CN113249225A

CN113249225A - 桑黄优良菌株gzis01和gzis03及其选育方法

Info

Publication number: CN113249225A
Application number: CN202011197145.7A
Authority: CN
Inventors: 龚光禄; 胡腾文; 王沁; 杨通静
Original assignee: Guizhou Institute Of Crop Variety Resources Guizhou Institute Of Modern Chinese Medicine
Current assignee: Guizhou Institute Of Crop Variety Resources Guizhou Institute Of Modern Chinese Medicine
Priority date: 2020-10-31
Filing date: 2020-10-31
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2040-10-31
Also published as: CN113249225B

Abstract

本发明属于食药用菌种质资源领域，涉及桑黄优良菌株GZIS01和GZIS03及其选育方法。所述桑黄菌株是由贵州省农作物品种资源研究所从桑树上寄生的野生子实体中分离选育而获得，经鉴定命名为“桑黄GZIS01”和“桑黄GZIS03”，学名Inontus sanghuang，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为“CCTCCM 20191051”和“CCTCCM 20191052”，为桑黄的优良菌株材料。

Description

桑黄优良菌株GZIS01和GZIS03及其选育方法

技术领域

本发明属于食药用菌种质资源领域，尤其是桑黄优良菌株GZIS01和 GZIS03及其选育方法。

背景技术

桑黄，在我国中南地区通常生长于桑属(MorusL)植物上，且其子实体为黄褐色，故名桑黄。它是近几年开发的一种多年生的珍贵药用真菌，是我国最具有发展前景的药用真菌之一；是多孔菌科，木层孔菌属 (Phellinus)和桑黄属(Inontus)的真菌的统称。

桑黄子实体入药，味微苦，常用于治疗血淋、脱肛、泻血、带下、闭经、脾虚泄泻、症瘕积聚、癖饮等症状。近代研究表明桑黄的水提物对小白鼠S-180的抑制率为96.7％，艾氏腹水癌的抑制率为87％；而桑黄中的多糖是其抗癌作用的主要成分。由于桑黄具有显著的抗癌效果，目前对桑黄的研究已成为国际药用真菌领域的热点。

目前国内外对桑黄研究的主要品种有裂蹄针层孔菌[Phellinus linteus(Berk.et.Curt)Teng]、火木层孔菌[Phellinus igniarius(L.et.Fr)Quel]和鲍氏层孔菌(Phellinus baumiiPilat)。本发明专利菌株桑黄GZIS01、GZIS03，学名 Inonotussanghuang Sheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai，为我国台湾学者吴声华于2012年在国内发现并命名的新种，寄生于桑树上，其子实体菌盖多数叠生在一起，马蹄形或不规则形，幼时柠檬黄至金黄色，老时土黄色或黄棕色，是近年来桑黄研究的新星。2013年笔者在贵州桑蚕区的老桑树上采集到了类似的菌株，并进一步系统研究，良种筛选等，得到本发明专利菌株及筛选方法，为桑黄品种选育和审定奠定基础。

发明内容

为了摸清桑黄种质资源、筛选适合优良菌株，为桑黄的品种选育、品种审定奠定基础，助推桑黄产业的发展，本发明提供了桑黄优良菌株GZIS01 和GZIS03及其筛选方法，具体是通过以下技术方案实现的：

桑黄菌株GZIS01，是由贵州省农作物品种资源研究所从贵州省黄平县谷陇镇大寨村桑树上寄生的野生子实体中分离筛选而获得，命名为桑黄 GZIS01，学名Inontussanghuang，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏日期为2019年12 月16日，保藏编号CCTCCM 20191051，为桑黄的优良菌株材料。

桑黄菌株GZIS03，是由贵州省农作物品种资源研究所从贵州省施秉县杨柳塘镇板屯村桑树上寄生的野生子实体中分离筛选而获得，命名为桑黄 GZIS03，学名Inontussanghuang，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏日期为2019年12 月16日，保藏编号CCTCCM 20191052，为桑黄的优良菌株材料。

上述两种桑黄菌株的选育方法，具体包括以下步骤：

(1)包括构建资源库：收集野生资源、栽培资源，同时引进其桑黄资源；分离与提纯复壮获得菌株，并进行菌株ITS多样性分析，排除非桑黄类菌株，筛选桑黄类真实菌株构建桑黄菌株库；

