CN113281322B

CN113281322B - 一种分子印迹-表面增强拉曼传感芯片及其制备方法和应用

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Publication number: CN113281322B
Application number: CN202110404884.7A
Authority: CN
Inventors: 李攻科; 董建伟; 夏凌
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113281322A

Abstract

本发明公开了一种分子印迹‑表面增强拉曼传感芯片及其制备方法和应用，所述分子印迹‑表面增强拉曼传感芯片包含贵金属纳米粒子膜和覆盖在所述贵金属纳米粒子膜表面的MIP膜；所述MIP膜是在微米级尺度的限域空间内制备而成，所述MIP膜的模板分子为SERS惰性分子或SERS活性分子。本发明利用MIP膜的特异识别作用，将目标分子吸附至贵金属纳米粒子的“热点”范围，通过贵金属纳米粒子的信号增强作用可以实现对目标分子的拉曼检测，尤其是实现对SERS惰性分子的拉曼检测。

Description

一种分子印迹-表面增强拉曼传感芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物技术领域，尤其涉及一种分子印迹-表面增强拉曼传感芯片及其制备方法和应用。

背景技术

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)由于其无需复杂的样品预处理、操作简便、检测速度快、准确率高、仪器便携等特点，被广泛应用于食品和环境中有害物质的检测。虽然SERS可以提供分子指纹特征，但也会受到复杂基质的干扰，因此需要对目标分子进行识别来排除基质的干扰。贵金属纳米粒子是较常见的SERS识别元件，含有巯基及带正电荷的分子易于吸附到贵金属纳米粒子表面，处于贵金属纳米粒子“热点”范围，产生SERS增强效果。而不易吸附到贵金属纳米粒子表面的分子没有SERS增强效果，信号很弱。但贵金属纳米粒子的这种识别的特异性有限，且目标分子范围窄。另外，长链烷烃、半胱氨酸、环糊精和金属-有机骨架材料(Metal-Organic Frameworks，MOF)等也可用于SERS识别，不过存在特异性识别作用预设性不强的问题。抗体和适配体也可作为SERS识别元件，特异性好，预设性强，但制备成本高、分子大，一般需要SERS探针分子，不能获得目标分子指纹图谱。

分子印迹聚合物(Molecular Imprinted Polymers，MIP)作为“人工抗体”，由于其具备良好的特异识别作用、高的稳定性及制备成本低等优点而被广泛用于目标分子吸附材料，例如固相萃取、色谱填料及传感器识别元件。MIP也被广泛用作SERS的识别元件构建分子印迹-表面增强拉曼(MIP-SERS)传感器，相比长链烷烃、半胱氨酸、环糊精和MOF等预设性更强，相比金属纳米粒子目标分子范围更宽。将MIPs与贵金属纳米粒子结合，可利用MIP识别吸附目标分子，同时利用贵金属纳米粒子增强目标分子的SERS的信号。MIPs与贵金属纳米粒子结合的形态主要分为两大类：粒子型和芯片型。粒子型即MIP和贵金属纳米粒子共聚为球状材料，包括MIP包裹贵金属、贵金属包裹MIP以及MIP和贵金属混合三种结合方式。芯片型即在平面载体表面制备MIP和贵金属纳米粒子的结合材料，同样包括MIP包裹贵金属、贵金属包裹MIP以及MIP和贵金属混合三种结合方式。以芯片为基础的MIP-SERS传感器具有比表面积大、传质速度快的特点，可以原位、快速检测目标分子，也可以结合SERS探针分子开发夹心法检测无SERS活性分子。但制备可控、均匀的MIP-SERS芯片识别元件仍具有很大挑战。

虽然表面增强拉曼光谱结合识别元件构建的传感器可以满足复杂基质中目标分子的检测，但很多目标分子为无SERS活性分子，因此受到信号强度的限制。虽然结合SERS探针分子和目标分子特异识别材料可以突破此限制，但材料制备及检测过程要复杂很多。欲产生较强的SERS信号需要具备两个条件：第一，分子存在活性基团，且活性基团易于吸附在SERS增强基底表面；第二，分子在SERS激光波长附近具有较强的光吸收。孔雀石绿(Malachite Green,MG)就满足这两个条件，是SERS活性分子，常被用于SERS探针分子，也易于直接进行SERS检测。但其在体内的代谢产物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)在SERS激光波长附近无光吸收，且不具备孔雀石绿的正电荷，与SERS基底的作用力也不强，视为无SERS活性分子，不能利用SERS对其进行直接检测。目前对隐色孔雀石绿进行检测的方法均是对其氧化后再测定，但检测结果是孔雀石绿和隐色孔雀石绿的总量，并非隐色孔雀石绿的含量。隐色孔雀石绿相较孔雀石绿具有更强的毒性及稳定性，对其检测具有重要的意义，很多研究者呼吁将其作为孔雀石绿污染的检测指标。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种分子印迹-表面增强拉曼传感芯片(MIP-SERS传感芯片)，不仅能够对具有SERS活性基团的SERS活性分子进行检测，还能够对SERS惰性分子进行原位检测。

同时，本发明还提供所述MIP-SERS传感芯片的制备方法和应用。

具体地，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种MIP-SERS传感芯片，包含贵金属纳米粒子膜和覆盖在所述贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹膜(MIP膜)；所述MIP膜是在微米级的限域空间内制备而成，所述MIP膜的模板分子为SERS惰性分子或SERS活性分子。

根据本发明第一方面的MIP-SERS传感芯片，至少包括如下有益效果：

本发明以SERS惰性分子作为MIP膜的模板分子，利用MIP膜的特异识别作用，将SERS惰性分子吸附到贵金属纳米粒子的“热点”范围内，通过贵金属纳米粒子的信号增强作用实现对SERS惰性分子的拉曼检测，解决SERS惰性分子不易结合SERS增强基底的问题，同时排除干扰；同时当MIP膜的模板分子为SERS活性分子时，也能够对SERS活性分子实现很好的检测。

在本发明的一些实施方式中，所述SERS惰性分子指的缺少SERS活性基团，不易吸附到贵金属表面的分子，包括但不限于隐色孔雀石绿、隐色结晶紫。所述SERS活性分子指的是含有SERS活性基团，容易吸附到贵金属表面的分子，例如孔雀石绿。

在本发明的一些实施方式中，所述贵金属纳米粒子膜包括金纳米粒子膜、银纳米粒子膜中的任意一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述限域空间的高度为5～180μm。

在本发明的一些实施方式中，所述限域空间的高度为8～140μm。

在本发明的一些实施方式中，所述限域空间的高度为30～110μm。

在本发明的一些实施方式中，所述限域空间的高度为50～90μm。

在本发明的一些实施方式中，所述限域空间的高度约为81μm。

本发明的第二方面是提供所述MIP-SERS传感芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)在贵金属纳米粒子膜表面接枝引发剂；

(2)以SERS惰性分子或SERS活性分子作为模板分子，将模板分子、分子印迹功能单体、交联剂和溶剂混合得分子印迹预聚液，然后将所述分子印迹预聚液加到接枝了引发剂的贵金属纳米粒子膜表面；然后将贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹预聚液限制在微米级的限域空间内进行聚合反应，反应结束后形成覆盖所述贵金属纳米粒子膜的MIP膜；

(3)去除所述MIP膜的模板分子。

根据本发明第二方面的MIP-SERS传感芯片的制备方法，至少具有如下有益效果：

本发明通过在微米级尺度的限域空间内反应制备MIP膜，可直接调控引发剂的有效浓度与聚合的MIP膜的短链的扩散，进而影响MIP膜的厚度形成；同时通过在贵金属纳米粒子膜表面接枝引发剂，而非将引发剂直接与模板分子、功能单体、交联剂一起预先混合，可避免引发剂引起预聚液聚合而造成MIP膜过厚，使MIP膜中的吸附位点脱离贵金属纳米粒子的“热点”范围。同时，如果向分子印迹预聚液中加入引发剂，则需要依靠旋涂仪涂布才能得到超薄的预聚合液膜。而本发明不需要旋涂仪就可以原位制备SERS理想的MIP膜，制备方式简单，也避免旋涂后制备过程需要严格避氧。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述在贵金属纳米粒子膜表面接枝引发剂的方法为，先在贵金属纳米粒子膜表面修饰羧基，对所述羧基进行活化后将贵金属纳米粒子膜浸泡于引发剂溶液中。

