CN113277938B - 棱子芹属植物活性成分制备方法及其在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

棱子芹属植物活性成分制备方法及其在制备抗炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天然植物中有效成分的分离纯化技术领域，具体涉及一种伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的制备方法，先采用醇提对P.candollei进行提取获得粗提物，然后采用高速逆流色谱对粗提物进行分离，高速逆流色谱采用的溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统，使用前分取上相和下相，上相用作固定相，下相用作流动相；得到以下化合物单体：
Figure DDA0003005783860000011
本发明建立的分离纯化方法实现了P.candollei植物中9个单体成分的成功分离，得到的各个单体纯度均大于98％，分离纯化效果好；且分离纯化得到的化合物7和8能够有效抑制NO产生。

Description

棱子芹属植物活性成分制备方法及其在制备抗炎药物中的 应用
技术领域
本发明涉及天然植物中有效成分的分离纯化技术领域，具体涉及棱子芹属植物活性成分制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
棱子芹属于伞形科具有镇痛作用、抗炎和抗疟疾作用，还用作调味品和草药香水。在中国民间医学中，心叶棱子芹被用作发汗、止痛、解热药。从棱子芹属植物中已经发现了多种化学成分，如萜类、类固醇、皂苷、酯、呋喃香豆素和双香豆素等。
Pleurospermum candollei(DC.)Benth.Ex C.B.Clark.(P.candollei)为棱子芹属植物变种，可用于治疗腹泻、胃部疾病、心脏疾病、降血压、降低胆固醇、胃部疾病和腹部疾病等。此外，还可用于治疗关节、背部疼痛，男性和女性不育等。然而，到目前为止，尚未对P.candollei植物的化学分离成分进行分离研究。
高速逆流色谱(HSCCC)作为一种无支撑的液-液分配色谱技术，已被广泛用于从天然产物中纯化生物活性成分。与硅胶柱色谱法相比，HSCCC消除了固相支持物的不可逆吸附、峰拖尾、失活和污染等问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种棱子芹属植物活性成分制备方法及其在制备抗炎药物中的应用，采用高速逆流色谱法(HSCCC)对伞形科棱子芹属植物P.candollei进行研究，采用连续进样和循环分离等方法成功从P.candollei植物中分离得到9化合物单体，各个化合物单体纯度均大于98％，分离纯化效果好；分离得到的活性成分具有良好的抗炎效果。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的制备方法，所述方法为：先采用醇提对P.candollei进行提取获得粗提物，然后采用高速逆流色谱对粗提物进行分离，得到以下化合物单体：
Figure GDA0003172210560000021
高速逆流色谱采用的溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统，使用前分取上相和下相，上相用作固定相，下相用作流动相。
在本发明的第二方面，提供一种伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的检测方法，包括第一方面所述的伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的制备方法，采用HPLC-ESI-MS对高速逆流色谱分离的每个组分进行检测。
在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述的制备方法制备得到的伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分在制备抗炎药物中的应用。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明建立了伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的的高速逆流色谱分离纯化方法，通过对高速逆流色谱溶剂体系的选择以及分离条件的摸索，从而实现了P.candollei植物中9个单体成分的成功分离制备，得到的各个单体纯度均大于98％，分离纯化效果好；且分离纯化得到的化合物7和8能够有效抑制NO产生。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1HSCCC分离P.candollei粗提物的色谱图；
图2为本发明实施例1两组混合物的二次HSCCC分离结果；图2A为化合物1-4离线循环；图2B为化合物6-7离线循环；
图3为本发明实施例1粗提物、混合组分和单体化合物的HPLC色谱图；
图4为本发明实施例1P.candollei中分离化合物的抗炎结果；图4A为化合物1-9在浓度为100μM下的抗炎结果；图4B和4C分别为化合物7和8在不同样品浓度下的测试结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供了一种伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的制备方法，所述方法为：先采用醇提对P.candollei进行提取获得粗提物，然后采用高速逆流色谱对粗提物进行分离，得到以下化合物单体：
Figure GDA0003172210560000031
高速逆流色谱采用的溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统，使用前分取上相和下相，上相用作固定相，下相用作流动相。
在一种具体的实施方式中，醇提步骤为：将P.candollei粉碎，采用乙醇浸泡提取三次，合并提取液，真空浓缩得到粗提物；
优选的，所述乙醇采用体积分数95％的乙醇溶液，每次浸泡46-50h，在40℃下真空浓缩并在4℃保存备用。