(2)拮抗实验：将桑黄菌株库中的任意4个真实菌株配对组合，接种于PDA综合培养基平板上，置于25℃恒温箱中进行对峙避光培养，筛选出有拮抗反应的差异性菌株，合并没有拮抗现象的相同菌株；

(3)菌丝生长评价：将(2)筛选出的差异性菌株，分别在母种培养基中、液体培养基中、原种培养基中接种培养，观察菌丝形态特征、生长速度等，淘汰弱势菌株、保留优势菌株；具体过程为：

①母种培养特性分析：将有差异性的菌株在PDA培养基上活化；然后取活化的菌种块接种于PDA综合培养基平板中央，在25℃下恒温、避光培养，选出菌丝长势整齐、颜色纯、生长速度快、菌丝旺盛、活力强的优良菌株；

②液体培养特性分析：将有差异性的菌株在PDA液体培养基中，在25℃下恒温、避光培养，观察菌丝形态特征、生长速度等；

③原种培养特性分析：将母种培养筛选的优良菌株，转接到原种木屑培养基中，在25℃下恒温、避光培养，选出菌丝长势整齐、颜色纯、生长速度快、菌丝旺盛、活力强的优良菌株；

(4)出菇评价：将(3)筛选的优良菌株，接种到出菇培养料中，观察菌丝长势、出菇时间、产量等，筛选能出菇或出菇优的优良菌株；具体过程为：将菌丝生长特性分析筛选得到的优良菌株接种到桑树基料中进行出菇培养，观察菌丝萌发时间、吃满料时间、生长速度、整齐度、原基发生时间、出菇时间、出菇产量及品相等，筛选出能出菇或出菇优的优良菌株。

需要说明的是，所述PDA培养基配方为：葡萄糖15-25g、琼脂粉8-12g、水1000ml；pH自然。

需要说明的是，所述PDA综合培养基(母种培养基)配方为：马铃薯 180-220g、葡萄糖15-25g、磷酸二氢钾2-4g、硫酸镁1-2g、维生素B1 5-10mg、琼脂20-30g、水1000mL；pH自然。

需要说明的是，所述原种培养基配方为桑木屑35-40wt％、棉籽壳 35-45wt％、麦麸18-22wt％、石膏粉0.5-1wt％、白糖0.5-1wt％；含水率为 60-65％；pH自然。

需要说明的是，所述桑树基料配方为：桑木屑45-50wt％、棉籽壳 25-35wt％、麦麸18-22wt％、石膏粉0.5-1wt％、白糖0.5-1wt％；桑树基料的含水率为60-65％，pH自然。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对收集分离的野生桑黄菌株、栽培菌株和引进的桑黄菌株进行真实性鉴定(ITS多样性分析)，筛选桑黄类菌株构建资源库；开展不同菌株的拮抗实验，观察菌丝的拮抗和融合反应，合并相同菌株筛选具有差异性的菌株；开展菌丝生长特性分析，分别在母种、原种培养基中观察菌丝的涨势，淘汰弱势菌株，筛选优势菌株；开展出菇特性分析，淘汰不能出菇或出菇差的菌株，筛选能出菇的或出菇较好的优质高产菌株。筛选获得的最终优良菌株“桑黄GZIS01”和“桑黄GZIS03”，学名为Inontus sanghuang，菌丝较密、长势较强、生长速度快、活力旺盛，子实体形肉质金黄、成熟后基部木质化、褐化；桑黄菌株GZIS01的平均产量可达9.25g。

附图说明

图1为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)菌株与其他菌株的ITS-PCR扩增图谱。

图2为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)菌株在母种培养基中的菌丝特征。

图3为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)菌株在液体培养中的菌丝特征。

图4为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)菌株在木屑原种和栽培种培养基上的菌丝特征。

图5为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)菌株在桑树基料上的出菇特性。

图6为GZIS01(采集号PM001)和GZIS03(采集号PM003)寄生在桑树上的野生子实体。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

