CN113248493A - 一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂与方法 - Google Patents

一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂与方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂与方法。所述荧光剂为吡啶并吡嗪酮离子型化合物，结构式如式(I)所示。所述荧光剂结合乙酰胆碱酯酶可以快速可视化检测氨基甲酸酯类农残。通过记录溶液荧光光谱、荧光强度可以求出配制样品中氨基甲酸酯类农药的浓度梯度曲线，最低检出限为0.064bpm；通过荧光颜色可以判断农药浓度是否超过一定阈值，可视化最低检出限为8.0bpm。
Figure DDA0002986477510000011

Description

一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂与方法
技术领域
发明属于分析检测领域，具体涉及一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂与方法。
背景技术
氨基甲酸酯类农药是继高毒的有机氯、有机磷类农药之后发展起来的合成农药，该类农药具有选择性强，高效，广谱，对人畜低毒，且易分解和残留少的特点，因此，在农业上得到了广泛的应用。虽然其毒性较有机氯、有机磷类农药低，但研究表明氨基甲酸酯类农药具有致突变、致畸和致癌作用，短时间内密切接触并误服氨基甲酸酯类农药会造成急性中毒，体内胆碱酯酶活性下降而引起的毒黄碱样，烟碱样和以中枢神经系统症状为主的全身性疾病。
氨基甲酸酯类农残的检测方法主要使用大型仪器如高效液相色谱，液相色谱-质谱联用等。但是仪器价格昂贵，操作繁琐，不能满足日常食品安全高通量检测的需求，也无法满足偏远地区特别是农村的检测需求。酶抑制法如(GB/T 5009.199-2003)虽然得到了有效应有，但是这种方法存在易受色素影响，且需要分光光度计的辅助等缺点，后续有用荧光显色剂代替常规显色剂虽然能减少色素的影响，但是其方法只涉及荧光的强弱变化，需要荧光光谱仪的辅助才能判断氨基甲酸酯类农残的含量。
因此需要开发一种简单、快捷、灵敏、价格低廉、不受色素影响的可视化快速检测氨基甲酸酯农残的技术。
发明内容
本发明公开了一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂(式I所示化合物)与方法。该方法不需要借助昂贵精密仪器检测，实验操作过程简单、快速，极大地降低了氨基甲酸酯类农残的检测成本。本发明发展的检测方法是一种具有运行成本低、试剂安全、检测快速、简便、选择性好、受色素影响小、检测限低、可视化等优点。
Figure BDA0002986477490000021
本发明目的通过以下技术方案实现：
提供一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂，其为吡啶并吡嗪酮离子型化合物，化学结构式如下：
Figure BDA0002986477490000022
式(I)中的阴离子X可以是I、Br、Cl。
所述吡啶并吡嗪酮离子型化合物的制备方法：如下式所示，由化合物1与化合物2，在氯化镍的催化下，140℃下搅拌反应12～48小时得到化合物I，即所述吡啶并吡嗪酮离子型化合物。
Figure BDA0002986477490000023
上述荧光剂(吡啶并吡嗪酮离子型化合物)结合乙酰胆碱酯酶(AchE)作为氨基甲酸酯类农药的检测试剂。
提供一种氨基甲酸酯类农药的检测方法，具体为：
氨基甲酸酯类农药检测的标准浓度曲线的构建，找出体系荧光变色时氨基甲酸酯类农药水溶液浓度，对待测样品的检测：
步骤1、将0.2mL不同浓度氨基甲酸酯类农药溶液分别与0.1mL乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，分别得到0.97mL不同浓度氨基甲酸酯类农药的混合溶液A，水浴15min；显色剂是指式(I)所示的吡啶并吡嗪酮离子型化合物；
步骤2、在每份不同浓度氨基甲酸酯类农药的混合溶液A中分别加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到含有不同浓度氨基甲酸酯类农药、一定浓度乙酰胆碱酯酶(AchE)、显色剂与碘化硫代乙酰胆碱的样品B，水浴反应5min；
步骤3、在430nm激发波长下测定每份样品B荧光光谱，将最大发射波长、最大发射光强分别与其对应氨基甲酸酯类农药的浓度进行线性拟合，可构建氨基甲酸酯类农药检测的标准浓度曲线；
步骤4、通过365nm紫外波长照射观察每份样品B荧光颜色变化，判断体系荧光变色时氨基甲酸酯类农药水溶液浓度，记作荧光突变阈值；
步骤5、对过滤后待测样品取样0.2mL与0.1mL乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，得到0.97mL混合溶液C，水浴15min；
