CN113249331A - 负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种负载Tax抗原的DC细胞，其是将CD3‑EGFR融合基因和编码Tax抗原的pX基因克隆至慢病毒载体上转染DC细胞而得到的呈递Tax抗原的DC细胞。本发明进一步将负载Tax抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得大量高活性CTL细胞。杀伤实验证明，此群CTL细胞可高效杀灭携带Tax抗原的靶细胞。

Description

负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体而言，是关于一种负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。
背景技术
成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）是一种顽固的成熟T细胞恶性肿瘤，具有多种临床特征，在病因学上与称为I型人T细胞白血病病毒（HTLV-1）的逆转录病毒相关。HTLV-1病毒感染在日本的西南地区，中南美洲，中非，中东，远东，澳大利亚中部和罗马尼亚等地比较多。中国属于HTLV低流行区，但在中国福建、广东等沿海地区发现有局部集中的HTLV-1的感染。
HTLV-1是一种致癌性逆转录病毒，感染了全球1000至2000万人。在这些感染人群中，有1-6％的感染者会发展为T细胞白血病/淋巴瘤（ATL / ATLL），另外2-3％的感染者会患上各种慢性炎症综合症，包括HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻瘫（HAM / TSP）；其余仍为该病毒的终身无症状携带者。ATL可通过化疗、同种异体造血干细胞移植等手段进行治疗，但整体预后不佳。临床上急需寻找更多的治疗手段。
免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的一大突破，针对ATL的免疫治疗也逐渐开展起来。有研究表明，多数感染HTLV-1病毒的人群都会产生针对HTLV-1病毒的强烈的CD8 + T细胞应答，其中包含针对HTLV-1病毒基因pX编码的Tax蛋白的CD8+T细胞。
CN109535231A 中公开了人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)特异性识别表位及其应用，表位肽以抗原蛋白Tax为靶标设计，为抗原蛋白Tax的HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽，但是其是用计算机模拟的方式寻找到Tax全蛋白里与HLA匹配的多肽片段进行验证和应用。此种方法的不足之处在于：（1）预测的准确性不够；（2）不同HLA（如HLA-A11, A24, B**）都需要通过类似的方法去预测，工作量大，效率不高；（3）预测出的多肽通过DC细胞进行递呈，DC细胞只适用于HLA-A2阳性的患者，且效用受预测准确度、DC细胞数量、活性和多肽负载效率的影响；（4）细胞不可再生，属于耗竭型产品。此外，DC细胞的负载效率和对T细胞的激活作用受DC细胞活性的影响，但是目前的DC细胞普遍存在活性差，难以扩增等问题。
因此，需要开发一种DC细胞活性高、容易扩增、内源性表达并呈递Tax蛋白的任意多肽并适用于任何HLA类型人群的针对人T细胞白血病/淋巴瘤的通用型DC细胞疫苗。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的针对HTLV-1病毒基因pX编码的Tax抗原的细胞免疫治疗技术。
为实现上述目的，本发明提供了一种负载Tax蛋白抗原的DC细胞。
由此，本发明首先提供了一种负载Tax整个蛋白抗原的方法，将CD3-EGFR融合基因和编码Tax抗原的pX基因序列分别插入到慢病毒载体上，通过慢病毒转染的方式使DC细胞负载并呈递Tax抗原。进一步，本发明使所得负载Tax的DC细胞与配体PBMC细胞（HLA-A2.1）进行共培养，以得到Tax抗原特异性的T细胞群，经验证具有高效的杀伤作用。
从而，一方面，本发明提供了一种负载Tax抗原的DC细胞，其是将CD3-EGFR融合基因和编码Tax抗原的pX基因分别克隆至慢病毒载体上转染DC细胞而得到的呈递Tax抗原的DC细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Tax抗原的DC细胞中，所述Tax抗原包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；优选地，所述编码Tax抗原的pX基因包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Tax抗原的DC细胞中，所述CD3-EGFR融合基因编码的蛋白包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；优选地，所述CD3-EGFR融合基因包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了一种所述负载Tax抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：
构建含有编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染DC细胞而得到呈递Tax抗原的DC细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明中所用的慢病毒载体例如可以是pCDH系列、pLVX系列、plenti系列。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Tax抗原的DC细胞的制备方法中，所述编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基因为具有SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Tax抗原的DC细胞的制备方法中，
所述编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的基因为具有SEQ ID NO:3所示序列的核苷酸。
本发明的方法制备的DC细胞，不仅可以用于自体T细胞的诱导，还可以用于诱导异体配型的T细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带Tax抗原的DC细胞可制备为癌症治疗性疫苗，针对Tax阳性的成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带Tax抗原的DC细胞，在体外诱导的Tax特异性细胞毒T细胞，用于过继性T细胞治疗成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）或HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻瘫（HAM / TSP）。
