CN113286652A - 用于使流通池基板图案化的系统和方法 - Google Patents

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袁大军
R·史密斯
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Abstract

本发明提供了一种使用光引发的化学反应使流通池基板图案化的方法，该方法包括通过如下制造平面波导流通池：在玻璃基板层上形成光耦合光栅层；在光耦合光栅层上沉积芯层；在芯层上沉积包覆层；以及在包覆层中形成纳米孔；对包覆层进行硅烷化；用第一组反应物涂覆硅烷化的包覆层和纳米孔；将第二组反应物引入纳米孔中，其中该第二组反应物包括目标反应物和光敏光引发剂体系；将光源耦合到光耦合光栅并且在平面波导流通池内将光内部导向以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应，其中该光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔的仅底部部分。

Description

用于使流通池基板图案化的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月9日提交的美国临时专利申请第62/884,753号和2019年8月21日提交的荷兰专利申请第2023679号的优先权；前述申请中每个申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
用于工业过程诸如通过边合成边测序的纳米孔基板的制造可涉及复杂的过程，该过程包括微流体装置诸如例如容纳或以其它方式包含纳米孔基板的流通池的表面官能化。在一些示例中，纳米孔基板制造的一个特别困难的方面涉及通过抛光纳米孔之间的间隙空间来去除存在于这些间隙区域中的现有表面化学物质。与这种类型的表面制备相关的问题包括过度抛光、抛光不足以及图案化表面的刮擦或损坏。因此，需要一种不受上述复杂性和困难的影响的制造纳米孔基板的方法。
发明内容
以下提供了某些示例的概述。本发明内容不是广泛的概述，并且不旨在识别本发明的关键或重要方面或元件或描绘其范围。
所述系统和方法的具体实施具有以下有益效果：使得能够对微流体装置(诸如流通池)内的纳米级特征进行在空间上分辨的化学图案化，并且通过完全消除抛光步骤来改善纳米孔基板制造。所述方法利用平面波导或类似装置来在空间上控制制造成流通池的每个纳米孔基板的特定预定区域的化学官能化。使用已知的流通池制造工艺将纳米孔基板图案化成微流体流通池装置。平面波导将激发光导向到每个纳米孔基板的仅底部，在此处它光引发化学反应，该化学反应将目标反应物共价结合到纳米孔基板的底部区域。在光引发之后的洗涤步骤期间去除未反应的分子，而对流通池图案化表面没有任何有害影响。在一些具体实施中，本发明所公开的系统和方法利用在边合成边测序过程期间使用的相同的光源和某些蓝光(例如，470nm波长)敏感的光引发剂体系。
根据一个具体实施，提供了用于使流通池基板图案化的第一方法。该方法包括制备用于光引发化学反应的流通池，其中该流通池包括其上形成有光耦合光栅的基板；设置在基板上方的第一材料层；设置在第一材料层上方的第二材料层；以及纳米孔，所述纳米孔形成在第二材料层中，其中每个纳米孔包括顶部部分和底部部分，并且其中制备该流通池包括对第二材料层进行硅烷化；以及用第一组反应物涂覆硅烷化的第二材料层和纳米孔；将第二组反应物引入纳米孔中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及在流通池内将光通过光耦合光栅内部导向到每个纳米孔的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔的仅底部部分。在某些示例中，该方法还包括将未反应的反应物从纳米孔中洗出；使用聚合物和与聚合物结合的叠氮部分作为第一组反应物；使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为聚合物；使用樟脑醌-胺光敏体系作为光敏光引发剂体系，该樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长；使用炔烃连接的引物作为目标反应物；使用炔烃连接的荧光团作为目标反应物；使用激光作为光源；以及对于基板使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于第一层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料，但其他值也是可能的。
根据另一个具体实施，提供了用于使流通池基板图案化的第二方法。该方法包括通过在玻璃基板层上形成光耦合光栅层来制造平面波导流通池；在光耦合光栅层上沉积芯层；在芯层上沉积包覆层；以及在包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中纳米孔基板限定其间的间隙区域；对包覆层进行硅烷化；用第一组反应物涂覆硅烷化的包覆层和纳米孔基板；将第二组反应物引入纳米孔基板中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；在平面波导流通池内将光通过光耦合光栅内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分。在某些示例中，该方法还包括将未反应的反应物从纳米孔中洗出；使用聚合物和与聚合物结合的叠氮部分作为第一组反应物；使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为聚合物；使用樟脑醌-胺光敏体系作为光敏光引发剂体系，该樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长；使用炔烃连接的引物作为目标反应物；使用炔烃连接的荧光团作为目标反应物；使用激光作为光源；以及对于光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料，但其他值也是可能的。
