CN113244254B - 一种增强金黄霉素a水溶性的组合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种增强金黄霉素A水溶性的组合物及其制备方法。所述增强金黄霉素A水溶性的组合物由金黄霉素A和甘草次酸钠按质量比1:80～120混合而成。本发明采用甘草次酸钠与金黄霉素A混合，其与金黄霉素A存在分子间相互作用力，利用机械化学的球磨法将其与金黄霉素A缔合，不仅能够提高金黄霉素A的水溶性，还增强了金黄霉素A的抗癌效果，同时在不影响金黄霉素A原有的生物活性情况下提高了金黄霉素A的生物利用度，改善脂溶性的金黄霉素A在肠段的吸收状况，有利于后续其固体制剂的开发。

Description

一种增强金黄霉素A水溶性的组合物及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种增强金黄霉素A水溶性的组合物及其制备方法，属于医药制剂领域。
(二)背景技术
金黄霉素A（Chrysomycins A，CA）是一种从来自中国南海海泥的海洋链霉菌Streptomyces sp.MS085中分离出的新型抗生素复合物，该化合物具有良好的抗肿瘤、抗细菌和抗真菌特性，同时对正常细胞几乎没有毒性，因此具有成为抗肿瘤、抗细菌乃至抗真菌候选药物的潜力。然而金黄霉素A在水中的溶解性很差，其口服生物利用度低，这在很大程度上限制了其临床应用。现有技术中，还未有增强金黄霉素A溶解性的相关技术报道。
其中所述的金黄霉素A的结构如下式(Ⅰ)所示
Figure SMS_1
(三)发明内容
本发明目的是针对该领域技术空白和研究需求，应用机械化学中的球磨法，加以辅料甘草次酸钠，经球磨来达到金黄霉素A增溶的目的，开发出一种增强金黄霉素A水溶性的组合物。
本发明采用的技术方案是：
一种增强金黄霉素A水溶性的组合物，由金黄霉素A和甘草次酸钠按质量比1:80～120混合而成。
进一步地，所述组合物中金黄霉素A和甘草次酸钠质量之比为1:99。
进一步地，所述组合物按如下方法制备得到：避光称取金黄霉素A和甘草次酸钠，混合后进行滚筒球磨，球磨转速20～40rpm，温度20～30℃，球磨时间为0.5～3.0h，球磨结束制得所述组合物。
本发明还涉及所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。甘草酸是甘草中最主要的活性成分。甘草酸及其系列产品，对肉瘤、癌细胞生长有抑制作用，并且有较强的增加人体免疫功能作用。本发明采用甘草次酸钠与金黄霉素A混合，其与金黄霉素A存在分子间相互作用力，利用机械化学的球磨法将其与金黄霉素A缔合，不仅能够提高金黄霉素A的水溶性，提高金黄霉素A的生物利用度，改善脂溶性的金黄霉素A在肠段的吸收状况；同时合用之后，有效的增加了金黄霉素A的抑瘤活性。因此，此组合物有利于后续其固体制剂的开发。
本发明的有益效果主要体现在：
1)本发明采用球磨的方法对金黄霉素A进行处理，球磨工艺简单，对环境无污染，适合于大规模生产，且金黄霉素A在水中的溶解度从1.68μg/mL增大到82.40μg/mL，溶解度显著提高。
2)本发明制备工艺不仅显著增加了金黄霉素A的水溶性，而且增加了药物的活性，对金黄霉素A的抗癌效果具有协同增效作用。
3)通过甘草次酸钠与金黄霉素A科学配伍，甘草次酸钠与金黄霉素A存在分子间作用力，不仅促进了金黄霉素A在水中的溶解度，而且改善了金黄霉素A在体内肠段的吸收，提高了它的生物利用度。
(四)附图说明
图1为金黄霉素A液相标准曲线。
图2为金黄霉素A原药和实例1制备的球磨时间为2.5h的组合物对抗各种癌细胞增殖效果图。
图3为金黄霉素A原药和实例1制备的球磨时间为2.5h的组合物进行血浆清除对比试验图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
增强金黄霉素A水溶性的组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备原料：称取150mg金黄霉素A和14.85g甘草次酸钠，混合均匀；
(2)滚筒球磨：准备直径22mm的锆球20个，将原料(原料按步骤(1)比例准备6份平行样品)和锆球都放入滚筒中拌匀，封盖拧紧，设定转速30rpm，温度25℃，设置6种不同的球磨转动时间(0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h)。球磨结束后即得水溶性增强的金黄霉素A组合物。
性能测试例1：本发明组合物的溶解度测定
采用高效液相色谱对抗癌药物组合物的溶解度进行测试，色谱条件如下：选用C18色谱柱；紫外检测器；流动相为乙腈：含0.1％甲酸的水(0.4:0.6，v/v)；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL；检测波长为254nm。
配置0.1％(w/w)甲酸水溶液和色谱级乙腈各500mL，超声20min备用。用金黄霉素A配置有浓度梯度的标准溶液，取适量溶液于液相小瓶，放于进样器上，通过HPLC制作标准曲线，标准曲线见图1。在一定量的水中加入金黄霉素A原药或药物球磨组合物，直至无法溶解，通过HPLC测量出峰面积，根据标准曲线算得溶解度。溶解度结果见表1：
表1：金黄霉素A和不同球磨时间制得本发明组合物的溶解度
Figure SMS_2
从表1可以看出通过本方法制备的金黄霉素A组合物可显著提高金黄霉素A的溶解度，这是因为甘草次酸钠与金黄霉素A之间存在分子间作用力，在机械球磨的作用下，两种的晶体结构被破坏，缔合形成无定形的纳米微粒。增强了金黄霉素A的水溶性。由于球磨时间2.5h制得的样品具有最佳溶解度(82.41±25.32μg/mL)，与金黄霉素A原药相比溶解度提高了约50倍，因此在后续的性能测试例中均使用球磨时间2.5h的样品进行测试。
性能测试例2：体外抗癌细胞增殖实验
将金黄霉素A原药(CA)作为对照组，本发明实例1中球磨2.5h的样品(Ball-milling，BM)作为实验组，进行体外抗癌细胞增殖实验，然后通过MTT分别测定细胞存活率，具体方法如下：
(1)细胞铺板。取对数生长期的癌细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数，用培养基稀释为3×104cell/mL的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μL的细胞悬液，孵育过夜。
(2)给药。小心吸弃96孔板中的旧培养基，分别加入用培养基配制的浓度为0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的金黄霉素A原药和本发明例1中球磨2.5h的样品混悬液各100μL于孔板中，每个样品浓度平行5个孔，置于培养箱中孵育48h。
(3)检测。取出96孔板，小心吸弃培养液，然后每孔加入100μL含10％MTT的培养基，使得每个孔中MTT的浓度为0.5mg/mL,继续置于培养箱中孵育4h。4h后取出96孔板，小心吸弃培养液，然后每孔加入100μL的二甲基亚砜，置于摇床中避光振荡10min溶解蓝紫色结晶，再用酶标仪检测570nm处各孔吸光度，然后用细胞活性百分率为指标评价药物对细胞活性的影响。其计算公式为：细胞活性(％)＝100×(A测试-A调零)/(A对照-A调零)。
其中所测试的肿瘤细胞包括人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa、人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，除MDA-MB-231细胞外，其余三种细胞均使用DMEM培养基，在37℃，5％CO2下培养，MDA-MB-231细胞使用L-15培养基在37℃，无CO2条件下进行培养。最终实验结果如图2所示。
从图2可以看出在所设置浓度范围内本发明制备的球磨组合物对各种癌细胞的抑制能力显著强于金黄霉素A原药，而金黄霉素A原药在该浓度范围内对各种癌细胞基本没有毒性。这一方面是因为球磨组合物在水中的溶解度更高，混悬在培养基中的药物更容易被癌细胞吸收发挥毒性作用，另一方面可能是因为甘草次酸钠对金黄霉素A的抗癌细胞增殖能力具有协同增效的作用。
同时对结果用SPSS进行统计学分析(n＝5)得到本发明例1中球磨2.5h的样品对各种癌细胞的半数抑制浓度IC50见表2：
表2：球磨组合物对各种癌细胞的细胞毒性结果
Figure SMS_3
性能测试例3：药物动力学实验
将金黄霉素A原药作为对照组，本发明实例1中球磨2.5h的样品作为实验组，进行血浆清除对比实验。将对照组和实验组样品分散在去离子水中，以金黄霉素A计50mg/kg的剂量对小鼠进行灌胃处理。实验用鼠为18-20g的ICR雌性小鼠，每组5只。
在灌胃后的不同时间点(15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时以及24小时)对小鼠进行眼眶取血200微升于肝素化的试管中，在4℃，5000rpm的条件下离心5分钟获得血浆上清液。取出血浆并加入3倍上清体积的乙腈，当产生蛋白沉淀后，将混合物涡旋2分钟后在4℃，10000rpm下离心10分钟；取上清，在-80℃下保持2小时，解冻后将样品在4℃，10000rpm下离心10分钟，即可将样品用0.22μm的滤膜过滤以供HPLC分析。HPLC测试条件与性能测试例1相同，经过计算即可得不同时间点下血液中金黄霉素A的浓度。结果如图3所示。
从图3可以看出，在灌胃给药后，对照组和实验组的血药浓度达峰时间均为30分钟，但本发明制备的组合物的血浆清除速度更慢，在体内的血液循环时间更久，表3为药物动力学试验参数结果汇总表：
表3：药物动力学试验参数结果汇总表
Figure SMS_4
Cmax：峰值时间下峰浓度
Tmax：血药浓度达峰时间
T1/2：血液浓度半衰期
AUC0→t：时间点下血药浓度—时间曲线面积
AUC0→∞：血药浓度—时间曲线面积
CL：血浆清除率
从表3可以看出本发明制备的组合物的血液消除半衰期长于金黄霉素A原药，其血浆药物浓度—时间曲线下面积(AUC)，即生物利用度，也有显著提高。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (4)

1.一种增强金黄霉素A水溶性的组合物，由金黄霉素A和甘草次酸钠按质量比1:80~120混合而成；所述组合物按如下方法制备得到：避光称取金黄霉素A和甘草次酸钠，混合后进行滚筒球磨，球磨转速为30 rpm，温度为25 ℃，球磨时间为2.5 h，制得所述组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物中金黄霉素A和甘草次酸钠质量之比为1:99。
3.制备权利要求1所述组合物的方法，所述方法包括：避光称取金黄霉素A和甘草次酸钠，混合后进行滚筒球磨，球磨转速为30 rpm，温度为25 ℃，球磨时间为2.5 h，制得所述组合物。
4.权利要求1所述增强金黄霉素A水溶性的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。
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