CN113288897B - 新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 - Google Patents
新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113288897B CN113288897B CN202110657588.8A CN202110657588A CN113288897B CN 113288897 B CN113288897 B CN 113288897B CN 202110657588 A CN202110657588 A CN 202110657588A CN 113288897 B CN113288897 B CN 113288897B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- derivative
- cells
- gastric cancer
- cell
- neobynine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明属于医药领域,具体涉及一种新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用。本发明发现,新白叶藤碱衍生物Z23能够抑制胃癌细胞的迁移,诱导胃癌细胞发生凋亡,抑制胃癌细胞增值;同时新白叶藤碱衍生物Z23对正常胃黏膜细胞的基本无毒附作用。即,与其他新白叶藤碱衍生物及顺铂和5‑Fu相比,本发明所述的新白叶藤碱衍生物Z23具有更显著的治疗胃癌的效果,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用。
背景技术
在2018年全球癌症统计中,胃癌是发病率较高的消化系统肿瘤,全球胃癌新发病例约为103万,发病率在恶性肿瘤的第5位。尽管有不同的癌症治疗方法,包括放疗,化疗,手术治疗,基因治疗等,但是化学治疗目前仍然是实体肿瘤治疗的必要手段,然而化学药的副作用大,肿瘤异质性以及化学药容易产生耐药性是其难以解决的问题,因此,开发新的毒性较小的治疗癌症的化学药物是非常必要的。
新白叶藤碱(Neocryptolepine),其作为天然产物在1996年被首次报道。Neocryptolepine具有广谱的生物活性,其作为非洲传统的药物用于治疗疟疾,黄疸,肝炎等,研究表明,其对广泛的癌症细胞均有良好的抗肿瘤效果,例如肝癌,胆管癌,肺癌,腹水癌以及白血病等,并且报道,其可以引起细胞周期的阻滞,诱导细胞凋亡,在体内具有良好的抗氧化作用。除此之外,通过在确定的位置引入合适的基团,它们的衍生物比母核具有更好的生物学活性。新白叶藤碱衍生物Z23作为一种新的化合物,通过对新白叶藤碱进行结构修饰得到,其抗胃癌活性尚未研究,其相关机制也未被研究。
本发明发现,新白叶藤碱衍生物Z23能抑制胃癌细胞的迁移,诱导胃癌细胞发生凋亡,降低线粒体膜电位;同时新白叶藤碱衍生物Z23还可以将胃癌细胞阻滞在G2/M期;而且新白叶藤碱衍生物Z23对正常胃黏膜细胞的基本无毒;具有显著的治疗胃癌的效果,且其治疗胃癌的效果优于其他现有的新白叶藤碱衍生物Z23及顺铂、5-Fu,具有良好的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题,本发明的目的在于提供一种新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用。
具体包括以下内容:
第一方面,本发明提供了一种新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料,制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第二方面,本发明提供了一种新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗胃癌药物中的应用。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐抑制胃癌细胞的增殖和/或胃癌细胞的转移。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐促进胃癌细胞的凋亡。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料,制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第三方面本发明提供了一种新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制胃癌转移药物中的应用。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料,制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
