CN113248625A

CN113248625A - 融合蛋白、编码融合蛋白的基因、重组载体及它们的应用

Info

Publication number: CN113248625A
Application number: CN202110391048.XA
Authority: CN
Inventors: 唐玲; 徐元宏; 王慧
Original assignee: First Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113248625B

Abstract

本发明涉及生物医学领域，公开了一种融合蛋白、编码融合蛋白的基因、重组载体及它们的应用。所述融合蛋白包括以下两个片段：(1)片段a：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；(2)片段b：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的融合蛋白能够精准高效杀灭多种不同种类的癌细胞，并且具有成本低、能够量化生产、使用时不受个体限制等优点，具有广阔的应用前景。

Description

融合蛋白、编码融合蛋白的基因、重组载体及它们的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种融合蛋白、编码融合蛋白的基因、重组载体及它们的应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病，针对其的治疗手段仍处于研究和探索阶段。近十多年以来，生物大分子药物包括单克隆抗体、双/多靶点抗体或蛋白等在肿瘤治疗领域取得了非常大的突破。

T淋巴细胞在机体对抗肿瘤中至关重要，但是肿瘤组织的高度免疫抑制微环境，导致肿瘤特异性T细胞难以形成，进而导致自身免疫系统无法有效控制肿瘤的发生发展。

为了突破抗原特异性T细胞难以形成的瓶颈，发挥自身T细胞的抗癌功能，目前有两种新兴的手段：利用基因工程方法为T细胞荷载靶向肿瘤的受体(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)和利用含有抗CD3抗体的双特异性蛋白引导T细胞靶向识别及杀伤肿瘤。

CAR-T方法通过基因工程技术将编码嵌合抗原受体的基因导入细胞中，在体外扩增后回输至病人体内，实现高效杀灭肿瘤细胞，精准治疗癌症的目的。

然而，CAR-T技术目前也面临很多瓶颈。例如，该技术是一种个体定制化治疗方法，必须采用患者自身的T细胞在体外荷载CAR分子和扩增，在体外培养一段时间，而后仅能回输给该患者使用，若用于其他患者则易发生移植物抗宿主反应(Graft Versus HostDisease，GVHD)，严重的甚至危及生命。这使得CAR-T的治疗方法由于其“定制性”的特点具有制备周期长、费用昂贵等缺陷。而且在临床试验中发现，在治疗过程中，当CAR-T细胞回输至患者体内后，通常会引起不良反应，而有些患者的反应程度很剧烈，需要辅助治疗帮助缓解，如果处理的不及时，还可能危及生命。这些不良反应主要包括细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrom，CRS)和神经毒性，以及过敏反应等。这些不良反应增加了患者的痛苦，而且还会带来额外的治疗费用，增加患者的治疗负担。另外，CAR-T细胞虽然输入体内后能够长期存活、分裂，但是无法精准调控其数量和功能，这也为CAR-T疗法带来不同程度的不便。

白介素13受体α2(IL13Rα2)在人神经胶质瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤组织细胞表面特异性高表达，这使得其成为一种潜在的肿瘤治疗靶点。IL13变体(E13Y)能够特异性结合IL13Rα2。2016年新英格兰医学杂志报道了一例利用荷载了IL-13变体(E13Y)的CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤患者后，肿瘤消退长达7个月的临床试验。但是该方法仍然不能避免CAR-T疗法本身带来的制备周期长、费用昂贵、存在剧烈不良反应风险等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中利用T细胞抗癌功能进行癌细胞靶向识别及杀灭的技术，例如CAR-T技术存在的制备周期长、费用昂贵且存在不良反应等问题，提供一种融合蛋白，该融合蛋白能够结合体内的T细胞，引导T细胞高效杀灭癌细胞(例如表达IL13Rα2的癌细胞)。而且该融合蛋白能够实现量化生产，使用时也不受个体限制，此外，该融合蛋白还可以通过改变用量来降低或者避免副作用。