在一种具体的实施方式中，所述高速逆流色谱的循环分离方法为：先使用体积比为8.5-9.5:1:8.5-9.5:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统对目标组分进行初步分离，得到化合物9、化合物5、化合物8和两组混合物，分别为化合物1-4的混合物以及化合物6和7的混合物；再使用体积比为6.5-7.5:2.5-3.5:6.5-7.5:2.5-3.5的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统进行化合物1-4的混合物进行二次分离，使用体积比为8.5-9.5:1:8.5-9.5:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统对化合物6和7的混合物进行循环分离。
在一种具体的实施方式中，高速逆流色谱分离中，固定相以28-32mL/min的流速泵入分离柱；流动相的流速为1.9-2.1mL/min；
高速逆流色谱的温度设定为20-30℃，检测器波长设定为254nm。
本发明的一种实施方式中，提供了一种伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的检测方法，包括上述的伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分的制备方法，采用HPLC-ESI-MS对高速逆流色谱分离的每个组分进行检测；
优选的，HPLC分析选择水(A)和乙腈(B)为流动相，梯度条件设置为：0-1min，90％A，10％B；1-3min，90％-50％A；3-7min，50％-10％A；7-16min，10％-50％A；16-18min，10％B。
检测波长为254nm，流速为0.5-1.5mL/min。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述的制备方法制备得到的伞形科棱子芹属植物P.candollei中活性成分在制备抗炎药物中的应用。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
1.1粗提物的制备
将P.candollei植物3Kg粉碎，采用2×8L的95％乙醇浸泡48h，重复3次，合并滤液，在40℃下真空浓缩，获粗提取物124g，并在4℃保存备用。
1.2两相溶剂系统的筛选和KD值测定
选择合适的两相溶剂系统是HSCCC成功分离的关键。本实验测试了多个不同比例的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶剂系统。
配置不同比例的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶剂系统10mL，加入约2mg粗提取物，剧烈摇动，充分溶解。取上、下相各1mL，氮气吹干，残余物用1mL甲醇溶解，通过HPLC进行分析。根据公式KD＝AU/AL计算化合物的分配系数KD值，其中AU和AL分别是目标化合物在上相和下相中的峰面积。
如表1所示，当使用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(5:5:5:5，v/v)溶剂系统时，化合物1-4的KD值小于0.5，其他化合物5-8的KD值大于5。化合物9的KD值为2.59，因此该系统不适用于HSCCC分离。为了降低化合物5-9的KD值，将甲醇与水的比例增加至9:1。因此，在保持正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(5:5:9:1，v/v)溶剂体系的情况下，发现化合物1-4的KD值远远小于1，而对于化合物5-8的KD值大于2。化合物8的KD值为1.33，不能用于分离。然后保持相同的甲醇:水比率(9:1，v/v)不变，减少乙酸乙酯，并增加正己烷。因此，使用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)，发现化合物1-4在KD值接近于零，而发现其他化合物9、5和8在KD值分别为0.35、0.99、1.49，化合物6和7的KD值接近0.74。因此，将正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)系统用于进一步的分离实验。为了更好分离化合物1-4的混合组分，测试了另一种溶剂系统正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7:3:7:3，v/v)，发现化合物1-4的KD值适合，相应KD值为化合物3(0.28)、化合物2(0.31)、化合物1(0.51)和化合物4(0.58)。
表1化合物在正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系中的分配系数
Figure GDA0003172210560000051
最终，使用优化的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)两相溶剂系统初步分离目标组分；再将正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7:3:7:3，v/v)两相溶剂系统进行化合物1-4混合物的循环分离化合物，和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)两相溶剂系统进行化合物6-7的混合物的循环分离。
1.3两相溶剂系统和样品溶液的制备
将正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)溶剂系统按比例置于分液漏斗，并充分摇匀，使用前分取上相(固定相)和下相(流动相)，上相被用作固定相，300mg粗提物溶解在20mL等体积的上下相中配置样品溶液。对峰I的离线循环分离采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7:3:7:3，v/v)溶剂系统进行分离，上相被用作固定相，100mg峰I溶解在20mL等体积的上下相中配置样品溶液。
1.4高速逆流色谱分离流程
将逆流色谱分离柱以30mL/min的流速从头对尾洗脱模式完全注满固定相(上层)，装置按顺时针800rpm，温度设定为25℃，检测器波长设定为254nm，流动相(下部)以2.0mL/min的流速泵入进行平衡，当达到流体动力学平衡后进样，按照HSCCC色谱图每10mL收集一管。固定相保留率计算公式为Sf(％)＝(Vtotal–Vretained)/Vtotal×100％，其中Vtotal是CCC色谱柱总容量，而Vretained是体积保留在CCC色谱柱环路中的固定相。