优选地,所述新白叶藤碱衍生物的制备方法为:将邻甲氨基苯甲醛、6-氟吲哚、p-TSA在无水乙醇中搅拌回流反应12h;冷却至室温,将反应物用NaOH洗涤,并将水层用二氯甲烷萃取即得。
优选地,所述邻甲氨基苯甲醛的制备方法为:0℃,将过氧化氢和1-甲基碘化喹啉的混合物加到氢氧化钾水溶液和1,2-二氯乙烷中,反应30分钟;将所得混合物在室温搅拌48h,然后分离有机层,并将水层用二氯甲烷萃取;合并的有机层用无水硫酸镁干燥;减压浓缩有机层,得邻甲氨基苯甲醛。
优选地,所述1-甲基碘化喹啉的制备方法为:在氮气条件下下,将喹啉和CH3I在异丙醇中的混合,90℃加热反应3h,冷却至室温,用异丙醇/乙酸乙酯的混合物洗涤,得1-甲基碘化喹啉。
本发明的有益效果是:本发明发现,新白叶藤碱衍生物Z23能抑制胃癌细胞的迁移,诱导胃癌细胞发生凋亡,降低线粒体膜电位;同时新白叶藤碱衍生物Z23还可以将胃癌细胞阻滞在G2/M期,抑制胃癌细胞的增值;而且新白叶藤碱衍生物Z23对正常胃黏膜细胞的基本无毒副作用;具有显著的治疗胃癌的效果,且其治疗胃癌的效果优于现有的新白叶藤碱衍生物、顺铂和5-Fu,具有良好的应用前景。
附图说明
图1新白叶藤碱衍生物Z23的合成路线;
图2新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h后细胞形态发生变化的结果;
图3MTT方法检测新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞的抑制作用;
图4MTT方法检测新白叶藤碱衍生物Z23对正常胃黏膜细胞GES-1的毒性作用;
图5新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞AGS迁移的影响;
图6新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞AGS线粒体膜电位的影响;
图7hoechst33258染色实验分析新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞AGS凋亡的影响;
图8流式细胞仪分析新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞AGS凋亡的影响;
图9流式细胞仪分析新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞AGS周期的影响;
图10qPCR实验结果;
图11WesternBlot实验结果。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的人胃癌细胞系AGS来源于ATCC。
实施例1新白叶藤碱衍生物Z23的合成
新白叶藤碱衍生物Z23的具体合成路线如图1所示。
具体合成方法包括以下步骤:
(1)目标化合物2的合成:
在氮气下,将喹啉(7.7mmol)和CH3I(11.6mmol)在异丙醇(1M)中的混合物在90℃下加热3h,将反应冷却至室温。通过真空过滤分离得到的沉淀,用异丙醇/乙酸乙酯(1∶1)的混合物洗涤,并真空干燥,所得黄色固体即为目标化合物2(1-甲基碘化喹啉)。
(2)目标化合物3的合成;
将过氧化氢(6.4mL,35%)和上述(1)获得的目标化合物2(1-甲基碘化喹啉,在15mL水中的浓度15mmol)的混合物在0℃下加到含0.148mol氢氧化钾的水溶液(30mL)和1,2-二氯乙烷(30mL)中,超过30分钟。将所得混合物在室温搅拌48h,然后分离有机层,并将水层用二氯甲烷(30mL×3)萃取。合并的有机层用无水硫酸镁干燥。减压浓缩有机层,得到目标化合物3(邻甲氨基苯甲醛),为黄色油状物。
(3)新白叶藤碱衍生物Z23的合成;
在50mL圆底烧瓶中加入上述(2)中合成的目标化合物3(邻甲氨基苯甲醛,5mmol),6-氟吲哚(5mmol)和p-TSA(5mmol),加入无水乙醇(10mL)中混合,在空气中搅拌回流12小时。冷却至室温后,将反应混合物用1M的NaOH(50mL)洗涤,并将水层用二氯甲烷(3×80mL)萃取。然后将合并的有机层用无水硫酸镁干燥。减压浓缩有机层,残余物通过硅胶柱层析纯化,用石油醚/乙酸乙酯(2∶1)除去杂质,然后用二氯甲烷/甲醇(40∶1)洗脱,得到最终产物,化合物为红色固体(新白叶藤碱衍生物Z23),产率50%。