为了发挥T细胞抗癌功能，同时避免CAR-T细胞上述不利因素，本发明的发明人经过研究发明了基于抗CD3抗体和IL-13变体(E13Y)的双特异蛋白。该双特异蛋白能够在GMP标准下大量生产、以合理的价格供患者使用，并且可以通过调节用量来降低或避免副作用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括以下两个片段：

(1)片段a：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)片段b：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第二方面提供编码表达如上所述融合蛋白的基因。

本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体中含有如上所述的基因。

本发明第四方面提供如上所述的融合蛋白、基因或重组载体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明第五方面提供一种治疗和/或预防肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中含有如前所述的融合蛋白、基因或重组载体；

或者，所述药物组合物中仅含有如前所述的融合蛋白、基因或重组载体作为活性组分。

通过上述技术方案，本发明提供的融合蛋白具有能够精准高效杀灭多种不同种类的癌细胞，对癌细胞的杀灭效果突出，并且治疗成本低等效果。

附图说明

图1是本发明提供的融合蛋白的结构模式图；

图2是实施例1中，本发明提供的融合蛋白与外周血T细胞结合实验结果；

图3是实施例2中，本发明提供的融合蛋白与CHO-IL13Rα2细胞结合实验的结果；

图4是实施例3中，本发明提供的融合蛋白与黑色素瘤A375细胞结合实验的结果；

图5是实施例4中，本发明提供的融合蛋白促进T细胞杀灭以黑色素瘤A375为例的癌细胞的效果；

图6是实施例4中，本发明提供的融合蛋白促进T细胞杀灭以胶质母细胞瘤U251为例的癌细胞的效果。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

研究表明，人正常组织细胞中不表达或低表达白细胞介素13(IL-13)受体IL13Rα2，然而，部分肿瘤细胞中则会高表达IL13Rα2，这使得IL13Rα2能够成为一个潜在的肿瘤治疗靶标受体。而人IL-13变体E13Y能够选择性地结合IL13Rα2，并且不结合IL13Rα1，这使得E13Y具有通过融合蛋白技术实现精准肿瘤治疗和/或预防的可能。分化簇3(CD3)通过盐桥与T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)相连，参与T细胞的信号转导。本发明的发明人通过将IL13变体(E13Y)与CD3抗体蛋白融合制成的异二聚体融合蛋白能够靶向定位高表达IL13Rα2的肿瘤细胞，从而实现促使T细胞靶向杀灭肿瘤细胞的目的。

本发明一方面提供一种融合蛋白(其模式图如图1所示)，所述融合蛋白包括以下两个片段：

(1)片段a：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)片段b：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的融合蛋白中，片段a和片段b之间可以通过融合蛋白技术中现有的任意方式进行连接。出于便于生产的目的，根据本发明的优选实施方式，其中，所述片段a和片段b之间通过人IgG1的Fc区段(IgG1-Fc)铰链区的二硫键共价连接，即C129(片段a)-C264(片段b)、C132(片段a)-C267(片段b)之间形成的二硫键。

为了实现片段a和片段b形成异二聚体，而不是片段a或片段b的同二聚体，本发明利用了Knob-into-hole(KIH)技术，通过突变人IgG1-Fc CH3结构域中氨基酸(a链中为T366S、L368A、Y407V突变，即“hole”；b链中为T366W突变，即“knob”)实现。具体到本发明的序列中，具体的突变位点为片段a(SEQ ID NO:1)中的S269、A271、V310和片段b(SEQ ID NO:2)中W404。

本发明第二方面提供编码表达如上所述融合蛋白的基因。

任意能够编码表达如上所述融合蛋白的基因均属本发明的内容，本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，当表达片段a和片段b的基因为核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的基因时，在表达量和表达产物活性方面均优于其他序列的基因。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述基因包括：