优化的双相溶剂系统正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)分离结果见图2，单次上样量300mg，洗脱流速2.0mL/min，转速800rpm，检测器波长254nm，HSCCC分离得到五个组分I-V，和两组混合物，单次分离时间小于4h，连续进样3次重现性良好。如图2所示，峰I和III分别是化合物1-4和6-7的混合物，峰II、IV、V分别对应高纯度的化合物9(3.66mg)、5(5.41mg)、8(1.90mg)(＞98％)。
进一步，峰I采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7:3:7:3，v/v)两相溶剂系统进行二次分离(图3A)，洗脱流速2.0mL/min，转速800rpm，检测器波长254nm。如图3A所示，对化合物1-4组分经过两次循环HSCCC分离，化合物3(图3A中峰I)和2(图3A中峰II)通过最先洗脱出来，分别得到1.74和2.33mg。经过五次循环分离，化合物1(图3A中峰III)和化合物4(图3A中峰IV)被成功分离，分别得到4.98和3.77mg。
如图3B所示，采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(9:1:9:1，v/v)溶剂系统对化合物6-7的混合物进行循环分离，洗脱流速2.0mL/min，转速800rpm，检测器波长254nm。经过4次循环，化合物6、7被成功分离，分别为1.55和1.89mg，纯度大于98％。
所有分离得到的化合物通过HPLC分析，纯度均大于98％，结果见如图4。
1.5HPLC分析和结构鉴定
HPLC分析选择水(A)和乙腈(B)为流动相，检测波长为254nm，流速为1mL/min，梯度条件设置为：0-1min，90％A，10％B；1-3min，90％-50％A；3-7min，50％-10％A；7-16min，10％-50％A；16-18min，10％B。分离的化合物通过ESI-MS、1H、13C和DEPT-135NMR光谱分析鉴定，NMR采用MeOH-d4或DMSO-d6作为溶剂，化学位移(δ)值以ppm表示，并且耦合常数(J)的单位为Hz。
结构鉴定
木犀草苷(1):淡黄色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 449.1009.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.0(1H,s,5-OH),7.46-7.50(1H,m,H-6′),7.41-7.44(1H,m,H-2′),6.91(1H,d,J＝8.3Hz,H-5′),6.80(1H,d,J＝1.6Hz,H-8),6.75(1H,s,H-2),6.45(1H,d,J＝1.8Hz,H-6),5.09(1H,d,J＝7.3Hz,Glc H-1),3.17-3.73(6H,m,Glc H).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:181.8(C-4),164.5(C-7),162.9(C-2),161.1(C-5),156.9(C-9),150.5(C-4′),146.0(C-3′),120.9(C-1′),119.1(CH,C-6′),116.0(CH,C-5′),113.5(CH,C-2′),105.3(C-3),102.9(CH,C-10),99.9(CH,Glc C-1),99.5(CH,C-6),94.7(CH,C-8),77.1(CH,Glc C-4),76.4(CH,Glc C-3),73.1(CH,Glc C-2),69.5(CH,Glc C-5),60.6(CH2,Glc C-6).
水合氧化前胡素(2):无色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 305.0979.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.39(1H,d,J＝9.8Hz,H-4),8.04(1H,d,J＝2.2Hz,H-2′),7.37(1H,s,H-8),7.32(1H,d,J＝1.4Hz,H-3′),6.36(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),5.28(1H,s,OH),4.75(1H,dd,J＝9.8,1.7Hz,H-1a″),4.51(1H,s,OH),4.27(1H,t,J＝9.2Hz,H-2″),3.63(1H,d,J＝7.2Hz,H-1b″),1.17(3H,s,CH3),1.09(3H,s,CH3).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:160.1(C＝O,C-2),157.5(C-7),152.1(C-8a),149.3(C-5),145.9(CH,C-2'),140.0(CH,C-4),113.4(C-6),112.1(CH,C-3),106.5(C-4a),105.4(CH,C-3'),93.3(CH,C-8),76.2(CH,C-2”),74.9(CH2,C-1”),70.6(C-3”),27.6(CH3,C-5”),24.1(CH3,C-4”).
栓翅芹烯醇(3):无色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 287.0935.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.31(1H,d,J＝9.8Hz,H-4),8.04(1H,d,J＝2.4Hz,H-2'),7.39(1H,s,H-8),7.32(1H,d,J＝1.4Hz,H-3'),6.36(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),5.10and 4.93(2H,s,H-4”),4.38-4.40(1H,m,H-2”),4.49(1H,dd,J＝9.4,3.5Hz,H-1”a),4.31-4.35(1H,m,H-1”b),1.74(3H,s,H-5”).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:157.5(C-7),152.0(C-8a),148.8(C-5),146.0(CH,C-2'),144.7(C-3”),139.8(CH,C-4),113.5(C-6),112.2(CH2,C-4”),112.0(CH,C-3),106.6(C-4a),105.5(CH,C-3'),93.5(CH,C-8),75.4(CH2,C-1”),72.6(CH,C-2”),18.5(CH3,C-5”).
