CN113244196B - 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法 - Google Patents

一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113244196B
CN113244196B CN202110544725.7A CN202110544725A CN113244196B CN 113244196 B CN113244196 B CN 113244196B CN 202110544725 A CN202110544725 A CN 202110544725A CN 113244196 B CN113244196 B CN 113244196B
Authority
CN
China
Prior art keywords
injectable
spongy
exosome
polyester
microspheres
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110544725.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113244196A (zh
Inventor
赵玉鸣
高一珂
袁作楹
黄建永
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University School of Stomatology
Original Assignee
Peking University School of Stomatology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University School of Stomatology filed Critical Peking University School of Stomatology
Priority to CN202110544725.7A priority Critical patent/CN113244196B/zh
Publication of CN113244196A publication Critical patent/CN113244196A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113244196B publication Critical patent/CN113244196B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/501—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5073—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals having two or more different coatings optionally including drug-containing subcoatings
    • A61K9/5078—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals having two or more different coatings optionally including drug-containing subcoatings with drug-free core
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法，包括海绵状聚酯微球、吸附涂层和外泌体，所述海绵状聚酯微球作为可注射基体，吸附涂层作为外泌体吸附锚点。本发明不同于传统包埋于支架或水凝胶中的外泌体，本发明的外泌体通过吸附涂层吸附在可注射海绵状聚酯微球，聚脂微球的海绵状结构为外泌体吸附提供了大的比表面积，吸附涂层于外泌体之间的结合能力差异可以控制外泌体的释放曲线。

Description

一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统 及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，特别是涉及一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法。
背景技术
干细胞的治疗作用主要来源于旁分泌作用，而干细胞分泌的外泌体是细胞间信号传导的主要作用媒介，具有多种功能性，如促血管生成，抗凋亡和抗炎等，已经在包括骨再生、心血管修复、肌肉组织再生、表皮伤口修复等方向得到了广泛研究。但是，外泌体的体内稳定性和保留率被认为是其临床转化的主要障碍，因为体内递送外泌体后，先天免疫系统会快速清除外泌体，这导致外泌体的体内半衰期短，治疗效果不佳。
生物材料的使用可能会克服外泌体的低组织滞留性，如与直接注射外泌体相比，通过外泌体功能化的聚乙二醇水凝胶可通过减轻炎症，细胞凋亡和纤维化来显着增强慢性肝衰竭模型中的肝再生。在另一项研究中，为了提高钛植入物的生物功能，巨噬细胞衍生的外泌体被用来修饰钛纳米管植入物以促进成骨作用。尽管已经有很多研究将外泌体与生物材料相结合，但是在外泌体的临床应用上，仍存在许多问题。首先，目前结合外泌体的方法多为在生物材料的制备过程中，直接将外泌体包埋入生物材料中，这些外泌体在后续处理及保存、运输过程中可能会失活。其次，外泌体的生物学作用具有浓度依赖性，现有方法无法有效控制外泌体的释放。第三，现有外泌体应用方法为直接注射，但与生物材料结合后，会失去其可注射性，为临床操作带来困难。
发明内容