步骤6、混合溶液C加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到样品D，水浴反应5min；
步骤7、用荧光光谱仪在430nm激发波长下测定每份样品D荧光光谱，对照步骤3中氨基甲酸酯类农药检测的标准浓度曲线可得出农残浓度。在365nm紫外灯下观察样品D荧光，若样品荧光为绿色，则可判断溶液D中氨基甲酸酯类农药浓度超过阈值；若样品荧光为蓝色，则可判断溶液D中氨基甲酸酯类农药浓度低于阈值。
本发明技术方案中：所述的氨基甲酸酯类农药为甲萘威、抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威、仲丁威、克百威、西维因、甜菜安、甜菜宁、丁硫克百威或丙硫克百威中的一种或二种以上。
本发明技术方案中：步骤1中所述的氨基甲酸酯类农药保存于去离子水中浓度为25ppm。
本发明技术方案中：步骤1中所述的显色剂溶液保存于一定浓度pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液中，显色剂溶液浓度为1μM～10mM。
本发明技术方案中：步骤1中所述的乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液保存于一定浓度pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液中，乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液浓度为0.05U/mL～20U/mL。
本发明技术方案中：pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液浓度为0.1mM～1M。
本发明技术方案中：样品B为不同浓度的氨基甲酸酯类农药，浓度分别为0bpm、0.0128bpm、0.064bpm、0.32bpm、1.6bpm、8bpm、40bpm、200bpm、1ppm、5ppm。
本发明技术方案中：步骤2中所述的碘化硫代乙酰胆碱溶液存储于去离子水中，浓度为300μM～300mM。
本发明技术方案中：步骤5所述待测样品为河水、湖水、自来水、或井水等水体样品。
本发明技术方案中：步骤5中所述的乙酰胆碱酯酶(AchE)浓度为0.05U/mL～2U/mL。
本发明技术方案中：步骤5中所述显色剂浓度为1μM～10mM。
本发明技术方案中：步骤6中所述的碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)溶液存储于去离子水中，浓度为300μM～300mM。
本发明技术方案中：所检测的农药浓度为配制好样品D中农药浓度，样品D是由待测溶液配制的，样品D的农药浓度为待测溶液取样农药浓度的五分之一。当待测溶液的农药浓度在0.32bpm～1ppm(即样品D农药浓度为0.064bpm～0.2ppm)时可以经过荧光光谱仪测出吸光度对比拟合曲线求出浓度；而用365nm紫外灯时可以由荧光颜色判断是否超过一定阈值，达到现场判断农药是否超标的目的。
本发明技术方案中：显色剂的荧光受溶液pH变化而变化，当pH变小时显色剂在溶液中的最大激发波长会发生转变。
本发明技术方案中：在乙酰胆碱酯酶的存在下，碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)可以水解产生乙酸，改变溶液的pH值，使溶液pH变小，荧光显色剂(式I所示的吡啶并吡嗪酮离子型化合物)在溶液中的最大激发波长会发生转变，从而影响荧光显色剂在365nm紫外灯照射下的荧光颜色。当氨基甲酸酯类农药存在时，氨基甲酸酯类农药会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致乙酸产量降低或者不能生成，溶液的pH值变化不明显，荧光显色剂在365nm紫外灯照射下的荧光颜色无变化，从而实现氨基甲酸酯类农药的可视化荧光检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
该方法不需要借助昂贵精密仪器检测，没有严格复杂的实验操作过程，简化了检测方法，极大地降低了氨基甲酸酯类农药检测成本，实现可视化快速检测，对于甲萘威农药可视化最低检测限为8bpm。本发明是一种具有运行成本低、试剂毒性小、检测快速简便、易判断、选择性好、受色素影响小、检测限低、肉眼可判断等优点。
附图说明
图1、10μM显色剂I与不同浓度碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)的荧光关系。
图2、10μM显色剂I、2U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)与不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)荧光关系。
图3、10μM显色剂I、9mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)与不同浓度乙酰胆碱酯酶(AchE)的荧光光谱图。
图4、10μM显色剂I、9mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)与不同浓度乙酰胆碱酯酶(AchE)的荧光最大发射波长关系图。
图5、10uM显色剂I、9mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)与不同浓度乙酰胆碱酯酶(AchE)的荧光最大发射光强关系图。
图6、由左到右为紫外灯下水浴反应5min后乙酰胆碱酯酶溶液浓度分别为1.0U/mL、0.8U/mL、0.6U/mL、0.4U/mL、0.3U/mL、0.2U/mL的荧光照片。
图7、10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针条件下不同浓度甲萘威的荧光光谱图。
图8、10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针条件下不同浓度甲萘威与荧光最大发射波长关系图。
图9、10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针条件下不同浓度甲萘威与荧光最大发射波长的对数关系图。
图10、10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针条件下不同浓度甲萘威与荧光最大发射波长关系图。
图11、10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针条件下不同浓度甲萘威的荧光最大发射波长的对数关系图。
图12、由左到右为紫外灯下水浴反应5min后甲萘威浓度分别为0.32bpm、1.6bpm、8bpm、40bpm、200bpm、1ppm、5ppm的荧光照片。
图13、在相同条件下不同种类5mg/L农药水浴5min后对乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制率。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本发明实施例中荧光显色剂选用的是吡啶并吡嗪酮离子型化合物，以下实施例中简称为显色剂I，化学式如下：
Figure BDA0002986477490000071
本发明实施例中氨基甲酸酯类农药选用的是甲萘威，但本发明的方案在具体应用时不限于甲萘威，还可用于对抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威等绝大多数氨基甲酸酯类农药的检测。
本发明实施例中不同种类农药比较中选用的是，氨基甲酸酯类农药：甲萘威、抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威，有机磷类农药：三唑磷、伐灭磷、敌百虫、草甘膦，三唑类农药：戊唑醇，苯基吡唑类农药：氟虫腈，拟除虫菊酯类农药：氰戊菊酯、阿维菌素农药：甲胺基阿维菌素苯甲酸盐。
本发明实施例中所述的农药保存于去离子水中浓度为25ppm。
本发明实施例中pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液浓度选用的是100mM，以下简称pH＝7缓冲液。
本发明实施例中存储于pH＝7缓冲溶液中的乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液浓度为20U/mL。
存储于去离子水中的碘化硫代乙酰胆碱溶液浓度为300mM。
实施例1、化合物I的制备。
合成路线为：
Figure BDA0002986477490000072
将上式化合物(1)、化合物(2)、氯化镍，使其摩尔比为1:1.5:0.5，其中化合物(1)为2mmol。将反应体系在140℃下搅拌反应12小时。反应结束后冷却，反应体系旋蒸，除去溶剂，剩余物用硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇10:1淋洗，TLC检测，合并含有产物的流出液，旋转蒸发仪蒸馏除去溶剂，真空干燥得到黄色固体的目标产物，产率分为13％—45％，纯度为99.5％(HPLC)。
化合物(I)的NMR数据如下(卤离子对阳离子部分的氢碳位移影响不明显)：
1H NMR(600MHz,TFA)δ9.48(s,1H),9.22(d,J＝6.6Hz,1H),8.79(d,J＝6.5Hz,1H),8.25(s,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,2H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.59(t,J＝7.7Hz,2H),4.16(s,3H).13C NMR(151MHz,TFA)δ165.3,159.4,144.3,143.2,141.7,138.5,135.8,133.3,132.3,130.3,129.2,128.7,113.4,57.8.
实施例2、检测体系碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)浓度的确定
a、10μM显色剂I与不同浓度碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)的荧光关系。把浓度为300mM存储于去离子水中的碘化硫代乙酰胆碱溶液分别稀释浓度为300mM、30mM、3mM、0.3mM、0.03mM的碘化硫代乙酰胆碱溶液，把0.3mL不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱溶液分别加入0.5mL、20μM的存储于pH＝7缓冲液中的显色剂I溶液、0.1mL去离子水以及0.1mL、pH＝7缓冲液震荡混合1min，36℃水浴5min，得浓度分别为90mM、9mM、900μM、90μM、9μM、0μM的碘化硫代乙酰胆碱混合溶液。用荧光光谱仪记录其430nm激发波长下的荧光发射光谱，记录其最大发射波长以及最大发射光强，于图1、表1。
b、10μM显色剂I、2U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)与不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)荧光关系。把浓度为300mM存储于去离子水中的碘化硫代乙酰胆碱溶液分别稀释浓度为300mM、30mM、3mM、0.3mM、0.03mM的碘化硫代乙酰胆碱溶液，把0.3mL不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱溶液分别加入0.5mL、20μM的存储于pH＝7缓冲液中的显色剂I溶液、0.1mL去离子水以及0.1mL、储于pH＝7缓冲溶液中的乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液震荡混合1min，36℃水浴5min，制得浓度分别为90mM、9mM、900μM、90μM、9μM、0μM的碘化硫代乙酰胆碱混合溶液。用荧光光谱仪记录其430nm激发波长下的荧光发射光谱，记录其最大发射波长以及最大发射光强于图2、表1。
通过表1，比较酶解前a、酶解后b的最大发射波长、最大发射光强变化。当碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)浓度为9mM、90mM时最大发射波长变化I1、最大发射光强变化I2都较大。考虑到当碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)浓度为9mM时其体系的荧光更强，有利于可视化，因此得出最佳检测体系碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)浓度为9mM。
表1、酶解前a、酶解后b的最大发射波长、最大发射光强比较
Figure BDA0002986477490000091
实施例3、检测体系乙酰胆碱酯酶(AchE)浓度的确定
10uM显色剂I、9mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)与不同浓度乙酰胆碱酯酶(AchE)的荧光关系。把浓度为20U/mL存储于pH＝7缓冲溶液中的乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液浓度为分别稀释至浓度为20U/mL、16U/mL、12U/mL、10U/mL、8U/mL、6U/mL、4U/mL、3U/mL、2U/mL、1.5U/mL、1U/mL、0.5U/mL、0U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，把0.1mL不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱溶液分别加入0.5mL、20μM的存储于pH＝7缓冲液中的显色剂I溶液、0.37mL去离子水震荡混合、36℃水浴15min后加入0.03mL、300mM碘化硫代乙酰胆碱水溶液，制得浓度分别为2U/mL、1.6U/mL、1.2U/mL、1.0U/mL、0.8U/mL、0.6U/mL、0.4U/mL、0.3U/mL、0.2U/mL、0.15U/mL、0.1U/mL、0.05U/mL、0.00U/mL的乙酰胆碱酯酶混合溶液。用荧光光谱仪记录其430nm激发波长下的荧光发射光谱、最大发射波长以及最大发射光强于图3、图4、图5。同时，用365nm紫外灯观察体系荧光，记录水浴反应5min后溶液荧光于图6。
365nm紫外灯观察体系荧光可以判断出当乙酰胆碱酯酶溶液大于等于0.3U/mL时，体系经过水浴反应5min后由绿色变为蓝色。考虑到乙酰胆碱酯酶溶液浓度越小体系对氨基甲酸酯类农药越灵敏，经过图3、图4、图5的比较，得出最佳检测体系乙酰胆碱酯酶(AchE)浓度为0.3U/mL。
实施例4、检测体系对于甲萘威农药浓度标准曲线构建与确定可视化判断浓度。
10μM显色剂I、0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)、9mM乙酰胆碱酯酶(AchE)作为荧光探针检测不同浓度甲萘威。把25ppm保存于去离子水中的甲萘威农药溶液为分别稀释至浓度为0.064bpm、0.32bpm、1.6bpm、8bpm、40bpm、200bpm、1ppm、5ppm、25ppm的乙酰胆碱酯酶溶液，把0.2mL不同浓度的甲萘威农药溶液分别加入0.5mL 20μM的存储于pH＝7缓冲液中的显色剂I溶液、0.1mL 3U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液、0.17mL去离子水震荡混合、36℃水浴15min后加入0.03mL 300mM碘化硫代乙酰胆碱水溶液，制得浓度分别为0bpm、0.0128bpm、0.064bpm、0.32bpm、1.6bpm、8bpm、40bpm、200bpm、1ppm、5ppm的甲萘威混合溶液。用荧光光谱仪记录其430nm激发波长下的荧光发射光谱、最大发射波长以及最大发射光强于图7、图8、图10。作对数关系于图9、图11，求出最大发射波长以及最大发射光强与甲萘威农药浓度的线性关系。同时，用365nm紫外灯观察体系荧光，记录水浴反应5min后溶液荧光于图12。
如图9，反应5min后430nm处甲萘威浓度与最大发射波长呈对数线性关系：y＝0.22411(±0.01956)ln(x)+503.0782(±0.06413)，R2＝0.99098。如图11，反应5min后430nm处甲萘威浓度与最大发射光强呈对数线性关系。此处为两段线性关系：y1＝14.4449(1.13695)ln(x)+1656.59934(±8.66119)，R2＝0.99853；y2＝54.82508±2.92915ln(x)+1873.99997(±7.85782)，R2＝0.9994。这是由于体系荧光由绿色变为蓝色，最大激发波长的改变会导致不同浓度甲萘威与最大发射光强对数的线性关系的斜率发生变化。甲萘威浓度为8bpm时还处于y2曲线的斜率，实际上在365紫外光下甲萘威浓度为8bpm水浴反应5min时体系还处于绿色荧光，甲萘威还对乙酰胆碱酯酶(AchE)有着抑制作用。
结合365nm紫外灯观察水浴反应5min后体系荧光，可以得出结论为，实验上甲萘威农药的可视化最小检测浓度为8bpm。
实施例5、检测体系对于农药选择准确性的测定
10μM显色剂I、9mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)下不同种类5mg/L农药水浴5min后对0.3U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制率。把0.2mL 25ppm的不同种类农药溶液(甲萘威、抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威、草甘膦、敌百虫、伐灭磷、三唑磷、戊唑醇、氟虫腈、氰戊菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐)分别加入0.5mL 20μM的存储于pH＝7缓冲液中的显色剂I溶液、0.1mL3U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液、0.17mL去离子水震荡混合、36℃水浴15min后加入0.03mL300mM碘化硫代乙酰胆碱水溶液，制得浓度为5ppm的不同种类农药混合溶液。用荧光光谱仪记录其430nm激发波长下的荧光发射光谱、最大发射波长以及最大发射光强于，求出不同种类5mg/L农药水浴5min后对乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制率于图13。
由图13可以看出，此方法对抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威、甲萘威等氨基甲酸酯类农药有着独特的选择性。
实施例6、检测体系对自来水农药浓度的现场检测
(1)对自来水取样0.2mL与0.1mL乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，得到0.97mL混合溶液C1，36℃水浴15min；
混合溶液C1加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到样品D1，水浴反应5min；
在365nm紫外灯下观察样品D1荧光，荧光为蓝色，则可判断溶液D1中氨基甲酸酯类农药浓度低于突变浓度8bpm，自来水氨基甲酸酯类农药浓度低于40bpm。
(2)另用同样水源的自来水配制200bpm甲萘威溶液，与0.1mL乙酰胆碱酯酶(AchE)溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，得到0.97mL混合溶液C2，36℃水浴15min；
混合溶液C2加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到样品D2，水浴反应5min；
在365nm紫外灯下观察样品D2荧光，荧光为绿色，则可判断溶液D2中氨基甲酸酯类农药浓度高于突变浓度8bpm，取样农药浓度超过40bpm。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之。

Claims (8)

1.一种用于快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的荧光剂，其特征在于，其为吡啶并吡嗪酮离子型化合物，化学结构式如下：
Figure RE-FDA0003151257410000011
式(I)中的阴离子X是I、Br或Cl。
2.一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将0.2mL不同浓度氨基甲酸酯类农药溶液分别与0.1mL乙酰胆碱酯酶溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，分别得到0.97mL不同浓度氨基甲酸酯类农药的混合溶液A，水浴15min；显色剂是指权利要求1所述的吡啶并吡嗪酮离子型化合物；
步骤2、在每份不同浓度氨基甲酸酯类农药的混合溶液A中分别加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到含有不同浓度氨基甲酸酯类农药、乙酰胆碱酯酶、显色剂与碘化硫代乙酰胆碱的样品B，水浴反应5min；
步骤3、在430nm激发波长下测定每份样品B荧光光谱，将最大发射波长、最大发射光强分别与其对应氨基甲酸酯类农药的浓度进行线性拟合，可构建氨基甲酸酯类农药检测的标准浓度曲线；
步骤4、通过365nm紫外波长照射观察每份样品B荧光颜色变化，判断体系荧光变色时氨基甲酸酯类农药水溶液浓度，记作荧光突变阈值；
步骤5、对过滤后待测样品取样0.2mL与0.1mL乙酰胆碱酯酶溶液、0.5mL显色剂溶液、0.17mL去离子水混合，得到0.97mL混合溶液C，水浴15min；
步骤6、混合溶液C加入0.03mL碘化硫代乙酰胆碱溶液得到样品D，水浴反应5min；
步骤7、用荧光光谱仪在430nm激发波长下测定每份样品D荧光光谱，对照步骤3中氨基甲酸酯类农药检测的标准浓度曲线可得出农残浓度；在365nm紫外灯下观察样品D荧光，若样品荧光为绿色，则可判断溶液D中氨基甲酸酯类农药浓度超过阈值；若样品荧光为蓝色，则可判断溶液D中氨基甲酸酯类农药浓度低于阈值。
3.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，所述的氨基甲酸酯类农药为甲萘威、抗蚜威、异丙威、速灭威、残杀威、仲丁威、克百威、西维因、甜菜安、甜菜宁、丁硫克百威或丙硫克百威中的一种或二种以上。
4.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，步骤1中所述的氨基甲酸酯类农药保存于去离子水中浓度为25ppm；
步骤1中所述的显色剂溶液保存于一定浓度pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液中，浓度为1μM～10mM；
步骤1中所述的乙酰胆碱酯酶溶液保存于一定浓度pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液中，浓度为0.05U/mL～20U/mL；
pH＝7的磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲溶液浓度为0.1mM～1M。
5.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，溶液B中不同浓度的氨基甲酸酯类农药浓度分别为0、0.0000128ppm、0.000064ppm、0.00032ppm、0.0016ppm、0.008ppm、0.04ppm、0.2ppm、1ppm、5ppm。
6.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，步骤2中所述的碘化硫代乙酰胆碱溶液存储于去离子水中，浓度为300μM～300mM。
7.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，步骤5所述待测样品为河水、湖水、自来水、或井水；
步骤5中所述的乙酰胆碱酯酶浓度为0.05U/mL～2U/mL；
步骤5中所述显色剂浓度为1μM～10mM。
8.根据权利要求2所述的一种快速可视化检测氨基甲酸酯类农残的方法，其特征在于，步骤6中所述的碘化硫代乙酰胆碱溶液存储于去离子水中，浓度为300μM～300mM。
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