佛手柑内酯(4):无色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 217.0471.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:8.27(1H,d,J＝9.8Hz,H-4),7.78(1H,d,J＝2.3Hz,H-2′),7.26(1H,d,J＝1.4Hz,H-3′),7.16(1H,s,H-8),6.27(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),4.31(3H,s,OCH3,H-1″).13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:163.2(C＝O,C-2),160.0(C-7),153.9(C-8a),151.2(C-5),146.6(CH,C-2'),141.2(CH,C-4),114.1(C-6),112.9(CH,C-3),107.4(C-4a),106.3(CH,C-3'),94.1(CH,C-8),60.8(OCH3,C-1”).
十七烷酸(5):无色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 271.2596.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:2.17(2H，t，J＝7.2Hz，H-2),1.48(2H，m，H-3)，1.23(26H，br s，H-4～H-16)，0.85(3H，t，J＝6.6Hz，H-17).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:174.5(C-1),33.7(CH2,C-2),31.2(CH2,C-3),29.0(CH2,C-4-C-10),28.8(CH2,C-11),28.7(CH2,C-12),28.6(CH2,C-13),28.5(CH2,C-14),24.5(CH2,C-15),22.0(CH2,C-16),13.9(CH3,C-17).
异榄香脂素(6):油状物(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 209.1142.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:6.67(2H,s,H-4,H-6),6.31-6.35(1H,m,H-7),6.22-6.29(1H,m,H-8),3.77(6H,s,CH3O-1,CH3O-3),3.62(3H,s,CH3O-2),1.83(3H,d,J＝5.7Hz,CH3-3′).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:153.4(C-1,C-3),138.3(C-2),133.6(C-5),131.3(CH,C-1′),125.3(CH,C-2′),103.5(2CH,C-4,C-6),60.4(CH3O-2),56.2(CH3O-1,CH3O-3),18.5(CH3,C-3′).
α-细辛醚(7):油状物(MeOH),ESI-MS(负离子模式)m/z 206.9716.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:6.99(1H,s,H-6),6.63(1H,s,H-3),6.54(1H,dd,J＝15.9,1.3Hz,H-1′),6.12(1H,dq,J＝13.3,6.6Hz,H-2′),3.77(3H,s,CH3O-2),3.77(3H,s,CH3O-1),3.70(3H,s,CH3O-4),1.82(3H,dd,J＝6.5,1.1Hz,H-3′).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:150.2(C-4),148.7(C-2),142.9(C-1),124.9(CH,C-1′),123.2(CH,C-2′),117.6(C-5),110.1(CH,C-6),98.4(CH,C-3),56.3(CH3O-2),56.2(CH3O-1),55.7(CH3O-4),18.5(CH3,C-3′).
α-亚麻酸(8):油状物(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 279.1552.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:5.26–5.41(m,6H,6CH),2.79–2.90(m,4H,2CH2,H-11,14),2.25(t,2H,J＝7.4Hz,CH2,H-2),2.05–2.12(m,4H,2CH2,H-17,8),1.55–1.68(m,2H,CH2,H-3),1.28–1.34(m,8H,4CH2),0.97(t,3H,J＝7.5Hz,CH3,H-18).13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:181.0(COOH,C-1),132.7(CH,C-9),131.0(CH,C-10),129.1(CH,C-13),129.1(CH,C-12),128.8(CH,C-15),128.2(CH,C-16),36.2(CH2,C-2),30.6(CH2,C-4),30.3(CH2,C-7),30.3(CH2,C-5),30.2(CH2,C-6),28.1(CH2,C-3),26.5(CH2,C-8),26.5(CH2,C-11),26.3(CH2,C-14),21.4(CH2,C-17),14.6(CH3,C-18).
异欧前胡素(9):无色固体(MeOH),ESI-MS(正离子模式)m/z 271.0925.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.17(1H,d,J＝9.8Hz,H-4),8.05(1H,d,J＝2.2Hz,H-2′),7.37(1H,s,H-8),7.35(1H,d,J＝1.3Hz,H-3′),6.32(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),5.53(1H,t,J＝6.9Hz,H-2″),4.98(2H,d,J＝7.0Hz,H-1″),1.74(3H,s,CH3),1.67(3H,s,CH3).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:160.1(C＝O,C-2),157.4(C-7),152.0(C-8a),148.6(C-5),146.0(CH,C-2'),139.6(CH,C-4),138.9(C-3”),119.4(CH,C-2”),113.9(C-6),112.4(CH,C-3),106.7(C-4a),105.5(CH,C-3'),93.6(CH,C-8),69.3(CH2,C-1”),25.4(CH3,C-5”),18.0(CH3,C-4”).