在又一个具体实施中，提供了用于使流通池基板在空间上图案化的第三方法。该方法包括通过在玻璃基板层上形成光耦合光栅层来制造平面波导流通池；在光耦合光栅层上沉积芯层；在芯层上沉积包覆层；以及在包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中纳米孔基板限定其间的间隙区域；以及对包覆层进行硅烷化；用第一组反应物涂覆包覆层和纳米孔基板，其中该第一组反应物还包括聚合物、结合到聚合物的叠氮部分、铜配体和光敏光引发剂体系；在平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物中的反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将聚合物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分；将第二组反应物引入纳米孔基板中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜配体和光敏光引发剂体系；以及在平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发共价结合的聚合物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分。在某些示例中，该方法还包括在每次光引发的化学反应之后将未反应的反应物从纳米孔基板中洗出；使用3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷对包覆层进行硅烷化；使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为聚合物；使用樟脑醌-胺光敏体系作为光敏光引发剂体系，该樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长；使用炔烃连接的引物作为目标反应物；使用炔烃连接的荧光团作为目标反应物；使用激光作为光源；以及对于光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料，但其他值也是可能的。
在另一个具体实施中，本文的方法包括通过降冰片烯硅烷的气相沉积进行硅烷化。在一个示例中，聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺通过以下过程旋涂在硅烷化层上：步骤1--600rpm，5秒，加速度1500rpm/秒；步骤2--1500rpm，30秒，加速度5000rpm/秒；步骤3--4000rpm，5秒，加速度5000rpm/秒；步骤4--600rpm，5秒，加速度5000rpm/秒，并且随后优选地在65℃-75℃处加热1小时。在另一个示例中，硅烷化通过如下进行：气相沉积3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷，之后优选地使用光引发反应将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与叠氮基团交联，该光引发反应使用双官能交联剂诸如NH-双(PEG-2炔丙基)、光引发剂(例如，470nm处的樟脑醌)和具有配体的硫酸铜例如PMDTA。在又一个示例中，使用优选为激光的光将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)共价结合到纳米孔底部的表面。
根据另一个具体实施，本文的方法包括将光通过光耦合光栅导向每个纳米孔的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应。在一个示例中，随后使用EDTA(0.1M)的稀释溶液去除铜。在另一个示例中，该方法不存在去除存在于纳米孔之间的间隙区域中的任何现有表面化学物质的抛光步骤。
在又一个具体实施中，提供了流通池。在一个示例中，流通池包括：基板；布置在基板上的光耦合光栅层；该光耦合光栅层具有折射率；布置在光耦合光栅层上的芯层，该芯层具有折射率，其中该芯层的折射率大于光耦合光栅层的折射率；布置在芯层上的硅烷化层，其中硅烷化层的多个纳米孔由间隙区域分开。在一个示例中，基板为玻璃。在另一个示例中，光耦合光栅层和芯层由树脂形成。在又一个示例中，光耦合光栅层和/或芯层由五氧化二钽形成。在又一个示例中，流通池包括共价结合到纳米孔底部处的表面的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。在另一个示例中，流通池包括布置在第一组反应物上的第二组反应物，并且包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系。在又一个示例中，流通池为平面波导流通池。该流通池可用于核酸测序，包括高容量边合成边测序，并且可根据本文所公开的用于制造流通池和使流通池基板在空间上图案化的任何方法来制备。
应当理解，本文所述的本公开的每个方面的任何相应特征/示例可以任何组合一起实现，以实现如本文所述的益处和结果，并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何组合实现以实现如本文所述的益处。
本公开包括以下条款：
1.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制备用于光引发化学反应的流通池，其中所述流通池包括其上形成有光耦合光栅的基板；
设置在所述基板上方的第一材料层；
设置在所述第一材料层上方的第二材料层；以及
纳米孔，所述纳米孔形成在所述第二材料层中，其中每个纳米孔包括顶部部分和底部部分，并且其中制备所述流通池包括：
对所述第二材料层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述硅烷化的第二材料层和纳米孔；
将第二组反应物引入所述纳米孔中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述流通池内将光通过所述光耦合光栅内部导向到每个纳米孔的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的化学反应，
其中所述光引发化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔的仅所述底部部分。
2.根据条款1所述的方法，还包括将未反应的反应物从所述纳米孔中洗出。
3.根据条款1-2中任一项所述的方法，还包括使用聚合物和结合到所述聚合物的叠氮部分作为所述第一组反应物。
4.根据条款3所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
5.根据条款1-4中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用470nm的光波长。
6.根据条款1-5中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
7.根据条款1-6中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
8.根据条款1-7中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
9.根据条款1-8中任一项所述的方法，还包括对于所述基板使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述第一层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
10.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制造平面波导流通池，其中制造所述平面波导流通池包括：
在玻璃基板层上形成光耦合光栅层；
在所述光耦合光栅层上沉积芯层；