产物谱图为:m.p.171.07-172.17℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.93(s,1H),8.22–8.06(m,2H),8.00(d,J=8.7Hz,1H),7.86(d,J=1.7Hz,0H),7.52(s,1H),7.34(dd,J=10.6,2.4Hz,1H),6.99(s,0H),4.31(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.91,162.50,156.94,136.64,131.14,130.33,129.26(d,J=2.2Hz),126.44,122.99(d,J=10.9Hz),122.60,120.88,120.81,115.54,106.97(d,J=24.3Hz),103.99(d,J=23.5Hz),33.31.MS-ESI m/z:calcd for C16H11FN2[M+H]+:251.1680;found:251.0631。
结构式如下式(Ⅰ)所示:
实施例2新白叶藤碱衍生物对胃癌细胞的抑制作用
用不同的新白叶藤碱衍生物Z2-Z49处理过后的AGS细胞加入到96孔板中,每孔加入10μL的5mg/mL的MTT溶液,在细胞培养箱中继续孵育4h。
孵育完成后,小心将96孔板中的液体吸出,每孔加入100μL的DMSO溶液,在摇床上120r/min孵育20min。待96孔板中溶液均匀,用酶标仪在490nm处测量吸光度值,计算不同新白叶藤碱衍生物对AGS细胞IC50。
结果如下表1所示,多数新白叶藤碱衍生物对AGS细胞均具有一定的抑制作用,其中新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞的抑制活性最显著,其IC50可以达到43.15±3.92nM。
表1不同新白叶藤碱衍生物作用于AGS细胞48h后的IC50(μM)
Compound | AGS | Compound | AGS | Compound | AGS |
Z2 | 27.4±7.4 | Z18 | 37.7±14.1 | Z34 | 3±0.1 |
Z3 | 14.1±8.3 | Z19 | 17.5±0.0 | Z35 | 6.5±1.4 |
Z4 | 4±0.6 | Z20 | 17.5±0.0 | Z36 | 13.1±3 |
Z5 | 3.3±0.5 | Z21 | 3.1±0.8 | Z37 | 20.7±11.8 |
Z6 | 5±2.5 | Z22 | 10.9±9.4 | Z38 | 2.3±0.8 |
Z7 | 14±1.6 | Z23 | 0.043±0.004 | Z39 | 2.7±1.5 |
Z8 | 40.8±0.0 | Z24 | >50 | Z40 | 4.8±2.2 |
Z9 | 7.1±0.2 | Z25 | >50 | Z41 | 5±2.7 |
Z10 | >50 | Z26 | 4.6±0.3 | Z42 | 15.5±2.3 |
Z11 | 36.0±0.0 | Z27 | 8.4±2.7 | Z43 | 3±1.4 |
Z12 | 3.1±0.3 | Z28 | 11.9±7.7 | Z44 | 3.6±2.5 |
Z13 | 6±0.8 | Z29 | >50 | Z45 | 1.3±1.4 |
Z14 | 8.6±1 | Z30 | 15.3±0.0 | Z46 | 7.1±3.3 |
Z15 | 14.3±1.4 | Z31 | 7.8±1.4 | Z47 | 2.8±3.6 |
Z16 | 8.1±3 | Z32 | 22.1±0.0 | Z48 | 7.7±5.7 |
Z17 | 7.9±0.6 | Z33 | 41.0±0.0 | Z49 | 26.9±37.6 |
其中Z23所述化合物结构式如上述实施例1中式(Ⅰ)所示,化合物Z2-Z22,及Z24-Z49的结构式如下所示:
实施例3新白叶藤碱衍生物Z23对胃癌细胞的抑制作用
1.细胞形态学的变化
(1)AGS细胞在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基(HyClone,USA)中,置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养,当细胞密度达到80%-90%时,将细胞从细胞培养箱中拿出,用PBS将细胞洗涤两次,每次4mL;加入2mL胰酶,放入培养箱中进行消化;
(2)将细胞从培养箱中取出,加入3mL培养基终止消化,将细胞悬液转移至5mL离心管中,取出新的1.5mL离心管,加入900μL的新鲜培养基,将细胞悬液混合均匀,取100μL细胞悬液至1.5mL的离心管中,混合均匀;
(3)取稀释后的细胞悬液10μL至提前准备好的细胞计数板中,在显微镜下进行计数,按照计上不计下,计左不计右的原则计数。
