CN113264970B - 一种恶霉灵氧糖苷缀合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型恶霉灵氧糖苷缀合物杀菌剂的制备方法和应用，分别用半乳糖，甘露糖，葡萄糖，甘露糖胺，半乳糖胺，氨基葡萄糖，N‑乙酰‑半乳糖胺，N‑乙酰‑甘露糖胺和乙酰氨基葡萄糖与恶霉灵缀合得到一系列恶霉灵糖苷缀合物，其结构通式如I所示，其中R分别为羟基，氧乙酰基，氨基，乙酰氨基，R1为氢和乙酰基。本发明缀合物结构新颖，具有良好的溶解性和抗真菌活性，具有成为新型绿色杀菌剂的潜力。
Figure DDA0003058254140000011

Description

一种恶霉灵氧糖苷缀合物及其制备和应用
技术领域
本发明属于杀菌剂，具体涉及一种新型恶霉灵氧糖苷缀合物及其制备和应用。
背景技术
自第二次世界大战以来，传统农业发生了翻天覆地的变化，单作精耕细作取代了轮作，大量化学合成的农药和化肥取代了动物肥料。在农作物的产量急剧增加的同时也增加了土壤肥力的消耗，改变了土壤微生态系统。这种变化最直接的危害是土壤传播疾病呈现指数级增长。土壤真菌病害是一种主要的土传病害，其病原体主要包括链格孢菌，辣椒疫霉，尖孢镰刀菌，立枯丝核菌等。土壤环境的复杂性和某些真菌独特的生存方式是治疗土壤传播疾病的最大阻力。传统的治疗方法是根除土壤中的病原体，例如土壤熏蒸，日光暴晒和洪水，但使用化学农药更为直接，快速和高效，因此为了实现这一目标，需要大量的不同种类的化学农药。然而，在农药的滥用之下可帮助真菌快速进化获得抗药性，并导致化学农药的作用降低。近年来，由于生物农药的低毒，高选择性，低残留和易降解等特点而备受关注，许多生物农药已被注册和使用。如Validamycin A，Gibberellin，Lysobacter等。因此，迫切需要找到可以替代传统化学农药的生物农药。
恶霉灵(化学名称：3-羟基-5-甲基异恶唑)是一种化学农药，是SankyoCo.Ltd.在1960年代开发的广谱土壤传播真菌，其对疫霉属和腐霉属真菌敏感。然而随着恶霉灵的广泛使用，它的一些缺点被暴露出来。首当其冲，已经发现有真菌对恶霉灵产生了抗药性，其次恶霉灵对土壤中的有益生物有毒害作用，例如蚯蚓，有益真菌等。另外恶霉灵能结合土壤中的铁，铝等金属离子，导致土壤肥效降低，从而导致作物生长受限，因此对恶霉灵进行结构修饰迫在眉睫。S.Kamimura等人发现，植物中的恶霉灵被代谢为两种糖苷代谢物，即N-连接的恶霉灵糖苷缀合物，2-(-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-甲基-4-异恶唑啉-3-酮和O-连接的恶霉灵糖苷缀合物，3-(-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-甲基异恶唑。有趣的是，这两种糖苷代谢物具有不同的活性，其中O-糖苷具有抗真菌活性而N-糖苷没有抗真菌活性。这两种糖苷代谢物是恶霉灵最重要的抗真菌机制之一。另外碳水化合物由于它们独特的生物活性和多样的结构，因此被认为是药物设计和开发中的理想支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型恶霉灵氧糖苷缀合物及其制备和应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种新型恶霉灵氧糖苷缀合物，缀合物为通式I所示，
Figure GDA0003963582740000021
式I中，R分别为羟基，氧乙酰基，氨基或乙酰氨基，R1为氢或乙酰基。
一种恶霉灵氧糖苷缀合物的制备方法，分别用半乳糖，甘露糖，葡萄糖，甘露糖胺，半乳糖胺，氨基葡萄糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-甘露糖胺或乙酰氨基葡萄糖分别与恶霉灵缀合得到通式如I所示恶霉灵糖苷缀合物。
进一步的说，将半乳糖，甘露糖，葡萄糖，甘露糖胺，半乳糖胺，氨基葡萄糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-甘露糖胺或乙酰氨基葡萄糖各糖在含有溴化氢的冰乙酸中反应获得各糖的溴糖供体，而后与恶霉灵缀合得到通式如I所示恶霉灵糖苷缀合物。
具体为：
步骤1、全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖的合成：将吡啶和乙酸酐的混合溶液放置在冰上，待完全冷却之后，将葡萄糖/半乳糖添加其中溶解后使反应体系的温度升温至室温，整个反应在N2保护下反应14-18h后反应液倒入冰水中，然后过滤，烘干得到白色固体产物全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖；
步骤2、全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体的合成：将含有冰乙酸的溴化氢液体在0℃下预冷，然后全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖分批添加至反应液中，待所有原料添加完毕后，缓慢升温至室温，继续反应1-2h，反应后向反应液中加入冰水，搅拌10-30min后，用二氯甲烷萃取三次，用冰冷的碳酸氢钠溶液清洗有机相，将有机相除水，减压去除有机相得到透明的粘稠液体，即全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体；
步骤3、3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑的合成：将全乙酰化葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾加入到无水乙腈中，室温下反应8-12h，反应后减压去除乙腈，将剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析分离，得到白色固体产物3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑；
步骤4、3-(β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑的合成：步骤3得到的固体溶解在含有甲醇钠的甲醇溶液中，室温下反应1-2h，反应结束用IR 120阳离子树脂中和体系，过滤，减压去除滤液得到粗品，将粗品用硅胶层析柱分离，得到白色固体产物3-(β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑；
步骤5、1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖的合成：将氨基葡萄糖盐酸盐/半乳糖胺盐酸盐/甘露糖胺盐酸盐和碳酸氢钠溶解在水中，然后氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯逐滴加入反应体系，滴加完毕后继续在室温下反应1-2h，用1M盐酸中和反应体系，将中和的反应液旋蒸至干；向剩余物中加入吡啶和乙酸酐的混合溶液，在室温下反应整晚，然后将反应液旋蒸去除，将剩余物用硅胶柱层析进行分离得到白色固体产物1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖；
步骤6、3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体的合成：向预冷好的冰乙酸和乙酸酐的混合溶液中添加步骤7所得的原料，再向反应体系中加入浓度为33％的氢溴酸，在室温下继续反应1-2h，反应液溶解于二氯甲烷中，然后依次用水和饱和碳酸氢钠溶液清洗有机相，除水，去除有机相得到无色粘稠液体产物3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体；
步骤7、3-(3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)1-β-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑的制备：将3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖溴糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾加入到无水乙腈中，室温下反应8-12h，反应后减压去除乙腈，将剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析(分离，得到白色固体产物3-(3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)1-β-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑；
步骤8、3-(2-脱氧-2-氨基-β-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑的制备：将3-(3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)1-β-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑溶解在甲醇中，冷却至0℃，然后添加甲醇钠，继续搅拌一个小时，随后将锌粉和冰醋酸添加至混合溶液中，反应体系缓慢升温至室温，继续反应10-12h，反应结束之后，将固体分离出去，然后将溶剂去除得到粗产物，再通过硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10：1)纯化粗品得到白色固体产物3-(2-脱氧-2-氨基-β-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑；
步骤9、2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖氯糖供体的制备：将乙酰氨基葡萄糖/N-乙酰-半乳糖胺/N-乙酰-甘露糖胺与氯乙酰，在25-30℃下，反应16-20h，反应结束后，向反应体系中加入二氯甲烷，然后，将该混合溶液倒入冰水中，收集有机层，然后用冰冷的饱和碳酸氢钠溶液清洗有机相，得到的粗品用乙酸乙酯和乙醚混合溶剂进行重结晶处理得到白色固体产物2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖氯糖供体；
