CN113248401B - 贝壳杉烷型二萜衍生物的制备及应用 - Google Patents

贝壳杉烷型二萜衍生物的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及贝壳杉烷型二萜衍生物的制备、药理作用机制研究、应用、制剂，具体涉及贝壳杉烷型二萜衍生物治疗血栓栓塞性疾病的用途。

Description

贝壳杉烷型二萜衍生物的制备及应用
技术领域：
本发明属于药物化学、药理学与制剂领域，具体涉及贝壳杉烷型二萜衍生物的制备、药理作用机制研究、应用、制剂，涉及贝壳杉烷型二萜衍生物治疗血栓栓塞性疾病的用途。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，是由血栓导致的血管腔狭窄或者闭塞，引起相应组织和器官缺血、缺氧和坏死，从而导致机体功能障碍的各种疾病。目前，临床上治疗血栓栓塞性疾病的抗凝药物主要有肝素类和香豆素类，虽然这些药物都有很好的疗效，但是也存在着诸多问题，例如不能口服，并且由于副作用需要经常监测凝血活性，如果使用不当可能会危及生命。FXa位于人体内源性凝血途径和外源性凝血途径的交汇处，若抑制FXa就能同时阻断两条凝血途径，因此FXa是抗凝药物研发中的一个非常具有吸引力的靶点。
甜菊苷(Steviolside)是从植物甜菊的叶子中提取出来的化合物，因其甜度高、热量低，被广泛用作天然甜味剂或食品添加剂，并获得了美国中国多个官方机构的认证。异甜菊醇是由甜菊苷水解得到的具有贝壳杉烷型四环二萜骨架结构的化合物，具有广泛的生物学活性，如降血糖、抗高血压、抗肿瘤、心肌保护、神经保护等等。
本发明主要运用基于靶点的药物设计方法对异甜菊醇进行结构修饰，通过体外分子水平、细胞水平以及体内动物水平研究，发现具有显著抗凝活性的化合物。
技术方案：
本发明设计贝壳杉烷型二萜衍生物，结构通式为：
Figure BDA0002959110940000011
R选自A类型
Figure BDA0002959110940000012
B类型
Figure BDA0002959110940000013
的任意一种。
本发明涉及贝壳杉烷型二萜衍生物的结构是如下任意一种：
Figure BDA0002959110940000021
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物用于制备抗凝的组合物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物用于制备治疗或预防血栓栓塞性疾病的组合物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物用于制备治疗或预防血栓的组合物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物用于制备治疗或预防血栓疾病的组合物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的组合物，组合物含有5-200mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的胶囊，100-500mg胶囊，含有5-200mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的胶囊，500mg胶囊，含有10mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的胶囊，500mg胶囊，含有50mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的胶囊，500mg胶囊，含有100mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的片剂，100-500mg片剂，含有5-200mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的片剂，500mg片剂，含有10mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的片剂，500mg片剂，含有50mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的片剂，500mg片剂，含有100mg的贝壳杉烷型二萜衍生物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物：其特征在于：采用本领域的辅料制备得到药物。
本发明的贝壳杉烷型二萜衍生物的组合物，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、微丸、缓释胶囊剂、冻干粉、注射剂等。
本发明的药效学实验：
药效学实验一：化合物对FXa抑制作用的体外研究
一、实验仪器及试剂材料
(1)仪器：FORMA700型超低温冰箱，Thermo公司；YC-300L型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；Direct-Q with pump型超纯水仪，Millopore公司；M200型全波长酶标仪，Tecan公司。
(2)试剂材料：Human FXa，(Kordia,Leiden,the Netherlands)；S-2765显色底物，(Boatman Biotech,Shanghai,China)；牛血清白蛋白(BSA)，国药集团；DMSO，国药集团；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)，(Sigma,St.Louis,MO,USA)；Rivaroxaban，(Sigma,St.Louis,MO,USA)。
二、实验方法
(1)配制BSA Buffer(牛血清白蛋白缓冲液)：取0.005mol(0.605g)Tris，0.01mol(0.58g)NaCl，0.10g BSA，加100ml三蒸水，摇匀，得到终浓度为0.05M Tris-0.1M NaCl-0.1％BSA缓冲液(pH＝7.4)。
(2)配制小分子化合物溶液：根据初筛结果将待测化合物配制成不同浓度的小分子化合物溶液(1nM,10nM,100nM,1000nM,10000nM或0.1nM,1nM,10nM,100nM,1000nM)。
(3)测定FXa的抑制活性：于96孔板中，每孔加入10μL已配好的不同浓度的小分子化合物溶液和25μL的0.003IU/mL的human FXa，以40μL的BSA缓冲液(pH 7.4)混合均匀。37℃下孵育15min。之后加入40μL显色底物S-2765，震荡10s后，于室温下孵育1h。酶标仪测定各孔在405nm的吸光度。
(4)数据处理：FXa抑制活性＝1-[OD(sample)/OD(control)]，IC50值通过Graphpad6软件计算分析得出，抑制常数Ki＝IC50/(1+[S]/Km)，S-2765显色底物的Km为10mM。
三、实验结果
表1化合物对FXa的抑制作用
Figure BDA0002959110940000041
实验结果显示：本发明对一系列贝壳杉烷型二萜衍生物进行了体外FXa抑制活性评价，结果显示化合物1-10对FXa具有显著抑制活性。
药效学实验二：化合物对PT和aPTT影响的体外研究
一、实验仪器及试剂材料
(1)仪器：FORMA 700型超低温冰箱，Thermo公司；YC-300L型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；Direct-Q with pump型超纯水仪，Millopore公司；Sysmex CA-6000全自动血凝仪，Dade-Behring公司。
(2)试剂材料：牛血清白蛋白(BSA)，DMSO，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)，Rivaroxaban和PEG 8000(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO,USA)；Dade Actin FS试剂盒、Thromboplastin C-Plus试剂盒(Dade Behring,Marburg,Germany)。
二、实验方法
(1)制备贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)：健康受试者静脉采血1mL于真空采血管中(含0.11mM柠檬酸钠)，在4℃条件下，以每分钟2000转离心10min制备贫血小板血浆。
(2)配制小分子化合物溶液：先用DMSO溶解小分子化合物得到母液，然后以PPP稀释成不同浓度(1nM、10nM、100nM、1000nM、10000nM、100000nM、1000000nM)。
(3)测试aPTT与PT：将贫血小板血浆与小分子溶液混合均匀后，37℃孵育1min，随后加入50μL Dade Actin FS试剂，2min后加入CaCl2，全自动血凝仪测定aPTT。将贫血小板血浆与小分子溶液混合均匀后，37℃孵育3min，随后加入100μLThromboplastin C-Plus试剂，全自动血凝仪测定PT。
三、实验结果
表2化合物对PT和aPTT影响
Figure BDA0002959110940000051
实验结果显示：本发明对一系列贝壳杉烷型二萜衍生物进行了体外抗凝aPTT和PT评价，结果显示四个化合物都展现出中度至高度体外抗凝活性。
药效学实验三：化合物对多种凝血因子抑制作用的体外研究
一、实验仪器及试剂材料
(1)仪器：FORMA700型超低温冰箱，Thermo公司；YC-300L型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；Direct-Q with pump型超纯水仪，Millopore公司；M200型全波长酶标仪，Tecan公司。
(2)试剂材料：Human thrombin,FXIIa(American Diagnostica Inc.,Greenwich,CT,USA)；Human FIXa,FXIa(Haematologic Technologies Inc.,Essex Junction,VT,USA)；Human trypsin(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO,USA)；Human FVIIa(NovoPharmaceuticals,Bagsvaerd,Denmark)；显色底物S-2222,显色底物S-2238,显色底物S-2366,显色底物S-2288(DiaPharma,West Chester,Ohio,USA)；SpectrozymeFIXa,FXIIa特异性显色底物(American Diagnostica Inc.,Greenwich,CT,USA)。
二、实验方法
(1)配制Thrombin、Trypsin活力测定工作液：100mM Na3PO4、200mMNaCl以及0.5％PEG 8000(pH 7.5)。配制FVIIa活力测定工作液：50mM HEPES、150mMNaCl、5mM CaCl2以及0.1％PEG8000(pH 7.4)。配制FIXa活力测定工作液：50mMTris、100mMNaCl、5mM CaCl2、0.5％PEG 8000以及2％DMSO(pH 7.4)。配制FXIa,FXIIa活力测定工作液：50mM HEPES、145mMNaCl、5mMKCl以及0.1％PEG 8000(pH 7.4)。
(2)配制小分子化合物溶液：根据初筛结果将待测化合物配制成不同浓度的小分子化合物溶液(10nM,100nM,1000nM,10000nM,100000nM)。
(3)测定Thrombin、FVIIa、FIXa、FXIa、FXIIa、Trypsin的抑制活性：于96孔板中，每孔加入10μL上述已配好的不同浓度的小分子化合物溶液和25μL的0.003IU/mL的FVIIa,FIXa,FXIa,FXIIa,凝血酶以及胰蛋白酶，以40μL的不同工作缓冲液混合均匀。37℃下孵育15min。之后分别加入40μL显色底物S-2222(Trypsin，终浓度为0.02mM)、S-2238(Thrombin，终浓度为0.007mM)、S-2366(FXIa，终浓度为0.73mM)、S-2288(FVIIa，终浓度为5mM)、SpectrozymeFIXa(终浓度为1.3mM)、FXIIa特异性显色底物(终浓度为0.8mM)，震荡10s后，于室温下孵育1h。酶标仪下测定各孔在405nm的吸光度。
(4)数据处理：抑制活性＝1-[OD(sample)/OD(control)]，IC50值通过Graphpad 6软件计算分析得出，抑制常数Ki＝IC50/(1+[S]/Km)，其中[s]为底物浓度，Km为Michaelisconstant。
三、实验结果
表3化合物对多种凝血因子的抑制作用
Figure BDA0002959110940000061
Figure BDA0002959110940000071
实验结果显示：本发明对一系列贝壳杉烷型二萜衍生物进行了体外多种凝血因子抑制活性评价，结果显示化合物5和7均表现出高度的选择性。
药效学实验四：化合物的体内抗凝作用研究
一、实验仪器及试剂材料
(1)仪器：BT5-3型低速台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；XT-2000i型全自动五分类血细胞分析仪，日本希森美康医用电子有限公司；FB-40型半自动血液凝固分析仪，山西亚森实业有限公司。
(2)试剂材料：阿哌沙班(正大天晴药业集团)，利伐沙班(拜耳医药保健有限公司)；ICR小鼠，体重20-22g，雌雄各半，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK(吉)-2018-0007，质量合格证号：202000031939。
二、实验方法
(1)对小鼠出血时间的影响：取ICR小鼠60只，雌雄各半，适应环境3天后，随机等分为六组，每组10只，第一组为溶媒对照组，第二组为阿哌沙班1.5mg/kg，第三组为利伐沙班5mg/kg，第四组为化合物7高剂量16mg/kg，第五组为化合物7中剂量8mg/kg，第六组为化合物7低剂量4mg/kg。一次灌胃给药，体积为10mL/kg，溶媒对照组给予相同体积的溶媒。于给药后1小时，将小鼠尾尖剪掉3mm，随即将鼠尾放入37℃生理盐水内，记录出血时间。
(2)对小鼠凝血时间的影响：取ICR小鼠60只，雌雄各半，适应环境3天后，随机等分为六组，每组10只，第一组为溶媒对照组，第二组为阿哌沙班1.5mg/kg，第三组为利伐沙班5mg/kg，第四组为化合物7高剂量16mg/kg，第五组为化合物7中剂量8mg/kg，第六组为化合物7低剂量4mg/kg。一次灌胃给药，体积为10mL/kg，溶媒对照组给予相同体积的溶媒。于给药后1小时，将小鼠右眼球摘除，弃去第一滴血，取两滴血于载玻片上，其中一滴血每隔30秒用针头挑一次，直至出现血丝，另一滴血供最后复检，记录凝血时间。
三、实验结果
表4化合物7对小鼠出血时间的影响
Figure BDA0002959110940000072
Figure BDA0002959110940000081
注：与溶媒对照组比较*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
结果可见，一次灌胃给药，化合物7高、中、低剂量及阿哌沙班和利伐沙班均可明显延长小鼠出血时间，与空白对照组比较均有显著性差异。
表5化合物7对小鼠凝血时间的影响
Figure BDA0002959110940000082
Figure BDA0002959110940000083
注：与溶媒对照组比较*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
结果可见，一次灌胃给药后，各剂量及阳性对照药均可明显延长小鼠凝血时间，与空白对照组比较有显著性差异。
药效学实验五：化合物的急性毒性试验
一、实验仪器及试剂材料
ICR小鼠，体重20-22g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK(吉)-2018-0007，质量合格证号：202000032247；羟丙基-β-环糊精(源叶生物)。
二、实验方法
取小鼠20只，雌雄各半，于清洁级观察室适应3日，随机等分为2组，每组10只，第一组为雄性组，第二组为雌性组。禁食不禁水16小时，灌胃给予25％化合物7混悬液，1日1次，体积均为40mL/kg，剂量为10g/kg/日。观察14日内小鼠摄食、饮水、活动、粪便、体重、皮毛光泽度、存亡动物数，以及鼻、眼、口腔是否有异常分泌物等情况。处死，解剖肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的变化，如有死亡动物进行主要脏器病理组织学检查。
三、实验结果
表6给药后14日内小鼠体重变化情况(
Figure BDA0002959110940000091
n＝10)
Figure BDA0002959110940000092
结果可见，灌胃给予化合物7剂量10g/kg/日，14日内体重呈正常增长趋势。
表7给药后14日内一般行为观察
Figure BDA0002959110940000093
Figure BDA0002959110940000101
由表结果可见，灌胃给予化合物7剂量10g/kg/日，药后10min动物可见安静少动、俯卧，于药后2-3h陆续恢复正常活动与饮食；4号雄性动物于药后80min出现共济失调，于第2日恢复正常饮食与活动。14日内所有动物体重呈正常增长趋势，无死亡。
表8给药后14日内鼻、眼、口腔及主要脏器观察
Figure BDA0002959110940000102
由表结果可见，于给药后14日内小鼠鼻、眼、口腔无异常分泌物。处死，解剖肉眼观察心、肝、脾、肺、肾均无明显改变。
具体实施例
实施例1
化合物1的制备
Figure BDA0002959110940000103
Reagents and conditions:a.oxalyl chloride,DMF,DCM,rt；b.N2H4·H2O,DCM,-10℃；c.
4-nitrobenzaldehyde,CH3COOH,CH3OH,reflux.
将异甜菊醇(5mmol)加入到50mL无水二氯甲烷中，然后缓慢加入草酰氯(7.5mmol)，反应20min后再加入DMF，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，蒸干溶剂得粗产物S-1，再加入100mL二氯甲烷，在-10℃下缓慢加入水合肼(80％)(15mmol)，搅拌40min，TLC监测，待反应完全，加入饱和氯化钠萃取，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后经柱层析分离，得S-2白色固体，收率71％。将S-2(0.45mmol)，4-nitrobenzaldehyde(0.495mmol)，乙酸(0.09mmol)依次加入到甲醇溶液中，加热回流3h，TLC监测。待反应完全，蒸干溶剂，加入蒸馏水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物1为黄色固体，收率88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.99(s,1H),8.48(s,1H),8.21(d,J＝8.7Hz,2H),7.84(d,J＝8.8Hz,2H),2.62(dd,J＝18.6,3.7Hz,1H),2.17(d,J＝14.5Hz,1H),2.02(d,J＝12.3Hz,1H),1.90–1.86(m,2H),1.83–1.76(m,2H),1.73–1.66(m,2H),1.62–1.51(m,4H),1.44–1.35(m,2H),1.30(s,3H),1.26–1.21(m,4H),1.01–0.94(m,1H),0.96(s,3H),0.81(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.25,173.74,148.61,145.15,140.24,128.12,124.05,57.89,54.79,54.25,48.81,48.44,44.13,41.67,40.02,39.57,38.26,37.88,37.31,29.93,22.35,20.46,19.94,19.33,14.03.HRMS calculated for C27H35N3O4:465.2628,found 466.2701[M+H]+.
化合物2的制备
Figure BDA0002959110940000111
Reagents and conditions:a.oxalyl chloride,DMF,DCM,rt；b.N2H4·H2O,DCM,-10℃；c.
3-pyridinecarboxaldehyde,CH3COOH,CH3OH,reflux.
将S-2(0.45mmol)，3-pyridinecarboxaldehyde(0.495mmol)，乙酸(0.09mmol)依次加入到甲醇溶液中，加热回流3h，TLC监测。待反应完全，蒸干溶剂，加入蒸馏水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物2为白色固体，收率95％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.10(s,1H),8.72(s,1H),8.56(d,J＝3.3Hz,1H),8.40(s,1H),8.14(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.30(m,1H),2.61(dd,J＝18.6,3.7Hz,1H),2.18(d,J＝14.3Hz,1H),2.01(dd,J＝13.1,2.7Hz,1H),1.90–1.82(m,2H),1.80–1.74(m,2H),1.72–1.65(m,2H),1.60–1.48(m,4H),1.42–1.33(m,2H),1.28(s,3H),1.24–1.18(m,4H),1.00–0.92(m,1H),0.95(s,3H),0.81(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.29,173.62,150.81,149.18,144.73,134.04,130.28,123.92,57.94,54.81,54.27,48.79,48.43,43.99,41.69,40.05,39.56,38.24,37.85,37.31,29.94,22.33,20.44,19.93,19.36,14.02.HRMS calculated for C26H35N3O2:421.2729,found 422.2812[M+H]+.
化合物3的制备
Figure BDA0002959110940000121
Reagents and conditions:a.oxalyl chloride,DMF,DCM,rt；b.N2H4·H2O,DCM,-10℃；c.
3-nitrobenzaldehyde,CH3COOH,CH3OH,reflux.
将S-2(0.45mmol)，3-nitrobenzaldehyde(0.495mmol)，乙酸(0.09mmol)依次加入到甲醇溶液中，加热回流3h，TLC监测。待反应完全，蒸干溶剂，加入蒸馏水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物3为白色固体，收率77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.00(s,1H),8.52(s,1H),8.44(t,J＝1.8Hz,1H),8.19(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H),7.54(t,J＝8.0Hz,1H),2.62(dd,J＝18.6,3.7Hz,1H),2.19(d,J＝14.5Hz,1H),2.03(dd,J＝13.0,2.5Hz,1H),1.90–1.83(m,2H),1.82–1.76(m,2H),1.74–1.66(m,2H),1.62–1.50(m,4H),1.43–1.35(m,2H),1.30(s,3H),1.26–1.19(m,4H),1.01–0.94(m,1H),0.96(s,3H),0.82(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.30,173.75,148.61,145.41,136.07,132.84,129.82,124.67,122.36,57.90,54.80,54.26,48.81,48.44,44.09,41.68,40.04,39.58,38.25,37.88,37.32,29.95,22.36,20.46,19.94,19.34,14.00.HRMS calculated for C27H35N3O4:465.2628,found 466.2706[M+H]+.
化合物4的制备
Figure BDA0002959110940000131
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-3(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物4白色固体，收率85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02–7.99(m,2H),7.53–7.48(m,3H),2.62–2.53(m,2H),2.16–2.06(m,2H),1.81–1.76(m,2H),1.75–1.62(m,3H),1.61–1.55(m,3H),1.46–1.33(m,4H),1.37(s,3H),1.27–1.11(m,3H),1.05–0.97(m,1H),0.97(s,3H),0.42(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.01,171.60,164.26,131.59,129.17,126.84,124.30,57.45,54.86,54.41,48.80,48.53,41.40,39.69,39.49,38.45,37.99,37.85,37.31,30.32,21.56,20.30,19.94,18.70,13.11.HRMS calculated for C27H34N2O2:418.2620,found 419.2697[M+H]+.
化合物5的制备
Figure BDA0002959110940000132
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-4(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物5白色固体，收率82％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03–7.98(m,2H),7.22–7.16(m,2H),2.59–2.52(m,2H),2.15–2.04(m,2H),1.81–1.75(m,2H),1.74–1.62(m,3H),1.60–1.55(m,3H),1.45–1.37(m,4H),1.37(s,3H),1.26–1.10(m,3H),1.04–0.96(m,1H),0.96(s,3H),0.41(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.07,171.65,164.73(d,JCF＝251.3Hz),163.47,129.07(d,JCF＝8.7Hz),120.59(d,JCF＝3.2Hz),116.49(d,JCF＝22.3Hz),57.36,54.79,54.34,48.79,48.51,41.33,39.62,39.46,38.40,37.95,37.82,37.27,30.31,21.54,20.27,19.93,18.66,13.09.HRMScalculated for C27H33FN2O2:436.2526,found 437.2608[M+H]+.
化合物6的制备
Figure BDA0002959110940000141
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-5(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物6白色固体，收率88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(t,J＝1.8Hz,1H),7.94(dt,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.65(m,1H),7.38(t,J＝7.9Hz,1H),2.61–2.52(m,2H),2.15–2.05(m,2H),1.82–1.76(m,2H),1.73–1.63(m,3H),1.62–1.56(m,3H),1.44–1.35(m,4H),1.38(s,3H),1.26–1.11(m,3H),1.04–0.97(m,1H),0.97(s,3H),0.41(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.05,172.05,163.02,134.58,130.77,129.64,126.13,125.41,123.21,57.40,54.84,54.38,48.80,48.52,41.31,39.60,39.47,38.43,37.98,37.91,37.28,30.33,21.56,20.29,19.94,18.69,13.10.HRMScalculated for C27H33BrN2O2:496.1725,found 497.1805[M+H]+.
化合物7的制备
Figure BDA0002959110940000151
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-6(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物7白色固体，收率80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(dd,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.73(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.45(td,J＝7.6,1.3Hz,1H),7.38(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),2.63–2.52(m,2H),2.21–2.04(m,2H),1.88–1.78(m,2H),1.75–1.65(m,3H),1.61–1.53(m,3H),1.45–1.35(m,4H),1.37(s,3H),1.26–1.12(m,3H),1.05–0.96(m,1H),0.96(s,3H),0.47(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.27,172.40,163.47,134.46,132.51,132.01,127.77,125.92,121.56,57.41,54.73,54.37,48.82,48.51,41.32,39.63,39.50,38.45,38.03,37.96,37.33,30.39,21.54,20.30,19.96,18.67,13.22.HRMS calculated for C27H33BrN2O2:496.1725,found 497.1800[M+H]+.
化合物8的制备
Figure BDA0002959110940000152
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-7(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物8白色固体，收率84％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(dd,J＝7.7,1.5Hz,1H),7.43–7.39(m,1H),7.35–7.30(m,2H),2.69(s,3H),2.62–2.53(m,2H),2.19–2.08(m,2H),1.81–1.76(m,2H),1.74–1.65(m,3H),1.62–1.55(m,3H),1.45–1.37(m,4H),1.38(s,3H),1.25–1.18(m,3H),1.04–0.97(m,1H),0.97(s,3H),0.44(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.11,171.13,164.57,138.29,131.85,131.12,128.93,126.30,123.42,57.41,54.81,54.39,48.81,48.52,41.36,39.67,39.48,38.48,38.00,37.76,37.30,30.33,22.20,21.58,20.30,19.95,18.69,13.10.HRMScalculated for C28H36N2O2:432.2777,found 433.2853[M+H]+.
化合物9的制备
Figure BDA0002959110940000161
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-8(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物9白色固体，收率89％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.69(m,1H),7.49(m,1H),7.23(m,1H),2.61–2.52(m,2H),2.16–2.05(m,2H),1.82–1.76(m,2H),1.74–1.64(m,3H),1.60–1.56(m,3H),1.44–1.35(m,4H),1.38(s,3H),1.26–1.11(m,3H),1.04–0.97(m,1H),0.97(s,3H),0.41(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.08,171.98,163.32(d,JCF＝3.3Hz),162.96(d,JCF＝245.9Hz),131.05(d,JCF＝8.3Hz),126.12(d,JCF＝8.7Hz),122.61(d,JCF＝3.3Hz),118.66(d,JCF＝21.2Hz),113.87(d,JCF＝24.1Hz),57.40,54.82,54.36,48.80,48.51,41.32,39.61,39.48,38.40,37.97,37.89,37.28,30.32,21.55,20.29,19.94,18.67,13.10.HRMS calculated for C27H33FN2O2:436.2526,found 437.2603[M+H]+.