(A)编码片段a的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示；

(B)编码片段b的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4所示。

本领域技术人员应当知晓，表达本发明提供的融合蛋白的基因中，除以上(A)和(B)两个片段外，还可以包括如启动子、增强子、非编码区等核苷酸序列，以实现提高所述基因的表达量、表达效率、产物活性等方面性能的目的。另外，所述基因中还可以包括方便检测产物表达情况等效果的标签的核苷酸序列，例如表达谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列等。

本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体中含有如前所述的基因。

本发明提供的重组载体可以为本领域现有技术中任意现有载体连接如前所述的基因后制得的重组载体。根据本发明的优选实施方式，其中，所述载体可以选自质粒(例如商购获得的质粒pSeTag2、PEE14、pMH3等，或者根据现有技术自行制备的可用于制备重组载体的质粒)、原核表达载体(例如大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、奇异变形菌等)、真核表达载体(例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞等)和噬菌体中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，为了提高本发明提供的融合蛋白的表达量，所述重组载体中除含有如前所述的基因外，还可以含有启动子和编码分泌信号肽的基因序列。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述重组载体中还可以含有用于筛选的标签基因，例如谷氨酰胺合成酶。

本发明第四方面提供如前所述的融合蛋白、基因或重组载体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明提供的上述融合蛋白、基因或重组载体可用于制备治疗和/或预防任意能够被所述融合蛋白靶向识别的肿瘤的药物。由于本发明提供的融合蛋白中含有能够高效靶向识别白介素13受体α2(IL13Rα2)的IL13(E13Y)片段(即片段a)，因此根据本发明的优选实施方式，其中，所述肿瘤选自表达IL13Rα2的肿瘤。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述肿瘤选自恶性神经胶质瘤、黑色素瘤、肾上腺皮质癌、胰腺癌、鳞状头颈细胞癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述药物中还含有药学上可接受的载体。所述载体是指制备药物过程中对所述融合蛋白的活性没有影响或者影响很小的辅料，用于使所述药物形成指定的剂型。

根据本发明的优选实施方式，所述药物组合物还可以与其他药物组合给药，以提高所述药物组合物的治疗效果。例如，所述其他药物可以选自调节IL13Rα2的药物等。

本发明提供的所述药物组合物可以为任意本领域现有用于治疗和/或预防肿瘤的药物剂型。在不破坏所述药物组合物的治疗效果的情况下，本领域技术人员可以根据实际需要对所述药物组合物的剂型进行选择。

本发明提供的所述药物组合物可以通过任意本领域现有的给药方式进行给药。出于方便给药的目的，根据本发明的优选实施方式，其中，所述药物组合物的给药方式可以选自口服给药、经鼻给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药、静脉给药、腹腔内给药中的至少一种。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

以下实施例中，a链和b链编码基因(分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)委托苏州金唯智公司合成。

制备例1

本制备例用于说明本发明提供的融合蛋白的制备。

试验方法：利用ExpiCHO Expression Medium培养基(购自Thermo Fisher)培养ExpiCHO细胞(购自Thermo Fisher)，调整细胞浓度为6×10⁶/ml，获得ExpiCHO细胞溶液。将含有a链和b链编码基因(分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)的pTT5载体(购自苏州金唯智公司)加入2ml OptiSFM培养基(Thermo Fisher)中，获得溶液A。将160μlExpiFectamineCHO转染试剂(Thermo Fisher)加入2ml OptiSFM培养基中，获得溶液B。然后将溶液A和溶液B混合，获得转染混合物，并在5分钟内将转染混合物全部加入50ml ExpiCHO细胞溶液中。在37℃、8％CO₂条件下培养1天后，加入8ml Feed、300μl Enhancer(ThermoFisher)，并转入32℃、5％CO₂条件下培养9天后收获培养上清，其中第5天添加8ml Feed。利用Protein A纯化柱(购自GE)从培养上清中亲和纯化融合蛋白，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别示出了该融合蛋白中的片段a和片段b的氨基酸序列。其中，C129(片段a)-C264(片段b)、C132(片段a)-C267(片段b)之间形成的二硫键，使得片段a和片段b形成异二聚体(结构示意图如图1所示)。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的融合蛋白靶向识别并结合人外周血CD₄+T细胞的结果。本实施例中采用的人外周血自安徽医科大学第一附属医院获得，已获得相关人员知情同意。