另一方面，本发明还提供了所述负载Tax抗原的DC细胞在制备Tax抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种免疫细胞，其是由本发明所述的负载Tax抗原的DC细胞诱导产生的。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞包括CTL细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞由本发明所述的负载Tax抗原的DC细胞与PBMC细胞共培养获得的；
根据本发明的一些具体实施方案，本发明所述的负载Tax抗原的DC细胞与PBMC细胞共培养时，所述的负载Tax抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5-1:500的量混合培养；
优选地，培养体系中加入100unit/mL-1000unit/mL的白介素2进行混合培养。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括：编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，编码SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，含有编码SEQ ID No.4所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体和/或本发明所述的负载Tax抗原的DC细胞。所述试剂盒还可包括转染试剂或所属领域中的常规试剂等。本发明的试剂盒可用于制备所述的Tax抗原特异性的免疫细胞组合物。
综上所述，本发明提供了一种针对人T细胞白血病/淋巴瘤的通用型疫苗及其制备方法和应用。本发明运用HTLV-1 pX基因以及嵌合基因CD3-EGFR，构建了工程化的树突状细胞。这种方法产生的DC细胞有如下优势：（1）Tax和CD3-EGFR共同驱动细胞生长，使DC细胞可以在体外培养增殖，保证足够的细胞数量；一方面，本发明意外发现pX基因可以促进细胞长时间存活；另一方面，pX基因可以在细胞内稳定持续表达，不需要再额外合成多肽或mRNA进行抗原加载；CD3-EGFR基因的加入能够进一步提升细胞的生长速度和生长状态，两者共同作用，可以生产稳定扩增、稳定呈递抗原的细胞产品；（2）该DC细胞可稳定表达Tax蛋白并递呈其多肽，刺激Tax特异性T细胞产生；同时，DC细胞内源性处理呈递的Tax抗原肽，理论上涵盖了该蛋白所有可能的肽段，相比预测抗原肽数量更多，刺激出多种特异性T细胞的潜能更大，能使杀伤作用更强；（3）该DC细胞经HLA配型后可用于异体ATL患者的治疗；（4）本发明通过Tax和CD3-EGFR促使DC细胞扩增，活性提升，同时内源性表达并递呈Tax蛋白的任意多肽，此法可推广至任何HLA类型的人群，都可以制备得到携带抗原的可扩增DC，而且可以反复使用，不受使用次数的限制。总的来说，本发明提供的DC细胞及其制备方法，同时解决了DC细胞数量、抗原负载和活性三方面的问题，且不局限与某一特定的HLA类型，而是DC细胞所有能够呈递Tax蛋白肽段的HLA都将发挥作用，效用会显著提高。
附图说明
图1A-图1B为DCX1-1细胞的流式表型。
图2为DCX1-1细胞诱导产生的CTL细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达情况。
图3为DCX1-1诱导的CTL细胞内验证因子的表达。
图4为MT4细胞内HLA-A2.1的表达情况。
图5为DCX1-1细胞诱导的CTL细胞对MT4细胞的杀伤效果。
图6为DCX1-1诱导的CTL细胞对3T3细胞的杀伤作用。
图7为DCX1-1诱导的CTL细胞对3T3细胞的杀伤作用。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1构建pX和CD3-EGFR的慢病毒载体
（1）含pX合成基因以及CD3-EGFR融合基因克隆到慢病毒骨架载体pCDH上得到重组质粒；其中pX基因的核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2。CD3-EGFR的融合基因及氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO:4。其中，CD3-EGFR基因是分别克隆CD3ζ片段（1-70个氨基酸）和EGFR胞内片段后，经平端连接后获得。CD3引物分别为 5’-gaggaattcgccaccatgaagtggaaggcgcttttcacc-3’（ SEQ ID NO:5）以及 5’-ctggttctggccctgctggtacgc-3（SEQ ID NO:6）’；EGFR引物分别为5’-aggcgccacatcgttcggaagcgc-3’（ SEQ ID NO:7）以及5’-gagtctagatcatgctccaataaattcactgctttg-3’（ SEQ ID NO:8）。
pX核苷酸序列（SEQ ID NO:1）
atggcccatttcccagggtttggacagagtcttcttttcggatacccagtctacgtgtttggagactgtgtacaaggcgactggtgccccatctctgggggactatgttcggcccgcctacatcgtcacgccctactggccacctgtccagagcatcagatcacctgggaccccatcgacggacgcgttatcggctcagctctacagttccttatccctcgactcccctccttccccacccagagaacctctaagaccctcaaggtccttaccccgccaatcactcatacaacccccaacattccaccctccttcctccaggccatgcgcaaatactcccccttccgaaatggatacatggaacccacccttgggcagcacctcccaaccctgtcttttccagaccccggactccggccccaaaacctgtacaccctctggggaggctccgttgtctgcatgtacctctaccagctttccccccccatcacctggcccctcctgccccacgtgattttttgccaccccggccagctcggggccttcctcaccaatgttccctacaagcgaatagaagaactcctctataaaatttccctcaccacaggggccctaataattctacccgaagactgtttgcccaccacccttttccagcctgctagggcacccgtcacgctaacagcctggcaaaacggcctccttccgttccactcaaccctcaccactccaggccttatttggacatttaccgatggcacgcctatgatttccgggccctgccctaaagatggccagccatctttagtactacagtcctcctcctttatatttcacaaatttcaaaccaaggcctaccacccctcatttctactctcacacggcctcatacagtactcttcctttcatagtttacatctcctgtttgaagaatacaccaacatccccatttctctactttttaacgaaaaagaggcagatgacaatgaccatgagccccaaatatcccccgggggcttagagcctcccagtgaaaaacatttccgagaaacagaagtctga
pX氨基酸序列（SEQ ID NO:2）
MAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVQGDWCPISGGLCSARLHRHALLATCPEHQITWDPIDGRVIGSALQFLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPITHTTPNIPPSFLQAMRKYSPFRNGYMEPTLGQHLPTLSFPDPGLRPQNLYTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFCHPGQLGAFLTNVPYKRIEELLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQNGLLPFHSTLTTPGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSHGLIQYSSFHSLHLLFEEYTNIPISLLFNEKEADDNDHEPQISPGGLEPPSEKHFRETEV
CD3-EGFR核酸序列（SEQ ID NO:3）
atgaagtggaaggcgcttttcaccgcggccatcctgcaggcacagttgccgattacagaggcacagagctttggcctgctggatcccaaactctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtgcctatcaagtggatggcattggaatcaattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctacggggtgactgtttgggagttgatgacctttggatccaagccatatgacggaatccctgccagcgagatctcctccatcctggagaaaggagaacgcctccctcagccacccatatgtaccatcgatgtctacatgatcatggtcaagtgctggatgatagacgcagatagtcgcccaaagttccgtgagttgatcatcgaattctccaaaatggcccgagacccccagcgctaccttgtcattcagggggatgaaagaatgcatttgccaagtcctacagactccaacttctaccgtgccctgatggatgaagaagacatggacgacgtggtggatgccgacgagtacctcatcccacagcagggcttcttcagcagcccctccacgtcacggactcccctcctgagctctctgagtgcaaccagcaacaattccaccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatcaaggaagacagcttcttgcagcgatacagctcagaccccacaggcgccttgactgaggacagcatagacgacaccttcctcccagtgcctgaatacataaaccagtccgttcccaaaaggcccgctggctctgtgcagaatcctgtctatcacaatcagcctctgaaccccgcgcccagcagagacccacactaccaggacccccacagcactgcagtgggcaaccccgagtatctcaacactgtccagcccacctgtgtcaacagcacattcgacagccctgcccactgggcccagaaaggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccagcaggacttctttcccaaggaagccaagccaaatggcatctttaagggctccacagctgaaaatgcagaatacctaagggtcgcgccacaaagcagtgaatttattggagcatga
CD3-EGFR 融合蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO:4）
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
（2）重组质粒转化感受态细胞，挑取单克隆，通过酶切或测序方法进行鉴定。
（3）构建正确的质粒转化感受态，摇菌，提取质粒备用。
实施例2 pX+CD3-EGFR激活扩增DC细胞
（1）健康供者采集静脉血10 mL至肝素抗凝管内。
（2）将抗凝管内10 mL血液转移到装有15 mL离心管内，600g，10min。
（3）取上层血浆转移至新的15mL离心管内，冻存；下层血细胞用等体积生理盐水稀释混匀。
（4）15 mL Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)溶液加入到一支50 mL离心管内。
（5）将稀释后的血液沿离心管壁轻轻加到Ficoll液面上；室温条件下，800 g离心20 min。
（6）用移液管尽可能多地吸弃最上层血浆，外周血单个核细胞（Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）的细胞层位于稀释后的血浆/Ficoll交界面。
（7）小心收集白膜层，加入适量的PBS缓冲液保证总体积为40mL，600g常温离心10min。
（8）弃上清，用20 mL PBS重悬细胞，500 g常温离心10 min。
（9）弃上清，含10% FBS血清RPMI1640培养基重悬细胞，计数。
（10）转移2×106个新鲜的PBMCs细胞至6孔板的一个孔内，加入5 μg/mL PHA 刺激并培养细胞。
（11）经PHA处理约24小时之后，收集细胞，离心弃上清，用2mL RPMI1640培养基重悬洗涤细胞，离心。
（12）弃上清，加入2 mL含血清PRMI1640重悬细胞并转移至新的6孔板内，加入100单位/mL IL-2继续培养细胞3-4天。
（13）将细胞悬液转移至15 mL离心管内，1500 rpm离心5 min。
（14）弃上清，RPMI1640培养基重悬细胞，计数。
（15）接种2×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10的pX慢病毒液和10 µg/mL聚凝胺，共培养24小时。
（16）收集细胞，离心，弃上清。
（17）RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清；用含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入100单位/ mL IL2后继续培养细胞。
（18）培养2个星期后，按比例加入抗CD3的磁珠，分离得到CD3阴性的细胞群。
（19）该细胞在含血清RPMI1640及100μ/ mL IL2条件下继续培养约3个月，期间细胞生长缓慢，状态较差。
（20）按照MOI为10的量向细胞中加入CD3-EGFR病毒液，10μg/mL聚凝胺，培养24小时。
（21）收集细胞，离心，弃上清，加入含血清RPMI1640及100μ/mL IL2继续培养，约4周后得到可扩增、生长状态良好的DC细胞。