针对传统外泌体治疗体内稳定性差、保留率低的现状，针对现有负载外泌体的不可注射生物材料无法控制外泌体的释放以及需要开放性手术，本发明的目的是提供一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统；不同于传统包埋于支架或水凝胶中的外泌体，本发明的外泌体通过吸附涂层吸附在可注射海绵状聚酯微球，聚脂微球的海绵状结构为外泌体吸附提供了大的比表面积，吸附涂层于外泌体之间的结合能力差异可以控制外泌体的释放曲线；本发明同时提供一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法。
为了达到上述目的，本发明有如下技术方案：
本发明的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统，包括海绵状聚酯微球、吸附涂层和外泌体，所述海绵状聚酯微球作为可注射基体，吸附涂层作为外泌体吸附锚点。
其中，所述外泌体来源为人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞中的一种或多种。
其中，所述外泌体能在一个月内持续释放，外泌体释放行为受吸附涂层调控。
本发明的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，有以下步骤：
(1)制备可注射海绵状聚酯微球；
(2)对步骤(1)中所得可注射海绵状聚酯微球进行吸附涂层修饰；
(3)分离细胞外泌体，将外泌体分散于缓冲液中，取步骤(2)中所得吸附涂层修饰后的可注射海绵状聚酯微球，置于含外泌体的缓冲液中，在避光、4摄氏度的摇床中20-100rpm孵育1-24小时；
(4)通过吸附涂层已经将外泌体吸附在可注射海绵状聚酯微球的表面，形成了可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释体。
其中，所述可注射海绵状聚酯微球的制备步骤为：
(1)溶液配制：将聚乙烯醇，表面活性剂Tween 60和去离子水混合配置得到外水相W；将表面活性剂Span 80生物可降解脂肪族聚酯溶于二氯甲烷中得到油相O；
(2)乳液形成：将致孔剂加入油相O中，2000-20000rpm均质5分钟，形成初乳液E；将初乳液E加入外水相W中，得到E/W复乳液；
(3)形成多孔结构：将所得E/W复乳液300rpm机械搅拌1-4小时，去除致孔剂，形成多孔聚酯微球；
(4)表面刻蚀：将(3)中多孔聚酯微球加入碱溶液中，100rpm搅拌1-30分钟，形成海绵状聚酯微球；
(5)收集冻干：停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集海绵状聚酯微球，经去离子水洗涤5次后，冷冻干燥24-48小时。
其中，所述步骤(1)中用到的生物可降解脂肪族聚酯，是聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯及它们的共聚物中的一种；生物可降解脂肪族聚酯溶液浓度为2.5-20wt％，每毫升聚合物溶液添加0.5-5毫克Span 80，每毫升去离子水中添加2-20毫克聚乙烯醇和0.5-5毫克Tween 60。
其中，所述步骤(2)中致孔剂为碳酸氢铵、盐颗粒、明胶的任一种，E/W复乳液由乳液搅拌，静电喷射，3D打印制得或微流控方法制得。
其中，所述步骤(4)中碱溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液，氨水的一种，碱溶液浓度为0.1-1mol/L，优选的浓度为0.2-0.5mol/L。
其中，所述步骤(2)的吸附涂层为聚乙烯亚胺涂层、聚多巴胺涂层和磷酸钙涂层的一种；所述吸附涂层修饰包括：聚乙烯亚胺涂层通过碳二亚胺法偶联到可注射海绵状聚酯微球表面上；所述聚多巴胺涂层是通过多巴胺碱性自聚合的方法沉积到可注射海绵状聚酯微球表面上；所述磷酸钙涂层是通过生物矿化的方法沉积到可注射海绵状聚酯微球表面上。
其中，所述缓冲液为PBS buffer和MES buffer的一种。
其中：
碳二亚胺法：配置10-100mg/ml的聚乙烯亚胺水溶液，调控pH范围为7.2-9，像聚乙烯亚胺水溶液中加入10-30mg/ml的EDC和5-20mg/ml的NHS，溶解完全后，将海绵状聚酯微球悬浮于其中，室温反应1-24h后，去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到聚乙烯亚胺涂层的海绵状聚酯微球。(其中优化的聚乙烯亚胺浓度为20mg/ml，EDC浓度为19.04mg/ml，NHS浓度为11.48mg/ml，溶液pH值为8.5，反应时间为12h)
多巴胺碱性自聚合的方法：配置0.5-5mg/ml的多巴胺水溶液，调控pH范围为7.2-9，将海绵状聚酯微球悬浮于其中，室温反应12-48h后，去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到聚多巴胺涂层的海绵状聚酯微球；其中优化的多巴胺浓度为2mg/ml，溶液pH值为8.5，反应时间为24h。
生物矿化的方法：配置1倍-10倍浓度的标准模拟体液(ISO 23317-2007)，将步骤海绵状聚酯微球悬浮于其中，在37℃反应3h-7天后，去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到磷酸钙涂层的海绵状聚酯微球；优化的生物矿化条件为5倍浓度的标准模拟体液，矿化时间为24h。
微流控方法是指使用微管道处理或操纵微小流体的系统，通过由不相溶的两种或更多种液体流动聚焦后，形成微小液滴，原理类似于乳液法。
本发明的有益效果是：
本发明所制备的可注射海绵状聚酯微球，得到的海绵状结构，具有比传统多孔微球更大的比表面积，微球表面富含羧基，有利于后续吸附涂层的涂附；不同于将外泌体包裹入水凝胶或其他生物材料中，本发明经吸附涂层涂附后，微球表面富含外泌体结合位点，能够高效率吸附外泌体；外泌体可以单独保存，在使用前与微球孵育即可将外泌体吸附在微球的吸附涂层表面上，达到缓释外泌体的效果；并且由于吸附涂层对外泌体吸附能力的差异，可有效控制外泌体的吸附和释放曲线。