试验方法：利用Ficoll梯度密度离心的方法获得人外周血单个核细胞(PBMC)，用完全RPMI-1640培养基将其稀释为1×10⁷/ml，加入100U/mL IL-2培养24小时。

用1×PBS将PBMC稀释为5×10⁶/ml，取90μL加入1.5mL的EP管中，同时向其中加入10μL小鼠血清，4℃静置封闭30min。将融合蛋白按照不同浓度梯度加入EP管中，4℃静置孵育30min。

孵育结束后，用PBS清洗PBMC两次，具体操作为：向EP管中加入1ml 1×PBS，4℃250g离心5min，弃上清。清洗结束后，每个EP管中加入100μL 1×PBS重悬细胞，而后加入1μLAPC标记的小鼠抗人IgG-Fc抗体(购自BioLegend)及0.5μL FITC标记的小鼠抗人CD4抗体(购自BD公司)，4℃静置避光孵育30min。孵育结束后，用PBS清洗PBMC两次。清洗结束后，每个EP管中加入200μL 1×PBS重悬细胞，用流式细胞仪(BD公司FACS Cantosys型号)对不同浓度的融合蛋白与抗体的结合比例进行检测。结果详见图2。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的融合蛋白靶向识别并结合CHO-IL13Rα2细胞的结果。

具体试验方法与实施例1中相同，不同之处在于将其中的CD₄+T细胞替换为CHO-IL13Rα2细胞(具有嘌呤霉素抗性)。结果详见图3。

本实施例中采用的CHO-IL13 Rα2细胞为本实验室构建获得。构建方法如下：将含有IL13 Rα2编码序列(苏州金唯智合成)的pLVX-EF1a-IRES-puro载体与包装质粒pMD2G、psPAX2(上述载体和包装质粒均购自优宝生物)共同转染293T细胞(购自ATCC)。48h后收获含有满病毒的培养上清，利用该上清感染CHO-K1细胞(购自ATCC)，获得CHO-IL13Rα2细胞。然后利用嘌呤霉素(购自Invivogen)筛选获得具有嘌呤霉素抗性的CHO-IL13Rα2细胞。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的融合蛋白靶向识别并结合A375细胞的结果。

具体试验方法与实施例1中相同，不同之处在于将其中的CD₄+T细胞替换为A375细胞。结果详见图4。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的融合蛋白对T细胞抗癌活性的影响。本实施例中采用的人外周血自安徽医科大学第一附属医院获得，已获得相关人员知情同意。

(1)肿瘤细胞(分别采用A375和U251，均购自中科院上海细胞库)用完全RPMI-1640培养基清洗2次，清洗方法同实施例1。而后加入实时无标记动态细胞分析(RTCA)芯片(购自XCELLIGENCE)中，每孔10000个细胞，置于RTCA仪器(购自XCELLIGENCE公司，型号为RTCATP)上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。

(2)PBMC用完全RPMI-1640培养基重悬，加入RTCA芯片中，每孔100000个细胞。

(3)用完全RPMI-1640培养基将融合蛋白按照浓度梯度进行稀释，加入芯片中。

(4)将芯片置于RTCA仪器上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。

(5)收集数据，分析并计算第48小时不同浓度的融合蛋白介导的特异性杀伤比例。计算公式为：特异性杀伤比例＝(融合蛋白组杀伤比例-无融合蛋白组杀伤比例)/(100％-无融合蛋白组杀伤比例)