在本发明的一些实施方式中，所述在贵金属纳米粒子膜表面修饰羧基的方法为，将贵金属纳米粒子膜浸泡于羧酸溶液中。

在本发明的一些实施方式中，所述羧酸包括11-巯基烷酸、10-巯基癸酸、8-巯基辛酸、巯基丁酸、巯基丙酸和巯基乙酸中的任意一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述羧酸溶液的浓度为5～30mM。

在本发明的一些实施方式中，所述贵金属纳米粒子膜浸泡于羧酸溶液的温度为0～10℃，浸泡时间为8～20h。

在本发明的一些实施方式中，所述对所述羧基进行活化具体为采用活化剂进行活化，所述活化剂包括2-乙基-5-苯基异唑-3′-磺酸盐(NEPIS)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)中的任意一种与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的混合物、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)任意一种的混合物。

在本发明的一些实施方式中，所述活化剂的浓度为50～100mM。

在本发明的一些实施方式中，对所述羧基进行活化的时间为1～5h。

在本发明的一些实施方式中，对所述羧基进行活化的步骤在避光中进行。

在本发明的一些实施方式中，所述引发剂为含氨基引发剂，包括2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐。

在本发明的一些实施方式中，所述引发剂溶液的浓度为0.05～0.2M。

在本发明的一些实施方式中，所述贵金属纳米粒子膜在引发剂溶液中的浸泡时间为1～5h。

在本发明的一些实施方式中，所述贵金属纳米粒子膜在引发剂溶液中的浸泡步骤在避光中进行。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述分子印迹功能单体包括丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、对乙烯苯甲酸、对乙基苯乙烯、4-乙烯基吡啶、2-乙烯基吡啶中的任意一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述交联剂包括二乙烯基苯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺中的任意一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液中，模板分子、分子印迹功能单体和交联剂的浓度分别为10～30mM、100～500mM、200～1000mM。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液与贵金属纳米粒子膜的比例为0.005～0.2μL：1mm²。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液与贵金属纳米粒子膜的比例为0.008～0.12μL：1mm²。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液与贵金属纳米粒子膜的比例为0.03～0.1μL：1mm²。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液与贵金属纳米粒子膜的比例为0.05～0.09μL：1mm²。

在本发明的一些实施方式中，所述分子印迹预聚液与贵金属纳米粒子膜的比例约为0.08μL：1mm²。

在本发明的一些实施方式中，所述贵金属纳米粒子膜负载于一载板上，将所述分子印迹预聚液加到接枝了引发剂的贵金属纳米粒子膜表面后，通过采用另一载板进行盖合，从而实现步骤(2)所述的将贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹预聚液限制在微米级的限域空间内进行聚合反应。盖合前后，载板一直水平放置。盖合后，通过载板的重力和分子印迹预聚液的表面张力形成所述微米级的限域空间。

在本发明的一些实施方式中，所述载板包括玻片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)片、环烯烃共聚物(COC)片或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片中的任意一种或多种。采用的两片载板的材质可相同，也可以不同。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述聚合反应的温度为30～80℃；所述聚合反应的时间为3～10h。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，通过采用乙腈、甲醇或其与乙酸混合溶液中任意一种多种去除所述MIP膜中的模板分子。

本发明的第三方面是提供上述MIP-SERS传感芯片在原位拉曼检测SERS惰性分子(如隐色孔雀石绿或隐色结晶紫)中的应用。

更具体地，本发明提供一种原位拉曼检测隐色孔雀石绿的方法，包括如下步骤：将待测溶液加到上述MIP-SERS传感芯片上，原位识别后，洗去杂质，加入氧化剂进行氧化，最后进行拉曼测定；所述MIP-SERS传感芯片的MIP膜以隐色孔雀石绿模板分子制备而成。所述氧化剂包括2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(DDQ)。