在所述芯层上沉积包覆层；以及
在所述包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中所述纳米孔基板限定其间的间隙区域；
对所述包覆层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述硅烷化的包覆层和纳米孔基板；
将第二组反应物引入所述纳米孔基板中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述平面波导流通池内将光通过所述光耦合光栅内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的化学反应，
其中所述光引发化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分。
11.根据条款10所述的方法，还包括将未反应的反应物从所述纳米孔基板中洗出。
12.根据条款10-11中任一项所述的方法，还包括使用聚合物和结合到所述聚合物的叠氮部分作为所述第一组反应物。
13.根据条款12所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
14.根据条款10-13中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用470nm的光波长。
15.根据条款10-14中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
16.根据条款10-15中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
17.根据条款10-16中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
18.根据条款10-17中任一项所述的方法，还包括对于所述光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
19.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制造平面波导流通池，其中制造所述平面波导流通池包括：
在玻璃基板层上形成光耦合光栅层；
在所述光耦合光栅层上沉积芯层；
在所述芯层上沉积包覆层；以及
在所述包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中所述纳米孔基板限定其间的间隙区域；以及
对所述包覆层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述包覆层和纳米孔基板，其中所述第一组反应物还包括聚合物、结合到所述聚合物的叠氮部分、铜配体和光敏光引发剂体系；
在所述平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物中的所述反应物之间的化学反应，其中所述光引发的化学反应将所述聚合物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分；
将第二组反应物引入所述纳米孔基板中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述共价结合的聚合物与所述第二组反应物之间的化学反应，其中所述光引发的化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分。
20.根据条款19所述的方法，还包括在每次光引发的化学反应之后将未反应的反应物从纳米孔基板中洗出。
21.根据条款19-20中任一项所述的方法，还包括使用3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷来对所述包覆层进行硅烷化。
22.根据条款19-21中任一项所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
23.根据条款19-22中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长。
24.根据条款19-23中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
25.根据条款19-23中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
26.根据条款19-25中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
27.根据条款19-26中任一项所述的方法，还包括对于所述光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
28.根据前述条款1-18中任一项所述的方法，其中硅烷化通过降冰片烯硅烷的化学气相沉积进行。
29.根据前述条款4-9、13-18中任一项所述的方法，其中聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺通过以下过程旋涂在所述硅烷化层上：步骤1--600rpm，5秒，加速度1500rpm/秒；步骤2--1500rpm，30秒，加速度5000rpm/秒；步骤3--4000rpm，5秒，加速度5000rpm/秒；步骤4--600rpm，5秒，加速度5000rpm/秒，并且随后优选地在65℃-75℃处加热1小时。
30.根据前述条款21-27中任一项所述的方法，其中硅烷化通过如下进行：气相沉积3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷，之后优选地使用光引发反应将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与叠氮基团交联，所述光引发反应使用双官能交联剂诸如NH-双(PEG-2炔丙基)、光引发剂(例如CQ，约470nm)、硫酸铜+配体例如PMDTA。
31.根据前述条款中任一项所述的方法，其中使用优选为激光的光将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共价结合到所述纳米孔的所述底部处的表面。
32.根据条款30或31所述的方法，其中随后使用EDTA(0.1M)的稀释溶液去除铜。
33.根据前述条款中任一项所述的方法，不存在去除存在于所述纳米孔之间的间隙区域中的任何现有表面化学物质的抛光步骤。
34.根据前述条款中任一项所述的方法，其中将光通过光耦合光栅导向到每个纳米孔的仅底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的所述化学反应。
35.一种用于光引发化学反应的流通池(10)，所述流通池包括：
基板(100)，
布置在所述基板(100)上的光耦合光栅层(200)，所述光耦合光栅层(200)具有折射率，
布置在所述光栅层(200)上的芯层(300)，所述芯层(300)具有折射率，其中所述芯层(300)的折射率大于所述光耦合光栅层(200)的折射率，
布置在所述芯层(300)上的硅烷化层(400)，其中硅烷化层(400)存在多个纳米孔(500)，并且
其中所述纳米孔(500)由间隙区域(600)分开。
36.根据结论35所述的流通池(10)，其中所述基板(100)为玻璃。
37.根据条款35或36所述的流通池，其中所述光耦合光栅层(200)和所述芯层(300)由树脂形成。
38.根据条款37所述的流通池，其中所述光耦合光栅层(200)和/或所述芯层(300)由五氧化二钽形成。
39.根据条款35-38中任一项所述的流通池，其中所述硅烷化层(400)由水缓冲或聚合物包覆层形成。
40.根据前述条款35-39中任一项所述的流通池，其中所述光耦合光栅层(200)的折射率在0.5至2.0、0.8至1.5或1.0至1.3的范围内，并且芯层(300)的折射率在1.5至2.5、1.8至2.3或2.0至2.15的范围内。
41.根据前述条款35-40中任一项所述的流通池，其中所述聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共价结合到所述纳米孔(500)的所述底部处的表面。
42.根据条款41所述的流通池，还包括第一组反应物，所述第一组反应物布置在共价结合到所述纳米孔(500)的所述底部处的表面的所述聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺上。
43.根据条款42所述的流通池，其中第二组反应物布置在所述第一组反应物上，所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系。
44.一种使用由前述条款1-34中任一项所述制备的流通池和/或根据条款35-43中任一项所述的流通池对核酸进行测序的方法。
45.一种用于光引发化学反应的系统，所述系统包括根据前述条款35-43中任一项所述的流通池以及优选为激光光源的光源。
在阅读并理解以下对示例的详细描述后，本发明的附加特征和方面对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。如技术人员将理解的，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，本发明的另外的示例是可能的。因此，附图和相关描述应被视为例示性的而非限制性的。
附图说明
一个或多个具体实施的细节在附图和下文的描述中进行阐述。根据说明书、附图和权利要求书，其他特征、方面和优点将变得显而易见，其中：
图1A示出了根据本发明所公开的系统和方法的一个具体实施的平面波导流通池的结构；
图1B示出了在一个具体实施中的图1A的流通池，其中流通池的上表面已使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)用叠氮部分水凝胶涂覆；
图1C示出了在一个具体实施中的图1B的流通池，其中反应物已被引入流通池中，其中该反应物包括炔烃连接的引物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；
图1D示出了在一个具体实施中的图1C的流通池，其中平面波导已耦接到流通池并且将光导向到流通池中；
图1E示出了在一个具体实施中的流通池内的纳米孔的近距离视图，其示出了其上已共价结合有引物的纳米孔的区域；
图2A示出了在本发明所公开的方法的一个具体实施中的化学反应，其中PAZAM-叠氮聚合物附接到平面波导流通池的表面；
图2B示出了在本发明所公开的方法的一个具体实施中的化学反应，其中使用光引发的炔烃-叠氮点击反应将目标反应物共价结合到纳米孔基板；
图3A示出了在本发明所公开的方法的另一个具体实施中的化学反应，其中利用第一光引发的点击反应使涂覆到平面波导流通池的表面上的PAZAM-叠氮聚合物图案化；
图3B示出了化学反应，其中使用第二次光引发的点击反应将引物(荧光团)图案化到图3A的PAZAM层上。
图4是示出用于使流通池基板图案化的第一方法的具体实施的流程图；
图5是示出用于使流通池基板图案化的第二方法的具体实施的流程图；并且
图6是示出用于使流通池基板图案化的第三方法的具体实施的流程图。
具体实施方式
所公开的系统和方法的具体实施利用平面波导来在空间上控制用于微流体装置(诸如用于边合成边测序的流通池)中的纳米孔的化学官能化。平面波导(即，具有平面几何形状的波导，其仅在一个方向上引导光)将激发光导向到纳米孔的仅底部区域中，在该底部区域处激发光光引发将目标反应物共价结合到纳米孔的底部的化学反应。在洗涤过程中去除未反应的分子，从而将目标化学物质定位于纳米孔的底部。
所公开的系统和方法的具体实施可包括光引发的叠氮-炔烃点击反应，诸如用于边合成边测序技术中的那些。在这种类型的反应中，叠氮官能团结合到跨微流体通道的表面形成的水凝胶层，然后添加炔烃-引物反应物。在某些示例中，使用铜化合物和光引发剂体系(诸如II型光引发剂体系，例如樟脑醌)来光引发叠氮-炔烃点击反应。该光引发剂体系可使用约470nm的蓝光作为激发源。混合化学可通过将另选的官能团结合到PAZAM中而将它们添加到水凝胶层中来实现。例如，叠氮和四唑可结合到PAZAM中。叠氮-炔烃点击反应是利用波长在450nm与495nm之间的光(例如蓝色)光引发的，四唑-烯烃反应是利用波长在520nm与560nm之间的不同光(例如绿色)光引发的。在一个示例中，所采用的蓝光具有约470nm的波长。
一般来讲，点击反应(点击化学)涉及生物缀合中常用于将各种基板与特定生物分子连接的生物相容性小分子反应。术语“点击化学”不是指单个特定反应，而是指用于通过将小模块单元彼此接合而生成物质的化学方法。在许多应用中，点击反应用于连接生物分子和报告分子。点击化学不限于生物学应用，并且点击反应的概念已用于药理学应用中。叠氮-炔烃点击反应涉及叠氮与炔烃的铜催化反应以形成5元杂原子环：Cu(I)催化的叠氮-炔环加成(CuAAC)。这种性质的光引发反应在Chen等人，Photoinitiated Alkyne-AzideClick and Radical Cross-Linking Reactions for the Patterning of PEGHydrogels,BioMacromolecules,2012,13:889-895；Shete和Kloxin,One-pot blue lighttriggered tough interpenetrating polymeric network(IPN)using CuAAC andmethacrylate reactions,Polym.Chem.,2017,8(24):3668-3673；以及Shete等人，Blue-light activated rapid polymerization for defect-free bulk Cu(i)-catalyzedazide-alkene cycloaddition(CuAAC)crosslinked networks,Chem.Commun(Camb).,2016,52(69):10574-10577中有所描述。
参考图1A至图1E，这些图示出了包括平面波导的流通池的制造。示例性平面波导流通池10包括：基板100，其可为玻璃；光耦合光栅层200，其可为树脂；芯层300，其可为折射率高于用于光耦合光栅层200的树脂的树脂(例如，五氧化二钽)；以及水缓冲或图案化的聚合物包覆层400(参见图1A)，其中形成多个纳米孔500。接下来，包覆层400的上表面涂覆有水凝胶(例如，PAZAM)，叠氮部分700已结合到该水凝胶上(参见图1B)。接下来，将各种反应物800引入流通池10中，其中反应物包括炔烃连接的底漆、铜螯合配体、光敏光引发剂体系(参见图1C)。接下来，使用光聚焦光学器件将光导向到平面波导流通池10中，使得光耦合光栅200和芯层300在流通池10内内部反射光。渐消波穿透每个纳米孔500的底部以引发期望的化学反应。测序引物或其他分子仅共价结合到每个纳米孔500的底部区域，并且在空间上被排除在间隙区域600之外。洗涤步骤随后从纳米孔中去除未反应的成分，例如任何未结合的水凝胶或未结合的引物。合适的洗涤溶液包括pH为至少10的碱性缓冲液和氢氧化钠。图1E提供了纳米孔500的特写，并且图1E的区域502指示光引发反应完成后共价结合的测序引物(或其他分子)的位置。
在各种具体实施中，光耦合光栅层200的材料的折射率在0.5至2.0、0.8至1.5或1.0至1.3的范围内，并且芯层300的材料的折射率在1.5至2.5、1.8至2.3或2.0至2.15的范围内。增加光耦合光栅层200和芯层300的折射率值之间的对比度差值可改善光进入平面波导流通池10的耦合效率，前提条件是上层(即，芯层300)的折射率保持大于下层(即，光耦合光栅层200)的折射率。在一个具体实施中，芯层300包括金属氧化物或由其制成，诸如例如五氧化二钽(Ta2O5)。
以下可商购获得的材料可用于本发明所公开的方法的具体实施中；(i)降冰片烯硅烷：[(5-双环[2.2.1]HEPT-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷，tech-95，内型/外型异构体(Gelest Inc.)；(ii)PAZAM：任何丙烯酰胺与Azapa比率的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)；(iii)Azapa：N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；(iv)五水合硫酸铜(II)(CuSO4.5H2O)(Sigma-Aldrich)；(v)N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDTA)，(Sigma-Aldrich)；(vi)Alexa
Figure BDA0003139018870000131
488炔烃(AF-488炔烃)(Invitrogen)；(vii)樟脑醌(CQ)光引发剂(Sigma-Aldrich)；(viii)乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma-Aldrich)；(ix)NH-双(PEG-2炔丙基)(BroadPharm)，BP-2313；(x)3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷(GelestInc.)。
方案I：一步光引发的点击反应
参考图2A至图2B，本发明所公开方法的一种具体实施利用包括使用约470nm光的樟脑醌-胺光敏体系的叠氮-炔烃点击反应的光引发机制。如上所述制造平面波导流通池，并且通过利用叠氮部分已结合到其上的PAZAM聚合物来进一步处理包覆层400。如图2A所示，首先使用化学气相沉积工艺用降冰片烯硅烷衍生物对包覆层400的上表面进行硅烷化；该工艺可为行业中的标准工艺。表面被涂覆，然后用PAZAM热交联。这可根据以下方法实现(描述于美国专利申请公布第2015/0005447A1号)：将500μL的含水PAZAM(0.25％+5％乙醇)沉积在降冰片烯硅烷化的玻璃基板的顶部上并铺展在整个表面上。PAZAM薄膜通过用以下过程旋涂而获得：步骤1--600rpm，5秒，加速度1500rpm/秒；步骤2--1500rpm，30秒，加速度5000rpm/秒；步骤3--4000rpm，5秒，加速度5000rpm/秒；步骤4-600rpm，5秒，加速度5000rpm/秒。旋涂后，将基板在烘箱或热板中于65℃-75℃处加热1小时。
如图2B所示，制备含有Alexa
Figure BDA0003139018870000141
488(AF-488炔烃)(30％w/w)与碳酸钾(35mM)和等浓度的CuSO4·5H2O、(PMDTA)和光引发剂樟脑醌的聚合物溶液(注意：该溶液的变体包括测序引物而不是AF-488炔烃)。可对溶液进行超声处理以促进溶解。然后将溶液引入流通池的通道中并保持在那里以使用平面波导的激发激光光学器件进行点击反应的后续光引发。在光引发的点击反应完成后，使用与铜形成络合物的EDTA(0.1M)的溶液从流通池通道中洗去铜。可使用共聚焦荧光显微镜收集荧光图像以验证荧光团在流通池的纳米孔内的存在。如先前所指出的那样，反应仅发生在纳米孔的底部区域中，因为光通过平面波导光栅仅被导向到纳米孔中。不使用抛光，因为染料标记的分子仅结合在纳米孔粒中，而不结合在纳米孔之间的间隙空间或区域中。
方案II：两步光引发的点击反应
参考图3A至图3B，本发明所公开的方法的另一个具体实施提供了两步光引发的点击反应，该反应也使用了使用约470纳米光的樟脑醌-胺光敏体系。该两步方法使试剂从期望目标区域的扩散最小化，从而导致流通池纳米孔之间的间隙空间或区域的较少官能化。如上所述制造平面波导，并且在该具体实施的第一步中(参见图3A)，使用第一光引发的点击反应在纳米孔中对PAZAM进行光图案化。该第一步包括使用3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷通过化学气相沉积工艺将叠氮基团附接到流通池的表面；该工艺可为行业中的标准工艺。然后使用光引发反应将PAZAM与叠氮基团交联，该光引发反应使用双官能交联剂诸如NH-双(PEG-2炔丙基)、光引发剂(例如CQ，约470nm)和具有配体的硫酸铜(例如PMDTA)以及光。使用导向到平面波导中的激光将PAZAM共价结合到纳米孔的底部处的表面。在反应完成后，使用与铜形成络合物的EDTA(0.1M)的稀释溶液去除铜。
在第二步(参见图3B)中，使用第二光引发的点击反应使荧光标记(或另一分子)图案化。制备含有Alexa
Figure BDA0003139018870000142
488(AF-488炔烃)(30％w/w)与碳酸钾(35mM)和等浓度的CuSO4·5H2O、PMDTA和光引发剂樟脑醌的聚合物溶液。可对溶液进行超声处理以促进溶解。然后将溶液引入流通池的通道中并保持在那里以使用平面波导的激发激光光学器件进行后续光引发。在光引发的点击反应完成后，使用与铜形成络合物的EDTA(0.1M)的溶液从通道中洗去铜。使用共聚焦荧光显微镜收集荧光图像以验证荧光团在流通池的纳米孔内的存在。如先前所指出的那样，反应仅发生在纳米孔的底部处，因为光通过平面波导光栅仅被导向到纳米孔中。不需要抛光，因为Alexa标记的染料分子仅结合在纳米孔粒中，而不结合在纳米孔之间的间隙空间或区域中。
图4是示出用于使流通池基板图案化的第一方法的具体实施的流程图。用于使流通池基板400图案化的第一方法包括在框402处制备用于光引发的化学反应的流通池，其中该流通池包括其上形成有光耦合光栅的基板；设置在基板上方的第一材料层；设置在第一材料层上方的第二材料层；以及纳米孔，所述纳米孔形成在第二材料层中，其中每个纳米孔包括顶部部分和底部部分，并且其中制备该流通池包括在框404处对第二材料层进行硅烷化；以及在框406处用第一组反应物涂覆硅烷化的第二材料层和纳米孔；在框408处将第二组反应物引入纳米孔中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及在框410处在流通池内将光通过光耦合光栅内部导向到每个纳米孔的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔的仅底部部分。
关于图4中示出的具体实施，以下是所述方法的各个方面的非限制性示例。示例性光引发的化学反应包括使用预定波长在约450nm与495nm之间的蓝光的叠氮-炔烃化学反应；使用预定波长在约520nm与560nm之间的绿光的四唑-烯烃化学反应；以及利用二苯并环辛炔作为环丙烯酮的三键掩蔽的无金属叠氮/乙炔环加成反应(参见例如，JACS 2009,131,15769-15776)。用于在基板(其可为玻璃)上形成光耦合光栅的示例性技术包括二氧化硅(SiO2)光栅的光刻图案化、剥离工艺、激光蚀刻和纳米压印。用于第一材料层的示例性材料包括低折射率纳米压印光刻(NIL)树脂和低折射率聚合物。用于在基板上沉积第一材料层的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于第二材料层的示例性材料包括高折射率树脂、高折射率聚合物和金属氧化物，诸如例如五氧化二钽(Ta2O5)。用于在第一材料层上沉积第二材料层的示例性技术包括真空薄膜气相沉积、溅射涂覆和旋涂。用于在第二材料层中形成纳米孔的示例性技术包括纳米压印光刻图案化。用于用第一组反应物涂覆硅烷化的第二材料层和纳米孔的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于将第二组反应物引入纳米孔中的示例性技术包括使用微流体泵系统，诸如例如蠕动泵。用于在流通池内将光通过光耦合光栅内部导向的示例性技术包括使用聚焦光学器件将来自外部源的光导向到流通池中。
图5是示出用于使流通池基板图案化的第二方法的具体实施的流程图。用于使流通池基板500图案化的第二方法包括：在框502处通过在框504处在玻璃基板层上形成光耦合光栅层来制造平面波导流通池；在框506处在光耦合光栅层上沉积芯层；在框508处在芯层上沉积包覆层；以及在框510处在包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中纳米孔基板限定其间的间隙区域；在框512处对包覆层进行硅烷化；在框514处用第一组反应物涂覆硅烷化的包覆层和纳米孔基板；在框516处将第二组反应物引入纳米孔基板中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及在框518处在平面波导流通池内将光通过光耦合光栅内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分。
关于图5中示出的具体实施，以下是所述方法的各个方面的非限制性示例。用于在基板(其可为玻璃)上形成光耦合光栅层的示例性技术包括二氧化硅(SiO2)光栅的光刻图案化、剥离工艺、激光蚀刻和纳米压印。用于芯层的示例性材料包括低折射率纳米压印光刻(NIL)树脂和低折射率聚合物。用于在基板上沉积芯层的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于包覆层的示例性材料包括高折射率树脂、高折射率聚合物和金属氧化物，诸如例如五氧化二钽(Ta2O5)。用于在芯层上沉积包覆层的示例性技术包括真空薄膜气相沉积、溅射涂覆和旋涂。用于在第二材料层中形成纳米孔的示例性技术包括纳米压印光刻图案化。用于用第一组反应物涂覆硅烷化的包覆层和纳米孔的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于将第二组反应物引入纳米孔中的示例性技术包括使用微流体泵系统，诸如例如蠕动泵。用于在流通池内将光通过光耦合光栅内部导向的示例性技术包括使用聚焦光学器件将来自外部源的光导向到流通池中。示例性光引发的化学反应包括使用预定波长在约450nm与495nm之间的蓝光的叠氮-炔烃化学反应；使用预定波长在约520nm与560nm之间的绿光的四唑-烯烃化学反应；以及利用二苯并环辛炔作为环丙烯酮的三键掩蔽的无金属叠氮/乙炔环加成反应(参见例如，JACS 2009,131,15769-15776)。
图6是示出用于使流通池基板图案化的第三方法的具体实施的流程图。用于使流通池基板600图案化的第三方法包括：在框602处通过在框604处在玻璃基板层上形成光耦合光栅层来制造平面波导流通池；在框606处在光耦合光栅层上沉积芯层；在框608处在芯层上沉积包覆层；以及在框610处在包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中纳米孔基板限定其间的间隙区域；以及在框612处对包覆层进行硅烷化；在框614处用第一组反应物涂覆所述包覆层和纳米孔基板，其中所述第一组反应物还包括聚合物、结合到所述聚合物的叠氮部分、铜配体和光敏光引发剂体系；在框616处在平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发第一组反应物中的反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将聚合物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分；在框618处将第二组反应物引入纳米孔基板中，其中该第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜配体和光敏光引发剂体系；以及在框620处在平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅底部部分，以用于光引发共价结合的聚合物与第二组反应物之间的化学反应，其中光引发的化学反应将目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅底部部分。
关于图6中示出的具体实施，以下是所述方法的各个方面的非限制性示例。用于在基板(其可为玻璃)上形成光耦合光栅的示例性技术包括二氧化硅(SiO2)光栅的光刻图案化、剥离工艺、激光蚀刻和纳米压印。用于芯层的示例性材料包括低折射率纳米压印光刻(NIL)树脂和低折射率聚合物。用于在基板上沉积芯层的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于包覆层的示例性材料包括高折射率树脂、高折射率聚合物和金属氧化物，诸如例如五氧化二钽(Ta2O5)。用于在芯层上沉积包覆层的示例性技术包括真空薄膜气相沉积、溅射涂覆和旋涂。用于在第二材料层中形成纳米孔的示例性技术包括纳米压印光刻图案化。用于用第一组反应物涂覆硅烷化的包覆层和纳米孔的示例性技术包括溅射涂覆和旋涂。用于将第二组反应物引入纳米孔中的示例性技术包括使用微流体泵系统，诸如例如蠕动泵。用于在流通池内将光通过光耦合光栅内部导向的示例性技术包括使用聚焦光学器件将来自外部源的光导向到流通池中。示例性光引发的化学反应包括使用预定波长在约450nm与495nm之间的蓝光的叠氮-炔烃化学反应；使用预定波长在约520nm与560nm之间的绿光的四唑-烯烃化学反应；以及利用二苯并环辛炔作为环丙烯酮的三键掩蔽的无金属叠氮/乙炔环加成反应(参见例如，JACS 2009,131,15769-15776)。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和网页，无论这些文献和类似材料的格式如何，都明确地全文以引用方式并入。如果所并入文献和类似材料中的一者或多者与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。
提供上述说明以使得本领域的技术人员能够实践本文所述的各种构型。虽然已参考各种附图和构型具体描述了本主题技术，但应当理解，这些附图和构型仅用于说明目的，而不应被视为限制本主题技术的范围。
如本文所用，以单数形式叙述且前面带有词语“一个”或“一种”的元件或步骤应当理解为不排除多个所述元件或步骤，除非明确地指明此类排除。此外，对“一个具体实施”的引用并非旨在被解释为排除也包含所叙述特征的附加具体实施的存在。此外，除非有相反的明确说明，否则“包括”或“具有”具有特定属性的一个或多个元件的具体实施可包括附加元件，无论它们是否具有该属性。
在本说明书通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明小的波动，诸如由于处理中的变化所引起的小的波动。例如，它们可以指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
可存在许多其他方式来实现本主题技术。在不脱离本主题技术的范围的情况下，本文所述的各种功能和元件可与所示的那些功能和元件不同地划分。对这些具体实施的各种修改对于本领域的技术人员而言可以是显而易见的，并且本文所定义的一般原理可应用于其他具体实施。因此，在不脱离本主题技术的范围的情况下，本领域的普通技术人员可对本主题技术进行许多改变和修改。例如，可采用不同数量的给定模块或单元，可采用一个或多个不同类型的给定模块或单元，可添加给定模块或单元或者可省略给定模块或单元。
带下划线和/或斜体的标题和子标题仅为了方便起见而使用，不限制本主题技术，并且不与本主题技术的描述的解释结合引用。本领域的普通技术人员已知的或稍后将知道的贯穿本公开描述的各种具体实施的元件的所有结构和功能等同物明确地以引用方式并入本文并且旨在被本主题技术所涵盖。此外，本文所公开的任何内容都不旨在专用于公众，而不管以上描述中是否明确地叙述了此类公开内容。
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。

Claims (45)

1.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制备用于光引发化学反应的流通池，其中所述流通池包括其上形成有光耦合光栅的基板；
设置在所述基板上方的第一材料层；
设置在所述第一材料层上方的第二材料层；以及
纳米孔，所述纳米孔形成在所述第二材料层中，其中每个纳米孔包括顶部部分和底部部分，并且其中制备所述流通池包括：
对所述第二材料层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述硅烷化的第二材料层和纳米孔；
将第二组反应物引入所述纳米孔中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述流通池内将光通过所述光耦合光栅内部导向到每个纳米孔的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的化学反应，
其中所述光引发化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔的仅所述底部部分。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括将未反应的反应物从所述纳米孔中洗出。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，还包括使用聚合物和结合到所述聚合物的叠氮部分作为所述第一组反应物。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括对于所述基板使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述第一层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
10.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制造平面波导流通池，其中制造所述平面波导流通池包括：
在玻璃基板层上形成光耦合光栅层；
在所述光耦合光栅层上沉积芯层；
在所述芯层上沉积包覆层；以及
在所述包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中所述纳米孔基板限定其间的间隙区域；
对所述包覆层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述硅烷化的包覆层和纳米孔基板；
将第二组反应物引入所述纳米孔基板中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述平面波导流通池内将光通过所述光耦合光栅内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的化学反应，
其中所述光引发化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括将未反应的反应物从所述纳米孔基板中洗出。
12.根据权利要求10和11中任一项所述的方法，还包括使用聚合物和结合到所述聚合物的叠氮部分作为所述第一组反应物。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的方法，还包括对于所述光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
19.一种用于使流通池基板图案化的方法，包括：
制造平面波导流通池，其中制造所述平面波导流通池包括：
在玻璃基板层上形成光耦合光栅层；
在所述光耦合光栅层上沉积芯层；
在所述芯层上沉积包覆层；以及
在所述包覆层中形成纳米孔基板，其中每个纳米孔基板包括顶部部分和底部部分，并且其中所述纳米孔基板限定其间的间隙区域；以及
对所述包覆层进行硅烷化；
用第一组反应物涂覆所述包覆层和纳米孔基板，其中所述第一组反应物还包括聚合物、结合到所述聚合物的叠氮部分、铜配体和光敏光引发剂体系；
在所述平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述第一组反应物中的所述反应物之间的化学反应，其中所述光引发的化学反应将所述聚合物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分；
将第二组反应物引入所述纳米孔基板中，其中所述第二组反应物包括至少一种目标反应物、铜配体和光敏光引发剂体系；以及
在所述平面波导流通池内将预定波长的光内部导向到每个纳米孔基板的仅所述底部部分，以用于光引发所述共价结合的聚合物与所述第二组反应物之间的化学反应，其中所述光引发的化学反应将所述目标反应物共价结合到每个纳米孔基板的仅所述底部部分。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括在每次光引发的化学反应之后将未反应的反应物从纳米孔基板中洗出。
21.根据权利要求19-20中任一项所述的方法，还包括使用3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷来对所述包覆层进行硅烷化。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，还包括使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺作为所述聚合物。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，还包括使用樟脑醌-胺光敏体系作为所述光敏光引发剂体系，所述樟脑醌-胺光敏体系使用约470nm的光波长。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的引物作为所述目标反应物。
25.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，还包括使用炔烃连接的荧光团作为所述目标反应物。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，还包括使用激光作为光源。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，还包括对于所述光耦合光栅层使用折射率在1.0至1.3范围内的材料，并且对于所述芯层使用折射率在2.0至2.15范围内的材料。
28.根据前述权利要求1-18中任一项所述的方法，其中硅烷化通过降冰片烯硅烷的化学气相沉积进行。
29.根据前述权利要求4-9、13-18中任一项所述的方法，其中聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺通过以下过程旋涂在所述硅烷化层上：步骤1--600rpm，5秒，加速度1500rpm/秒；步骤2--1500rpm，30秒，加速度5000rpm/秒；步骤3--4000rpm，5秒，加速度5000rpm/秒；步骤4--600rpm，5秒，加速度5000rpm/秒，并且随后优选地在65℃-75℃处加热1小时。
30.根据前述权利要求21-27中任一项所述的方法，其中硅烷化通过如下进行：气相沉积3-叠氮基丙基三甲氧基硅烷，之后优选地使用光引发反应将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺与叠氮基团交联，所述光引发反应使用双官能交联剂。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用优选为激光的光将聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共价结合到所述纳米孔的所述底部处的表面。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中随后使用EDTA(0.1M)的稀释溶液去除铜。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，不存在去除存在于所述纳米孔之间的间隙区域中的任何现有表面化学物质的抛光步骤。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将光通过光耦合光栅导向到每个纳米孔的仅底部部分，以用于光引发所述第一组反应物与所述第二组反应物之间的所述化学反应。
35.一种用于光引发化学反应的流通池，所述流通池包括：
基板，
布置在所述基板上的光耦合光栅层，所述光耦合光栅层具有折射率，
布置在所述光栅层上的芯层，所述芯层具有折射率，其中所述芯层的折射率大于所述光耦合光栅层的折射率，
布置在所述芯层上的硅烷化层，其中硅烷化层存在多个纳米孔，并且
其中所述纳米孔由间隙区域分开。
36.根据权利要求35所述的流通池，其中所述基板为玻璃。
37.根据权利要求35或36所述的流通池，其中所述光耦合光栅层和所述芯层由树脂形成。
38.根据权利要求37所述的流通池，其中所述光耦合光栅层和/或所述芯层由五氧化二钽形成。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的流通池，其中所述硅烷化层由水缓冲或聚合物包覆层形成。
40.根据前述权利要求35-39中任一项所述的流通池，其中所述光耦合光栅层的折射率在0.5至2.0的范围内，并且芯层的折射率在1.5至2.5的范围内。
41.根据前述权利要求35-40中任一项所述的流通池，其中所述聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共价结合到所述纳米孔的所述底部处的表面。
42.根据权利要求41所述的流通池，还包括第一组反应物，所述第一组反应物布置在共价结合到所述纳米孔的所述底部处的表面的所述聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺上。
43.根据权利要求42所述的流通池，其中所述第二组反应物布置在所述第一组反应物上，并且包括至少一种目标反应物、铜螯合配体和光敏光引发剂体系。
44.一种使用由前述权利要求1-34中任一项所述制备的流通池和/或根据权利要求35-43中任一项所述的流通池对核酸进行测序的方法。
45.一种用于光引发化学反应的系统，所述系统包括根据前述权利要求35-43中任一项所述的流通池以及优选为激光光源的光源。
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