附图说明
附图说明：
图1：可注射海绵状聚酯微球扫描电子显微镜图；
图2：经聚多巴胺涂层和磷酸钙涂层修饰后的可注射海绵状聚酯微球扫描电子显微镜图；
图3：经聚多巴胺涂层和磷酸钙涂层修饰后的可注射海绵状聚酯微球对外泌体的吸附曲线；
其中，1、PLA-PMS-PDA；2、PLA-PMS-Ca；3、PLA-PMS；
图4：经聚多巴胺涂层和磷酸钙涂层修饰后的可注射海绵状聚酯微球吸附外泌体后的释放曲线；
其中，1、PLA-PMS-PDA；2、PLA-PMS-Ca。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1：可注射海绵状聚乳酸微球的制备
(1)将1克聚乳酸(PLA，分子量5万)溶于20毫升二氯甲烷溶液，磁力搅拌12小时，得到溶液A。
(2)向溶液A中加入20毫克Span 80，将0.75g碳酸氢铵溶于5ml水中加入溶液A，在12000rpm下均质5分钟，得到初乳液B。
(3)将0.2克Tween 60，2克聚乙烯醇(PVA 1788)溶于200毫升去离子水中得到溶液C，在300rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的初乳液B，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4小时，进行二氯甲烷溶剂的挥发。
(4)停止搅拌，经去离子水洗涤3次后，将微球浸没在0.2M的NaOH溶液中5min进行刻蚀，得到海绵状微球
(5)在4000rpm下离心10分钟收集硬化成型的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，得到可注射海绵状聚乳酸微球，记为：PLA-PMS。
实施例2：可注射海绵状丙交酯-乙交酯共聚物微球的制备
(1)将1克丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA7525，丙交酯/乙交酯摩尔比75:25，分子量5万)溶于20毫升二氯甲烷溶液，磁力搅拌12小时，得到溶液A。
(2)向溶液A中加入20毫克Span 80，将0.75g碳酸氢铵溶于5ml水中加入溶液A，在12000rpm下均质5分钟，得到初乳液B。
(3)将0.2克Tween 60，2克聚乙烯醇(PVA 1788)溶于200毫升去离子水中得到溶液C，在300rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的初乳液B，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4小时，进行二氯甲烷溶剂的挥发。
(4)停止搅拌，经去离子水洗涤3次后，将微球浸没在0.2M的NaOH溶液中5min进行刻蚀，得到海绵状微球
(5)在4000rpm下离心10分钟收集硬化成型的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，得到可注射海绵状丙交酯-乙交酯共聚物微球，记为：PLGA-PMS。
实施例3：可注射海绵状聚己内酯微球的制备
(1)将1克聚己内酯(PCL，分子量5万)溶于20毫升二氯甲烷溶液，磁力搅拌12小时，得到溶液A。
(2)向溶液A中加入20毫克Span 80，将0.75g碳酸氢铵溶于5ml水中加入溶液A，在12000rpm下均质5分钟，得到初乳液B。
(3)将0.2克Tween 60，2克聚乙烯醇(PVA 1788)溶于200毫升去离子水中得到溶液C，在300rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的初乳液B，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4小时，进行二氯甲烷溶剂的挥发。
(4)停止搅拌，经去离子水洗涤3次后，将微球浸没在0.2M的NaOH溶液中5min进行刻蚀，得到海绵状微球
(5)在4000rpm下离心10分钟收集硬化成型的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，得到可注射海绵状聚己内酯微球，记为：PCL-PMS。
实施例4：聚多巴胺涂层修饰可注射海绵状聚酯微球的制备
(1)Tris缓冲液配置：在1000ml塑料容器中装入800ml去离子水，称量1.21g Tris加入其中，然后用1mol/L的盐酸调pH至8.5，加水至1000ml，密封，放到4℃冰箱中保存。
(2)多巴胺溶液配制：在250ml烧杯中加入100mL Tris缓冲液，加入0.2g多巴胺，200rpm搅拌5分钟。
(3)向(2)中多巴胺溶液中分别加入实施例1-3制备的可注射海绵状聚酯微球PLA-PMS，PLGA-PMS，PCL-PMS，在机械搅拌100rpm的条件下避光反应24h。
(4)停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集聚多巴胺涂层修饰的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，分别得到聚多巴胺涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，记为：PLA-PMS-PDA，PLGA-PMS-PDA，PCL-PMS-PDA。
实施例5：聚乙烯亚胺涂层修饰可注射海绵状聚酯微球的制备
(1)Tris缓冲液配置：在1000ml塑料容器中装入800ml去离子水，称量1.21g Tris加入其中，然后用1mol/L的盐酸调pH至8.5，加水至1000ml，密封，放到4℃冰箱中保存。
(2)聚乙烯亚胺涂层配制：在250ml烧杯中加入100mL Tris缓冲液(pH＝8.5)，加入2g聚乙烯亚胺，200rpm搅拌5分钟。
