CN113289068A - 一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法 - Google Patents

一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚beta‑氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法。制备丙烯酰基封端且含炔基的聚beta‑氨基酯，通过生物相容性的点击化学反应偶联含有叠氮的神经生长因子活性肽和甲基强的松龙衍生物；通过自由基聚合反应得到基于聚beta‑氨基酯/PEGDA水凝胶。本发明制得的可注射水凝胶能够填充复杂解剖结构且结构不规则的脊髓损伤空洞，能够抑制瘢痕；其次，本研究制备的水凝胶易于降解，且无毒副作用。且神经生长因子活性肽‑聚beta‑氨基酯偶联物不仅能够延长活性肽的半衰期，而且能够促进轴突再生。甲基强的松龙衍生物‑聚(beta‑氨基酯)偶联物能够抑制脊髓损伤部位炎症反应，避免脊髓继发性损伤。

Description

一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于人工合成聚合物水凝胶的制备领域，具体设计一种点击化学反应偶联神经营养因子活性肽到聚beta氨基酯水凝胶的方法。
背景技术
目前，人们主要采用透明质酸，胶原，脱细胞组织基质等天然水凝胶材料和自组装多肽、基于聚乙二醇的PEG水凝胶，能够有效改善脊髓损伤修复。但是，这些水凝胶在使用过程中受到天然材料的交联剂潜在毒性，脱细胞基质的潜在的宿主反应，多肽水凝胶力学性能控制以及聚乙二醇凝胶的无生物活性且难以功能化修饰的问题困扰。
聚beta氨基酯水凝胶是一类人工合成的聚合物水凝胶，合成方法简单，结构多样性，易于修饰，聚beta氨基酯水凝胶在体内可以降解成无毒的小分子产物，避免在体内的滞留。聚beta氨基酯水凝胶不仅能够有效填充脊髓损伤空洞区域的复杂的解剖结构，而且通过点击化学偶联的活性物质还能够有助于促进神经细胞的生长，水凝胶的降解产物生物相容性好且无毒副作用。
目前临床上大剂量甲泼尼龙琥珀酸钠(甲强龙)疗法是全世界公认的治疗早期脊髓损伤的有效治疗方法，可以挽救早期受损的脊髓细胞，减少炎症介质的释放，促进脊髓修复。甲泼尼龙琥珀酸钠是欧洲医药机构及美国食品及药品管理局批准的临床最常用的脊髓损伤修复的治疗药物。甲基强的松龙是一种能够抑制脂质过氧化的皮质类固醇，是自由基清除剂，还能够抑制炎症反应，保护血脊髓屏障，加快脊髓部位的血流。甲泼尼龙琥珀酸钠本身具有药理活性，市售的甲泼尼龙琥珀酸钠注射剂为甲泼尼龙的前体化合物(甲泼尼龙琥珀酸钠)，能够在体内迅速转化为甲泼尼龙发挥药效。由于甲泼尼龙能扩散透过细胞膜与细胞内受体结合，进入细胞核内，能够与DNA结合并不刺激mRNA的翻译，可以稳定细胞膜并抑制吞噬作用，从而达到减少脊髓继发性损伤的目的。大剂量甲泼尼龙琥珀酸钠疗法也给患者带来了严重的副作用和后遗症，通常会导致胃出血、败血症、肺炎、急性皮质类固醇肌病，伤口感染，骨质疏松，股骨头坏死等。甲泼尼龙可以抑制骨细胞的活力，减少骨中胶原和骨基质的分解，使骨盐不易沉着，骨质形成发生障碍导致典型的不良反应骨质疏松症。甲泼尼龙还对糖、脂肪和蛋白质的代谢有影响，影响电解质的代谢，使电解质代谢紊乱。对于治疗脊髓损伤来说，研发新型的甲泼尼龙治疗方式势在必行。通过点击化学偶联的甲泼尼龙的聚beta氨基酯还有望实现抑制炎症，保护血脊髓屏障并减轻副作用；水凝胶的降解产物生物相容性好且无毒副作用。
神经生长因子是首先发现的细胞生长调节因子，Rita和Stanley因其发现神经生长因子及其在神经系统生长发育中的重要生理作用而获得1986年诺贝尔生理与医学奖。神经生长因子参与细胞分化，存活，细胞生长及神经元凋亡等多种信号的传导过程。成熟的神经生长因子是对称的同型二聚体，每个原聚体有 118-119个氨基酸组成。
结合以上的研究背景，本研究拟通过点击化学反应与聚合反应构建神经生长因子活性肽/甲基强的松龙衍生物-聚(beta-氨基酯)偶联物的可注射水凝胶修复脊髓神经损伤。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是发明一种通过迈克尔加成反应制备的，丙烯酰基封端且含炔基的聚beta氨基酯水凝胶，来明确抑制胶质瘢痕的产生及促进轴突生长对脊髓损伤的治疗效果及作用机制，为组织工程修复脊髓神经损伤提供新的研究思路和研究方法。
技术方案：聚beta-氨基酯的炔基可以通过生物相容性的点击化学反应偶联含有叠氮的神经生长因子活性肽和甲基强的松龙衍生物；封端的丙烯酰基团可以通过自由基聚合反应得到基于聚beta-氨基酯/PEGDA水凝胶。
本发明提出了一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，制备丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯；
步骤2，制备含叠氮的活性物质；包括制备含叠氮的神经生长因子活性肽和制备含叠氮的甲基强的松龙衍生物；
步骤3，制备偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta- 氨基酯；
步骤4，制备丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的水凝胶。
进一步的，步骤1中制备丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯，具体方法为：
氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯0.66g,3.3mmol，炔丙胺0.165g,3 mmol搅拌溶解在10mL氯仿中，反应液加热到50℃搅拌反应12小时；反应液升温到80℃反应12h，反应溶液经透、冻干得到丙烯酰基封端且含炔基的聚beta- 氨基酯。
进一步的，步骤2中制备含叠氮的活性物质；具体包括如下步骤：
步骤2.1，制备含叠氮的神经生长因子活性肽；
通过计算机模拟，选取神经生长因子中含有Loop4片段的85-100序列与 TrkA结合的片段(TFVKALTMDGKQAAWR)；通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子活性肽 [K(N3)TFVKALTMDGKQAAWR]；
步骤2.2，制备含叠氮的甲基强的松龙衍生物；
通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物。
进一步的，步骤3中制备偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯，具体方法为：
氮气保护条件下，丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯66mg,含有叠氮的甲基强的松龙衍生物0.01mmol溶解在2mL四氢呋喃的溶液中，五水硫酸铜0.005mmol溶解在0.2mL水溶液，加入上述溶液中；将抗坏血酸钠0.01mmol 溶解在0.2mL水溶液中，通过注射器加入到上述溶液中还原硫酸铜为一价铜催化点击化学反应；继续搅拌反应四小时，反应溶液经透析、冻干得到丙烯酰基封端且含甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯；
通过相同的制备步骤得到丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽的聚beta-氨基酯。
进一步的，步骤4中制备丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽、甲基强的松龙衍生物的水凝胶，具体方法为：
利用偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA溶解在水溶液中，加入过硫酸胺，加热引发聚合反应；新制备的水凝胶经过PBS浸泡，除去未反应的小分子和引发剂；通过改变聚beta 氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA的浓度制备杨氏模量为0.18KPa，0.36KPa， 0.72KPa和1.4KPa力学性能的水凝胶。
进一步的，步骤2.1中的Fmoc化学策略具体方法为：
(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂；
(2)氨基酸偶联树脂，加入Fmoc-氨基酸和DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h；
(3)甲醇封闭未反应的树脂；
(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF溶液反应30min；
(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；
(6)重复步骤(4-5)，依次进行氨基酸缩合；
(7)用三氟乙醇裂解液将氨基酸序列从树脂切下来；
(8)环化氨基酸，加入HATU和DIEA的DMF溶液，并室温反应2h；
(9)从树脂上切除和去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；
(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子活性肽[K(N3)TFVKALTMDGKQAAWR]。
进一步的，步骤2.2中的Fmoc化学策略具体方法为：
(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂；
(2)氨基酸偶联树脂，加入芴甲氧羰基-叠氮-赖氨酸[Fmoc-Lys(N3)-OH]和 DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h；
(3)甲醇封闭未反应的树脂；
(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF溶液反应30min；
(5)甲泼尼龙琥珀酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；
(6)从树脂上切下，三氟乙醇：二氯甲烷(1:4)混合溶液将多肽从树脂上切除；
(7)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物。
进一步的，步骤3中，偶联有神经生长因子活性肽、甲基强的松龙衍生物的聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA的质量比为1:2。
有益效果：本发明创造的一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶，不仅能够有效填充脊髓损伤空洞区域的复杂的解剖结构；通过点击化学偶联的活性物质还能够有助于促进神经细胞的生长；水凝胶的降解产物生物相容性好且无毒副作用。
本发明制备的通过点击化学偶联的甲泼尼龙的聚beta氨基酯还有望实现抑制炎症，保护血脊髓屏障并减轻副作用；水凝胶的降解产物生物相容性好且无毒副作用。
本发明制备的通过点击化学反应偶联神经营养因子活性肽到聚beta氨基酯水凝胶能够促进轴突再生。
附图说明
图1是本发明制备方法的流程图。
具体实施方式
本发明的一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，如图1 所示，包括如下步骤：
步骤1，丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯的制备：
氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(0.66g,3.3mmol)，炔丙胺(0.165g, 3mmol)搅拌溶解在10mL氯仿中，反应液加热到50℃搅拌反应12小时。反应液升温到80℃反应12h，反应溶液经透析(截留分子量1000)、冻干得到丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯；
步骤2，含叠氮的活性物质的制备；
步骤2.1，含叠氮的神经生长因子活性肽制备；
通过计算机模拟，选取神经生长因子中含有Loop4片段的85-100序列与 TrkA结合的片段(TFVKALTMDGKQAAWR)。通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，具体合成步骤：(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂； (2)氨基酸偶联树脂，加入Fmoc-氨基酸和DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h； (3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF溶液反应 30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4-5)，依次进行氨基酸缩合；(7)用三氟乙醇裂解液将氨基酸序列从树脂切下来；(8)环化氨基酸，加入HATU和DIEA的DMF溶液，并室温反应2h；(9)从树脂上切除和去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基； (10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子活性肽 [K(N3)TFVKALTMDGKQAAWR]；
步骤2.1，含叠氮的甲基强的松龙衍生物的制备；
通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物；Fmoc化学策略制备方法为(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂；(2)氨基酸偶联树脂，加入芴甲氧羰基-叠氮-赖氨酸[Fmoc-Lys(N3)-OH]和DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF 溶液反应30min；(5)甲泼尼龙琥珀酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA 的DMF溶液，室温反应2h；(6)从树脂上切下，三氟乙醇：二氯甲烷(1:4)混合溶液将多肽从树脂上切除。(7)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物；
步骤3，偶联有神经生长因子活性肽、甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯制备：
氮气保护条件下，丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯(66mg),含有叠氮的甲基强的松龙衍生物溶解在四氢呋喃的溶液中，五水硫酸铜溶解在水溶液，加入上述溶液中。将抗坏血酸钠溶解在水溶液中，通过注射器加入到上述溶液中还原硫酸铜为一价铜催化点击化学反应。继续搅拌反应4h，反应溶液经透析、冻干得到丙烯酰基封端且含甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯。通过相同的制备步骤得到丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽的聚beta-氨基酯；
步骤4，丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的水凝胶的制备：
利用偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA溶解在水溶液中，加入过硫酸胺，加热引发聚合反应。新制备的水凝胶经过PBS浸泡，除去未反应的小分子和引发剂。通过改变聚beta 氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA的浓度制备杨氏模量为0.18KPa，0.36KPa， 0.72KPa和1.4KPa力学性能的水凝胶。

Claims (8)

1.一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，制备丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯；
步骤2，制备含叠氮的活性物质；包括制备含叠氮的神经生长因子活性肽和制备含叠氮的甲基强的松龙衍生物；
步骤3，制备偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯；
步骤4，制备丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的水凝胶。
2.根据权利要求1所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤1中制备丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯，具体方法为：
氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯0.66g,3.3mmol，炔丙胺0.165g,3mmol搅拌溶解在10mL氯仿中，反应液加热到50℃搅拌反应12小时；反应液升温到80℃反应12h，反应溶液经透、冻干得到丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯。
3.根据权利要求1或2所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2中制备含叠氮的活性物质；具体包括如下步骤：
步骤2.1，制备含叠氮的神经生长因子活性肽；
通过计算机模拟，选取神经生长因子中含有Loop4片段的85-100序列与TrkA结合的片段(TFVKALTMDGKQAAWR)；通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子活性肽[K(N3)TFVKALTMDGKQAAWR]；
步骤2.2，制备含叠氮的甲基强的松龙衍生物；
通过固相合成法，以Fmoc化学策略制备，粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物。
4.根据权利要求3所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤3中制备偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯，具体方法为：
氮气保护条件下，丙烯酰基封端且含炔基的聚beta-氨基酯66mg,含有叠氮的甲基强的松龙衍生物0.01mmol溶解在2mL四氢呋喃的溶液中，五水硫酸铜0.005mmol溶解在0.2mL水溶液，加入上述溶液中；将抗坏血酸钠0.01mmol溶解在0.2mL水溶液中，通过注射器加入到上述溶液中还原硫酸铜为一价铜催化点击化学反应；继续搅拌反应四小时，反应溶液经透析、冻干得到丙烯酰基封端且含甲基强的松龙衍生物的聚beta-氨基酯；
通过相同的制备步骤得到丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽的聚beta-氨基酯。
5.根据权利要求4所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤4中制备丙烯酰基封端且偶联有神经生长因子活性肽、甲基强的松龙衍生物的水凝胶，具体方法为：
利用偶联有神经生长因子活性肽，甲基强的松龙衍生物的聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA溶解在水溶液中，加入过硫酸胺，加热引发聚合反应；新制备的水凝胶经过PBS浸泡，除去未反应的小分子和引发剂；通过改变聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA的浓度制备杨氏模量为0.18KPa，0.36KPa，0.72KPa和1.4KPa力学性能的水凝胶。
6.根据权利要求3所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2.1中的Fmoc化学策略具体方法为：
(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂；
(2)氨基酸偶联树脂，加入Fmoc-氨基酸和DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h；
(3)甲醇封闭未反应的树脂；
(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF溶液反应30min；
(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；
(6)重复步骤(4-5)，依次进行氨基酸缩合；
(7)用三氟乙醇裂解液将氨基酸序列从树脂切下来；
(8)环化氨基酸，加入HATU和DIEA的DMF溶液，并室温反应2h；
(9)从树脂上切除和去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；
(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子活性肽[K(N3)TFVKALTMDGKQAAWR]。
7.根据权利要求3所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2.2中的Fmoc化学策略具体方法为：
(1)在固相反应管内，二氯甲烷溶胀2-氯-三苯甲基氯树脂；
(2)氨基酸偶联树脂，加入芴甲氧羰基-叠氮-赖氨酸[Fmoc-Lys(N3)-OH]和DIEA的二氯甲烷溶液，室温反应2h；
(3)甲醇封闭未反应的树脂；
(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶的DMF溶液反应30min；
(5)甲泼尼龙琥珀酸缩合，加入Fmoc-氨基酸，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；
(6)从树脂上切下，三氟乙醇：二氯甲烷(1:4)混合溶液将多肽从树脂上切除；
(7)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的甲基强的松龙衍生物。
8.根据权利要求4所述一种基于聚beta-氨基酯/PEGDA可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤3中，偶联有神经生长因子活性肽、甲基强的松龙衍生物的聚beta氨基酯末端的丙烯酰基与PEGDA的质量比为1:2。
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