实施例2
抗炎活性测定：
MTT法用于评估细胞毒性。巨噬细胞Raw 264.7细胞系来自中国科学院(中国上海)的细胞库。将总共2×104个细胞/mL铺在96孔板中，并在37℃的含10％FBS的DMEM培养基中孵育过夜。除去细胞培养基后，用PBS缓冲液洗涤Raw 264.7细胞3次。然后，将细胞用不同浓度的六种化合物处理，并在37℃下再孵育24h。在每个孵育期结束时，将每个孔用PBS缓冲液洗涤3次，并加入150.0μL新鲜的MTT溶液(0.5mg mL–1)。随后，去除上清液，添加150.0μLDMSO，振摇15min，在37℃下孵育4h。最终，在490nm处3次平行测定每个孔的光密度。
通过抑制脂多糖在Raw 264.7细胞中诱导的培养上清液中的一氧化氮(NO)和来评估6种化合物的抗炎作用。用Griess试剂测量NO的产生。
统计分析：所有分析均测定3次，所有数据均表示为平均值±标准差(SD)。数据分析通过单向方差分析(ANOVA)以及Tukey检验进行的。小于0.05的p值被认为具有统计学上意义的显着差异结果。
抗炎活性测试结果：
采用脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型评价了化合物的抗炎活性，化合物浓度为100μM条件下筛选分离化合物NO产生抑制能力，山奈酚为阳性对照。
结果表明，化合物3和9在剂量为100μM的RAW 264.7细胞中均没有抑制NO产生的作用(图4A)，化合物1、2和6表现出微弱的抑制活性，化合物4和5表现出一定的NO产生抑制作用，化合物7和8表现出显着的NO产生抑制作用。进一步，选择化合物7(图4B)和8(图4C)以200、100、50、10、2、1、1、0.5、0.1、0.05μM系列样品浓度进行测试，以确定其NO抑制的IC50。最终，化合物7和8有效抑制NO产生的IC50值分别为28.44μM和53.18μM。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，先采用醇提对P. candollei进行提取获得粗提物，然后采用高速逆流色谱对粗提物进行分离纯化，高速逆流色谱采用的溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统，使用前分取上相和下相，上相用作固定相，下相用作流动相；
得到以下9种化合物单体：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述高速逆流色谱的分离纯化方法为：先使用体积比为8.5-9.5:1: 8.5-9.5:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统对目标组分进行初步分离，得到化合物9、化合物5、化合物8和两组混合物，再使用体积比为6.5-7.5:2.5-3.5: 6.5-7.5:2.5-3.5的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统对化合物1-4的混合物进行二次分离，得到化合物1、化合物2、化合物3和化合物4；使用体积比为8.5-9.5:1: 8.5-9.5:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两相溶剂系统对化合物6-7的混合物进行循环分离，得到化合物6和化合物7。
2.如权利要求1所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，醇提的步骤为：将P. candollei粉碎，采用乙醇浸泡提取2-4次，合并提取液，真空浓缩得到粗提物。
3.如权利要求2所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，所述乙醇采用体积分数75-95%的乙醇溶液，每次浸泡提取时间为46-50 h。
4.如权利要求1所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，化合物1-4的混合物的分离经过至少五次循环分离；化合物6-7混合组分的分离经过至少四次循环分离。
5.如权利要求1所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，高速逆流色谱分离中，固定相以28-32 mL/min的流速泵入分离柱；流动相的流速为1.9-2.1 mL/min。
6.如权利要求1所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，其特征在于，高速逆流色谱的温度设定为20-30℃，检测器波长设定为254 nm。
7.一种伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的检测方法，其特征在于，包括权利要求1-6任一所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的制备方法，然后采用HPLC-ESI-MS对高速逆流色谱分离的每个组分进行检测。
8.如权利要求7所述的伞形科棱子芹属植物P. candollei中活性成分的检测方法，其特征在于，HPLC分析选择水（A）和乙腈（B）为流动相，梯度条件设置为：0-1 min，90%A，10%B；1-3 min，90%-50%A； 3-7 min，50%-10%A；7-16 min，10%-50%A；16-18 min，10%B；
HPLC的检测波长为254 nm，流速为0.5-1.5mL/min。
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