(3)向(2)中聚乙烯亚胺溶液中加入1.904g的NHS，1.148g的EDC和实施例1-3制备的可注射海绵状聚酯微球PLA-PMS，PLGA-PMS，PCL-PMS，在机械搅拌100rpm的条件下反应12h。
(4)停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集聚乙烯亚胺涂层修饰的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，分别得到聚乙烯亚胺涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，记为：PLA-PMS-P，PLGA-PMS-P，PCL-PMS-P。
实施例6：磷酸钙涂层修饰可注射海绵状聚酯微球的制备
(1)配置5倍模拟体液：具体操作为向恒温37℃的1000ml去离子水中，依次加入NaCl 11.994g，NaHCO3 0.525g，KCl 0.336g，K2HPO4·3H2O 0.342g，MgCl2·6H2O 0.458g，Na2SO4 0.107g和Tris 9.086g，用1mol/L盐酸调节溶液pH至6.5后加入CaCl2 0.417g，最后再用少量Tris将溶液pH调至7.0。
(2)向(1)中1.5倍模拟体液中分别加入实施例1-3制备的可注射海绵状聚酯微球PLA-PMS，PLGA-PMS，PCL-PMS，在恒温37℃，机械搅拌100rpm的条件下避光反应24h。
(3)停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集磷酸钙涂层修饰的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，分别得到磷酸钙涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，记为：PLA-PMS-Ca，PLGA-PMS-Ca，PCL-PMS-Ca。
实验例7：吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球外泌体吸附率测试
将实施例4-6制备的吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，各取30毫克，分别悬浮于10毫升的含1微克外泌体PBS中，置于4℃、60rpm的恒温水浴震荡摇床中，分别在第1、2、3、4、5、6、7、8小时，取上清，通过BCA试剂盒检测上清液中外泌体浓度，比较不同微球的外泌体吸附行为。以实施例4-6制备的吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球PLA-PMS-PDA和PLA-PMS-Ca为例，PLA-PMS-PDA在第四小时达到吸附峰值，吸附率为30％，PLA-PMS-Ca在第四小时达到吸附峰值，吸附率为40％。
实验例8：吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球外泌体释放测试
将实施例4-6制备的吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，各取30毫克，分别悬浮于10毫升的含1微克外泌体PBS中，置于4℃、60rpm的恒温水浴震荡摇床中吸附外泌体4小时后离心分离微球，重悬于10毫升PBS中，分别在第1、3、5、7、14、21、28天，取上清，通过BCA试剂盒检测上清液中外泌体浓度，比较不同微球的外泌体释放行为；以实施例4-6制备的吸附涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球PLA-PMS-PDA和PLA-PMS-Ca为例，PLA-PMS-PDA在初期表现出明显爆发释放，在第14天已检测不到外泌体释放；而PLA-PMS-Ca释放曲线平稳，可持续缓释至28天。
由于外泌体与不同涂层之间的亲和力不同，且不同涂层所提供的比表面积也不同，就实验例8而言，磷酸钙涂层比多巴胺涂层拥有更大的比表面积，吸附外泌体更多，且磷酸钙涂层与外泌体结合更紧密，能达到更长时间的缓释；附图3和附图4说明的就是PLA-PMS-Ca释放曲线平稳，可持续缓释至28天。
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统，其特征在于：包括海绵状聚酯微球、吸附涂层和外泌体，所述海绵状聚酯微球作为可注射基体，吸附涂层作为外泌体吸附锚点；
所述外泌体来源为人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞中的一种或多种；
所述外泌体能在一个月内持续释放，外泌体释放行为受吸附涂层调控；
所述海绵状聚酯微球为：可注射海绵状聚乳酸微球，可注射海绵状丙交酯-乙交酯共聚物微球，可注射海绵状聚己内酯微球；
所述吸附涂层为磷酸钙涂层；所述磷酸钙涂层是通过生物矿化的方法沉积到可注射海绵状聚酯微球表面上；配制1倍-10倍浓度的标准ISO 23317-2007模拟体液，将海绵状聚酯微球悬浮于其中，在37℃反应3h-7天后，去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到磷酸钙涂层的海绵状聚酯微球。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，其特征在于有以下步骤：
(1)制备可注射海绵状聚酯微球；
(2)对步骤(1)中所得可注射海绵状聚酯微球进行吸附涂层修饰；
(3)分离细胞外泌体，将外泌体分散于缓冲液中，取步骤(2)中所得吸附涂层修饰后的可注射海绵状聚酯微球，置于含外泌体的缓冲液中，在避光、4摄氏度的摇床中20-100rpm孵育1-24小时；
(4)通过吸附涂层已经将外泌体吸附在可注射海绵状聚酯微球的表面，形成了可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释体；
其中，磷酸钙涂层修饰可注射海绵状聚酯微球的制备：
1)配制1.5倍模拟体液：具体操作为：向恒温37℃的1000ml去离子水中，依次加入NaCl11.994g，NaHCO3 0.525g，KCl 0.336g，K2HPO4·3H2O 0.342g，MgCl2·6H2O 0.458g，Na2SO4 0.107g和Tris 9.086g，用1mol/L盐酸调节溶液pH至6.5后加入CaCl2 0.417g，最后再用少量Tris将溶液pH调至7.0；
2)向步骤1)中1.5倍模拟体液中分别加入可注射海绵状聚乳酸微球PLA-PMS，可注射海绵状丙交酯-乙交酯共聚物微球PLGA-PMS，可注射海绵状聚己内酯微球PCL-PMS，在恒温37℃，机械搅拌100rpm的条件下避光反应24h；
3)停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集磷酸钙涂层修饰的微球，水洗三遍，冷冻干燥24小时，分别得到磷酸钙涂层修饰的可注射海绵状聚酯微球，记为：PLA-PMS-Ca，PLGA-PMS-Ca，PCL-PMS-Ca。
3.根据权利要求2所述的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，其特征在于：所述可注射海绵状聚酯微球的制备步骤为：
(1)溶液配制：将聚乙烯醇，表面活性剂Tween 60和去离子水混合配制得到外水相W；将表面活性剂Span80、生物可降解脂肪族聚酯溶于二氯甲烷中得到油相O；
(2)乳液形成：将致孔剂加入油相O中，2000-20000rpm均质5分钟，形成初乳液E；将初乳液E加入外水相W中，得到E/W复乳液；
(3)形成多孔结构：将所得E/W复乳液300rpm机械搅拌1-4小时，去除致孔剂，形成多孔聚酯微球；
(4)表面刻蚀：将步骤(3)中多孔聚酯微球加入碱溶液中，100rpm搅拌1-30分钟，形成海绵状聚酯微球；
(5)收集冻干：停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集海绵状聚酯微球，经去离子水洗涤5次后，冷冻干燥24-48小时；
所述步骤(1)中用到的生物可降解脂肪族聚酯，是聚乳酸、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己内酯中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，其特征在于：生物可降解脂肪族聚酯溶液浓度为2.5-20wt％，每毫升聚合物溶液添加0.5-5毫克Span 80，每毫升去离子水中添加2-20毫克聚乙烯醇和0.5-5毫克Tween60。
5.根据权利要求3所述的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中致孔剂为碳酸氢铵、盐颗粒、明胶的任一种，E/W复乳液由乳液搅拌，微流控方法制得。
6.根据权利要求3所述的一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中碱溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液，氨水的一种，碱溶液浓度为0.1-1mol/L。
CN202110544725.7A 2021-05-19 2021-05-19 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法 Active CN113244196B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110544725.7A CN113244196B (zh) 2021-05-19 2021-05-19 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110544725.7A CN113244196B (zh) 2021-05-19 2021-05-19 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113244196A CN113244196A (zh) 2021-08-13
CN113244196B true CN113244196B (zh) 2022-11-25

Family

ID=77182800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110544725.7A Active CN113244196B (zh) 2021-05-19 2021-05-19 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113244196B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115970001B (zh) * 2023-01-10 2023-08-22 北京大学口腔医学院 多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料的应用
CN115957378A (zh) * 2023-02-08 2023-04-14 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种骨修复组合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113244196A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113244196B (zh) 一种基于表面吸附的可注射海绵状聚酯微球外泌体缓释系统及其制备方法
Deplaine et al. Biomimetic hydroxyapatite coating on pore walls improves osteointegration of poly (L‐lactic acid) scaffolds
Chu et al. Biomaterials fabrication and processing handbook
US7621963B2 (en) Composite bone graft material
Hokugo et al. Controlled release of platelet growth factors enhances bone regeneration at rabbit calvaria
Leeuwenburgh et al. Mineralization, biodegradation, and drug release behavior of gelatin/apatite composite microspheres for bone regeneration
CN108283729B (zh) 具有可控镁离子释放行为的可注射骨修复材料及其制备方法
Abalymov et al. Alkaline phosphatase delivery system based on calcium carbonate carriers for acceleration of ossification
Schlaubitz et al. Pullulan/dextran/nHA macroporous composite beads for bone repair in a femoral condyle defect in rats
US20030071380A1 (en) Method of preparing microsphere composite of collagen and bioceramic powder
US20230285305A1 (en) Delivery devices and methods for making the same
CA3028338C (en) Microencapsulation of bacteriophages and related products
Tuukkanen et al. Hydroxyapatite as a nanomaterial for advanced tissue engineering and drug therapy
Félix Lanao et al. RANKL delivery from calcium phosphate containing PLGA microspheres
Yao et al. Hollow hydroxyapatite microspheres/chitosan composite as a sustained delivery vehicle for rhBMP-2 in the treatment of bone defects
Hasan et al. Preparation and evaluation of BCP‐CSD‐agarose composite microsphere for bone tissue engineering
Sivakumar et al. Preparation, characterization, and in vitro release of gentamicin from coralline hydroxyapatite‐alginate composite microspheres
Wan et al. Investigating a new drug delivery nano composite membrane system based on PVA/PCL and PVA/HA (PEG) for the controlled release of biopharmaceuticals for bone infections
Cheng et al. Strontium ion-functionalized nano-hydroxyapatite/chitosan composite microspheres promote osteogenesis and angiogenesis for bone regeneration
CN108339152B (zh) 一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架及其制备方法
Raja et al. Multifunctional calcium-deficient hydroxyl apatite–alginate core–shell-structured bone substitutes as cell and drug delivery vehicles for bone tissue regeneration
JPH09208457A (ja) 生体内可溶性複合体粒子
Olthof et al. Effect of biomaterial electrical charge on bone morphogenetic protein-2-induced in vivo bone formation
JP5280432B2 (ja) 比重の増加した細胞培養用支持体及びその製造方法
Vargas-Osorio et al. Three-dimensional hybrid mesoporous scaffolds for simvastatin sustained delivery with in vitro cell compatibility

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant