提取出来，还能保护虾青素不被氧化；
(2)并且不需要大型设备，还具有操作简单，方便，快捷，对环境无污染的特性。
具体实施方式
本发明提供了一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法，包括如下步骤：
(1)将红法夫酵母的菌体用碱液处理后，离心弃上清，得到中间菌体；
(2)在中间菌体中加入β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液进行酶解处理后，萃取得到虾青素。
在本发明中，碱液处理的步骤为：将红法夫酵母的菌体加入到碱液中，在30～40℃条件下，优选为在35℃条件下，
处理10～20min，优选为15min；
红法夫酵母的菌体与碱液的质量体积比为1g：12～14mL，优选为1g： 13mL；
碱液的pH为11～12，优选为11.5。
在本发明中，碱液为NaOH溶液。
在本发明中，离心的转速为10000～12000r/min，优选为11000r/min；离心的时间为2～3min，优选为2.5min。
在本发明中，β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液中β-葡聚糖酶与几丁质酶的体积比为2～3:1，优选为2.5:1。
在本发明中，酶解处理时，β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的加入体积与红法夫酵母菌体的质量比为12～14mL：1g，优选为13mL：1g。
在本发明中，酶解的温度为40～45℃，优选为42.5℃；
酶解的时间为45～60min，优选为50～55min，进一步优选为52.5min；
酶解时的pH为6～7，优选为6.5。
在本发明中，萃取的方法为超临界CO2萃取。
在本发明中，萃取的温度为23～25℃，优选为24℃；
萃取的压力为38～40MPa，优选为39MPa；
萃取的时间为40～45min，优选为42.5min。
在本发明中，萃取时以甲醇为夹带剂；
甲醇的体积分数为2～3％，优选为2.5％。
在本发明实施例和对比例中所用的红法夫酵母重组突变株为CZ10，分类命名为红法夫酵母Phaffia rhodozyma，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年07月12日，保藏编号为CGMCCNo.6355。
在本发明实施例和对比例中所用的红法夫酵母的菌体为湿菌体；
湿菌体的制备方法为：将红法夫酵母发酵液，离心后得到的菌体在浓度为1～3％的NaCl溶液中浸泡1～2min后，离心得到的菌体。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取10g红法夫酵母湿菌体，用140mLpH为11的NaOH溶液，在30℃条件下处理20min后，10000r/min离心3min，得到中间菌体。
在中间菌体中加入140mLβ-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液，调pH为6.5，在40℃条件下酶解60min后，采用超临界CO2的萃取方法萃取其中的虾青素。萃取时的温度设置为23℃，压力为38MPa，萃取时间为40min，萃取时采用体积分数为2％的甲醇为夹带剂。
在本实施例1中所用的β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的配置方法为，取105mLβ-葡聚糖酶与35mL几丁质酶混合得到。
经过计算，采用本发明实施例1的方法，得到的红法夫酵母胞内虾青素得率为20.51mg/g。
实施例2
取100g红法夫酵母湿菌体，用1200mLpH为12的NaOH溶液，在35℃条件下处理10min后，12000r/min离心2min，得到中间菌体。
在中间菌体中加入1200mLβ-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液，调pH为 7，在45℃条件下酶解45min后，采用超临界CO2的萃取方法萃取其中的虾青素。萃取时的温度设置为25℃，压力为40MPa，萃取时间为45min，萃取时采用体积分数为3％的甲醇为夹带剂。
在本实施例2中所用的β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的配置方法为，取800mLβ-葡聚糖酶与400mL几丁质酶混合得到。
经过计算，采用本发明实施例2的方法，得到的红法夫酵母胞内虾青素得率为22.34mg/g。
实施例3
取1000g红法夫酵母湿菌体，用13000mL pH为12的NaOH溶液，在 40℃条件下处理15min后，12000r/min离心3min，得到中间菌体。
在中间菌体中加入13000mLβ-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液，调pH为 6，在42℃条件下酶解50min后，采用超临界CO2的萃取方法萃取其中的虾青素。萃取时的温度设置为24℃，压力为40MPa，萃取时间为40min，萃取时采用体积分数为3％的甲醇为夹带剂。
在本实施例3中所用的β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的配置方法为，取9750mLβ-葡聚糖酶与3250mL几丁质酶混合得到。
经过计算，采用本发明实施例3的方法，得到的红法夫酵母胞内的虾青素得率为21.47mg/g。
对比例1
按照实施例1的方法设置对比例1的方法，与实施例1的方法不同的是，将实施例1的碱液处理改为pH为3的HCl进行处理。
按照对比例1的方法设置实验，得到的红法夫酵母中虾青素的得率为 12.31mg/g。
对比例2
按照实施例2的方法设置对比例2的实验，对比例2中所用的β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的配置方法与实施例2的不同。本对比例2所述的β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的配置方法为，取600mLβ-葡聚糖酶与 600mL几丁质酶混合得到。
采用此方法，提取得到的红法夫酵母中虾青素的得率为15.68mg/g。
对比例3
按照实施例3的方法设置对比例3的实验，对比例3中所用的酶与实施例3的不同，对比例3中采用的酶为溶菌酶。
采用此方法，提取得到的红法夫酵母胞内虾青素的得率为13.87mg/g。
对比例4
按照实施例1的方法设置对比例4的实验，对比例4中将实施例1的碱液处理改为pH为3的HCl处理，同时将酶解步骤中的酶改成溶菌酶，其余步骤与实施例1相同。
采用此方法提取红法夫酵母中的虾青素，虾青素的得率为14.63mg/g。
由以上实施例可知，本发明提供了一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法。采用本发明的方法提取红法夫酵母胞内的虾青素，较现有技术的酸解处理，溶菌酶处理，酸解处理与溶菌酶配合处理得到的虾青素的得率都高，并且本发明的条件温和，能更好的保护虾青素不被氧化。
由此可知，本发明方法中的碱液处理方法与β-葡聚糖酶与几丁质酶酶解破壁的方法相辅相成，更有效的破坏红法夫酵母的细胞壁，使虾青素从红法夫酵母中提取出来；并且不需要大型设备，还具有操作简单，方便，快捷，对环境无污染的特性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种利用β-葡聚糖酶与几丁质酶提取红法夫酵母胞内虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将红法夫酵母的菌体用碱液处理后，离心弃上清，得到中间菌体；
(2)在中间菌体中加入β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液进行酶解处理后，萃取得到虾青素；
离心的转速为10000～12000r/min，离心的时间为2～3min；
β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液中β-葡聚糖酶与几丁质酶的体积比为2～3:1；
酶解处理时，β-葡聚糖酶与几丁质酶的混合液的加入体积与红法夫酵母菌体的质量比为12～14mL：1g；
萃取的方法为超临界CO2萃取；
萃取的温度为23～25℃；萃取的压力为38～40MPa；萃取的时间为40～45min；
萃取时以甲醇为夹带剂；甲醇的体积分数为2～3％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碱液处理的步骤为：将红法夫酵母的菌体加入到碱液中，在30～40℃条件下，处理10～20min；
红法夫酵母的菌体与碱液的质量体积比为1g：12～14mL；
碱液的pH为11～12。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，碱液为NaOH溶液。
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