(4)计算母液细胞密度:(细胞数量/4)×10×104cell/mL;
(5)计算所需细胞悬液的体积,按照8000cell/孔的密度,每孔100μL进行铺板,显微镜下观察,放入细胞培养箱中继续培养24h左右;
(6)用培养基将母液浓度为10mM的新白叶藤碱化合物Z23分别稀释为10nM,25nM,50nM,100nM,250nM浓度,用不同浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理AGS细胞48h;
(7)药物处理48h后,用显微镜观察阴性对照组,记录50nM和100nM的新白叶藤碱衍生物Z23处理组的细胞形态。
结果如图2所示,阴性对照组细胞生长状态良好,而在新白叶藤碱衍生物Z23浓度为50nM时,细胞出现皱缩,而随着其浓度的增大,在浓度为100nM时,细胞形态变化更加明显。
2.MTT法检测新白叶藤碱衍生物对AGS细胞的抑制作用
用不同浓度的新白叶藤碱衍生物、阳性药顺铂和5-Fu处理过后的AGS细胞,在96孔板中每孔加入10μL的5mg/mL的MTT溶液,在细胞培养箱中继续孵育4h。
孵育完成后,小心将96孔板中的液体吸出,每孔加入100μL的DMSO溶液,在摇床上120r/min孵育20min。待96孔板中溶液均匀,用酶标仪在490nm处测量吸光度值,计算其抑制率。
结果如图3所示,本发明所述化合物新白叶藤碱衍生物Z23(10-250nM)能够显著抑制胃癌细胞的增值,其效果显著优于阳性药顺铂和5-Fu。
3.MTT法检测新白叶藤碱衍生物对胃黏膜上皮细胞GES-1细胞的毒性
采用上述2中所述方法,检测白叶藤碱衍生物对胃黏膜上皮细胞GES-1细胞的毒性。
结果如图4所示,本发明所述化合物新白叶藤碱衍生物Z23对正常胃黏膜上皮细胞GES-1的毒性较小,其IC50为39.85±2.69μM。
4.细胞迁移实验
(1)AGS细胞在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基(HyClone,USA)中,置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养,当细胞密度达到80%-90%时,将细胞从细胞培养箱中拿出,用PBS将细胞洗涤两次,每次4mL;加入2mL胰酶,放入培养箱中进行消化;
(2)用含有1%胎牛血清的完全培养基将新白叶藤碱衍生物Z23母液稀释为浓度为10nM和20nM的溶液,将细胞密度调整为3×104cell/孔,每孔加入含有新白叶藤碱衍生物Z23的细胞悬液100μL,将细胞悬液加入到24孔板小室的上室;
(3)在24孔板小室的下室加入100μL含有20%的胎牛血清的完全培养基。将24孔板放入细胞培养箱中继续培养48h;
(4)将24孔板上室和下室中的培养基小心吸出,用PBS清洗2次,在下室加入300μL的4%的多聚甲醛固定液,在室温固定20min;
(5)将固定液吸出,用PBS清洗两次,加入0.1%的结晶紫染液300μL,进行染色,20min;
(6)用PBS溶液清洗至溶液澄清,将小室晾干,置于倒置相差显微镜下观察细胞的染色情况。
结果如图5所示,本发明所述的新白叶藤碱衍生物Z23能够显著抑制胃癌细胞的迁移。
5.线粒体膜电位实验
(1)将直径为12mm圆形盖玻片浸泡在75%乙醇中,充分消毒后用PBS润洗三次,将盖玻片置于24孔板中,放置在超净工作台中备用;
(2)当AGS细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以10×103cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(3)分别用10nM,50nM,250nM浓度新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(4)将JC-10(200×)的染色液用超纯水稀释,稀释后剧烈震荡充分溶解并混匀JC-10,然后再加入适量JC-10染色缓冲液(5×),混匀后即为染色工作液;
(5)吸出培养基,用PBS洗涤两次,加入混匀的500μL的完全培养基和500μL的染色工作液,细胞培养箱中37℃孵育20min;
(6)将适量的5×的染色缓冲液用蒸馏水稀释为1×的染色缓冲液,置于冰浴;
(7)37℃孵育结束后,吸出上清液,用1×JC-10染色缓冲液洗涤两次;
(8)将盖玻片置于载玻片上,用荧光显微镜观察细胞。
结果如图6所示,浓度为10nM、50nM、250nM的新白叶藤碱衍生物Z23分别处理AGS细胞48h后,随着浓度的增加,绿色荧光较阴性对照组增强,红色荧光下降,因此,新白叶藤碱衍生物能够使细胞的线粒体膜电位降低,从而引起胃癌细胞凋亡。
6.Hoechst33258染色实验