步骤10、3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖)-5-甲基异噁唑的制备：将2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖氯糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾加入到无水乙腈中，室温下反应8-12h，反应后减压去除乙腈，将剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析分离，得到白色固体产物3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖/半乳糖/甘露糖)-5-甲基异噁唑；
步骤11、步骤10得到的固体溶解在含有甲醇钠的甲醇溶液中，室温下反应1-2h，反应结束用IR 120阳离子树脂中和体系，过滤，减压去除滤液得到粗品，粗品进一步分离得通式如I所示恶霉灵与葡萄糖/半乳糖/甘露糖的糖苷缀合物。
所述步骤1中，吡啶和乙酸酐的体积比为：1:2～1:3，葡萄糖/半乳糖/甘露糖与混合溶液的质量体积比(g/ml)为1:10～1:15；
所述步骤2中，全乙酰氨基葡萄糖/半乳糖/甘露糖与溴化氢液体的质量体积比(g/ml)为1:1～1:3，反应液，水和二氯甲烷的体积比分别为：1:1～3:6～9。
步骤4，8，11中，原料与甲醇钠的摩尔比为10～15:1，原料与甲醇的体积比为1:10～15；所述步骤3，7和10中，糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾的投料摩尔比为1.1～1.5:1:3～6，糖供体与乙腈和二氯甲烷的质量体积比(g/ml)为1:40～60:50～80。
所述步骤5中，氨基葡萄糖盐酸盐/半乳糖胺盐酸盐/甘露糖胺盐酸盐，碳酸氢钠和氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯的投料摩尔比为1:2～4:1.1～1.5，吡啶和乙酸酐的体积比为2～3:1，氨基葡萄糖盐酸盐/半乳糖胺盐酸盐/甘露糖胺盐酸盐与水和吡啶乙酸酐混合溶液的质量体积比(g/ml)为1:10～15:5～10。
所述步骤6中，冰乙酸和乙酸酐的体积比为3～8:1，原料与冰乙酸乙酸酐混合溶液，33％氢溴酸和二氯甲烷的质量体积比(g/ml)为1:0.3～0.5:5～10:40～60；低频点击步骤8中，原料与锌粉的质量比为1:1～1.5，原料与冰乙酸的质量体积比(g/ml)为1:5～10；所述步骤9中，乙酰氨基葡萄糖/N-乙酰-半乳糖胺/N-乙酰-甘露糖胺与氯乙酰和二氯甲烷的质量体积比(g/ml)为1:2～3:10～15。
一种恶霉灵糖苷缀合物的应用，所述式I所示缀合物在制备农业抑菌剂中的应用。
一种恶霉灵糖苷缀合物的应用，所述式I所示缀合物在制备植物促生制剂中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明缀合物结构新颖，采用仿生合成的设计理念，将有机小分子与糖相结合，既能增加小分子的水溶性也能改善小分子的活性，且对生物无毒害作用；
本发明提出将半乳糖，甘露糖，葡萄糖，甘露糖胺，半乳糖胺，氨基葡萄糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-甘露糖胺和乙酰氨基葡萄糖与恶霉灵采用O连接进而获得恶霉灵糖苷缀合物，制备过程中选择性高,避免反应生成N-连接的恶霉灵糖苷物，采用本发明可特异性使糖与与恶霉灵特异性识别O-连接糖缀合物。
本发明所得糖苷缀合物另外设计的具有良好的抗真菌和促进植物生长活性，具有成为新型绿色杀菌剂的潜力，本发明恶霉灵糖苷缀合物具有成为生物农药的潜力，具有改善恶霉灵杀菌剂现状的潜力，为进一步在农业领域的应用提供了基础。
附图说明：
图1为本发明是实例提供的恶霉灵氧糖苷缀合物制备结构示意图：
图2A为本发明是实例提供的3-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑和恶霉灵对烟草幼苗的根长的影响效果图。
图2B为本发明是实例提供的3-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑和恶霉灵对烟草幼苗湿重的影响效果图。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1：3-(β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑的合成参见图1：
将75ml吡啶和50ml乙酸酐的混合溶液放置在冰上，待完全冷却之后，将10g葡萄糖添加其中，至完全溶解之后。使反应体系的温度缓慢升温至室温，整个反应在N2保护下反应15h后反应液倒入冰水中，然后过滤，烘干得到15.1g白色固体产物全乙酰化葡萄糖。
将20ml含有冰乙酸的33％溴化氢液体在0℃下预冷，然后10g全乙酰化葡萄糖分批添加(每次1g，5分钟内加完完毕)至反应液中，待所有原料添加完毕后，缓慢升温至室温，继续反应1h，TLC监测原料消耗殆尽时，向反应液中加入40ml冰水，搅拌30min后，用80ml二氯甲烷萃取三次，用冰冷的碳酸氢钠溶液清洗有机相，将有机相除水，减压去除有机相得到8.9g透明的粘稠液体，即全乙酰化葡萄糖溴糖供体。
分别称取全乙酰化葡萄糖溴糖供体4g，0.8g恶霉灵和4.8g无水碳酸钾加入到50ml无水乙腈中，室温下反应20h。TLC监测原料消失时，减压去除乙腈，将剩余物溶解在100ml二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析分离，层析分离洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝100：1(v/v)，得到3.7g白色固体产物3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.69(s,1H),5.61(d,J＝7.6Hz,1H),5.30–5.14(m,2H),4.31(dd,J＝12.5,4.3Hz,1H),4.13(d,J＝12.2Hz,1H),3.87(d,J＝8.5Hz,1H),2.34(s,3H),2.03(t,J＝13.1Hz,12H).13C NMR(500MHz,CDCl3)δ171.05(s),170.56(s),170.07(m),170.03(s),169.36(s),169.29(s),97.36(s),93.45(s),72.66(s),72.43(s),70.84(s),67.77(s),61.41(s),20.67(s),20.56(d,J＝2.5Hz),12.91(s).ESI-HRMS m/z:[M+H]+calcd for C18H24NO11:430.13；found:430.14.
称取2g 3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑溶解在含有130mg甲醇钠的30ml甲醇溶液中，室温下反应1h，反应结束用IR 120阳离子树脂中和体系，过滤，减压去除滤液得到粗品。将粗品用硅胶层析柱分离，层析分离洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝10：1(v/v)，得到1.2g白色固体产物3-(β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。
1H NMR(500MHz,D2O)δ5.61(s,1H),5.20(dd,J＝9.2,4.1Hz,1H),3.91–3.71(m,2H),3.65–3.42(m,3H),3.35(td,J＝9.4,4.5Hz,1H),2.21(t,J＝9.3Hz,3H)13C NMR(500MHz,D2O)δ174.53(s),170.48(s),97.45(s),82.61(s),78.21(s),76.16(s),69.13(s),68.97(s),60.36(s),12.58(s).ESI-HRMS m/z:[M+H]+calcd for C10H15NO7:262.09；found:262.09
将11g氨基葡萄糖盐酸盐和13g碳酸氢钠溶解在100ml水中，然后8ml氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯逐滴加入反应体系，滴加完毕后继续在室温下反应2h，用1M盐酸中和反应体系，将中和的反应液旋蒸至干。向剩余物中加入50ml吡啶和25ml乙酸酐的混合溶液，在室温下反应整晚。然后将反应液旋蒸去除，将剩余物用硅胶柱层析进行分离，分离洗脱液为正己烷：乙酸乙酯＝4：1(v/v),收集洗脱组分得到16.2g白色固体产物1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖。
向预冷好的34ml冰乙酸和7ml乙酸酐的混合溶液中添加10g1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖，再向反应体系中加入70ml 33％的氢溴酸。在室温下继续反应1h。反应液溶解于500ml二氯甲烷中，然后依次用水和饱和碳酸氢钠溶液清洗有机相，除水，去除有机相得到9.6g无色粘稠液体产物3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖溴糖供体。
将4g3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2，2，2-trichloroethoxycarbonylamino)-α-吡喃葡萄糖溴糖供体，0.6g恶霉灵和3.5g无水碳酸钾加入到50ml无水乙腈中，室温下反应10h。TLC监测原料消失时，减压去除乙腈，将剩余物溶解在400ml二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100：1)分离，得到白色固体产物3.3g3-(3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)1-β-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.69(dd,J＝4.5,3.8Hz,2H),5.65(d,J＝9.4Hz,1H),5.35–5.29(m,1H),5.15(dd,J＝19.2,9.7Hz,1H),4.64(d,J＝12.0Hz,1H),4.32(dd,J＝12.4,4.4Hz,1H),3.92–3.86(m,1H),2.33(s,2H),2.10–2.02(m,9H),1.81(s,3H).13C NMR(500MHz,CDCl3)δ171.18(s),171.10(s),170.64(s),170.30–170.22(m),169.41(s),154.27(s),97.87(s),93.40(s),74.44(s),72.50(s),71.84(s),68.08(s),61.61(s),60.39(s),55.84(s),21.02(s),20.69(s),20.58(s),14.17(s).12.88(s).ESI-HRMS m/z:[M+H]+calcd for C19H24Cl3N2O11:562.03；found:562.04.
将2g3-(3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)1-β-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑溶解在20ml甲醇中，冷却至0℃，然后添加100mg甲醇钠，继续搅拌一个小时。随后将2.5g锌粉和7ml冰醋酸添加至混合溶液中。反应体系缓慢升温至室温，继续反应10h。反应结束之后，将固体分离出去，然后将溶剂去除得到粗产物。再通过硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化粗品得到0.6g白色固体产物3-(2-脱氧-2-氨基-β-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δ5.49(s,1H),5.39(d,J＝8.4Hz,1H),3.91–3.86(m,1H),3.77–3.72(m,1H),3.55(dd,J＝10.2,8.7Hz,1H),3.49–3.45(m,2H),3.07(dd,J＝10.2,8.4Hz,1H),1.97(s,3H).13C NMR(500MHz,CD3OD)δ171.76(s),170.48(s),98.36(s),92.80(s),77.66(s),73.53(s),69.73(s),60.53(s),56.02(s),48.44(s),11.30(s).ESI-HRMSm/z:[M+H]+calcd for C10H16N2O6:261.10；found:261.11.
将10g乙酰氨基葡萄糖装入单口烧瓶，在单口烧瓶上装冷凝管，然后通过冷凝管上端加入20ml氯乙酰，在25-30℃下，反应18h。反应结束后，从冷凝管上端向反应体系中加入100ml二氯甲烷，然后，将该混合溶液倒入冰水中，通过分液漏斗分离出有机层，然后用冰冷的饱和碳酸氢钠溶液清洗有机相。清洗完毕后立即对有机相进行除水和去除有机相操作，对得到的粗品用乙酸乙酯和乙醚混合溶剂进行重结晶处理得到14g白色固体产物2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖氯糖供体。将4g 2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖氯糖供体，1g恶霉灵和5g无水碳酸钾加入到50ml无水乙腈中，室温下反应10h。TLC监测原料消失时，减压去除乙腈，将剩余物溶解在100ml二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100：1)分离，得到3.7g白色固体产物3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.11(d,J＝9.6Hz,1H),5.71(s,1H),5.64(d,J＝10.3Hz,1H),5.29–5.21(m,1H),5.17–5.10(m,1H),4.36–4.22(m,1H),4.11(dd,J＝12.6,2.6Hz,1H),3.85(ddd,J＝10.2,4.8,2.5Hz,1H),2.31(s,3H),2.03(t,9H),1.89(s,3H).13C NMR(600MHz,CDCl3)δ171.16(d),170.80(s),170.56(d),169.44(s),98.09(s),93.70(s),72.58(s),72.43(s),68.08(s),61.78(s),53.87(s),23.27(s),20.94–20.57(t),13.00(s).ESI-HRMS m/z:[M+H]+calcd for C18H24NO11:429.15；found:429.15.
将2g 3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑溶解在含有150mg甲醇钠的20ml甲醇溶液中，室温下反应1h，反应结束用IR 120阳离子树脂中和体系，过滤，减压去除滤液得到粗品。将粗品用硅胶层析柱(二氯甲烷/甲醇＝10：1)分离，得到0.9g白色固体产物3-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑。
1H NMR(500MHz,D2O)δ5.84(s,1H),5.24(d,J＝8.5Hz,1H),3.82(dt,J＝21.5,10.2Hz,3H),3.71–3.64(m,2H),3.57–3.39(m,1H),2.23(s,3H).13C NMR(500MHz,D2O)δ174.96(s),173.19(s),170.92(s),99.05(s),93.09(s),76.57(s),73.31(s),69.42(s),60.37(s),55.17(s),22.04(s),12.19(s).ESI-HRMS m/z:[M+H]+calcd for C12H18N2O7:303.11；found:303.12.
进一步的可按照上述图1记载的制备过程，以及实施例记载的具体步骤将原料进行替换即可制备通式I所示其他化合物。
当R基为羟基和氧乙酰基，R1为乙酰基和氢时，便得到了恶霉灵的氧苷缀合物。将糖单元替换为氨基葡萄糖时，即可得到表1中R＝NTroc,R1＝Ac和R＝NH2,R1＝H的恶霉灵氧糖苷缀合物；将糖单元替换为乙酰氨基葡萄糖时，即可得到表1中R＝NHAc,R1＝Ac和R＝NHAc,R1＝H的恶霉灵氧糖苷缀合物。
抑菌活性测定：
采用生长速率法测定样品对2种土传致病真菌(油菜菌核，链格孢菌)的抑菌活性。测试上述实施例获得6个不同单糖恶霉灵缀合物在200μg/mL下对两种真菌的抑制效果。
具体，不同单糖恶霉灵缀合物的配置为先用DMSO分别溶解各单糖恶霉灵缀合物配制100mg/ml的原液，然后加入到15ml的培养基中，使培养基中个单糖恶霉灵缀合物浓度为200ug/ml；其中，培养基为综合PDA。
实验以相同浓度的恶霉灵(绿亨一号)为阳性对照，以蒸馏水为空白对照。将培养基均匀倒入直径为9cm的培养皿中，待完全凝固后，在每个培养皿中接种3块直径为5mm的菌饼。在28℃下培养至空白组真菌长到快要接触时，测量菌落直径，计算样品的抑菌率。每次处理设置3个培养皿，每个培养皿接种3个菌落，对每个菌落选择不同角度读取三个直径D1、D2、D3，取平均值为样品抑菌圈直径D样品，全部试验重复一次。根据下式计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(D空白－D样品)/(D空白－5)×100
实验结果见表1
表1通式I不同单糖恶霉灵缀合物对油菜菌核，链格孢菌的抑制活性
Figure GDA0003963582740000091
从表1中可以看出，恶霉灵糖苷缀合物保持了恶霉灵的杀菌活性，其中用乙酰氨基葡萄糖连接恶霉灵生成的缀合物活性最高，其在200ug/ml浓度下对链格孢菌和油菜菌核的抑制率分别为100％和83.5％，其体外抑菌活性略低于阳性对照恶霉灵。
植物生长实验
选取2-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑和恶霉灵进行对烟草幼苗(烤烟K326)的植物生长实验。
将烟草种子分别浸泡在1％CuSO4和0.5％ZnSO4溶液中消毒30分钟和15分钟。消毒后的种子均匀地撒在装有营养土壤和蛭石(体积比＝1：1)的50孔育苗盘上，然后在表面撒上一层薄薄的营养土，并浇水浸湿。将育苗盘放在26℃的气候室中，以12h/12h的白天黑夜模式培养7天。随后将幼苗移植到装有400g由营养土，普通土壤和砾石(体积比＝1：1：1)组成的混合土的塑料培养皿中。每周一次用2-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑和恶霉灵(100、200μg/ml，10ml)灌溉幼苗，每组十只幼苗。21天后，测量并记录所有幼苗的湿重和根长，实验结果如图2A和2B。
通过图2A和2B，可以发现2-(-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑对植物具有明显的促生作用，尤其能显著促进植物的根生长，而根是植物的营养器官，对植物的生长至关重要，因此该发明的缀合物除了具有良好的抗真菌性，同时其还能够进一步促进植物生长活性，使其赋予更高的活性效果，在农业上具有很大的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种恶霉灵氧糖苷缀合物，其特征在于，缀合物为通式I所示，
Figure 6954DEST_PATH_IMAGE001
I
式I中，R为乙酰氨基，R1为氢。
2.按权利要求1所述的恶霉灵氧糖苷缀合物的制备方法，其特征在于，将乙酰氨基葡萄糖在含有溴化氢的冰乙酸中反应获得溴糖供体，而后与恶霉灵缀合得到通式如I所示恶霉灵糖苷缀合物。
3.按权利要求2所述的恶霉灵氧糖苷缀合物的制备方法，其特征在于，
步骤1、2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖氯糖供体的制备：将乙酰氨基葡萄糖与氯乙酰，在25-30℃下，反应16-20h，反应结束后，向反应体系中加入二氯甲烷，然后，将该混合溶液倒入冰水中，收集有机层，然后用冰冷的饱和碳酸氢钠溶液清洗有机相，得到的粗品用乙酸乙酯和乙醚混合溶剂进行重结晶处理得到白色固体产物2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖氯糖供体；
步骤2、3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑的制备：将2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖氯糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾加入到无水乙腈中，室温下反应8-12h，反应后减压去除乙腈，将剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗有机相，有机相除水，旋蒸去除有机相得到粗品，然后将粗品用硅胶柱层析分离，得到白色固体产物3-(-2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-5-甲基异噁唑；
步骤3、步骤2得到的固体溶解在含有甲醇钠的甲醇溶液中，室温下反应1-2h，反应结束用IR 120阳离子树脂中和体系，过滤，减压去除滤液得到粗品，粗品进一步分离得通式如I所示恶霉灵与葡萄糖的糖苷缀合物。
4.按权利要求3所述的恶霉灵氧糖苷缀合物的制备方法，其特征在于，步骤3中，原料与甲醇钠的摩尔比为10~15:1，原料与甲醇的体积比为1:10~15；所述步骤2中，糖供体，恶霉灵和无水碳酸钾的投料摩尔比为1.1~1.5:1:3~6，糖供体与乙腈和二氯甲烷的质量体积比（g/ml）为1:40~60:50~80。
5.按权利要求3所述的恶霉灵氧糖苷缀合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，乙酰氨基葡萄糖与氯乙酰和二氯甲烷的质量体积比（g/ml）为1:2~3:10~15。
6.一种如权利要求1所述恶霉灵糖苷缀合物的应用，其特征在于：所述式I所示缀合物在制备农业抑菌剂中的应用。
7.一种如权利要求1所述恶霉灵糖苷缀合物的应用，其特征在于：所述式I所示缀合物在制备植物促生制剂中的应用。
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