化合物10的制备
Figure BDA0002959110940000171
Reagents and conditions:a.PhI(OAc)2,DCM,rt.
将S-9(0.25mmol)和碘苯二乙酸(0.375mmol)溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测。待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物10白色固体，收率84％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.39(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),2.62–2.52(m,2H),2.17–2.04(m,2H),1.84–1.76(m,2H),1.71–1.61(m,3H),1.57–1.53(m,3H),1.44–1.35(m,4H),1.34(s,3H),1.26–1.12(m,3H),1.04–0.97(m,1H),0.97(s,3H),0.44(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.08,172.52,162.19,138.09,133.65,132.20,131.13,127.80,122.28,57.45,54.77,54.40,48.81,48.48,41.34,39.63,39.50,38.43,38.01,37.97,37.33,30.34,21.44,20.32,19.96,18.64,13.08.HRMS calculated forC27H32Cl2N2O2:486.1841,found 487.1921[M+H]+.
实施例2
化合物5制剂的制备
片剂的制备
化合物50.5g；微晶纤维素10g；乳糖5g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素50g；25％淀粉浆100ml；硬酸镁2g，制粒，60℃干燥，12目筛整粒，压成片剂.
胶囊剂的制备
化合物50.5g；微晶纤维素10g；乳糖5g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素50g；25％淀粉浆100ml；100目筛制粒，80℃干燥，100目筛整粒，填入空胶囊。
冻干粉针剂的制备
化合物50.5g；环糊精5g；加入10.0g甘露醇，加入注射用水，加热溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。上述冷冻干燥分为四个阶段：(1)预冻5小时，温度在-30℃；(2)减压干燥12小时，温度在-30℃；(3)升温干燥6小时，温度在-10℃；(4)二次升温干燥4小时，温度在35℃。
实施例3
化合物7制剂的制备
片剂的制备
化合物70.5g；微晶纤维素10g；乳糖5g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素50g；25％淀粉浆100ml；硬酸镁2g，制粒，60℃干燥，12目筛整粒，压成片剂.
胶囊剂的制备
化合物70.5g；微晶纤维素10g；乳糖5g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素50g；25％淀粉浆100ml；100目筛制粒，80℃干燥，100目筛整粒，填入空胶囊。
冻干粉针剂的制备
化合物70.5g；环糊精5g；加入10.0g甘露醇，加入注射用水，加热溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。上述冷冻干燥分为四个阶段：(1)预冻5小时，温度在-30℃；(2)减压干燥12小时，温度在-30℃；(3)升温干燥6小时，温度在-10℃；(4)二次升温干燥4小时，温度在35℃。

Claims (11)

1.贝壳杉烷型二萜衍生物，结构是如下任意一种：
Figure FDA0003647877510000011
2.根据权利要求1的贝壳杉烷型二萜衍生物在制备抗凝血的组合物的用途。
3.根据权利要求1的贝壳杉烷型二萜衍生物在制备治疗或预防血栓栓塞性疾病的组合物的用途。
4.包含权利要求1的贝壳杉烷型二萜衍生物的制剂，制剂为如下的任意一种：胶囊剂、片剂、颗粒剂、微丸、冻干粉、注射剂。
5.包含权利要求1的贝壳杉烷型二萜衍生物的制剂，制剂为缓释胶囊剂。
6.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物5的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000012
将0.25mmolS-4和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物5白色固体，收率85％。
7.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物6的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000013
将0.25mmolS-5和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物6白色固体，收率88％。
8.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物7的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000021
将0.25mmolS-6和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物7白色固体，收率80％。
9.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物8的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000022
将0.25mmolS-7和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物8白色固体，收率84％。
10.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物9的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000023
将0.25mmolS-8和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物9白色固体，收率89％。
11.贝壳杉烷型二萜衍生物的化合物10的制备方法如下：
Figure FDA0003647877510000031
将0.25mmolS-9和0.375mmol碘苯二乙酸溶于二氯甲烷溶液中，室温搅拌8h，TLC监测，待反应完全，加入蒸馏水，二氯甲烷萃取，合并有机层，饱和NaCl反洗，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后，柱层析分离，得化合物10白色固体，收率84％。
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