(1)将直径为12mm圆形盖玻片浸泡在75%乙醇中,充分消毒后用PBS润洗三次,将盖玻片置于24孔板中,放置在超净工作台中备用;
(2)当AGS细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以10×103cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(3)分别用10nM,50nM,250nM浓度新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(4)将24孔板中的培养基吸出,加入300μL的4%的多聚甲醛溶液,室温固定20min;
(5)将24孔板中的固定液吸出,用PBS洗涤两次,用PBS将Hoechst 33258染色液(1mg/mL)稀释100倍,每孔加入300μL稀释过后的hoechst33258染色液,室温放置5分钟;
(6)吸出Hoechst33258染色液,用PBS洗涤3次,每次5min;
(7)将盖玻片置于载玻片上,用荧光显微镜观察细胞,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。
结果如图7所示,用不同浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理AGS细胞48h后,随着化合物浓度的增加,胃癌细胞的数量明显减少,而且化合物作用于胃癌AGS48h后,AGS细胞出现了明显的细胞核皱缩,强蓝色荧光的细胞数目增加,并呈现出浓度依赖性。
7.细胞凋亡实验
(1)当AGS细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以7×105cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(2)分别用10nM,50nM,250nM浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(3)将6孔板中的培养基转移至10mL离心管中,用PBS洗涤细胞两次,每次1mL,将洗涤液收集到10mL离心管中;
(4)用不含EDTA的胰酶消化细胞,一般消化时间为4min左右,加入收集的培养基混匀细胞,1500r/min,5min;
(5)弃上清,加入1mL4℃预冷的PBS,重悬细胞,离心收集细胞。
(6)弃上清,用去离子水按照1:3稀释结合缓冲液,6孔板中每孔加入300μL,调节其浓度为1-5×106cell/ml;
(7)取100μL的细胞悬液于5mL流式管中,加入5μL AnnexinV/Alexa Fluor 488混匀后于室温避光孵育5分钟;
(8)加入10μl 20μg/ml的碘化丙锭溶液(PI),并加400μl PBS,立刻进行流式检测,用flowjo进行数据分析。
分析结果如图8所示,新白叶藤碱衍生物Z23作用于AGS细胞后,其凋亡细胞的比例从3.5%增加到44.8%,可以明显促进胃癌细胞的凋亡,并且具有浓度依赖关系。
8.细胞周期实验
(1)当细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以1×106cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(2)分别用50nM,250nM浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(3)将6孔板中的培养基吸出,用PBS洗涤细胞两次,加入500μL胰酶,浸润细胞后将胰酶吸出,将其放入培养箱中,消化时间为4min左右;
(4)加入2mL培养基终止消化,将细胞吹打均匀,将细胞悬液转移至5mL离心管中,1000r/min,5min,离心收集细胞;
(5)弃上清液,用PBS重悬洗涤细胞一次,1800r/min,5min,离心收集细胞;
(6)弃细胞上清液700μL,加入700μL4℃预冷的无水乙醇,混匀细胞,将其放置于-20℃放置过夜固定;
(7)取固定的细胞1800r/min,8min,收集细胞;
(8)加入PBS重悬洗涤细胞2次,1800r/min,8min,离心收集细胞;
(9)弃上清后,加入100μL的RNaseA溶液重悬细胞,将其放置于37℃水浴锅中孵育30min;
(10)孵育过后,加入400μL的PI染色液,将其混匀,4℃避光孵育30min,流式细胞仪检测,用Modfit进行数据分析。
结果如图9所示,新白叶藤碱衍生物Z23作用于AGS细胞过程中,处于G0/G1期的细胞数目减少,而处于G2/M期的细胞数目增加。因此,新白叶藤碱衍生物Z23可以使肿瘤细胞AGS阻滞在G2/M期,进而抑制胃癌细胞的增殖。
9.qPCR实验
(1)当细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以1×106cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(2)用50nM浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(3)按照RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒的操作步骤提取细胞的RNA,将提取出的RNA用nanodrop2000测定浓度;
(4)加入RNA的质量为1μg,按照FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒进行反转录,反转录后用nanodrop2000测定cDNA的浓度;
(5)先通过PCR实验验证引物的特异性,所用的PCR程序为95℃,30s;56℃,30s;72℃,2min,30个循环;
(6)使用特异性较好的引物进行相关的qPCR实验,先将阴性对照组和给药组的cDNA浓度稀释为100ng/μL,按照SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green)试剂盒说明进行试验,并对结果进行分析。
结果如图10所示,新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h之后,调控细胞周期的基因CDK1和CylinB1的mRNA下调,进一步表明了新白叶藤碱衍生物Z23可以将胃癌细胞阻滞在G2/M期,E-cadherin的mRNA水平下降;经过新白叶藤碱衍生物Z23处理之后,AGS存在负反馈调节的结果导致其mRNA的水平降低。在细胞相关通路方面,在PI3K/AKT/m-TOR信号通路中,经过新白叶藤碱衍生物Z23处理过后,PI3KCA以及m-TOR的mRNA水平上升,AKT的mRNA水平下降;在其他信号通路中,β-catenin的mRNA水平下降,而GSK-3β,MEK的mRNA水平升高,由此说明新白叶藤碱衍生物Z23可能不仅仅通过PI3K/AKT/m-TOR信号通路发挥作用,其可以通过不同通路的调节发挥抗肿瘤作用。拓扑异构酶I和拓扑异构酶2β的基因TOP1和TOP2B的mRNA水平略有升高。
10.WesternBlot实验
蛋白提取:
(1)当细胞密度达到80%-90%时,按照上述步骤进行消化,以7×105cell/孔的密度进行铺板,将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右;
(2)用100nM浓度的新白叶藤碱衍生物Z23处理细胞48h;
(3)将培养基吸出,用PBS洗涤细胞一次,加入1mL胰酶,待其浸润细胞后,将胰酶吸出,将6孔板放入培养箱中消化4min左右;
(4)加入1.4mL的培养基终止消化,将细胞吹打均匀,将其转移到离心管中,1500r/min,5min,离心收集细胞,用PBS重悬洗涤细胞一次,1500r/min,5min,离心收集细胞;
(5)配置150μL的RIPA裂解液,加入1.5μL的磷酸酶抑制剂和1.5μLPMSF溶液,6孔板每孔加入70μL左右,将细胞混合均匀,置于冰上裂解30min,每10min震荡一次;
(6)裂解完毕后,将细胞置于低温高速离心机中,12000r/min,4℃,离心10min;
(7)将5mg/mL的BSA标准品稀释10倍,分别加入0,2,4,6,8,12,16,20μL至96孔板中,用PBS将其总体积补充至20μL,将离心后的上清液转移至新的离心管中,取2μL上清液至96孔板中;
(8)按照BCA试剂:Cu试剂=50:1的比例配置BCA工作液,配置完毕后,在每个96孔板中每孔加200μL的BCA工作液,置于37℃烘箱中孵育30min,用酶标仪在562nm处测定其吸光度值;
(9)通过标准曲线计算提取的蛋白的浓度;
(10)将剩余的蛋白样品加入5×的loading buffer,将其放置于金属浴中100℃变性10min,待其冷却后,2000r/min,离心3min。将变性后的蛋白样品放置于-20℃冰箱。
Western Blot实验:
(1)将制胶器,玻璃板等清洗干净并用蒸馏水润洗,配置10%的分离胶5mL,混合均匀后缓慢地加4.5mL左右,用蒸馏水将分离胶压平;
(2)30min后,观察分离胶的凝固情况,配置5%的基层胶3mL,混合均匀后缓慢加入1.5mL左右,插入1.0mm的10孔的梳子;
(3)30min后,将梳子缓慢拔出,倒入提前配置好的电泳液,根据BCA定量的结果上样25μg,marker加3μL,将电压调制70V,待蛋白样品转移至分离胶时,将电压调至120V,继续电泳,待蛋白样品距离电泳槽1cm左右时,停止电泳;
