CN113278626B - 一种提高水稻整精米率的位点qHMRR4-1、分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高水稻整精米率的位点qHMRR4‑1、分子标记及其应用。qHMRR4‑1位于水稻第4号染色体，在物理位置28744933bp处的核苷酸为C，在物理位置28759361bp处的核苷酸为G。qHMRR4‑1的特异性分子标记qHMRR4‑1(C)、qHMRR4‑1(T)和qHMRR4‑1(Common)能够有效选择qHMRR4‑1，可用于杂交育种过程中的分子标记辅助选择。本发明通过试验证明qHMRR4‑1能够显著提高水稻的整精米率和改善谷粒粒型，在水稻的品质改良中具有重要的价值。

Description

一种提高水稻整精米率的位点qHMRR4-1、分子标记及其应用

技术领域：

本发明属于水稻育种领域，涉及qHMRR4-1及其特异性分子标记在提高水稻整精米率和改善谷粒粒型中的应用。

背景技术：

稻米品质包括碾磨加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质,其中碾磨加工品质包括糙米率、精米率和整精米率三个指标。在新修订的优质稻国家标准《GB/T 17891-2017》中，整精米率是优质稻谷定级的三个指标之一(整精米率、垩白度和食味)。整精米率是指稻谷经脱壳、碾磨成精米后，整精米(长度达到完整米粒平均长度四分之三及以上的米粒)占净稻谷质量的百分率，影响稻谷的最终产量，因此直接决定了稻米的商品价值和经济效益。

研究表明，整精米率是一个多基因控制的复杂性状，存在基因型×环境互作，性状的表达受环境影响较大。以表型鉴定为基础的常规育种难以有效选育整精米率高的品种。只有在基因水平上深入了解控制整精米率的分子遗传基础，开展高效准确的分子育种，高整精米率的水稻育种才能取得突破。虽然目前对整精米率的分子遗传研究已取得了一定的进展，但是很少鉴定出在不同环境下稳定表达的QTL/基因，与整精米率直接相关的QTL/基因的精细定位及克隆未见报道。此外，长粒型是优质籼稻选育的一个重要方向，而整精米率与谷粒粒长存在一定的负相关，这为提高水稻整精米率的优质化育种增加了困难。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高水稻整精米率的位点qHMRR4-1、分子标记及其应用，为水稻整精米率和谷粒粒型的育种改良提供新的遗传位点和可用的分子标记。

本发明的第一个目的是提供一种水稻整精米率的位点qHMRR4-1，其特征在于，该位点位于水稻第4号染色体，qHMRR4-1在物理位置28744933bp处的核苷酸为C，在物理位置28759361bp处的核苷酸为G。

本发明的第二个目的是提供一种qHMRR4-1的特异性分子标记，其特征在于，根据4号染色体物理位置28744933bp处的核苷酸多态性设计的KASP标记，包括qHMRR4-1(C) 、qHMRR4-1(T)和qHMRR4-1(Common)；所述的分子标记qHMRR4-1(C)引物序列：5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTGTCTGTTATATGAACGCCCC-3’，qHMRR4-1(T)引物序列：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGTTGTCTGTTATATGAACGCCCT-3’，qH MRR4-1(Common)引物序列：5’-CAACGTCGTCTTCAAAGAAGCATCC-3’。

本发明的第三个目的是提供了上述水稻整精米率的位点qHMRR4-1在水稻育种中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述qHMRR4-1的特异性分子标记在水稻育种中的应用。

优选，所述的在水稻育种中的应用是在水稻整精米率改良中的应用或者谷粒粒型改良中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供一种提高水稻整精米率的位点qHMRR4-1，该位点在提高水稻整精米率中具有潜在的应用价值。

(2)qHMRR4-1在提高水稻整精米率的同时，能够改善谷粒粒型，是十分难得的优异位点。

(3)本发明提供的qHMRR4-1(C)、qHMRR4-1(T)和qHMRR4-1(Common)标记是qHMRR4-1位点的特异性KASP分子标记，具有多态性明显、准确、易于检测等优点，能够提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。

(4)本发明提供的qHMRR4-1及其特异性分子标记通过试验证明能够显著提高水稻的整精米率和改善谷粒粒型，在水稻品质改良方面意义重大。

附图说明：

图1：300份籼稻的全基因组关联分析(GWAS)结果。图1 A和图1 B表示2016年广州试验基地GWAS结果的曼哈顿图和QQ plot，图1 C和图1 D表示2018年阳江试验基地GWAS结果的曼哈顿图和QQ plot，本发明中的qHMRR4-1在图中用箭头标出。