（22）取该群细胞进行流式分析，检测DC细胞相关的分子表型如CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达（图1A和图1B），证实获得了成熟的树突状细胞株，命名为DCX1-1细胞。
实施例3 DCX1-1诱导扩增抗原特异性CTL细胞及其活性检测
（1）取DCX1-1细胞和配体PBMC细胞（HLA-A2.1），计数。
（2）用含5%人血清的RPMI1640培养基，按照DC细胞：PBMC=1:100的量混合DC细胞和PBMC细胞，静置培养过夜。
（3）次日，向培养体系内加入200unit/mL的IL2，混合后培养。
（4）根据细胞生长状况，添加适量的培养基和IL2。
（5）第12-14天时，收集部分细胞进行流式分析。
（6）取1-5×105个细胞，2500rpm，离心5min。
（7）PBS洗涤2次，2500rpm，离心5min。
（8）向细胞内加入100μL 含BSA的封闭液，冰上封闭10-15min。
（9）将细胞分成两份，一份加入CD3+CD56抗体，另一份加入两个抗体的同型对照抗体，冰上孵育30min。
（10）PBS洗涤3次，2500rpm，5min。
（11）500μL PBS重悬细胞，过滤后上流式细胞仪检测。
（12）检测结果显示CD3-CD56-区域细胞少于3%时，收集1×107个细胞进行CD3磁珠分选，获得CD3+的T细胞。
（13）用含5%人血清的RPMI1640培养基重悬磁珠，加入200unit/mL IL2，置于6孔板内培养过夜。
（14）收集孔板内磁珠于离心管内，充分吹打磁珠，置于磁力加上以使T细胞和磁珠分离。
（15）收集并合并上清，1000rpm，5min。
（16）用含5% 人血清的RPMI1640培养基细胞继续培养，此细胞即为CTL细胞。
（17）每份CTL细胞取1×106个用于western blot分析，检测CTL细胞内颗粒酶和穿孔素的表达情况，结果见图2。
（18）取编号为1和2的两份CTL细胞，Trizol法提取总RNA。
（19）反转录获取CTL1和CTL2的cDNA，实时荧光定量PCR法检测细胞内各免疫因子的表达水平，结果见图3。
实施例4 DCX1-1诱导的CTL细胞对靶细胞的杀伤作用
1.1构建靶细胞
1.1.1 pX抗原、luciferase、HLA-A0201等分子慢病毒包装及浓缩
（1）复苏293细胞，培养传代。
（2）转染前一天胰酶消化，按照5×106个细胞/皿接种于10cm培养皿内，37℃，培养过夜。
（3）转染,慢病毒包装质粒与目的基因载体按照1:1质量比混合，加入转染试剂，质量比:质粒=3:1，室温放置30min。
（4）用RPMI1640培养基替换培养皿内的培养基，将转染混合液轻轻加入培养皿内，轻柔混匀。
（5）4小时后，弃转染上清，替换成含FBS的培养基继续培养细胞。
（6）分别于24小时，48小时和72小时收集病毒。
（7）加入病毒浓缩液，混匀后4℃冰箱静置过夜。
（8）3000rpm，4℃，1小时，弃上清，按照原体积1/10的量加入新鲜培养基重悬病毒，分装后储存于-80℃冰箱。
1.1.2 MT4靶细胞构建
MT4细胞（HLA-A2.1-）是一株HTLV-1病毒转化的细胞系，其持续表达pX基因编码的蛋白Tax。
（1）MT4细胞按照5×105个细胞接种于6孔板内，配制500μL浓缩后的luciferase病毒液+500μL完全培养基+1μL 10mg/mL polybrene混合液，加入到细胞内培养过夜。
（2）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用luciferase病毒混合液进行二次转染。
（3）由于MT4细胞是HLA-A2.1阴性的，因此，再用慢病毒方式将HLA-A2.1基因转入到该细胞内，并经流式检测合格备用（图4）。
1.1.3 NIH3T3靶细胞构建
（1）NIH3T3细胞按照5×105个细胞接种于6孔板内，贴壁3小时。配制500μL浓缩后的luciferase病毒液+500μL完全培养基+1μL 10mg/mL polybrene混合液，加入到细胞内培养过夜。
（2）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用luciferase病毒混合液进行二次转染。
（3）按照（1）和（2）的步骤再次转染β2M病毒，得到3T3L细胞。
（4）消化并按照5×105个细胞接种于6孔板内，转入HLA-A2.1慢病毒，后经流式检测HLA分子表达情况，得到3T3L-A2.1细胞（图5）。
（5）取5×106个3T3L-A2.1细胞，转入pX病毒或空载体，得到3T3L-A2.1/pX或3T3L-A2.1/vector细胞。
1.2 杀伤测试
1.2.1 Luciferase活性测试
（1）取靶细胞MT4，MT4-A2.1， 3T3L-A2.1/pX，3T3L-A2.1/vector计数，按照5×104个细胞/孔接种于24孔板内。3T3细胞需贴壁2-3小时后再与CTL进行共培养；MT4细胞可直接与CTL细胞进行共培养。
（2）CTL细胞计数，按照效应细胞：靶细胞分别为1.25:1，2.5:1，5:1和10:1的比例将效应细胞加入到靶细胞内，混合培养4小时。
（3）对于MT4细胞的杀伤，收集所有细胞至1.5mL EP管内，2500rpm，离心5min；1mLPBS重悬细胞，2500rpm，离心5min，弃上清，置于冰上；对于3T3细胞，吸弃悬浮的T细胞，PBS轻柔洗涤1次以去除漂浮的死亡靶细胞，吸干孔内液体。
（4）每管/孔加入100μL的细胞裂解液，冰上裂解，使细胞释放出luciferase蛋白。
（5）转移裂解液至1.5mL EP管内，3000rpm，离心3min。
（6）取luciferase报告基因底物100μL加至酶标板内，分别取裂解液上清20μL加入底物中。
（7）样品上机检测，根据荧光强度计算靶细胞杀伤效率（图6）。
1.2.2 细胞成像用于检测杀伤效果
（1）消化靶细胞 3T3L-A2.1/pX和3T3L-A2.1/vector计数，按照5×105个细胞/孔接种于6孔板内，培养过夜。
（2）次日，两种细胞各消化一孔，计数，用于确定加入效应细胞前的靶细胞数量。根据计算，按照效应细胞：靶细胞分别为1.25:1，2.5:1，5:1和10:1的比例将效应细胞加入到靶细胞内，混合培养4小时。
（3）轻轻晃动6孔板，使死亡细胞以及T细胞漂浮起来，吸弃悬浮的细胞，PBS轻柔洗涤2次以去除漂浮的细胞，2mL RPMI1640完全培养基加入孔内。
（4）上机拍照，数据处理（图7）。
实验结果：
1、经pX和CD3-EGFR基因转导和长时间培养，制备得到一株DC细胞。该DC细胞CD3-/CD16-/CD14-/CD19-/CD56-等显示阴性，排除其是T细胞、NK细胞、单核细胞、B细胞等。同时，该细胞表达DC细胞特异性标志物CD11c/CD123/CD205；树突状细胞成熟标志物CD83和树突状细胞活化标志物（CD40/CD80/CD86/CD70/HLA-DR）。趋化因子受体CCR7也高表达，表明这些细胞能够归巢到淋巴组织。HLA-ABC大量表达，提示这些细胞已准备好呈递抗原。总之，DCX1-1细胞的免疫表型表明这些细胞是成熟和活化的DC细胞。