(4)提前准备好转膜液,将电泳后的玻璃撬开,取出胶,将电泳的蛋白样品切出,用剪刀剪取同样大小的0.22μm的PVDF膜,将PVDF膜放入甲醇中活化30s左右,将其转移至盘中的转膜液中,按照海绵-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-海绵的“三明治”结构进行转膜,同时注意“黑胶白膜”以及电极的正反等;
(5)将电泳槽放置于冰盒中,调节电流为300mA,转膜时间为2h,待转膜完毕后,取出PVDF膜,将其置于TBST溶液中,摇床上洗涤2次,每次10min;
(6)用TBST溶液配置5%的脱脂牛奶,将膜放置于5%的脱脂牛奶中,于摇床上室温封闭2h;
(7)封闭完成后,用TBST溶液洗涤PVDF膜三次,每次10min;
(8)洗完之后,按照目的条带的不同剪不同分子量的蛋白条带,然后将条带放置于相应的一抗溶液中,一抗用通用型抗体稀释液配置,一抗比例为1:2000,将其放置于4℃冰箱中过夜;
(9)将放置过夜的条带取出,用TBST溶液将条带洗涤三次,每次10min,将其放置于提前配制好的二抗溶液中,二抗通常用TBST溶液配制,其比例通常为1:10000。将其放置于摇床上室温孵育2h;
(10)孵育完成后,用TBST溶液洗涤条带三次,每次10min;
(11)按照A液:B液=1:1的比例配置ECL发光液,用曝光仪曝光条带,并拍照记录结果,用imageJ进行统计分析。
结果如图11所示,胃癌细胞AGS经过新白叶藤碱衍生物Z23处理后,与阴性对照组相比,PI3KCA蛋白的表达量降低,同时AKT和P-AKT的蛋白含量也下降,因此新白叶藤碱衍生物Z23通过影响PI3K/AKT/mTOR通路来抑制胃癌细胞的增值。经过新白叶藤碱衍生物Z23处理AGS细胞过后,细胞中E-cadherin蛋白的蛋白量升高,进一步从分子层面说明了经过新白叶藤碱衍生物Z23处理过后,抑制了胃癌细胞的迁移。新白叶藤碱衍生物Z23处理后还会引起周期蛋白CDK1蛋白的下降,而CylinB1蛋白含量增加,这从分子层面解释了新白叶藤碱衍生物Z23可以引起AGS细胞G2/M期的阻滞。除此之外,新白叶藤碱衍生物Z23还可以引起凋亡蛋白Cleaved-caspase3蛋白含量的升高,这与流式细胞仪的检测结果一致,即新白叶藤碱衍生物Z23能够促进胃癌细胞的凋亡。
Claims (5)
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料,制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述新白叶藤碱衍生物的制备方法为:将邻甲氨基苯甲醛、6-氟吲哚、p-TSA在无水乙醇中搅拌回流反应12h;冷却至室温,将反应物用NaOH洗涤,并将水层用二氯甲烷萃取即得。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述邻甲氨基苯甲醛的制备方法为:0℃,将过氧化氢和1-甲基碘化喹啉的混合物加到氢氧化钾水溶液和1,2-二氯乙烷中,反应30分钟;将所得混合物在室温搅拌48h,然后分离有机层,并将水层用二氯甲烷萃取;合并的有机层用无水硫酸镁干燥;减压浓缩有机层,得邻甲氨基苯甲醛。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述1-甲基碘化喹啉的制备方法为:在氮气条件下,将喹啉和CH3I在异丙醇中的混合,90℃加热反应3h,冷却至室温,用异丙醇/乙酸乙酯的混合物洗涤,得1-甲基碘化喹啉。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110657588.8A CN113288897B (zh) | 2021-06-13 | 2021-06-13 | 新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110657588.8A CN113288897B (zh) | 2021-06-13 | 2021-06-13 | 新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113288897A CN113288897A (zh) | 2021-08-24 |
CN113288897B true CN113288897B (zh) | 2022-05-27 |
Family
ID=77328230
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110657588.8A Active CN113288897B (zh) | 2021-06-13 | 2021-06-13 | 新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113288897B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115350189B (zh) * | 2022-09-22 | 2023-05-30 | 兰州大学 | 新白叶藤碱衍生物在制备治疗结直肠癌药物中的应用 |
-
2021
- 2021-06-13 CN CN202110657588.8A patent/CN113288897B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113288897A (zh) | 2021-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109134586B (zh) | 雷公藤红素衍生物及其应用 | |
CN102438449A (zh) | 抗癌药物及将其用于治疗恶性黑色素瘤及其它癌症 | |
CN113288897B (zh) | 新白叶藤碱衍生物在制备治疗胃癌药物中的应用 | |
CN113501819B (zh) | 吡啶并咪唑取代的喹唑啉酮衍生物及其合成方法和应用 | |
CN111569051B (zh) | 人血管内皮细胞抑制因子vegi-251在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN110548032B (zh) | 一种吡唑并嘧啶类化合物在制备预防/治疗肿瘤药物上的用途 | |
CN110790762B (zh) | 一组四氢吲哚并喹唑啉类化合物及其应用 | |
Gao et al. | Chromosome aberrations associated with centrosome defects: a study of comparative genomic hybridization in breast cancer | |
CN113687077B (zh) | PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用 | |
CN114848617A (zh) | 一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的应用 | |
Greenberger et al. | Acute myelogenous leukemia of the Wistar/Furth rat: establishment of a continuous tissue culture line producing lysozyme in vitro and in vivo | |
CN114907439B (zh) | 一种抗癌化合物及其制药用途 | |
CN109303779B (zh) | 氨基吡啶咪唑酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN115785134B (zh) | 一种含氮杂环的硼酸化合物及制备方法和应用 | |
CN110183320B (zh) | 一类多烯二酮类抗肿瘤化合物 | |
CN109321578A (zh) | Foxm1基因、用于检测其的试剂盒及其用途 | |
CN116041305B (zh) | 青霉菌(Penicillium mali)的发酵化合物及其制备方法和抗肿瘤应用 | |
CN114712345B (zh) | 四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN110872299B (zh) | 一种对苯醌并双三氮唑核心骨架衍生物及其制备方法和应用 | |
CN111991381B (zh) | 猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用 | |
CN115873042B (zh) | 一种含有生物活性基团的二价钌化合物及其合成方法和应用 | |
CN113413386B (zh) | 香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用 | |
CN117503771A (zh) | 一种靶向nras rna g-四链体的小分子配体在制备治疗乳腺癌药物中的应用 | |
CN115093474A (zh) | Cyth2作为靶点在筛选治疗非小细胞肺癌的药物中的应用 | |
CN116570585A (zh) | 光甘草定在制备治疗结直肠癌的药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |