CN113264937A

CN113264937A - 一种4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物及其应用

Info

Publication number: CN113264937A
Application number: CN202110637732.1A
Authority: CN
Inventors: 杨光; 黄袆磊; 魏明明; 孙悦
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: CN113264937B

Abstract

本发明公开了一种4‑氨基吡唑并[3，4‑d]嘧啶衍生物及其应用，该衍生物结构如式Ⅰ所示，A为芳环基团或芳杂环基团；L为脂肪烷烃；Cyclic为含N杂环结构；Q为羰基或磺酰基；R为烷烃、芳基或杂芳基。本发明合成并筛选出了一种新的4‑氨基吡唑并[3,4‑d]嘧啶衍生物，可以以剂量依赖性抑制ALK5受体的活性，该衍生物或其溶剂合物、可药用盐可应用于制备治疗和/或预防癌症的药物中。

Description

一种4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物及其应用

技术领域

本发明属于化药领域，具体涉及一种4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物及其应用。

背景技术

TGF-β(转化生长因子-β)是一种大小约25kDa的由二硫化物连接的二聚体蛋白，调控着众多的生物进程。在哺乳动物中主要有三种受体与TGF-β结合，即TGF-βRI,TGF-βRII,和TGF-βRIII，这些受体广泛的分布于细胞膜表面，其中I型受体TGF-βRI，又被称为活化素受体样激酶5(ALK5)，是磷酸化下游信号通路的核心区域，也是多数药物分子的作用靶点。TGF-β/Smad通路的成分高度保守，属于经典的膜-核信号通路，其相互作用和功能以及许多方面的结构基础都是已知的，涉及直接受体介导Sma d转录因子的激活。

TGF-β信号通路的异常表达与肿瘤微环境的形成具有密切的联系，选择性抑制该信号通路被认为是治疗癌症的有效方法。其中，TGF-βRI(ALK5)是一个较为理想的靶点。TGF-β/Smad信号通路被认为是癌症的关键信号通路，在肿瘤微环境的形成中发挥了重要作用。该通路的异常表达不仅可以促进肿瘤组织中上皮间质转化的发生，帮助肿瘤组织中形成致密的纤维化基质，形成一个耐药的微环境；还可以帮助癌细胞逃避免疫监控，使肿瘤组织内处于一个免疫低响应的状态；另外，它还会促进肿瘤组织内血管的生成，这进一步加速了肿瘤组织的进展。因此，越来越多的治疗策略开始转向通过阻断TGF-β信号通路来抑制肿瘤微环境的形成，实现阻止肿瘤的发展的目的。

虽然现阶段国内外众多科研单位聚焦于ALK5抑制剂的研发，并且已经取得了不俗的进展，但是目前形势仍然不是很明朗，已开发的药物分子结构相对单一，进入临床实验的候选分子较少，而且仍然没有上市药物。因此，开发新型，高选择性的AL K5小分子抑制剂迫在眉睫。

发明内容

本发明创造旨在克服现有的技术中的缺陷，提出了一种结构新颖的靶向ALK5受体的化合物，并提供了制备方法以及其在靶向ALK5来防治癌症药物中的应用。

为达到上述目的，本发明发现一种新型化合物，即一种4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

所述A为芳环基团或芳杂环基团；所述L为脂肪烷烃；所述Cyclic为含N杂环结构；所述Q为羰基或磺酰基；所述R为烷烃、芳基或杂芳基。

上述化合物的结构为4a-4h、8c₁-8c₆、8s₁-8s₂₂、11a-11l、16a-16c中的一种：

当其结构为4a-4h中的一种，其合成路线为：

当其结构为8c₁-8c₆、8s₁-8s₂₂中的一种，其合成路线为：

当其结构为11a-11l中的一种，其合成路线为：

当其结构为16a-16c中的一种，其合成路线为：

发明人发现上述4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物或其溶剂合物、可药用盐可应用于制备治疗和/或预防癌症的药物中。特别是具有TGF-βRI异常激活的癌症，如胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌或神经母细胞癌。

本发明的有益效果为：本发明合成并筛选出了一种新的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，可以以剂量依赖性抑制ALK5受体的活性。

附图说明

图1所示为化合物16a的¹H-NMR光谱图；

图2所示为化合物16a的¹³C-NMR光谱图；

图3所示为化合物16a对PAN02肿瘤生长的抑制作用实验结果图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例1：结构为4a-4h的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的制备

其合成路线为：

通过上述合成路线合成的化合物如表1所示：

表1

合成路线中，由(1)和(2)制备中间体(3)(后简称为化合物3)的具体过程为：

向三颈瓶中加入3-溴1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(1.49g，7.00mmol)，5-吲哚硼酸(2.26g,14.0mmol)，四(三苯基膦)钯(405mg,350μmol)，磷酸钾(4.46g，21.0mmol)；然后加入1,4-二氧六环(35mL)，纯净水(7mL)，再将反应装置用氩气鼓吹10分钟，在氩气保护下于90℃下油浴加热反应12小时；待反应液冷却至室温后，将反应混合物用乙酸乙酯(35mL)稀释，过滤，滤去不溶物并将滤液于真空下浓缩，浓缩物通过硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到化合物3(白色固体，1.23g，70％)。

对化合物3进行检测，其检测结果如下：M.p.175.3-176.9℃；IR(KBr):2930,2872,1620,1545,1443,1392,1256,1196,882,603cm^-1.¹H NMR(400MHz,DM SO)δ13.5(s,1H),11.3(s,1H),8.2(s,1H),7.8(s,1H),7.6(d,J＝8.4Hz,1H),7.5(d,J＝2.9Hz,1H),7.4(d,J＝8.5Hz,1H),6.5(m,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ158.6,156.1,154.6,145.5,136.4,128.5,127.0,124.2,121.8,120.5,112.6,97.8.HRMS(ESI)calculated for C₁₃H₁₀N₆Na⁺[M+Na]⁺:273.0967,found 273.0962。

(1)化合物4a的合成路线和具体制备过程：

合成路线：

具体制备过程：将化合物3(1.00g，4.00mmol)，N-Boc-4-哌啶乙醇(1.12g，5.19mmol)和三苯基膦(1.36g，5.19mmol)加入到干燥的反应瓶中，再加入无水四氢呋喃(80mL)，然后在冰浴下搅拌，待装置冷却充分后，缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯(1.11g，5.19mmol)，冰浴下反应5小时；反应完成后，将混合物浓缩，将残余物通过硅胶柱色谱层析法纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1-25：1)，得到化合物4a(白色固体，1.25g，70％)。

对化合物4a进行检测，其检测结果如下：M.p.145.2-146.3℃；IR(KBr):3540,2364,2345,1838,1367,1320,842,692cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.9(s,1H),8.4(s,1H),7.9(m,1H),7.5(m,2H),7.3(dd,J＝3.2,2.4Hz,1H),6.6(ddd,J＝3.0,2.0,0.9Hz,1H),5.9(s,2H),4.3(d,J＝7.3Hz,2H),4.1(s,2H),2.7(s,2H),2.3(dqt,J＝10.9,7.2,3.6Hz,1H),1.5(s,9H),1.3(m,2H).¹³C N MR(100MHz,CDCl3)δ158.2,155.8,154.9,154.6,145.9,136.1,128.5,125.7,124.6,122.3,120.9,112.1,103.0,98.4,79.5,77.3,52.1,36.8,28.5.HRMS(ESI)calc ulated for C₂₄H₃₀N₇O₂ ⁺[M+H]⁺:448.2455,found:448.2453。

(2)化合物4b的合成路线和具体制备过程：

合成路线同化合物4a，将反应物中N-Boc-4-哌啶乙醇改为N-Boc-4-羟基哌啶得到化合物4b(白色固体，73％)。对化合物4b进行检测，其检测结果如下：M.p.140.3-141.9℃；IR(KBr):3462,3230,3064,2851,2360,2341,1934,1624,1381,1363,771,688cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.9(s,1H),8.3(s,1H),7.9(d,J＝1.5Hz,1H),7.5(m,2H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),6.6(m,1H),5.9(s,2H),4.9(tt,J＝11.5,4.0Hz,1H),4.3(s,2H),2.9(s,2H),2.3(qd,J＝12.3,11.5,3.7Hz,2H),2.0(m,2H),1.5(s,9H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.2,155.5,154.6,153.6,145.7,136.1,128.5,125.7,124.7,122.3,120.9,112.1,103.0,98.8,79.8,77.3,54.1,31.4,28.5.HRMS(ESI)calculated for C₂₃H₂₈N₇O₂ ⁺[M+H]⁺:434.2299,found:434.2294。

(3)化合物4c-4h的合成路线均同化合物4a：

化合物4c：将N-Boc-4-哌啶乙醇改为N-Boc-4-哌啶甲醇得到化合物4c(白色固体，75％)。化合物4d：将N-Boc-4-哌啶乙醇改为N-Boc-(3-甲基-3-吡咯烷基)得到化合物4d(白色固体，63％)。化合物4e：需将N-Boc-4-哌啶乙醇改为3-羟甲基氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯得到化合物4e(白色固体，67％)。化合物4f：将N-Boc-4-哌啶乙醇改为1-Boc-3-羟甲基哌啶得到化合物4f(白色固体，70％)。化合物4g：将N-Boc-4-哌啶乙醇改为叔丁基-4-(2-羟乙基)哌嗪-1-羧酸酯得到化合物4g(白色固体，73％)。化合物4h：将N-Boc-4-哌啶乙醇改为N-Boc-4-(3-羟丙基)-哌啶得到化合物4h(白色固体，76％)。

实施例2：结构为8c₁-8c₆、8s₁-8s₂₂的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的制备

其合成路线为：

通过上述合成路线合成的化合物如表2所示：

表2

合成路线中，化合物(6)(后简称为化合物6)的具体制备过程为：

冰浴下，将4-哌啶乙醇(1.00g，7.74mmol)，氯甲酸-9-芴基甲酯(2.20g，8.51mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，缓慢加入三乙胺(1.17g，11.6mmol)于室温下搅拌3小时。待反应完毕后，用饱和氯化钠溶液(15mL)洗，将有机相浓缩，用硅胶柱色谱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝5：1)纯化，得到化合物6(白色固体，2.44g，90％)。

对化合物6进行检测，其检测结果如下：M.p.215.5-216.2℃；IR(KBr):3071,2858,2367,1388,846,808,778,695cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.7(dd,J＝22.8,7.5Hz,4H),7.3(dt,J＝29.5,7.4Hz,4H),4.1(m,1H),3.7(t,J＝6.5Hz,2H),3.1(d,J＝11.0Hz,2H),2.7(s,2H),2.2(t,J＝11.1Hz,2H),1.8(d,J＝11.1Hz,2H),1.5(m,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ146.3,141.0,127.2,126.8,125.4,119.7,62.4(m),60.6,54.3,44.8,39.3,32.3(m),29.7.HRMS(ES I)calculated for C₂₂H₃₆NO₃ ⁺[M+H]⁺:352.1835,found:352.1840。

合成路线中，化合物(7)(后简称为化合物7)的具体制备过程为：

将化合物1(1.00g，4.67mmol)(实施例1中合成路线中的(1))，化合物6(2.13g，6.07mmol)和三苯基膦(1.59g，6.07mmol)加入到干燥的反应瓶中，再加入无水THF(50mL)。然后在冰浴下缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯(1.47g，6.07mmol)，将混合物在室温搅拌反应4小时。然后将混合物浓缩，并通过硅胶柱色谱法层析法纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1)，得到化合物7(1.69g，66％)。

对化合物7进行检测，其检测结果如下：M.p.161.5-162.3℃；IR(KBr):3020,2928,1657,1613,1610,1585,1430,1160cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.3(s,1H),7.8(d,J＝7.5Hz,2H),7.6(d,J＝7.4Hz,2H),7.4(t,J＝7.4Hz,2H),7.3(t,J＝7.4Hz,2H),6.2(s,2H),4.4(q,J＝7.2Hz,4H),4.2(t,J＝6.8Hz,1H),4.1(m,2H),2.7(s,2H),1.9(q,J＝7.1Hz,2H),1.8(m,2H),1.4(dqt,J＝13.7,6.5,3.2Hz,1H),1.1(s,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ157.5,156.7,155.2,154.1,144.1,141.3,127.7,127.0,125.0,120.0,77.3,67.1,47.4,44.9,44.0,35.9,33.2.HRMS(ESI)calculated for C₂₇H₂₈BrN₆O₂ ⁺[M+H]⁺:547.1374,foun d:547.1380。

(1)化合物8c₁的合成路线和具体制备过程：

合成路线：

具体制备过程：在Schlenk管中装入化合物7(1.00g，1.83mmol)，5-吲哚硼酸(353mg，2.19mmol)，四(三苯基膦)钯(106mg，91.3μmol)，碳酸钾(631mg，4.57mmol)，再加入1,4-二氧六环(18mL)，纯净水(3.6mL)，然后用氩气鼓泡10分钟后，将装置于氩气保护下，90℃加热过夜。待反应完成后，将装置冷却至室温，反应混合物用乙酸乙酯稀释(20mL)，过滤除去不溶物，将滤液浓缩为棕色固体备用。冰浴下，将上一步的得到的棕色固体加入干燥的二氯甲烷(9mL)中，再依次加入三乙胺(278mg，2.75mmol)，氯甲酸苄酯(311mg,1.83mmol)冰浴下反应4h，然后将混合物浓缩，并通过硅胶柱色谱层析法纯化(二氯甲烷：甲醇＝15：1)，得到化合物8c₁(白色固体，616mg，68％)。

对化合物8c₁进行检测，其检测结果如下：M.p.174.1-176.0℃；IR(KBr):3122,2919,2821,2372,1656,1579,1496,1399,937,809,769,541cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.5(s,1H),8.4(s,1H),7.9(d,J＝1.6Hz,1H),7.5(m,2H),7.3(m,6H),6.6(t,J＝2.6Hz,1H),5.7(s,2H),5.1(s,2H),4.5(t,J＝7.2Hz,2H),4.2(s,2H),2.7(s,2H),1.9(q,J＝7.1Hz,2H),1.8(s,2H),1.5(m,1H),1.2(d,J＝14.9Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.0,155.8,155.3,154.2,145.7,136.9,136.1,128.5,127.9,127.8,125.6,124.8,122.4,120.9,112.1,103.2,67.0,44.6,44.1,36.1,33.5.HRMS(ESI)calculated forC₂₈H₃₀N₇O₂ ⁺[M+H]⁺:496.2455,found:496.2608。

(2)化合物8c₂-8c₆、化合物8s₂-8s₂₂的合成路线均同化合物8c₁：

化合物8c₂：将氯甲酸苄酯改为苯甲酰氯得到化合物8c₂(白色固体，80％)。对化合物8c₂进行检测，其检测结果如下：M.p.156.2-158.5℃；IR(KBr):3468,3171,3008,2360,2341,1624,1564,1516,1480,1456,1338,1302,1035,972,936,884,801,728,591,571cm^- ¹.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.0(s,1H),8.4(s,1H),7.9(s,1H),7.5(m,2H),7.4(s,5H),7.3(d,J＝2.7Hz,1H),6.6(t,J＝2.6Hz,1H),5.9(s,2H),4.7(d,J＝13.2Hz,1H),4.5(t,J＝7.1Hz,2H),3.7(m,1H),2.9(d,J＝12.9Hz,1H),2.7(s,1H),2.0(m,4H),1.8(d,J＝12.9Hz,1H),1.6(ddp,J＝11.2,7.5,3.4Hz,1H),1.3(m,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.4,158.3,155.7,154.1,146.0,136.3,136.2,129.6,128.5,126.8,125.8,124.4,122.1,120.8,112.2,102.8,102.8,98.5,44.5,36.0,33.7.HRMS(ESI)calculated for C₂₇H₂₈N₇O⁺[M+H]⁺:466.2349,found:466.2350。

化合物8c₃：将氯甲酸苄酯改为特戊酰氯得到化合物8c₃(白色固体，81％)。对化合物8c₃进行检测，其结果如下：M.p.136.7-137.2℃；IR(KBr):3444,3125,2921,2857,2360,2340,1650,1615,1542,1505,1475,1397,890,803,771,723,703cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.9(s,1H),8.4(s,1H),7.9(d,J＝1.6Hz,1H),7.5(m,2H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),6.6(t,J＝2.5Hz,1H),5.8(s,2H),4.5(m,4H),2.7(m,2H),1.9(q,J＝7.1Hz,2H),1.8(m,2H),1.5(ddt,J＝11.1,7.7,3.9Hz,1H),1.3(s,9H),1.2(td,J＝12.4,3.9Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ176.2,158.1,155.8,154.2,145.7,136.1,128.5,125.7,124.7,122.4,120.9,112.1,103.1,98.5,44.6,38.7,36.1,33.8,32.2,28.5.HRMS(ESI)calculated forC₂₅H₃₂N₇O⁺[M+H]⁺:446.2662,found:446.2663。

化合物8c₄：将氯甲酸苄酯改为乙酰氯得到化合物8c₄(白色固体，81％)。对化合物8c₄进行检测，其结果如下：M.p.146.8-147.7℃；IR(KBr):3734,3648,2360,1882,1564,1563,1534,1449,930,864,825cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.7(s,1H),8.4(s,1H),7.9(s,1H),7.5(m,2H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),6.6(t,J＝2.6Hz,1H),5.7(s,2H),4.6(m,1H),4.5(t,J＝7.2Hz,2H),3.8(d,J＝13.7Hz,1H),3.0(td,J＝13.0,2.8Hz,1H),2.5(td,J＝12.9,2.9Hz,1H),2.1(s,3H),1.9(m,4H),1.5(ddp,J＝10.8,7.0,3.6Hz,1H),1.2(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.9,158.0,155.8,145.8,136.1,128.5,125.7,124.7,122.3,120.9,112.1,103.1,98.5,46.6,44.6,41.7,36.0,33.6,32.4,31.6,21.6.HRMS(ESI)calculatedfor C₂₂H₂₆N₇O⁺[M+H]⁺:404.2193,found:404.2193。

化合物8c₅：将氯甲酸苄酯改为丙炔酰氯得到化合物8c₅(白色固体，78％)。化合物8c₆：将氯甲酸苄酯改为邻甲氧基苯甲酰氯得到化合物8c₆(白色固体，90％)。化合物8s₁：将反应物中的氯甲酸苄酯改为对甲苯磺酰氯得到化合物8s₁(白色固体，90％)。

对化合物8s₁进行检测，其检测结果如下：M.p.166.6-168.8℃；IR(KBr):3101,2918,2840,2341,1647,1568,1516,1490,1456,1338,1302,1035,972,936,884,801,728,591,571cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.4(d,J＝9.9Hz,2H),7.9(s,1H),7.6(d,J＝8.0Hz,2H),7.5(m,2H),7.3(m,3H),6.6(m,1H),5.5(s,2H),4.4(t,J＝7.1Hz,2H),3.8(d,J＝11.5Hz,2H),2.4(s,3H),2.2(m,2H),1.9(m,4H),1.4(qd,J＝12.2,4.0Hz,2H),1.2(m,1H).¹³C NMR(100MH z,CDCl₃)δ157.9,155.8,129.6,128.5,127.7,125.6,122.4,120.9,112.0,103.2,46.3,44.4,35.7,32.6,31.2,21.6.HRMS(ESI)calculated for C₂₇H₃₀N₇O₂S⁺[M+H]⁺:516.2176,found:516.2182。

化合物8s₂：将氯甲酸苄酯改为β-萘磺酰氯得到化合物8s₂(白色固体，87％)。化合物8s₃：将氯甲酸苄酯改为2、4、6-三甲基苯磺酰氯得到化合物8s₃(白色固体，94％)。化合物8s₄：将氯甲酸苄酯改为对叔丁基苯磺酰氯得到化合物8s₄(白色固体，93％)。化合物8s₅：将氯甲酸苄酯改为2-噻吩磺酰氯得到化合物8s₅(白色固体，92％)。

对化合物8s₅进行检测，其结果如下：M.p.126.4-127.2℃；IR(KBr):3121,2850,2381,1659,1608,1526,1500,1308,894,831,798,621cm^-1.¹H NMR(400M Hz,CDCl₃)δ8.6(s,1H),8.3(s,1H),7.9(d,J＝1.5Hz,1H),7.6(dd,J＝5.0,1.3Hz,1H),7.5(d,J＝8.3Hz,1H),7.5(dd,J＝3.8,1.3Hz,1H),7.5(dd,J＝8.3,1.6Hz,1H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),7.1(dd,J＝5.0,3.7Hz,1H),6.6(t,J＝2.6Hz,1H),5.8(s,2H),4.5(t,J＝7.1Hz,2H),3.8(dt,J＝12.0,3.3Hz,2H),2.3(td,J＝11.9,2.5Hz,2H),1.9(q,J＝7.0Hz,2H),1.9(dd,J＝13.5,3.4Hz,2H),1.4(qd,J＝12.2,4.1Hz,2H),1.2(dt,J＝11.3,3.9Hz,1H).¹³C N MR(100MHz,CDCl₃)δ158.1,155.8,154.2,145.8,136.5,136.1,132.2,131.9,128.5,127.6,125.7,124.7,122.3,120.9,112.1,103.1,46.4,44.4,35.6,32.5,31.1.H RMS(ESI)calculated forC₂₄H₂₆N₇O₂S₂ ⁺[M+H]⁺:508.1584,found:508.1588。

化合物8s₆：将氯甲酸苄酯改为吡啶-3-磺酰氯得到化合物8s₆(白色固体，87％)。化合物8s₇：将氯甲酸苄酯改为乙基磺酰氯得到化合物8s₇(白色固体，92％)。化合物8s₈：将氯甲酸苄酯改为丙基磺酰氯得到化合物8s₈(白色固体，88％)。

对化合物8s₈进行检测，其检测结果如下：M.p.166.7-167.8℃；IR(KBr):3139,2896,2748,2389,1675,1596,1554,1488,1346,944,809,736,509cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.6(s,1H),8.4(s,1H),7.9(s,1H),7.5(d,J＝8.4Hz,1H),7.5(m,1H),7.3(q,J＝2.3,1.8Hz,1H),6.6(t,J＝2.5Hz,1H),5.8(s,2H),4.5(t,J＝7.0Hz,2H),3.8(d,J＝11.5Hz,2H),2.8(m,2H),2.7(t,J＝11.0Hz,2H),2.0(d,J＝6.5Hz,2H),1.8(m,4H),1.3(tq,J＝12.6,8.7,7.1Hz,3H),1.0(td,J＝7.4,1.5Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.1,155.8,154.2,136.1,128.5,125.7,124.7,122.3,120.9,112.1,103.1,103.1,98.5,50.9,46.0,44.5,35.8,32.9,31.7,16.9,13.2.HRMS(ESI)calculated for C₂₃H₃₀N₇O₂S⁺[M+H]⁺:468.2176,found:468.2179。

化合物8s₉：将氯甲酸苄酯改为1-丁基磺酰氯得到化合物8s₉(白色固体，92％)。对化合物8s₉进行检测，其检测结果如下：M.p.126.1-127.6℃；IR(KBr):3263,3266,2857,2366,1940,1630,1387,1369,844,777,694cm^-1.¹H NMR(400MHz,C DCl₃)δ8.6(s,1H),8.4(s,1H),7.9(d,J＝1.6Hz,1H),7.6(d,J＝8.4Hz,1H),7.5(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),6.6(t,J＝2.6Hz,1H),5.8(s,2H),4.5(t,J＝7.1Hz,2H),3.8(dd,J＝12.5,4.0Hz,2H),2.9(m,2H),2.7(t,J＝11.9Hz,2H),1.9(m,5H),1.8(m,2H),1.4(q,J＝7.5Hz,2H),1.3(m,2H),0.9(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.1,155.8,154.3,145.8,136.1,128.5,125.7,124.7,122.4,120.9,112.1,103.1,49.0,46.0,44.5,35.8,33.0,31.7,25.1,21.8,13.6.HRMS(ESI)calculated forC₂₄H₃₂N₇O₂S⁺[M+H]⁺:482.2332,found:482.2333。

化合物8s₁₀：将氯甲酸苄酯改为环丙磺酰氯得到化合物8s₁₀(白色固体，95％)。对化合物8s₁₀进行检测，其检测结果如下：M.p.120.2-121.2℃；IR(KBr):3013,2930,2742,2352,1689,1569,974,889,730,593cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.8(s,1H),8.4(s,1H),7.9(d,J＝1.5Hz,1H),7.5(d,J＝8.4Hz,1H),7.5(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),7.3(t,J＝2.8Hz,1H),6.6(ddd,J＝3.0,1.9,0.8Hz,1H),5.9(s,2H),4.5(t,J＝7.1Hz,2H),3.8(dd,J＝12.4,3.9Hz,2H),2.7(t d,J＝11.5,2.5Hz,2H),2.2(tt,J＝8.0,4.9Hz,1H),2.0(q,J＝6.7Hz,2H),1.9(d,J＝11.3Hz,2H),1.3(tq,J＝11.6,7.6,6.9Hz,3H),1.1(qd,J＝5.5,1.0Hz,2H),0.9(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.2,155.8,154.3,145.8,136.1,128.5,125.7,124.7,122.3,120.9,112.1,103.1,98.5,46.4,44.5,35.8,32.9,31.6,25.8,4.3.HRMS(ESI)calculated forC₂₃H₂₈N₇O₂S⁺[M+H]⁺:466.2019,fou nd:466.2019。

化合物8s₁₁：将氯甲酸苄酯改为4-三氟甲基苯磺酰氯得到化合物8s₁₁(白色固体，87％)。化合物8s₁₂：将氯甲酸苄酯改为4-氰基苯磺酰氯得到化合物8s₁₂(白色固体，90％)。化合物8s₁₃：将氯甲酸苄酯改为对甲氧基苯磺酰氯得到化合物8s₁₃(白色固体，89％)。化合物8s₁₄：将氯甲酸苄酯改为2，5-二甲氧基苯磺酰氯得到化合物8s₁₄(白色固体，94％)。化合物8s₁₅：将氯甲酸苄酯改为2-氟苯磺酰氯得到化合物8s₁₅(白色固体，95％)。化合物8s₁₆：将氯甲酸苄酯改为3，5-二氟苯磺酰氯得到化合物8s₁₆(白色固体，95％)。化合物8s₁₇：将氯甲酸苄酯改为2，5-二氯苯磺酰氯得到化合物8s₁₇(白色固体，89％)。化合物8s₁₈：将氯甲酸苄酯改为2，3-二氯苯磺酰氯得到化合物8s₁₈(白色固体，88％)。化合物8s₁₉：将氯甲酸苄酯改为3-氯苯磺酰氯得到化合物8s₁₉(白色固体，92％)。化合物8s₂₀：将氯甲酸苄酯改为2-氯苯磺酰氯得到化合物8s₂₀(白色固体，92％)。化合物8s₂₁：将氯甲酸苄酯改为2，4-二氯苯磺酰氯得到化合物8s₂₁(白色固体，74％)。化合物8s₂₂：将氯甲酸苄酯改为异丙基磺酰氯得到化合物8s₂₂(白色固体，84％)。

实施例3：结构为11a-11l的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的制备

其合成路线为：

通过上述合成路线合成的化合物如表3所示：

表3

合成路线中，中间体(9)(后简称为化合物9)的具体过程为：

在冰浴下，将化合物5(合成路线中(5)的简称)(2.00g，15.5mmol)溶于DC M溶液中(8mL)，将乙酸酐(1.10g，17.0mmol)缓慢滴入其中，冰浴下搅拌2小时。待反应完成后，将反应液用饱和氯化钠洗涤(8mL)，无水硫酸钠干燥后浓缩得化合物9，(无色油状液体，2.28g，86％)。

对化合物9进行检测，其检测结果如下：¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.4(d dt,J＝13.3,4.8,2.3Hz,1H),3.7(ddt,J＝13.6,4.8,2.4Hz,1H),3.6(t,J＝6.6Hz,2H),3.3(s,1H),2.9(td,J＝12.9,2.6Hz,1H),2.4(td,J＝12.9,2.7Hz,1H),2.0(s,3H),1.6(dddd,J＝29.9,14.7,6.4,3.1Hz,3H),1.4(q,J＝6.6Hz,2H),1.0(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ169.0,77.4,59.5,46.7,41.8,38.9,32.7,32.5,31.8,21.4.HRMS(ESI)calculated forC₉H₁₈NO⁺[M+H]⁺:172.1260,found:172.1258。

合成路线中，中间体(10)(后简称为化合物10)的具体过程为：

向干燥的反应瓶中加入化合物1(实施例1中合成路线中的(1))(2.00g，9.34mmol)，化合物9(2.08g，12.2mmol)和三苯基膦(3.19g，12.2mmol)，再加入无水THF(93mL)。然后将装置至于冰浴中，待装置冷却充分后，缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(2.94mg，12.2mmol)。将混合物在冰浴下搅拌3-4小时，待反应完成以后，将混合物浓缩，并通过硅胶柱色谱层析法纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1)，得到化合物10(白色固体，2.26g，66％)。

对化合物10进行检测，其检测结果如下：M.p.166.7-167.5℃；IR(KBr):3425,3392,3245,2901,2992,2765,1884,1570,1438,1148,1089,893,877,608cm^-1.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.2(s,1H),4.3(t,J＝7.0Hz,3H),3.7(m,1H),2.9(td,J＝13.5,12.9,2.7Hz,1H),2.4(td,J＝12.7,2.8Hz,1H),2.0(m,3H),1.7(m,4H),1.4(dqd,J＝10.9,7.0,3.3Hz,1H),1.0(dqd,J＝51.3,12.2,4.3H z,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.3,157.9,157.1,154.2,117.4,99.8,46.2,44.6,41.3,35.8,33.1,32.3,31.6,21.8.HRMS(ESI)calculated for C₁₄H₂₀BrN₆O⁺[M+H]⁺:367.0809,found:367.0806。

(1)化合物11a的合成路线和具体制备过程：

合成路线：

具体制备过程：在Schlenk管中加入化合物7(1.00g，1.83mmol),3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯(578mg，2.19mmol)，四(三苯基膦)钯(106mg，91.3μmol)，碳酸钾(631mg，4.57mmol)。再加入1,4-二氧六环(18mL)，纯净水(4mL)，将反应装置用氩气鼓泡10分钟后，将反应装置在氩气保护下于90℃下加热反应8小时。反应完毕后，待装置冷却至室温，将反应混合物用乙酸乙酯稀释(20mL)，过滤，除去不溶物，滤液浓缩后利用硅胶柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝20：1-15：1)分离后得到化合物11a(白色固体，629mg，81％)。

对化合物11a进行检测，其检测结果如下：M.p.196.3-197.2℃；IR(KBr):3506,3421,3342,3290,2898,2890,2660,2459,1881,1645,1567,1324,1256,1145,1086,890,874,605cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.3(d,J＝2.5Hz,1H),7.1(m,2H),7.0(dd,J＝8.2,2.6Hz,1H),5.8(s,2H),4.5(d,J＝13.4Hz,1H),4.4(t,J＝7.4Hz,2H),3.9(d,J＝2.7Hz,6H),3.7(d,J＝13.5Hz,1H),2.9(t,J＝13.2Hz,1H),2.4(t,J＝13.1Hz,1H),2.0(s,3H),1.8(m,4H),1.5(m,1H),1.1(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.8,158.0,155.8,154.2,149.9,149.6,144.3,125.8,120.8,111.6,111.5,98.4,56.1,46.5,44.6,41.7,36.0,33.6,32.4,31.6,21.5.HRMS(ESI)calculated for C₂₂H₂₉N₆O₃ ⁺[M+H]⁺:425.2296,found:425.2295。

(2)化合物11b-11k的合成路线均同化合物11a：

化合物11b：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为3，4-亚甲基苯硼酸频那醇酯得到化合物11b，(白色固体，84％)。对化合物11b进行检测，其检测结果如下：M.p.146.2-147.2℃；IR(KBr):2855,2342,1580,1509,1483,1328,1286,1223,1169,816,720cm^-1.¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.4(s,1H),7.2(m,2H),7.0(d,J＝7.7Hz,1H),6.1(s,2H),4.6(ddt,J＝13.2,4.6,2.4Hz,1H),4.5(t,J＝7.2Hz,2H),3.8(ddt,J＝13.8,4.7,2.4Hz,1H),3.0(td,J＝13.0,2.8Hz,1H),2.5(td,J＝12.9,3.0Hz,1H),1.9(m,4H),1.5(ttt,J＝10.1,6.4,3.5Hz,1H),1.2(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.8,158.0,155.8,154.2,148.6,148.5,144.0,127.1,122.2,109.1,108.9,101.6,98.3,46.5,44.6,41.7,35.9,33.5,32.4,31.6,21.5.HRMS(ESI)calculated forC₂₁H₂₅N₆O₃ ⁺[M+H]⁺:409.1982,found:409.1980。

化合物11c：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为喹喔啉-6-硼酸频那醇酯得到化合物11c，(白色固体，81％)。化合物11d：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为6-喹啉硼酸频那醇酯得到化合物11d，(白色固体，82％)。化合物11e：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为6-苯并噻唑频哪醇硼酸酯得到化合物11e，(白色固体，84％)。化合物11f：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为1-甲基吲哚-5-硼酸频哪醇酯得到化合物11f，(白色固体，80％)。化合物11g：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为3-氟-5-甲氧基苯硼酸得到化合物11g，(白色固体，83％)。化合物11h：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为苯并呋喃-2-硼酸得到化合物11h，(白色固体，86％)。化合物11i：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为4-氨基-2-甲基苯硼酸频那醇酯得到化合物11i，(白色固体，85％)。化合物11j：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为3-乙酰氨基苯硼酸频那醇酯得到化合物11j，(白色固体，88％)。化合物11k：将3,4-二甲氧基苯硼酸频哪醇酯改为吲哚-6-硼酸频哪醇酯得到化合物11k，(白色固体，82％)。

(12)化合物11l的合成路线和具体制备过程：

合成路线:

具体制备过程：在Schlenk管中加入化合物10(500mg，1.36mmol)，(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二杂氧戊硼烷-2-基)-1H-吲唑(497.2mg，2.04mmol)，四(三苯基膦)钯(78.7mg，50.0μmol)，磷酸钾(867mg，4.08mmol)。然后加入N,N-二甲基甲酰胺(6mL)，纯净水(3mL)，将反应装置用氩气鼓泡10分钟后，在氩气的保护下于80℃下加热反应12小时。反应完成后，待装置冷却至室温，反应液用乙酸乙酯(13mL)溶解，(13mL)水洗两次，除去不溶物，滤液浓缩后利用硅胶柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝20：1-15：1)分离后得到化合物11l(白色固体，165mg，30％)。

对化合物11l进行检测，其检测结果如下：M.p.146.4-147.6℃；IR(KBr):3423,3243,2899,2990,2763,1882,1436,1146,1087,891,875,606cm^-1.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ13.3(s,1H),8.3(s,1H),8.2(s,1H),8.0(s,1H),7.7(m,2H),4.4(t,J＝7.0Hz,2H),4.3(d,J＝12.9Hz,1H),3.8(d,J＝13.5Hz,1H),2.9(td,J＝13.1,2.7Hz,1H),2.4(td,J＝12.7,2.8Hz,1H),2.0(s,3H),1.8(m,4H),1.5(dq,J＝11.3,3.8Hz,1H),1.1(m,1H),1.0(qd,J＝12.2,4.3Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.3,158.6,156.1,154.5,144.7,140.2,134.7,127.0,125.6,123.7,121.1,111.3,97.7,46.2,44.3,41.3,36.0,33.3,32.4,31.7,21.8.HRMS(ESI)calculated for C₂₁H₂₅N₈O⁺[M+H]⁺:405.2073,found:405.2060。

实施例4：结构为16a-16c的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的制备

其合成路线为：

通过上述合成路线合成的化合物如表4所示：

表4

合成路线中，中间体15(a)(后简称为化合物15a)的具体过程为：

在Schlenk管中装入化合物5-溴-6-甲基吲哚(500mg，2.83mmol)，联硼酸频那醇酯(903mg，3.57mmol)，二氯[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]钯(II)二氯甲烷络合物(97.2mg，120μmol)，醋酸钾(701mg，7.14mmol)。然后加入无水的1,4-二氧六环(14mL)后，将反应装置用氩气鼓泡10分钟后，在氩气的保护下于80℃加热反应。待反应完毕后，将装置冷却至室温，向反应混合物中加入乙酸乙酯(14mL)稀释，过滤除去不溶物，滤液用饱和氯化钠洗涤，干燥，浓缩后利用硅胶柱色谱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝10：1-5：1)分离纯化后得到化合物15a(白色固体，568mg，78％)。

对化合物15a进行检测，其检测结果如下：M.p.144.4-145.2℃；IR(KBr):3266,3269,2860,2369,2341,1644,1461,1221,846,808,778,695cm^-1.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.9(s,1H),7.9(s,1H),7.3(ddd,J＝35.1,8.3,2.0Hz,2H),7.1(s,1H),2.3(d,J＝1.9Hz,3H),1.3(d,J＝2.1Hz,12H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ127.3,126.4,123.4,118.4,111.2,110.4,83.5,25.2,10.0.HRMS(E SI)calculated for C₁₅H₂₁BNO₂ ⁺[M+H]⁺:258.1589,found:258.1586。

合成路线中，中间体15(b)(后简称为化合物15b)的具体过程为：

合成路线同化合物15a，只需将反应物中的5-溴-3-甲基吲哚改为5-溴-2-甲基吲哚经色硅胶柱色谱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝10：1-5：1)，得到化合物15b，(白色固体，87％)。

对化合物15b进行检测，其检测结果如下：M.p.146.6-137.9℃；IR(KBr):3225,3200,2870,2829,2341,1754,1565,1440,1325,853,848,788,745,605cm^-1.¹H N MR(400MHz,CDCl₃)δ8.1(d,J＝4.5Hz,1H),7.9(s,1H),7.6(t,J＝6.1H z,1H),7.3(t,J＝4.6Hz,1H),6.3(d,J＝4.3Hz,1H),2.4(m,3H),1.4(m,12H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ138.2,135.1,128.8,127.4,127.2,109.7,100.9,83.4,24.9,13.7.HRMS(ESI)calculated forC₁₅H₂₁BNO₂ ⁺[M+H]⁺:258.1589,found:258.1588。

合成路线中，中间体15(c)(后简称为化合物15c)的具体过程为：

合成路线同化合物15a，只需将反应物5-溴-3-甲基吲哚改为5-溴-6-甲基吲哚经色硅胶柱色谱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝10：1-5：1)，得到化合物15c，(白色固体，85％)。

对化合物15c进行检测，其检测结果如下：M.p.151.7-151.6℃；IR(KBr):3306,3259,2880,2449,2334,1764,1561,1461,1221,856,845,767,705cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.1(s,1H),8.0(s,1H),7.1(s,1H),7.0(dd,J＝3.2,2.3H z,1H),6.4(m,1H),2.6(s,3H),1.3(s,12H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ138.4,138.0,129.8,125.4,123.4,111.7,102.9,83.1,24.9,22.8.HRMS(ESI)calculated for C₁₅H₂₁BNO₂ ⁺[M+H]⁺:258.1585,found:258.1588。

(1)化合物16a的合成路线和具体制备过程：

合成路线：

具体制备过程：在Schlenk管中加入化合物10(200mg，540μmol)，15a(154mg,600μmoL),四(三苯基膦)钯(31.5mg，27.2μmol)，碳酸钾(188mg，1.36mmol)。再加入甲苯(5mL)，乙醇(1mL),纯净水(250μL)，将反应装置用氩气鼓泡10分钟后，在氩气的保护下于80℃下加热反应8小时。反应完成后，待装置冷却至室温，反应液用饱和氯化钠洗涤，乙酸乙酯萃取两次，有机相干燥，浓缩后将粗品利用硅胶柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝20：1-15：1)分离后得到化合物16a(白色固体，169mg，75％)。

对化合物16a进行检测，其检测结果如下：M.p.154.2-155.5℃；IR(KBr):3126,3088,2341,1771,1749,1671,1652,1558,1507,1473,1419cm^-1.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.5(s,1H),8.4(s,1H),7.9(s,1H),7.5(d,J＝2.2Hz,2H),7.1(s,1H),5.8(m,2H),4.6(d,J＝13.6Hz,1H),4.5(t,J＝7.1Hz,2H),3.8(d,J＝13.6Hz,1H),3.0(td,J＝13.0,2.8Hz,1H),2.5(td,J＝12.8,3.0Hz,2H),2.4(s,3H),2.1(m,3H),1.9(m,4H),1.5(ddq,J＝11.3,7.7,4.5,3.7Hz,1H),1.2(qd,J＝12.6,4.2Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.8,158.1,155.8,154.2,146.0,129.0,123.9,123.1,122.1,119.2,112.2,111.9,98.6,46.6,44.6,41.7,36.0,33.6,32.4,31.6,21.6,9.7.HRMS(ESI)calculated for C₂₃H₂₈N₇O⁺[M+H]⁺:418.2277,found:418.2299。化合物16a的¹H-NMR光谱图如图1所示，化合物16a的¹³C-NMR光谱图如图2所示。

(2)化合物16b-16c的合成路线均同化合物16a：

化合物16b：将反应物15a更改为15b即可得到化合物16b(白色固体，75％)。化合物16c：将反应物15a更改为15c即可得到化合物16a，(白色固体，70％)。

效果验证例：

一、Luciferase测试

该实验的目的是鉴定在基于细胞的测定中选择性干扰SMAD 2,3依赖性基因表达的化合物，证明它们在细胞水平上抑制ALK5。在DMEM培养基(Invitrogen)中的96孔板中，将可检定的冷冻原液以每孔4000个细胞的平板接种Luc-Smad2/3-NIH3T3细胞(南开大学杨诚实验室)。细胞过夜附着后，将培养基更换为2％FBS。伴随细胞用TGF-β1(4ng/mL)处理，并在2％FBS培养基中显示指定浓度的ALK5抑制剂，并在5％CO₂中于37℃孵育24小时。根据制造商的说明，使用Bright-Glo荧光素酶测定系统(Promega)制备细胞裂解物，并通过光度计MDSpectraMax M3(美国分子仪器公司)测量发光。具体检测结果如表5所示。数据证明部分列表化合物可在纳摩尔浓度范围下，在细胞内抑制ALK5参与的信号通路。

表5

二、激酶活性测试

我们根据luciferase报告系统初筛的结果选择活性较好的20个化合物进行体外酶活测试。利用发光ADP检测测定法用于评估化合物的ALK5结合能力(ADP-Glo^TM激酶测定法，Promega)。选择化合物LY-364947作为阳性对照，

将每种化合物用DMSO配置成10nM溶液，并依次将其稀释至10μM，3.333μM，1.111μM，370nM，123nM，41nM，14nM，4.6nM，1.5nM和0.5nM。用激酶缓冲液(40mM Tris-HCl(pH7.5)，0.10％BSA，1mM DTT和20mM Mn Cl₂)稀释该激酶，并将部分溶液添加到含有该化合物溶液的384孔板中，并于室温下孵育10分钟。用激酶缓冲液稀释FAM标签的ALK5多肽(Promega)和ATP，然后将2.5μL溶液添加到含有反应溶液的384孔板中，并于室温下孵育120分钟。然后加入10μLADP-Glo试剂于室温下孵育40分钟，以终止反应并消耗掉过量的ATP。加入10μl激酶检测试剂，室温下孵育40分钟，在在Envision 2104读板器上读取发光信号，计算抑制率。具体测试结果如表6所示。测试数据显示，下表中化合物均可以在蛋白水平抑制ALK5的激酶活性。

表6

三、体外抗增殖活性实验

利用MTT比色法，我们评价了共51个ALK5抑制剂小分子抑制剂。测试的肿瘤细胞系为人胰腺癌细胞系(PANC-1)和小鼠的胰腺癌细胞系(PAN02)，以及人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)和小鼠乳腺癌细胞系(4T1)。对这一系列的肿瘤细胞系的体外抗增值活性测试结果如表7所示。

表7

通过对以上51个化合物的抗肿瘤活性筛选结果，我们发现，所设计并且合成的一系列小分子中多数具有抗肿瘤细胞增殖的效果，对TGF-β信号通路高表达的胰腺癌和乳腺癌细胞具有显著的抑制作用，其中16a的抑制作用最强，可作为候选评价药物。

四、小鼠体内抗肿瘤实验

动物研究得到了南开大学机构审查委员会的批准。所有动物研究均按照南开大学动物伦理委员会批准的规程进行。构建小鼠皮下荷瘤模型评价化合物16a对C57BL/6雌性小鼠的抗肿瘤作用。Pan02小鼠胰腺癌细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。所有小鼠均在标准无特定病原体(SPF)条件下饲养。对6～8周龄的C57BL/6雌性小鼠皮下注射Pan02细胞5x10⁶个。每天对小鼠进行成瘤检查，以确定肿瘤的发展情况。肿瘤生长到一定大小时，将小鼠随机分为两组，每组5只，给药组进行腹腔注射给药，给药量为50mpk。每天使用游标卡尺测量肿瘤直径并记录小鼠体重。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5×a×b²，a和b分别代表肿瘤的大小径，21天摘取肿瘤组织。以肿瘤体积的变化评价该化合物的抑瘤效果。结果如图3中所示，a图表示给药组和对照组肿瘤体积差别显著，b图表示给药组与对照组肿瘤的质量具有显著差异，c图表示给药组与对照组小鼠质量并无较大变化，d图表示给药组和对照组肿瘤对比，结果显示化合物16a具有良好的抗肿瘤活性。

Claims

1.一种4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构如式Ⅰ所示：

2.根据权利要求1所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构为4a-4h、8c₁-8c₆、8s₁-8s₂₂、11a-11l、16a-16c中的一种：

3.根据权利要求2所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构为4a-4h中的一种，其合成路线为：

4.根据权利要求2所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构为8c₁-8c₆、8s₁-8s₂₂中的一种，其合成路线为：

5.根据权利要求2所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构为11a-11l中的一种，其合成路线为：

6.根据权利要求2所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于，其结构为16a-16c中的一种，其合成路线为：

7.权利要求1至2任一项所述的4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物或其溶剂合物、可药用盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌症为具有TGF-βRI异常激活的癌症。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症为胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌或神经母细胞癌。