2、DCX1-1与6个健康供者的PBMC进行共培养以获得CTL细胞，经western blot检测发现T细胞内高表达穿孔素和颗粒酶，提示DCX1-1诱导扩增的CTL具有很强的活性以及细胞毒性。
3、DCX1-1诱导的CTL细胞可产生包括IL1A、IL2、IL6、IL8、IL12、IL15、IFNγ以及TNFα等多种炎症因子，其中 IL12，IL15，IFNγ及TNFa 的表达量非常高。
4、MT4是一株由HTLV-1病毒转化的人T细胞白血病细胞株，其本身表达pX蛋白。根据文献报道，该细胞是HLA-A2.1阴性的。为验证HLA-A2.1限制性的杀伤，本研究经慢病毒转导方式将HLA-A2.1基因导入MT4细胞内，经流式检测，几乎100%的MT4细胞都表达HLA-A2.1。
5、细胞杀伤实验表明，DCX1-1诱导的CTL细胞对MT4/A2.1细胞的杀伤效果优于MT4细胞，说明这种靶细胞杀伤是HLA限制性的。结果还表明，在高E:T（效应靶比）条件下，这些CTL对MT4细胞也有一定的杀伤作用。这种杀伤可能是由其他可能匹配的HLA分子或CD3+/CD56+T细胞引起的，它们以非HLA限制的方式显示出相对广泛的抗癌活性。CTL分泌的IFNγ对白血病细胞也有非特异性的杀伤作用。
6、数据显示，DCX1-1诱导的CTLs能有效地杀伤表达pX蛋白的3T3L-A2.1/pX细胞。在高E:T比值下，DCX1-1诱导的CTL细胞可降低对照细胞的存活率。由于DCX1-1细胞和3T3细胞均表达TERT（端粒酶逆转录酶），TERT在小鼠和人之间具有高度同源性，因此这种相对较低的杀伤可能是由HLA-A2.1限制的TERT特异性CTL引起的。
DCX1.1诱导CTL细胞对特3T3靶细胞杀伤也通过影像学的方法进行了验证，如下所示。DCX1-1诱导的CTLs能有效杀伤3T3L-A2.1/pX细胞，验证了这些CTLs介导pX特异性、HLA-A2.1限制性靶细胞识别和杀伤的结论。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京翊博普惠生物科技发展有限公司
<120> 负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
<130> GAI21CN1214
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> I型人T细胞白血病病毒（HTLV-1）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1062)
<400> 1
atg gcc cat ttc cca ggg ttt gga cag agt ctt ctt ttc gga tac cca 48
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
gtc tac gtg ttt gga gac tgt gta caa ggc gac tgg tgc ccc atc tct 96
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
ggg gga cta tgt tcg gcc cgc cta cat cgt cac gcc cta ctg gcc acc 144
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
tgt cca gag cat cag atc acc tgg gac ccc atc gac gga cgc gtt atc 192
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
ggc tca gct cta cag ttc ctt atc cct cga ctc ccc tcc ttc ccc acc 240
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
cag aga acc tct aag acc ctc aag gtc ctt acc ccg cca atc act cat 288
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His
85 90 95
aca acc ccc aac att cca ccc tcc ttc ctc cag gcc atg cgc aaa tac 336
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tcc ccc ttc cga aat gga tac atg gaa ccc acc ctt ggg cag cac ctc 384
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu
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cca acc ctg tct ttt cca gac ccc gga ctc cgg ccc caa aac ctg tac 432
Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu Tyr
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acc ctc tgg gga ggc tcc gtt gtc tgc atg tac ctc tac cag ctt tcc 480
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
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ccc ccc atc acc tgg ccc ctc ctg ccc cac gtg att ttt tgc cac ccc 528
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
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ggc cag ctc ggg gcc ttc ctc acc aat gtt ccc tac aag cga ata gaa 576
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile Glu
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ctc acc act cca ggc ctt att tgg aca ttt acc gat ggc acg cct atg 768
Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
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att tcc ggg ccc tgc cct aaa gat ggc cag cca tct tta gta cta cag 816
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