图2：qHMRR4-1在物理位置28744933bp和28759361bp处的核苷酸验证。箭头指示的为位于LOC_Os04g48260基因内部28744933bp处的核苷酸。

图3：qHMRR4-1对整精米率和谷粒粒型的影响。图3A、图3B、图3C和图3D为2016年广州试验基地的结果，分别表示qHMRR4-1两种单倍型种质在整精米率、谷粒粒长、粒宽和长宽比的比较；图3E、图3F、图3G和图3H为2018年阳江试验基地的结果。

图4：杂交亲本在整精米率和谷粒粒形方面的表型比较。图4A和图4B为两个杂交亲本的整精米率比较，图4C、图4D、图4E分别表示两个杂交亲本在谷粒粒长、粒宽和长宽比方面的比较。

图5：qHMRR4-1的特异性分子标记的检测结果和qHMRR4-1在提高整精米率和改善谷粒粒型中的有效性验证。图5A是利用qHMRR4-1特异性分子标记对杂交后代(F₂)单倍型的鉴定结果。图5B、图5C、图5D和图5E分别表示杂交后代(F₂)两种纯合单倍型在整精米率、谷粒粒长、粒宽和长宽比方面的比较。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施案例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

1.控制水稻整精米率位点的挖掘

我们以从国际水稻所引进的300份多样性籼稻种质为材料，将这300份籼稻于2016年和2018年晚造分别种植在广州大丰试验基地和阳江试验基地，收获种子后，根据国标GBT 21719-2008测定稻谷的整精米率。获得表型数据后，利用该300份籼稻全基因组70万个SNP数据进行全基因组关联分析(GWAS)。全基因组关联分析利用软件包GAPIT 2.0进行(参考文献：Tang,You,et al."GAPIT version 2:an enhanced integrated tool for genomic association and prediction."The plant genome 9.2(2016):1-9.)，结合群体的kinship 矩阵和主成分PC，利用混合线性模型(mix liner model，MLM)进行计算。根据常规的全基因组关联分析结果筛选标准，即在基因组连续200Kb区间范围内有3个P值小于10^-4的SNP，则该区间就作为一个QTL位点。两年的GWAS结果都在4号染色体上鉴定到一个效应大的QTL，该QTL命名为qHMRR4-1(图1)。参考日本晴参考基因组(IRGSP-1.0)， qHMRR4-1位于水稻第4号染色体，我们根据鉴定到qHMRR4-1的单倍体型选取整精米率高和低的种质各5份进行了重测序，发现高整精米率种质在物理位置28744933bp处的核苷酸为C，在物理位置28759361bp处的核苷酸为G，两处的核苷酸CG连锁，而低整精米率的种质为TT类型。此外，qHMRR4-1在物理位置28744933bp处的核苷酸位于LOC_Os 04g48260基因编码区，该位置的核苷酸变异导致了氨基酸的变异(图2)。

为了检验qHMRR4-1与整精米率的相关性，我们比较了不同单倍型种质的整精米率。我们发现单倍型为CG种质的整精米率极显著高于单倍型为TT的种质(图3A和3E，P＜0.01)。长粒型是优质籼稻选育过程中的一个重要方向，由于整精米率与谷粒粒长存在一定程度的负相关，为了研究qHMRR4-1对谷粒粒形的影响，我们测定了两种单倍型种质的谷粒粒长、粒宽和长宽比，发现单倍型为CG种质的粒长显著高于单倍型为TT的种质(图3 B和3F，P＜0.05)，单倍型为CG种质的粒宽极显著低于单倍型为TT的种质(图3C和3 G，P＜0.01)，单倍型为CG种质的长宽比显著高于单倍型为TT的种质(图3D和3H，P ＜0.05)。以上结果表明，qHMRR4-1的单倍型具有较高的整精米率和细长的谷粒粒型。

2.qHMRR4-1特异性分子标记的研发和有效性验证

qHMRR4-1在物理位置28744933bp处的核苷酸位于LOC_Os04g48260基因编码区(图2)，有利于研发功能性分子标记。我们根据qHMRR4-1在物理位置28744933bp处的保守核苷酸差异，设计了针对qHMRR4-1的特异性KASP标记，包括高整精米率单倍型特异引物qHMRR4-1(C)、低整精米率单倍型特异引物qHMRR4-1(T)和通用引物qHMRR4-1(Com mon)。所述的分子标记qHMRR4-1(C)引物序列：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGG TTGTCTGTTATATGAACGCCCC-3’，qHMRR4-1(T)引物序列：5’-GAAGGTGACCAAGT TCATGCTTGGTTGTCTGTTATATGAACGCCCT-3’，qHMRR4-1(Common)引物序列： 5’-CAACGTCGTCTTCAAAGAAGCATCC-3’。