1、桑黄种质资源收集，真实性鉴定、淘汰非桑黄菌株，构建菌株库

(1)桑黄资源收集：

在贵州蚕桑主产区施秉、黄平、麻江等地，在桑树采集到野生子实体并分离成功7个菌株株，并收集引进了省外野生资源和主栽菌株8个，分别在韩国、日本进行规模化种植的菌株2株，共17个菌株；菌株信息如表1所示。

表1菌株收集信息表

(2)对收集引进的17个菌株进行了ITS多样性分析研究

1)实验准备

试剂和仪器：TS引物为ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATAGGC-3')通用引物。

菌丝的培养：将活化后的菌种接入直径为6cm的平皿中培养，待菌丝即将长满平板还未爬壁时，揭下玻璃纸，刮取菌丝备用。

DNA的提取和检测：子实体菌柄组织和菌丝体总DNA的提取，用白永宏等改进的CTAB法。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其DNA的质量和浓度。

PDA培养基配方：葡萄糖15-25g、琼脂粉8-12g和水800-1200ml；pH自然。

PDA综合培养基配方：马铃薯180-220g、葡萄糖15-25g、磷酸二氢钾 2-4g、硫酸镁1-2g、维生素B1 5-10mg、琼脂20-30g和水1000mL；pH自然。

原种培养基配方、栽培种木屑原培养基配方为：桑木屑35-40wt％、棉籽壳35-45wt％、麦麸18-22wt％、石膏粉0.5-1wt％、白糖0.5-1wt％，含水率为60-65％，pH自然。

桑树基料配方为：桑木屑45-50wt％、棉籽壳25-35wt％、麦麸18-22wt％、石膏粉0.5-1wt％、白糖0.5-1wt％；桑树基料的含水率为60-65％，pH自然。

2)ITS反应体系及序列测定

①ITS反应体系：

ITS-PCR扩增反应的总体积为25μL；其中，10×TaqPCR Buffer(with Mg²⁺)2.5μL，Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.3μL，dNTPs(10mmol/L) 1μL，10μmol/L ITS1/ITS4引物各1μL，模板DNA 1μL(浓度1～100ng/μL)， ddH₂O 18.2μL。

ITS-PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min， 72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸8min。

②ITS序列测定

采用TA克隆测序的方法，将PCR纯化产物与pMD19-T Vector(TaKaRa) 连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含X-Gal、IPTG、Amp的LB 平板上培养进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，进行菌落PCR检测，引物为M13R/F。扩增体系总体积为15μL，其中，10×TaqPCR Buffer(with Mg²⁺) 1.5μL，Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.15μL，dNTPs(10mmol/L)1.2μL， 10μmol/L M13R/F引物各0.3μL，菌液0.5μL，ddH₂O 11.05μL。ITS-PCR扩增条件：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。克隆成功后，样品委托上海生物工程技术服务有限公司进行双向测序。将各菌株测序所得的ITS序列通过DNASTAR.Lasergene.V7.1中的SeqMan拼接，反复校对、拼接组装后提交GenBank数据库。运用MegAlin和MEGA5.1 软件计算各个rDNA-ITS序列间的相似性及遗传距离。

17个菌株的ITS-PCR扩增图谱如附图1所示，由图1可知，17株桑黄菌株的基因组DNA经ITS-PCR扩增后均获得了单一目的条带，其序列片段长度为 600～750bp，PM008、PM011和PM014片段较小，其余各菌株间的条带大小略有差异，相似性和遗传距离如表2所示。

表2 17个菌株ITS序列的相似性和遗传距离

由表2可知，17株菌株ITS序列的相似性较低；遗传距离相差较大。说明，17株菌株的同源性较差，PM001和PM003同源性较高，PM005和PM010 同源性较高，PM008、PM013和PM015同源性较高，PM002、PM004和PM012 同源性较高，PM006、PM007和PM009同源性较高，其余菌株间同源性低。同源性高的菌株可能为同种菌株，同源性低的为不同种菌株。

③ISSR的聚类分析

对17个桑黄的ITS进行了聚类分析，可将17个桑黄菌株划分为8个类群。第1类群包含2个菌株，分别为PM001和PM003，为Inontus sanghuang；第2 类群包含2个菌株，分别为PM005和PM010，为Fuscoporia gilva；第3类群包含3个菌株，分别为PM008、PM013和PM015，为Phellinus baumii；第4类群包含4个菌株，分别为PM002、PM004、PM011和PM012，为Phellinus sp.；第5类群包含3个菌株，分别为PM006、PM007和PM009，为Phellinusigniarius；第6类群包含1个菌株，PM014，为Elaphocrdycepe sp.或 Chanunopycnis；第7类群包含1个菌株，PM016，为Gymnopilus；第8类群包含1个菌株，PM017，为Phellinus mori。

(3)桑黄菌株库的构建

通过对17个菌株进行了ITS多样性分析研究，排除PM005、PM010、 PM014、PM016、PM017这5个非桑黄菌株，获得12个桑黄菌株，构建了12 个菌株的库，具体信息如表3所示。

表3桑黄菌株库信息表

编号	采集编号	来源	地方名/中文名	拉丁名	菌株类型及寄主
						1	PM001	黄平县谷陇镇大寨村	桑黄菌	Inontussanghuang	野生型、老桑树干
2	PM002	黄平县苗陇乡克麻村	桑黄菌	Phellinussp.	野生型、老桑树桩
						3	PM003	施秉县杨柳塘镇板屯村	桑黄菌	Inontussanghuang	野生型、老桑树干
4	PM004	施秉县杨柳塘镇长田村	桑黄菌	Phellinussp.	野生型、老桑树桩
						5	PM006	杨柳塘镇	桑黄	Phellinus igniarius	栽培型
6	PM007	麻江	桑黄	Phellinus igniarius	栽培型
						7	PM008	谷陇	桑黄	Phellinus baumii	栽培型
8	PM009	日本	桑黄	Phellinus igniarius	栽培型
						9	PM011	吉林长白山	火针层孔菌	Phellinussp.	野生型、桦树
10	PM012	黑龙江伊春	桑黄	Phellinussp.	野生型、桑属植物
						11	PM013	北京延庆松山	鲍姆木层孔菌	Phellinus baumii	野生型、暴马丁香
12	PM015	吉林安图	火针层孔菌	Phellinus baumii	野生型、松树

2、开展拮抗实验、淘汰相同菌株，筛选具有差异性菌株

在无菌条件下，将12个桑黄菌株中的任意4个菌株配对组合，接种于 PDA综合培养基平板上，置于25℃恒温箱中进行对峙避光培养，观察有无拮抗反应，合并无拮抗反应的菌株。结果如表4所示。

表4 12个桑黄菌株间的拮抗情况

PM001

PM002

PM003

PM004

PM006

PM007

PM008

PM009

PM011

PM012

PM013

PM002

-

PM003

-

PM004

-

PM006

-

PM007

-

+

PM008

-

+

-

PM009

-

PM011

-

PM012

-

PM013

-

PM015

-

注：+融合；—拮抗

从表4可知，菌株PM006、PM007、PM008菌株间无拮抗反应，说明为统一菌株；合并后取任意菌株与其余9个菌株一起，获得10个具有差异性的桑黄菌株进行下一步试验。

3、菌丝生长特性分析，淘汰弱势菌株，筛选优势菌株

(1)母种培养特性初筛分析

将10个有拮抗反应的菌株在PDA培养基上活化，以保证试验中菌龄和接种量一致。取活化后0.5cm²的菌种块接种到PDA综合培养基平板中央，在 25℃恒温、避光培养。试验设3个重复，每天记录菌丝生长速度、长势、菌落边缘特征等。当生长速度最快的菌株即将长满平板时取出，测定菌落半径，并对菌丝生长速度进行差异显著性分析，初筛菌丝长势较好的菌株。结果如表5所示。

表5 10个桑黄菌株在母种培养基上生长情况

注：+菌丝稀疏、生长势较弱；++菌丝较密、生长势较强；+++菌丝浓密、生长旺盛，下同

(3)液体培养特性分析

将有差异性的菌株在PDA液体培养基中，在25℃下恒温、避光培养，观察菌丝形态特征、生长速度等。结果显示：桑黄菌株在液体培养基中生长较快，菌丝形态存在多样性，菌丝球也表现出独特的多样性特征，颜色差异显著、观察特征差异显著、菌丝球表面特征多元化。