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tcc tcc tcc ttt ata ttt cac aaa ttt caa acc aag gcc tac cac ccc 864
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
tca ttt cta ctc tca cac ggc ctc ata cag tac tct tcc ttt cat agt 912
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Ser
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Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Leu Leu
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Val
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<213> I型人T细胞白血病病毒（HTLV-1）
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Val
<210> 3
<211> 1836
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3-EGFR融合基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1836)
<400> 3
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Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp
195 200 205
aat att ggc tcc cag tac ctg ctc aac tgg tgt gtg cag atc gca aag 672
Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys
210 215 220
ggc atg aac tac ttg gag gac cgt cgc ttg gtg cac cgc gac ctg gca 720
Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala
225 230 235 240
gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca ccg cag cat gtc aag atc aca gat 768
Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp
245 250 255
ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt gcg gaa gag aaa gaa tac cat gca 816
Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala
260 265 270
gaa gga ggc aaa gtg cct atc aag tgg atg gca ttg gaa tca att tta 864
Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu
275 280 285
cac aga atc tat acc cac cag agt gat gtc tgg agc tac ggg gtg act 912
His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
290 295 300
gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga tcc aag cca tat gac gga atc cct 960
Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro
305 310 315 320
gcc agc gag atc tcc tcc atc ctg gag aaa gga gaa cgc ctc cct cag 1008
Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln
325 330 335
cca ccc ata tgt acc atc gat gtc tac atg atc atg gtc aag tgc tgg 1056
Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp
340 345 350
atg ata gac gca gat agt cgc cca aag ttc cgt gag ttg atc atc gaa 1104
Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu
355 360 365
ttc tcc aaa atg gcc cga gac ccc cag cgc tac ctt gtc att cag ggg 1152
Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly
370 375 380
gat gaa aga atg cat ttg cca agt cct aca gac tcc aac ttc tac cgt 1200
Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg
385 390 395 400
gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg gac gac gtg gtg gat gcc gac gag 1248
Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu
405 410 415
tac ctc atc cca cag cag ggc ttc ttc agc agc ccc tcc acg tca cgg 1296
Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg
420 425 430
act ccc ctc ctg agc tct ctg agt gca acc agc aac aat tcc acc gtg 1344
Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val
435 440 445
gct tgc att gat aga aat ggg ctg caa agc tgt ccc atc aag gaa gac 1392
Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp
450 455 460