结果如图5(A375)及图6(U251)所示。

通过上述实施例的结果可以看出，本发明提供的融合蛋白能够靶向识别结合多种不同的肿瘤细胞，且均表现出较高的结合效率。而且该融合蛋白还能够促进T细胞杀灭以A375、U251为例的表达IL13Rα2的肿瘤细胞，说明本发明提供的融合蛋白具有用于制备广谱高效抗癌药物的潜质。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO：1

SPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：2

EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：3

TCACCAGGACCAGTTCCTCCTTCTACCGCACTTAGATACTTGATTGAAGAGCTGGTCAATATCACACAGAACCAGAAGGCTCCCCTGTGCAACGGTAGTATGGTGTGGTCTATCAACTTGACAGCAGGAATGTATTGTGCCGCCCTGGAGTCCCTGATCAATGTCTCCGGCTGTTCCGCTATTGAGAAGACCCAGCGGATGCTGTCCGGGTTTTGTCCCCATAAAGTGAGTGCTGGGCAGTTCTCTAGTCTCCATGTCAGGGATACCAAGATCGAGGTGGCACAGTTTGTCAAGGACCTGCTGCTGCATCTGAAGAAGCTGTTTCGGGAAGGACGTTTCAACGGAGGAGGTGGCAGCCCTAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGTCCACCTTGCCCTGCTCCTGAACTGCTCGGTGGACCTAGTGTTTTCTTGTTTCCTCCAAAGCCCAAAGATACTCTCATGATTTCCAGAACACCTGAAGTGACTTGTGTTGTCGTGGCAGTGTCTCACGAGGATCCCGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGTCGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAACCCCGAGAAGAGCAGTATGCATCTACCTACAGAGTCGTGAGTGTGCTCACTGTGTTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAATGTAAGGTGTCAAACAAAGCCTTGCCCGCACCAATCGAAAAGACTATCTCCAAGGCAAAGGGACAACCTAGAGAACCCCAGGTATACACACTGCCTCCCTCTCGGGAAGAAATGACTAAGAACCAGGTGTCCTTGTCATGCGCTGTAAAGGGCTTTTACCCTAGTGACATTGCTGTCGAATGGGAGTCAAATGGTCAGCCAGAGAACAATTATAAGACTACCCCACCAGTCCTCGACTCCGATGGCAGCTTTTTTCTGGTGTCCAAGCTCACCGTAGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAATGTATTTAGTTGTAGCGTTATGCACGAGGCTCTGCATAACCACTATACTCAGAAGAGCCTCAGTCTCTCTCCTGGCAAA