在检测过程中，将隐色孔雀石绿吸附到SERS基底“热点”范围内，再利用DDQ对隐色孔雀石绿进行原位氧化为孔雀石绿，改变其光吸收性质，变为SERS活性分子，实现SERS的直接检测。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明利用MIP膜的特异识别作用，将包括SERS惰性分子在内的待检测目标分子吸附到贵金属纳米粒子的“热点”范围内，通过贵金属纳米粒子的信号增强作用实现对目标分子的拉曼检测，尤其是实现对SERS惰性分子的拉曼检测，解决SERS惰性分子不易结合SERS增强基底的问题，同时排除干扰。

本发明的MIP-SERS传感芯片制备方法简单、高效，试剂用量少，成本低，可控性高，并实现了对SERS惰性分子的拉曼原位检测，分离识别与检测一体化进行，操作简便，省时省力。

附图说明

图1为实施例1的MIP-SERS传感芯片的制备(①)和检测隐色孔雀石绿(②)的流程示意图；

图2为不同限域空间尺度下制备的MIP-SERS传感芯片的SERS信号；

图3为不同浓度的隐色孔雀石绿标准液的SERS信号(a)、SERS信号与隐色孔雀石绿浓度的关系曲线(b)；

图4为MIP-SERS传感芯片的特异性检测结果；

图5为MIP-SERS传感芯片的重复性检测结果。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例在限域空间中原位制备MIP膜，得到MIP-SERS传感芯片，并用于拉曼原位检测SERS惰性分子隐色孔雀石绿。

MIP-SERS传感芯片的制备流程如图1①所述，具体包括如下步骤：

(1)制备镀金玻片

将玻片浸入浓H₂SO₄:30％H₂O₂＝7:3(v/v)的溶液中，浸泡1h，然后使用大量水洗至中性，60℃干燥1h。再将玻片浸入5％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，50℃孵育5h，乙醇洗3遍，烘干。然后再浸入AuNPs制备还原液中(5mg葡萄糖、62.5mg碳酸氢钾、250μL1.97％氯金酸溶于5mL蒸馏水)，50℃孵育4h，在玻片表面形成一层均匀的金纳米粒子膜(金膜)，得到镀金玻片。

(2)在金膜表面接枝引发剂

将步骤(1)制得的镀金玻片浸入含20mM十一巯基烷酸的乙醇溶液中，4℃过夜，形成自组装分子层。再将镀金玻片浸入含80mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的水溶液中室温避光孵育3h，活化羧基；水洗后，浸入含有0.1M的2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐水溶液，室温避光孵育3h，形成表面接枝引发剂的镀金玻片。

(3)将10μL分子印迹预聚液(20mM隐色孔雀石绿、200mM丙烯酰胺和400mM二乙烯基苯溶于二甲亚砜)滴到表面接枝引发剂的镀金玻片表面，盖上一块相同形状的玻片，于称量瓶中内密封后，置于恒温箱中60℃聚合6h。盖合前后，玻片一直水平放置。

取出后，掀开盖片，用甲醇：冰乙酸＝9:1(v/v)溶液洗涤MIP包覆的镀金玻片，每次15min，直到SERS检测不到模板分子为止，得到MIP-SERS传感芯片。

另外，作为对照，将分子印迹预聚液中的模板分子(隐色孔雀石绿)去除，按照步骤(1)～(3)相同的方法制得NIP-SERS传感芯片。

MIP-SERS传感芯片检测隐色孔雀石绿的方法如图1②所示：将含隐色孔雀石绿的样液加到MIP-SERS传感芯片上，MIP膜特异识别隐色孔雀石绿，其他干扰分子被冲洗去除；为增大检测信号，加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(DDQ)原位氧化，用乙腈洗去DDQ，烘干后进行拉曼测定。

实施例2

本实施例通过在实施例1的步骤(3)中，改变加入到两个玻片之间的分子印迹预聚液体积来调控两个玻片间的限域空间尺度，研究SERS信号强度与限域空间尺度的关系。分子印迹预聚液体积如下表1所示。

实施例1所用玻片的面积为123.5mm²，在玻片间加入不同体积的分子印迹预聚液，假设预聚液铺满玻片且靠表面张力将玻片支撑，则限域空间高计算如下表1所示：

表1.分子印迹预聚液体积与限域空间尺度

加10μL 10mg/L隐色孔雀石绿的乙腈溶液于MIP-SERS传感芯片上，识别30min后，用乙腈洗去杂质；然后加50μL 0.3mg/mL DDQ原位氧化30min后，用乙腈洗去DDQ，60℃烘干5min，然后进行拉曼测定。

SERS信号与限域空间尺度的关系如图2所示。从图2可以看出，当限域空间高度在8～81μm范围内，SERS信号逐渐增强，当限域空间高度为81～178μm时，信号又逐渐降低，在限域空间高度为81μm时SERS信号最强，效果最佳。

实施例3

本实施例以水产品中的隐色孔雀石绿为目标物，采用实施例1的MIP-SERS传感芯片进行原位拉曼检测，具体检测方法如下：

(1)样品处理：称取5g已绞碎水产品(鱼、贝类或虾)可食部分于50mL离心管中，加入10mL乙腈，混合振荡2min，超声萃取20min，加入5g酸性氧化铝，振荡2min，4000r/min离心10min。上清转移至50mL茄形瓶中。再向50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作。合并乙腈层至茄形瓶中，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。转移至5mL离心管中，氮吹，乙腈定容至1mL，得到待测液。

(2)加10μL待测液于MIP-SERS传感芯片上，识别30min后，用乙腈洗去杂质。加50μL0.3mg/mL DDQ原位氧化30min后，用乙腈洗去DDQ，60℃烘干5min，然后拉曼测定。

(3)另外，配制系列浓度为0～10⁶μg/L的隐色孔雀石绿标准液，分别加到MIP-SERS传感芯片上，识别30min后，用乙腈洗去杂质。加50μL 0.3mg/mL DDQ原位氧化30min后，用乙腈洗去DDQ，60℃烘干5min，然后拉曼测定。

系列隐色孔雀石绿标准液的拉曼测试结果如图3所示。在1μg/L～10mg/L浓度范围内，隐色孔雀石绿浓度与SERS信号强度呈线性关系，线性回归方程为y＝1210.6lgC+18.679(r＝0.9959，C为隐色孔雀石绿浓度)，对隐色孔雀石绿的检出限为0.15μg/L，优于国标方法检出限0.5μg/kg。但NIP-SERS的信号值很低，信号来源于少量的非特异吸附。也说明MIP的吸附识别性能较好。

采用实施例1的MIP-SERS传感芯片原位检测三种水产品(鱼、贝类和虾)中的隐色孔雀石绿，所得结果和国标方法GB/T 20361-2006结果一致。利用三个水平浓度(2、10和50μg/kg)进行加标回收率实验，回收率范围为89.2％～107.7％，RSD范围2.0％～7.4％，具体见表2：

表2.水产品检测结果

n.d.：表示未检出

实施例4

本实施例评价实施例1的MIP-SERS传感芯片的检测特异性，具体方法如下：

(1)样品配置：配置浓度10mg/L的隐色孔雀石绿(LMG)及其结构类似物(孔雀石绿MG、结晶紫CV、隐色结晶紫LCV、亮绿BG、乙基紫EV、甲基绿Methyl G和亚甲基蓝MB)乙腈溶液。

(2)加10μL不同分子的乙腈溶液于MIP-SERS传感芯片上，识别30min后，用乙腈洗去杂质。

(4)加50μL 0.3mg/mL DDQ原位氧化30min后，用乙腈洗去DDQ，60℃烘干5min，然后进行拉曼测定。

不同分子的检测结果如图4所示。结果显示，只有隐色孔雀石绿的SERS信号强度最强，接近于5500，隐色孔雀石绿的结构类似物信号均在1000以下，说明MIP膜的特异识别作用强，隐色孔雀石绿的几种结构类似物几乎不影响隐色孔雀石绿的测定。

实施例5

本实施例评价基于实施例1的MIP-SERS传感芯片原位检测隐色孔雀石绿的重复性，具体方法如下：

(1)样品配置：为使MIP膜吸附足量的隐色孔雀石绿，配置浓度10mg/L的隐色孔雀石绿乙腈溶液。

(2)加10μL隐色孔雀石绿乙腈溶液于MIP-SERS传感芯片上，识别30min后，用乙腈洗去杂质。

(3)加50μL 0.3mg/mL DDQ原位氧化30min后，用乙腈洗去DDQ，60℃烘干5min，然后进行拉曼测定。

(4)DMSO洗步骤(3)进行拉曼测定后的MIP-SERS传感芯片上3次，每次15min。

(5)重复(2)～(4)步骤。(2)～(4)步骤为一个检测循环，一直进行下去，直到SRES信号出现显著下降为止。

采用实施例1的MIP-SERS传感芯片重复原位检测隐色孔雀石绿的结果如图5所示。从图5可以看出，在8次循环内，信号无显著降低，第9次才出现信号降低的现象，但是降低不多，说明MIP-SERS传感芯片具有较好的重复使用性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分子印迹-表面增强拉曼传感芯片的制备方法，其特征在于：包含贵金属纳米粒子膜和覆盖在所述贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹膜；所述分子印迹膜是在微米级的限域空间内制备而成，所述分子印迹膜的模板分子为SERS惰性分子，所述SERS惰性分子包括隐色孔雀石绿，所述限域空间的高度为50~90μm；

所述分子印迹-表面增强拉曼传感芯片的制备方法包括如下步骤：

（1）在贵金属纳米粒子膜表面接枝引发剂；

（2）以SERS惰性分子或SERS活性分子作为模板分子，将模板分子、分子印迹功能单体、交联剂和溶剂混合得分子印迹预聚液，然后将所述分子印迹预聚液加到接枝了引发剂的贵金属纳米粒子膜表面；然后将贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹预聚液限制在微米级的限域空间内进行聚合反应，反应结束后形成覆盖所述贵金属纳米粒子膜的分子印迹膜；

（3）去除所述分子印迹膜的模板分子；

步骤（1）中，所述在贵金属纳米粒子膜表面接枝引发剂的方法为，先在贵金属纳米粒子膜表面修饰羧基，对所述羧基进行活化后将贵金属纳米粒子膜浸泡于引发剂溶液中，所述引发剂为含氨基引发剂，包括2,2 '-偶氮二异丁基脒二盐酸盐；

所述贵金属纳米粒子膜负载于一载板上，将所述分子印迹预聚液加到接枝了引发剂的贵金属纳米粒子膜表面后，通过采用另一载板进行盖合，从而实现步骤（2）所述的将贵金属纳米粒子膜表面的分子印迹预聚液限制在微米级的限域空间内进行聚合反应。

2.根据权利要求1所述分子印迹-表面增强拉曼传感芯片的制备方法，其特征在于：所述贵金属纳米粒子膜包括金纳米粒子膜、银纳米粒子膜中的任意一种或多种。

3.分子印迹-表面增强拉曼传感芯片在原位拉曼检测SERS惰性分子中的应用，其特征在于，所述分子印迹-表面增强拉曼传感芯片为权利要求1-2任一项所述的分子印迹-表面增强拉曼传感芯片制备方法制备得到的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SERS惰性分子包括隐色孔雀石绿。

5.一种原位拉曼检测隐色孔雀石绿的方法，其特征在于：包括如下步骤：将待测溶液加到分子印迹-表面增强拉曼传感芯片上，原位识别后，洗去杂质，加入氧化剂进行氧化，最后进行拉曼测定；所述MIP-SERS传感芯片的MIP膜以隐色孔雀石绿为模板分子制备而成；所述分子印迹-表面增强拉曼传感芯片为权利要求1-2任一项所述的分子印迹-表面增强拉曼传感芯片制备方法制备得到的。