agc ttc ttg cag cga tac agc tca gac ccc aca ggc gcc ttg act gag 1440
Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu
465 470 475 480
gac agc ata gac gac acc ttc ctc cca gtg cct gaa tac ata aac cag 1488
Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln
485 490 495
tcc gtt ccc aaa agg ccc gct ggc tct gtg cag aat cct gtc tat cac 1536
Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His
500 505 510
aat cag cct ctg aac ccc gcg ccc agc aga gac cca cac tac cag gac 1584
Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp
515 520 525
ccc cac agc act gca gtg ggc aac ccc gag tat ctc aac act gtc cag 1632
Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
530 535 540
ccc acc tgt gtc aac agc aca ttc gac agc cct gcc cac tgg gcc cag 1680
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln
545 550 555 560
aaa ggc agc cac caa att agc ctg gac aac cct gac tac cag cag gac 1728
Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp
565 570 575
ttc ttt ccc aag gaa gcc aag cca aat ggc atc ttt aag ggc tcc aca 1776
Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr
580 585 590
gct gaa aat gca gaa tac cta agg gtc gcg cca caa agc agt gaa ttt 1824
Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe
595 600 605
att gga gca tga 1836
Ile Gly Ala
610
<210> 4
<211> 611
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu
65 70 75 80
Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser
85 90 95
Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu
100 105 110
Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr
115 120 125
Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala
130 135 140
Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys
165 170 175
Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln
180 185 190
Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp
195 200 205
Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys
210 215 220
Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp
245 250 255
Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala
260 265 270
Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu
275 280 285
His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
290 295 300
Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro
305 310 315 320
Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln
325 330 335
Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp
340 345 350
Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu
355 360 365
Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly
370 375 380
Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu
405 410 415
Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg
420 425 430
Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val
435 440 445
Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp
450 455 460
Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu
465 470 475 480
Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln
485 490 495
Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His
500 505 510
Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp
515 520 525
Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
530 535 540
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln
545 550 555 560
Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp
565 570 575
Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr
580 585 590
Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe
595 600 605
Ile Gly Ala
610
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 5
gaggaattcg ccaccatgaa gtggaaggcg cttttcacc 39
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 6
ctggttctgg ccctgctggt acgc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
aggcgccaca tcgttcggaa gcgc 24
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 8
gagtctagat catgctccaa taaattcact gctttg 36

Claims (10)

1.一种负载Tax抗原的DC细胞，其特征在于，所述DC细胞是将CD3-EGFR融合基因和编码Tax抗原的pX基因分别克隆至慢病毒载体上转染DC细胞而得到的呈递Tax抗原的DC细胞。
2.根据权利要求1所述的DC细胞，其特征在于，所述Tax抗原包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的DC细胞，其特征在于，所述CD3-EGFR融合基因编码的蛋白包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项所述的DC细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括：
构建含有编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染DC细胞而得到呈递Tax抗原的DC细胞。
5.权利要求1-3中任一项所述的负载Tax抗原的DC细胞在制备Tax抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。
6.一种免疫细胞，其是由权利要求1-3中任一项所述的负载Tax抗原的DC细胞诱导产生的。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括CTL细胞。
8.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，该免疫细胞是由权利要求1-3中任一项所述的负载Tax抗原的DC细胞与PBMC细胞共培养获得的。
9.权利要求6-8中任一项所述的免疫细胞在制备具有杀灭携带Tax抗原的靶细胞的试剂中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，编码SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，含有编码SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体和/或权利要求1-3中任一项所述的负载Tax全抗原的DC细胞。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108289909A (zh) * 2015-10-19 2018-07-17 巴尔的摩马里兰大学 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
CN108546679A (zh) * 2018-04-23 2018-09-18 北京翊博普惠生物科技发展有限公司 在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用
CN109535231A (zh) * 2018-11-21 2019-03-29 温州医科大学附属第医院 人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用
US20190269728A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-05 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for delivery of cargo to cells
CN111479921A (zh) * 2017-09-18 2020-07-31 埃克苏马生物技术公司 用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108289909A (zh) * 2015-10-19 2018-07-17 巴尔的摩马里兰大学 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
CN111479921A (zh) * 2017-09-18 2020-07-31 埃克苏马生物技术公司 用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物
US20190269728A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-05 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for delivery of cargo to cells
CN108546679A (zh) * 2018-04-23 2018-09-18 北京翊博普惠生物科技发展有限公司 在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用
CN109535231A (zh) * 2018-11-21 2019-03-29 温州医科大学附属第医院 人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUA CHENG ET AL.: "Construction of a Novel Constitutively Active Chimeric EGFR to Identify New Targets for Therapy", 《NEOPLASIA》 *
POOJA JAIN ET AL.: "Modulation of dendritic cell maturation and function by the Tax protein of human T cell leukemia virus type 1", 《J LEUKOC BIOL》 *
贾锐等: "抗血管生成肿瘤疫苗研究进展", 《军事医学科学院院刊》 *

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