SEQ ID NO：4

GAAGTACAACTCTTGGAGTCTGGCGGTGGACTTGTACAACCTGGCGGATCACTGAAACTGTCCTGTGCCGCCTCTGGCTTTACTTTTAACACTTACGCTATGAACTGGGTGAGACAAGCCCCAGGGAAAGGGCTGGAATGGGTGGCTCGCATCCGCTCTAAGTATAACAATTATGCAACCTACTACGCAGACAGCGTGAAGGATCGGTTTACTATCTCTCGTGATGATAGCAAGAATACCGCTTATCTGCAGATGAATAATCTGAAGACAGAGGACACTGCAGTATATTACTGTGTGCGACACGGGAATTTTGGCAATTCATACGTGAGCTGGTTCGCTTACTGGGGGCAGGGCACTTTGGTGACAGTATCTAGCGGTGGTGGTGGTTCAGGAGGTGGAGGTTCAGGAGGGGGAGGTAGCGAGCTTGTGGTTACCCAGGAGCCTAGCCTTACCGTGTCCCCTGGAGGTACCGTCACACTCACATGCAGATCCTCTACCGGCGCAGTTACAACTAGCAACTACGCAAACTGGGTGCAACAGAAGCCAGGACAGGCACCCAGAGGACTGATCGGCGGAACTAACAAACGGGCCCCAGGAACCCCCGCTAGATTCTCTGGTAGCCTGCTTGGCGGAAAGGCTGCCTTGACTCTTTCTGGGGTGCAACCCGAAGATGAAGCCGAGTATTATTGCGCCCTGTGGTATAGCAATCTGTGGGTTTTCGGAGGCGGAACCAAATTGACTGTATTGGGGGGCGGCGGCTCCCCAAAGAGTTGTGATAAGACACATACCTGCCCTCCATGTCCAGCACCTGAACTGCTGGGCGGCCCATCTGTCTTCCTGTTCCCACCTAAACCTAAAGATACACTCATGATTAGCCGAACCCCCGAGGTGACTTGCGTTGTGGTTGCCGTGTCCCATGAGGATCCAGAAGTCAAATTTAATTGGTATGTAGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCAAAGACAAAGCCCAGGGAGGAACAGTACGCCTCCACATACCGAGTTGTGTCTGTCTTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAAGCCTTGCCCGCCCCAATCGAGAAGACTATAAGCAAGGCCAAAGGTCAGCCCCGTGAGCCCCAGGTTTATACTCTCCCCCCTAGTCGAGAAGAGATGACCAAAAACCAGGTGTCATTGTGGTGCCTGGTTAAAGGATTCTACCCCTCCGACATAGCAGTCGAGTGGGAGTCCAACGGTCAGCCCGAGAACAACTATAAGACCACCCCACCTGTCCTTGACTCCGATGGCTCTTTTTTTCTGTATTCAAAGTTGACTGTAGACAAGAGTCGTTGGCAACAGGGAAATGTCTTCTCCTGCAGCGTCATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTACACTCAGAAAAGTCTGAGCCTCTCCCCCGGTAAG

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽医科大学第一附属医院

<120> 融合蛋白、编码融合蛋白的基因、重组载体及它们的应用

<130> I66256AYFY

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu

1 5 10 15

Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly

20 25 30

Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala

35 40 45

Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr

50 55 60

Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln

65 70 75 80

Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe

85 90 95

Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg

100 105 110

Phe Asn Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

165 170 175

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys

245 250 255

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

260 265 270

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

275 280 285

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val

290 295 300

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

305 310 315 320

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser

325 330 335

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

340 345 350

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

355 360 365

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

370 375 380

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

385 390 395 400

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

405 410 415

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

420 425 430

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

435 440 445

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

450 455 460

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

465 470 475 480

Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 3

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaccaggac cagttcctcc ttctaccgca cttagatact tgattgaaga gctggtcaat 60

atcacacaga accagaaggc tcccctgtgc aacggtagta tggtgtggtc tatcaacttg 120

acagcaggaa tgtattgtgc cgccctggag tccctgatca atgtctccgg ctgttccgct 180

attgagaaga cccagcggat gctgtccggg ttttgtcccc ataaagtgag tgctgggcag 240

ttctctagtc tccatgtcag ggataccaag atcgaggtgg cacagtttgt caaggacctg 300

ctgctgcatc tgaagaagct gtttcgggaa ggacgtttca acggaggagg tggcagccct 360

aagtcctgtg acaagaccca cacatgtcca ccttgccctg ctcctgaact gctcggtgga 420

cctagtgttt tcttgtttcc tccaaagccc aaagatactc tcatgatttc cagaacacct 480

gaagtgactt gtgttgtcgt ggcagtgtct cacgaggatc ccgaggtcaa gtttaattgg 540

tacgtcgacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaaac cccgagaaga gcagtatgca 600