(4)原种培养中生长特性复筛

将经过初筛后的10个桑黄菌株种到原种木屑培养基中培养，原种木屑培养基装入200mL的三角瓶，每瓶装150g，每个品种重复3次，其他方法同常规制种。接种后置于25℃恒温避光培养，待菌种定植后，观察菌丝长势、密度等，当生长速度最快的菌株即将长满三角瓶时取出，测定菌丝生长速度，并进行差异显著性分析，复筛出菌丝长势较好的菌株。结果如表6所示。

表6 10个桑黄菌株在原种培养基上生长情况

从表6可知：10个菌株间菌丝生长情况差异显著，其中PM002、PM004 菌丝为白色，生长速度显著优于其他菌株，与其他菌株差异显著。

4、出菇特性分析，淘汰不出菇或出菇差的菌株，筛选出菇优的菌株

(1)菌丝生长特性分析

复筛后的菌株接种到桑树基料中进行栽培品比试验。每种菌株栽培50 个菌棒，观察一次菌丝的长势，以及菌丝长满时间。记录吃料深度进行测量并计算出日平均生长速度。结果如表7所示。

表7桑黄菌株在基质料中菌丝生长特性

注：+菌丝白色、较密、长势较强，爬土能力弱、无菌丝束；++菌丝、白色、较密、生长势较强，爬土较强、菌丝束少；+++菌丝洁白、浓密、生长旺盛，爬土强、菌丝束较多

从表7中可知，在栽培料中不同菌株均没有发现有污染的情况，菌丝日平均生长速度差异显著，一般20天左右即可长满基质料，菌丝长势以菌株 PM002和PM004较好，表现菌丝洁白、稀疏、生长旺盛；桑黄菌株PM001、 PM003以及PM013长势较差，但菌丝浓密淡黄。

(2)出菇特性分析

将桑黄菌株于4月18日制包，播种后第二天即开始萌发并吃料，6月中旬大部分菌丝长满，开始进入出菇管理。桑黄菌株品比实验的农业性状表8 所示。

表8桑黄菌株品比实验的农业性状

从表8可知，PM001、PM003能正常出菇、切菌肉金黄色，可以进行品种选育及审定的优良菌株。

根据菌株的分子鉴定特征以及菌株在桑树基料的长势及子实体性状，选育出优质高产的菌株，PM001和PM003菌株，并将这两个菌株分别命名为“桑黄GZIS01”和“桑黄GZIS03”，学名为Inontus sanghuang。保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为“CCTCCM 20191051”和“CCTCCM 20191052”。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

Claims

1.一种桑黄菌株GZIS01，其特征在于，命名为桑黄GZIS01，学名Inontus sanghuang，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏日期为2019年12月16日，保藏编号CCTCCM 20191051，为桑黄的优良菌株材料。

2.一种桑黄菌株GZIS03，其特征在于，命名为桑黄GZIS03，学名Inontus sanghuang，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏日期为2019年12月16日，保藏编号CCTCCM 20191052，为桑黄的优良菌株材料。

3.权利要求1或2所述的桑黄菌株，其特征在于，所述桑黄菌株是从寄生在桑树上的野生子实体经过组织块分离筛选而获得。

4.如权利要求1或2所述的桑黄菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包括构建资源库：广泛收集桑黄资源，分离与提纯复壮获得菌株，并进行菌株ITS多样性分析，排除非桑黄类菌株，筛选桑黄类真实菌株构建桑黄菌株库；

(2)拮抗实验：将桑黄菌株库中的真实菌株在平板培养基上对峙培养，合并没有拮抗现象的相同菌株，选出有拮抗的差异性菌株；

(3)菌丝生长评价：将(2)筛选出的差异性菌株，分别在母种培养基中、液体培养基中、原种培养基中接种培养，观察菌丝形态特征、生长速度，淘汰弱势菌株、保留优势菌株；

(4)出菇评价：将(3)筛选的优势菌株，接种到出菇培养料中，观察菌丝长势、出菇时间、产量，筛选能出菇或出菇优的菌株。