为了进一步验证上述标记的有效性，我们利用高整精米率、长粒型种质(SANTHI

SUFAID 207)与低整精米率、短粒型种质(BENAMURI)(图4A、4B、4C、4D和 4E)进行杂交。利用qHMRR4-1的特异性KASP标记对F₂代的344个分离单株进行鉴定，如图5A所示，该标记可以准确和清晰的将4号染色体物理位置28744933bp处的两种单倍型区分开。

上述试验中，DNA提取方法步骤如下：(1)将少量水稻新鲜叶片放入96孔DNA 提取板中打磨成粉状；(2)加入200μL CTAB缓冲液于65℃水浴30min；(3)5,000 rpm离心5min，吸取上清100μL于新的96孔DNA提取板中；(4)加入100μL冷的乙醇，-20℃放置30min用于沉淀DNA；(5)5,000rpm离心5min，弃上清；(6) 于37℃烘箱适当烘干DNA，加入100μL双蒸灭菌水(ddH₂O)溶解DNA。

利用KASP基因分型试验试剂盒进行单倍型分型试样，采用96孔微量滴定板进行反应和上机。96孔板的单孔总反应体积为10μL，反应体系包括：10μM的qHMRR4-1(C)引物0.1μL，10μM的qHMRR4-1(T)引物0.1μL，10μM的qHMRR4-1(Common)引物0.3μL， 2×KASP MasterMix 5μL，DNA模板25～250ng，补充ddH₂O至10μL。PCR反应条件为：第一步，95℃预变性10min；第二步扩增反应，95℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸 60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第三步扩增反应，95℃变性20s， 57℃退火并延伸60s，26～35个循环；第四步读板，30℃30s。

3.qHMRR4-1及其特异性分子标记在水稻整精米率和粒型改良中的应用

如上所述，利用qHMRR4-1特异性分子标记可清晰检测到4号染色体物理位置287449 33bp处的单倍型(图5A)。为了验证该标记检测到的单倍型与整精米率和谷粒粒型的相关性，研究qHMRR4-1在提高水稻整精米率和谷粒粒型中的应用价值，我们对两种纯合单倍型的整精米率和谷粒粒型进行了测定。整精米率根据国标GBT 21719-2008进行测定，粒型利用SC-G型多功能种子分析仪进行测定。结果表明，单倍型为C的材料的整精米率均值为49.03％，显著高于单倍型为T的材料的整精米率(均值为42.53％)(图5B，P＜0.05)，单倍型为C材料的谷粒粒长极显著高于单倍型为T的材料(图5C，P＜0.01)，单倍型为C 材料的粒宽极显著低于单倍型为T的材料(图5D，P＜0.01)，单倍型为C材料的长宽比极显著高于单倍型为T的材料(图5E，P＜0.01)。

Claims (2)

1.一种qHMRR4-1上的核苷酸多态性位点在水稻育种中的应用，其中，qHMRR4-1为位于第4号染色体的数量性状基因座（QTL），所述的应用是鉴别水稻整精米率和谷粒粒型，当所述位点在qHMRR4-1的物理位置28744933bp处的核苷酸为C，在物理位置28759361bp处的核苷酸为G时，称为CG连锁类型；当所述位点在qHMRR4-1的物理位置28744933bp处的核苷酸为T，在物理位置28759361bp处的核苷酸为T时，称为TT连锁类型；当水稻为CG连锁类型时，该水稻相对于TT连锁类型为高整精米率和长粒型种质；当水稻为TT连锁类型时，该水稻相对于CG连锁类型为低整精米率和短粒型种质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，根据4号染色体物理位置28744933bp、28759361bp处的核苷酸多态性并利用KASP技术设计引物，其引物分别用“qHMRR4-1(C)”、“qHMRR4-1(T)”、“qHMRR4-1(Common)”表示，其中，qHMRR4-1(C)引物序列为：5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTGTCTGTTATATGAACGCCCC-3’，qHMRR4-1(T)引物序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGTTGTCTGTTATATGAACGCCCT-3’，qHMRR4-1(Common)引物序列为：5’-CAACGTCGTCTTCAAAGAAGCATCC-3’。

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