tctacctaca gagtcgtgag tgtgctcact gtgttgcacc aggattggct gaacggcaag 660

gagtacaaat gtaaggtgtc aaacaaagcc ttgcccgcac caatcgaaaa gactatctcc 720

aaggcaaagg gacaacctag agaaccccag gtatacacac tgcctccctc tcgggaagaa 780

atgactaaga accaggtgtc cttgtcatgc gctgtaaagg gcttttaccc tagtgacatt 840

gctgtcgaat gggagtcaaa tggtcagcca gagaacaatt ataagactac cccaccagtc 900

ctcgactccg atggcagctt ttttctggtg tccaagctca ccgtagacaa gagccggtgg 960

cagcagggca atgtatttag ttgtagcgtt atgcacgagg ctctgcataa ccactatact 1020

cagaagagcc tcagtctctc tcctggcaaa 1050

<210> 4

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaagtacaac tcttggagtc tggcggtgga cttgtacaac ctggcggatc actgaaactg 60

tcctgtgccg cctctggctt tacttttaac acttacgcta tgaactgggt gagacaagcc 120

ccagggaaag ggctggaatg ggtggctcgc atccgctcta agtataacaa ttatgcaacc 180

tactacgcag acagcgtgaa ggatcggttt actatctctc gtgatgatag caagaatacc 240

gcttatctgc agatgaataa tctgaagaca gaggacactg cagtatatta ctgtgtgcga 300

cacgggaatt ttggcaattc atacgtgagc tggttcgctt actgggggca gggcactttg 360

gtgacagtat ctagcggtgg tggtggttca ggaggtggag gttcaggagg gggaggtagc 420

gagcttgtgg ttacccagga gcctagcctt accgtgtccc ctggaggtac cgtcacactc 480

acatgcagat cctctaccgg cgcagttaca actagcaact acgcaaactg ggtgcaacag 540

aagccaggac aggcacccag aggactgatc ggcggaacta acaaacgggc cccaggaacc 600

cccgctagat tctctggtag cctgcttggc ggaaaggctg ccttgactct ttctggggtg 660

caacccgaag atgaagccga gtattattgc gccctgtggt atagcaatct gtgggttttc 720

ggaggcggaa ccaaattgac tgtattgggg ggcggcggct ccccaaagag ttgtgataag 780

acacatacct gccctccatg tccagcacct gaactgctgg gcggcccatc tgtcttcctg 840

ttcccaccta aacctaaaga tacactcatg attagccgaa cccccgaggt gacttgcgtt 900

gtggttgccg tgtcccatga ggatccagaa gtcaaattta attggtatgt agatggcgtg 960

gaggtgcata atgcaaagac aaagcccagg gaggaacagt acgcctccac ataccgagtt 1020

gtgtctgtct tgaccgtgct gcaccaagat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 1080

gtgtccaata aagccttgcc cgccccaatc gagaagacta taagcaaggc caaaggtcag 1140

ccccgtgagc cccaggttta tactctcccc cctagtcgag aagagatgac caaaaaccag 1200

gtgtcattgt ggtgcctggt taaaggattc tacccctccg acatagcagt cgagtgggag 1260

tccaacggtc agcccgagaa caactataag accaccccac ctgtccttga ctccgatggc 1320

tctttttttc tgtattcaaa gttgactgta gacaagagtc gttggcaaca gggaaatgtc 1380

ttctcctgca gcgtcatgca cgaagctctg cataatcact acactcagaa aagtctgagc 1440

ctctcccccg gtaag 1455

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括以下两个片段：

(1)片段a：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)片段b：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述片段a和片段b之间通过人IgG的Fc区段铰链区的二硫键共价连接。

3.编码表达权利要求1或2中所述融合蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其中，所述基因包括：

(A)编码片段a的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示；

(B)编码片段b的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4所示。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求3或4中所述的基因。

6.权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的重组载体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述肿瘤选自表达白介素13受体α2的肿瘤。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其中，所述肿瘤选自恶性神经胶质瘤、黑色素瘤、肾上腺皮质癌、胰腺癌、鳞状头颈细胞癌、肾细胞癌和胰腺导管腺癌中的至少一种。

9.根据权利要求6所述的应用，其中，所述药物中还含有药学上可接受的载体。

10.一种治疗和/或预防肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的重组载体；

或者，所述药物组合物中仅含有权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的重组载体作为活性组分。