CN113230301A - 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法 - Google Patents

自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113230301A
CN113230301A CN202110472823.4A CN202110472823A CN113230301A CN 113230301 A CN113230301 A CN 113230301A CN 202110472823 A CN202110472823 A CN 202110472823A CN 113230301 A CN113230301 A CN 113230301A
Authority
CN
China
Prior art keywords
temperature
leaves
low
eucommia ulmoides
eucommia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110472823.4A
Other languages
English (en)
Inventor
赵艳
潘龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202110472823.4A priority Critical patent/CN113230301A/zh
Publication of CN113230301A publication Critical patent/CN113230301A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/46—Eucommiaceae (Eucommia family), e.g. hardy rubber tree
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/17—Preparation or pretreatment of starting material involving drying, e.g. sun-drying or wilting

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，包括以下步骤：1)低温干燥：在真空冷冻条件下，利用第一温度T1干燥新鲜叶片，得到干燥无水叶片；2)低温断丝：将干燥无水叶片剪成片状后，在第二温度T2下冷冻进行断丝处理；3)低温粉碎：将断丝后的叶片在第三温度T3下粉碎得到褐绿色的杜仲叶粉末；所述第三温度T3<10℃，所述第三温度T3>第二温度T2>第一温度T1。本发明通过三个阶段的低温，确保了叶片中有效成分的维持。

Description

自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法
技术领域
本发明涉及植物提取前预处理技术领域，尤其涉及自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法。
背景技术
杜仲叶是杜仲科杜仲属植物杜仲的叶片。杜仲传统以树皮入药，是中国自古以来的名贵滋补药材，补肝肾，强筋骨。用于治疗肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软等病症。现代药理研究表明，杜仲中含有的有效成分对免疫系统、内分泌系统、中枢神经系统、循环系统和泌尿系统均有不同程度的调节作用，还能兴奋垂体-肾上腺皮质系统，增加肾上腺皮质功能。
传统的杜仲取材方式大多是采用树皮环剥再生技术。杜仲从开始种植到取皮一般需10年左右，即使采用环剥再生技术也需4-5年的生长时间，周期较长，导致杜仲皮供不应求，极大的影响了杜仲及其产品的产量。且这种仅以树皮入药的方式利用率较低，造成了杜仲资源的大量浪费。现代研究表明，杜仲叶与杜仲皮所含有效成分基本相同，包括木质素类、黄酮类、环烯醚萜类等六七十种化合物。且相比于杜仲皮，杜仲叶的资源更加丰富且易于再生，并于2005年作为一种新药收入《中国药典》，是极具开发价值的新型药材。因此，若能以杜仲叶代替杜仲树皮入药，不仅能够提高杜仲的药材利用率，减小药材的浪费，更有利于提高杜仲产品的产量，扩大杜仲的经济效益。
陕西是杜仲的优势产地之一，杜仲也是首批列入陕西省道地药材目录的重点中药材，故本专利选择十月份采摘的陕南杜仲叶为研究目标，以松脂醇二葡萄糖苷为模型成分，探索陕南杜仲叶的预处理方法。
现有技术中杜仲叶前期的处理方法，主要存在以下问题：
首先，在干燥工艺上。常用的干燥方法多为晒干、烘干等，均在0℃以上或更高的温度下进行。一方面，温度的升高易导致易挥发成分的损失、部分热敏性成分的变性或活性成分的破坏，加速部分活性基团的氧化，从而造成药效损失；另一方面，干燥所得的叶片一般体积缩小、质地变硬，三维结构易被破坏，失去气孔等形貌特征。同时，干燥后的叶片水溶性降低，与干燥之前相比，在性状上存在很大差异，不利于有效成分的提取。
其次，在粉碎工艺上。常用的粉碎方法主要有两种，一种是机械粉碎，另一种是手工剪碎。机械粉碎过程中常由于机器运行导致部件发热，从而使温度升高，造成药效损失；而手工剪碎粒径较大，易导致提取效率的降低。中药材中有效成分的提取过程是典型的固-液传质过程，根据固-液扩散公式(1)可知，提取率与原料的表面积成正比，与原料粒径成反比。因此，手工剪碎的方式不利于制备粒径小的中药材原料，易导致提取率的降低。
Figure BDA0003046154230000021
式中，W为提取率(％)，T为绝对温度，S为原料表面积，r为原料粒径，Kc为常数，η为溶剂粘度，Cn为原料内溶质浓度，Cw为原料外溶质浓度，t为提取时间。
最后，现有技术中，整个处理工艺至少有一部分是高温处理，高温不仅会造成药效损失，且会使叶片部分变形。例如高温断丝易使剪切后的叶片中活性成分更易损失，三维结构遭到破坏等，影响后期的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，通过在低温环境下进行一系列的处理，为后期的提取、测定等奠定基础。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术手段予以实现。
自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，包括以下步骤：
1)低温干燥：在真空冷冻条件下，利用第一温度T1干燥新鲜叶片，得到干燥无水叶片；
2)低温断丝：将干燥无水叶片剪成片状后，在第二温度T2下冷冻进行断丝处理；
3)低温粉碎：将断丝后的叶片在第三温度T3下粉碎得到褐绿色的杜仲叶粉末；
所述第三温度T3<10℃，所述第三温度T3>第二温度T2>第一温度T1。
本技术方案中，整个过程的最低温度是10℃，通过控制处理温度，确保整个前处理过程在低温环境下进行，以最大程度保留有效成分的含量，降低药效损失。具体地，低温预处理环境有利于降低活性基团的氧化速度，避免有效成分的破坏，最大程度的保留药效。
本技术方案中，采取真空冷冻干燥的方式干燥叶片。具体地，先将清洗后的含水叶片冷冻，后置于真空冷冻干燥机的干燥盘中，在压力为10Pa、温度为-60℃至-80℃的负压环境下干燥48h以上。负压、低温的环境能够使水直接从固态升华为气态。该步骤有以下几个优势：1)干燥过程在-60℃至-80℃下进行，冻结的状态抑制了微生物的生长和酶的作用，有利于叶片原始性状、形貌和体积的保持。相比于热烘干的叶片，真空冻干的叶片明显更加疏松；2)干燥是叶片预处理的第一步，极低的干燥温度从根源上保证了有效成分的保留，降低了活性成分的氧化速度；3)真空冷冻干燥能够排除95％-99％以上的水分，保证干燥后的叶片可以长期保存而不变质。同时，干燥后的叶片具有良好的水溶性，加水后性状极易恢复，有利于提高叶片的利用率。
本技术方案中，采用杜仲叶片作为原料，相比于杜仲树皮，杜仲叶采摘难度低，资源更加丰富且易于再生，对植物的损伤小。同时配合低温的处理，能够使得叶片中的有效成分得到最大限度的保留。本技术方案中，实际操作中，干燥的目的是去除水分，故温度最低。而断丝的目的是切断断面叶片间的杜仲胶，利于后续粉碎，故温度高于干燥温度，以减少能源浪费。而最后粉碎的目的使为了将片状的干燥杜仲叶片粉碎为粒径更小的颗粒状，故温度低于室温即可。本专利中采用4℃进行粉碎处理，其温度高于断丝温度，也是为了进一步减小预处理过程中的能源浪费。
作为本发明的进一步改进，所述低温干燥步骤之前，还包括杜仲叶的筛选清洗步骤，具体为：筛选表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片，经冲洗后冷冻保存待用。
本技术方案中，带虫孔、干枯以及表面有杂质的叶片，一方面含有过多的杂质，易干扰松脂醇二葡萄糖苷的提取和鉴定；另一方面，这类叶片含有的微生物较多，会使叶片中部分成分的含量明显变化。故前期选择表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片，冲洗去除表面的杂物。冷冻保存是为了保证储存过程中叶片的性状不发生变化。
作为本发明的进一步改进，所述低温干燥步骤中，所述第一温度T1具体为-60℃至-80℃，所述低温干燥的时间为48-52h。
本技术方案中，采用-60℃至-80℃进行真空冷冻干燥，能够使叶片中的水分升华，同时不影响叶片的性状及有效成分，具体地，10Pa、温度为-60℃至-80℃的负压环境有利于水分的升华。
对于干燥时间，若时间太短，无法实现叶片中水分的有效升华，导致部分叶片无法完全干燥；若干燥时间太长，则会造成能源的浪费。故选择48-52h作为干燥时间。
作为本发明的进一步改进，所述低温干燥步骤中，具体为将新鲜的绿色叶片低温干燥后，得到褐色、无水分的干燥叶片。
本技术方案中，首先，由于采用低温干燥技术，故相比于其它方式，叶片厚度没有变化，冻干的叶片三维结构不发生改变，不会像烘干的叶片那样变成扁平状。
作为本发明的进一步改进，所述低温断丝步骤具体为：将干燥无水叶片，采用剪切工艺，剪成面积为干燥叶片面积五分之一至十分之一的断面叶片，所述断面叶片低温冷冻并进行断丝处理。
本技术方案中，由于叶片大小不一，若剪的过小，则增加了剪切的难度，提高了人工操作的复杂性；若剪的过大，会增加冷冻断丝所需的时间，降低预处理效率。
作为本发明的进一步改进，所述断面叶片的面积为2-3cm2。
作为本发明的进一步改进，所述低温断丝步骤中，所述低温冷冻温度为在-20℃至-10℃，冷冻时间0.5-1.5h。
本技术方案中，首先采用-10℃的温度进行预冷冻，即将干燥的叶片再次冷冻，使其表面硬化，更易于剪切。
进一步地，杜仲断丝的目的是为了粉碎，杜仲胶存在时会使其在粉碎过程中变成絮状，无法进一步粉碎为颗粒状。杜仲胶本质是一种天然橡胶，常温时为硬质固体，55℃下软化，60℃为熔点。且杜仲胶内有2种晶体共存，一种晶体的熔点在65℃，另一种在55℃。低温冷冻能够使杜仲胶硬化，发生脆性断裂。故本技术方案的冷冻环境，能够促使杜仲胶发生脆性断裂，便于打粉。
作为本发明的进一步改进，所述低温粉碎步骤具体为：断丝后的叶片，经细胞级超微粉碎工艺粉碎，得到颗粒粒径平均值为9.7μm，中位数为8.7μm的杜仲叶粉末，避光保存。
本技术方案中，由公式(1)可知，原料粒径越小，比表面积越大，提取率越高。采用本技术方案中的预处理技术，能够得到微米级的粉末，有利于提高有效成分的提取率。
作为本发明的进一步改进，所述第三温度T3具体为2℃-6℃，粉碎时间为50-70min。
本技术方案中，在10℃以下的环境中进行粉碎。用于中药材粉碎的研磨仪器通常不具有控温功能，仪器使用时通常伴随着自发热现象，且时间越久温度越高，易造成有效成分的损失。而2℃-6℃的低温环境则有利于有效成分的保留。
作为本发明的进一步改进，所述第三温度T3具体为4℃，粉碎时间为60min。
本技术方案中，具体为4℃，60min，以实现断面叶片的高效率粉碎，同等成本下提高效率。
附图说明
图1为本发明提供的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法的流程示意图。
图2为本发明提供的杜仲叶粉末的扫描电子显微镜(SEM)图。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
本发明的技术方案包括以下步骤：
参照附图1-2所示，本实施例中，自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，包括以下步骤：
1)低温干燥：在真空冷冻条件下，利用第一温度T1干燥新鲜叶片，得到干燥无水叶片；
2)低温断丝：将干燥无水叶片剪成片状后，在第二温度T2下冷冻进行断丝处理；
3)低温粉碎：将断丝后的叶片在第三温度T3下粉碎得到褐绿色的杜仲叶粉末；
所述第三温度T3<10℃，所述第三温度T3>第二温度T2>第一温度T1。
本实施例中，整个过程中，最高温度是10℃。
通过控制处理温度，确保整个过程在低温环境下进行，最大程度保留有效成分含量，降低药效损失。具体地，低温预处理环境有利于降低活性基团的氧化速度，避免有效成分的破坏，最大程度保留药效。
本实施例中，采取真空冷冻干燥的方式干燥叶片。具体地，先将清洗后的含水叶片冷冻，后置于真空冷冻干燥机的干燥盘中，在压力为10Pa、温度为-60℃至-80℃的负压环境下干燥48h以上。负压、低温的环境能够使水直接从固态升华为气态。该步骤有以下几个优势：1)干燥过程在-60℃至-80℃下进行，冻结的状态抑制了微生物的生长和酶的作用，有利于叶片原始性状、形貌和体积的保持，相比于热烘干的叶片，真空冻干的叶片明显更加疏松；2)干燥是叶片预处理的第一步，极低的干燥温度从根源上保证了有效成分的保留，降低了活性成分的氧化速度；3)真空冷冻干燥能够排除95％-99％以上的水分，保证干燥后的叶片可以长期保存而不变质。同时，干燥后的叶片具有良好的水溶性，加水后性状极易恢复，有利于提高叶片的利用率。
本实施例中，采用杜仲叶作为原料，相比于杜仲皮，杜仲叶采摘难度低，资源更加丰富且易于再生，对植物的损伤小。同时配合低温的处理，能够使得叶片中的有效成分得到最大限度的保留。
本实施例中，实际操作中，干燥的目的是去除水分，故温度最低。而断丝的目的是切断断面叶片间的杜仲胶，利于后续粉碎，故温度高于干燥温度，以减少能源浪费。而粉碎的目的是为了将片状的干燥杜仲叶片粉碎为粒径更小的颗粒状，故温度低于室温即可。本发明中采用4℃进行粉碎处理，其温度高于断丝温度，也是为了进一步减小预处理过程中的能源浪费。
本实施例中详细步骤如下：
第一步，杜仲叶的筛选清洗步骤，具体为：筛选表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片，经冲洗后冷冻保存待用。
本实施例中，带虫孔、干枯以及表面有杂质的叶片，一方面含有过多的杂质，易干扰松脂醇二葡萄糖苷的提取和鉴定；另一方面，这类叶片含有的微生物较多，会使叶片中部分成分的含量明显变化。故前期选择表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片，冲洗去除表面的杂物。冷冻保存是为了保证储存过程中叶片的性状不发生变化。
第二步，低温干燥步骤，具体为在第一温度T1(即-60℃至-80℃)条件下，低温干燥48-52h。
本实施例中，采用-60℃至-80℃进行真空冷冻干燥，能够使叶片中的水分升华，同时不影响叶片的性状及有效成分，具体地，10Pa、温度为-60℃至-80℃的负压环境有利于水分的升华。
对于干燥时间，若时间太短，无法实现叶片中水分的有效升华，导致部分叶片无法完全干燥；若干燥时间太长，则会造成能源的浪费。故选择48-52h作为干燥时间。
进一步地，所述低温干燥步骤中，具体为将新鲜的绿色叶片低温干燥后，得到褐色、无水分的干燥叶片。
本实施例中，由于采用低温干燥技术，故相比于其它方式，叶片厚度没有变化，冻干的叶片三维结构不发生改变，不会像烘干的叶片那样变成扁平状。
第三步，低温断丝，具体为：将干燥无水叶片，采用剪切工艺，剪成面积为干燥叶片面积五分之一至十分之一的断面叶片；将剪切后的断面叶片低温冷冻，进行断丝处理。
本实施例中，由于叶片大小不一，若剪的过小，则增加了剪切的难度，提高了人工操作的复杂性；若剪的过大，会增加冷冻断丝所需的时间，降低预处理效率。
进一步地，所述断面叶片的面积为2-3cm2。
第四步，低温断丝，具体地，低温冷冻温度为在-20℃至-10℃，冷冻时间0.5-1.5h。
本实施例中，首先采用-10℃的温度进行预冷冻，即将干燥的叶片再次冷冻，使其表面硬化，更易于剪切。
进一步地，所述低温粉碎具体为：断丝后的叶片，经细胞级超微粉碎工艺粉碎，得到颗粒粒径的平均值为9.7μm，中位数为8.7μm的杜仲叶粉末后，避光保存。
进一步地，杜仲断丝的目的是为了粉碎，杜仲胶存在时会使其在粉碎过程中变成絮状，无法进一步粉碎为颗粒状。杜仲胶本质是一种天然橡胶，常温时为硬质固体，55℃下软化，60℃为熔点。且杜仲胶内有2种晶体共存，一种晶体的熔点在65℃，另一种在55℃。低温冷冻能够使杜仲胶硬化，发生脆性断裂。故本技术方案的冷冻环境，能够促使杜仲胶发生脆性断裂，便于打粉。
本实施例中，由公式(1)可知，原料粒径越小，比表面积越大，提取率越高。采用本技术方案中的预处理技术，能够得到微米级的粉末，有利于提高有效成分的提取率。
第五步，低温粉碎，具体为在第三温度T3具体为2℃-6℃条件下，粉碎50-70min。
本实施例中，在10℃以下的环境中进行粉碎。用于中药材粉碎的研磨仪器通常不具有控温功能，仪器使用时通常伴随着自发热现象，且时间越久温度越高，易造成有效成分的损失。而2℃-6℃的低温环境则有利于有效成分的保留。
具体地，低温粉碎为：断丝后的叶片，经细胞级超微粉碎工艺粉碎，得到颗粒粒径平均值为9.7μm，中位数为8.7μm的杜仲叶粉末，避光保存。
进一步地，所述第三温度T3具体为4℃，粉碎时间为60min。
本实施例中，具体为4℃，60min，以实现断面叶片的高效率粉碎，同等成本下提高效率。
本实施例中，低温干燥时候温度最低，具体地，低温干燥的目的是去除叶片中的水分，是预处理的第一步。整个过程中，此时的处理温度最低，进而从根源上保证了有效成分的保留，避免了活性物质的丢失，使得叶片得以充分利用。
本实施例中，采用杜仲叶作为原料，相比于杜仲皮，杜仲叶更易获取，对植物的损伤小，同时配合低温处理，能够使得叶片中的有效成分得到最大限度的保留。
实施例1
本实施例中，以具体处理方案为主进行介绍。
首先，杜仲叶的预处理：
(1)杜仲叶采自陕西省西安澜泰药业有限公司院内，采摘月份为10月份，选择表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片用自来水冲洗干净，冷冻保存。
(2)使用小型真空冷冻干燥机(LGJ-18NS)将洗净的叶片在-80℃、真空条件下干燥48h，得到干燥、无水的叶片。
(3)将叶片剪碎(粒度约为2～3cm2)，在-15℃冷冻1h进行断丝处理。
(4)将断丝后的叶片放入带控温的振动式细胞级超微粉碎机中，在4℃下低温粉碎1h，得褐绿色粉末，置于棕色玻璃瓶内避光保存。
其次，杜仲叶的提取：
以上述得到的褐绿色粉末作为样品，提取其中的松酯醇二葡萄糖苷，具体操作如下：
(1)称取10.0036g杜仲叶粉末，加入质量分数为65％的乙醇溶液，料液比为15mL:1g，调节提取液pH至7.4，置于超声波清洗机中，设置温度为70℃，提取时间为1.5h，趁热抽滤除去药渣。
(2)向药渣中加入质量分数为65％的乙醇溶液，料液比为15mL:1g，调节提取液pH至9.1，置于超声波清洗机中，设置温度为70℃，提取时间为1.0h，趁热抽滤除去药渣。
(3)合并两次滤液，减压浓缩至30mL，离心10min，离心速度为8000r/min，收集上清液。
(4)旋蒸浓缩上清液至25mL，加入过量的95％乙醇，在室温下搅拌30min，后静置1h。采用铺设孔径为0.22μm的有机系滤膜的G4玻璃砂芯漏斗减压抽滤，除去黑色不溶沉淀。
(5)将滤液减压旋蒸至近干，加入5mL去离子水，重复步骤(4)，至无不溶物出现。本实验共重复3次。
(6)将提取液减压旋蒸至25mL，转移至分液漏斗中，加入75mL的氯仿，摇匀，静置12h后，除去下层萃取液。
(7)重复步骤(6)三次，将萃取后的提取液减压旋蒸至干，加入10mL甲醇，用0.45μm有机系滤膜过滤，滤液置于4℃下低温保存。
(8)将(7)所得提取液稀释10倍制得杜仲叶提取物样品a，进行高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱。
最后，杜仲叶中有效成分的测定：
(1)色谱柱：Shimadzu(岛津)228-34937-92，C18，4.6*250mm。流动相：甲醇—水梯度洗脱，进样体积10μL，柱温25℃，流动相流速为1mL/min，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为277nm。
(2)流动相梯度洗脱
Figure BDA0003046154230000111
(3)精密称取4.0mg PDG标准品(成都瑞芬思生物科技有限公司)至40mL玻璃样品瓶中，加入6mL去离子水溶解，得到终浓度为0.67mg/mL的PDG标准品。
(4)取溶液(3)1mL至40mL玻璃样品瓶中，加入19mL去离子水稀释，得到终浓度为0.03mg/mL的PDG标准对照溶液b。
(5)利用杜仲叶提取物样品a制得杜仲叶提取液，向制得的杜仲叶提取液中加入一定量的PDG标准品，加入适量甲醇，使提取液的终浓度为提取液浓度的0.1倍，PDG终浓度为0.03mg/mL，制得加标杜仲叶提取物溶液c，进行HPLC梯度洗脱。
(6)计算方法：
杜仲叶提取物样品a中PDG浓度＝PDG标准对照溶液b中PDG浓度×杜仲叶提取物样品a中PDG峰面积/PDG标准对照溶液b中PDG峰面积
加标杜仲叶提取物样品c中PDG浓度＝PDG标准对照溶液b中PDG浓度×加标杜仲叶提取物样品c中PDG峰面积/PDG标准对照溶液b中PDG峰面积
杜仲叶提取物中平均PDG浓度＝(杜仲叶提取物样品a中PDG含量+加标杜仲叶提取物样品c中PDG含量-PDG标准对照溶液b中PDG含量)/2
(7)含量检测结果
Figure BDA0003046154230000121
计算得杜仲叶提取物PDG平均含量为0.015mg/mL。
(8)准确称取10.0017g杜仲叶粉末置于烧杯中，准确加入3mL浓度为0.67mg/mL的PDG标准品溶液，按照提取方法一的步骤提取杜仲叶中的PDG，并按照测定方法一的步骤测定含量，计算得到本方法的加标回收率约为89.70％，计算可知杜仲叶中PDG含量约为0.17mg/g。
实施例2
采用实施例1中的杜仲叶粉末作为样品，继续进行提取和鉴定。
杜仲叶有效成分的提取：
(1)称取10.0036g杜仲叶粉末，加入质量分数为65％的乙醇溶液，料液比为15mL:1g，调节提取液pH至7.4，置于超声波清洗机中，设置温度为70℃，提取时间为1.5h，趁热抽滤除去药渣。
(2)向药渣中加入质量分数为65％的乙醇溶液，料液比为15mL:1g，调节提取液pH至9.1，置于超声波清洗机中，设置温度为70℃，提取时间为1.0h，趁热抽滤除去药渣。
(3)合并两次滤液，减压浓缩至30mL，离心10min，离心速度为8000r/min，收集上清液。
(4)旋蒸浓缩上清液至25mL，加入过量的95％乙醇，在室温下搅拌30min，后静置1h。采用铺设孔径为0.22μm的有机系滤膜的G4玻璃砂芯漏斗减压抽滤，除去黑色不溶沉淀。
(5)将滤液减压旋蒸至近干，加入5mL去离子水，重复步骤(4)，至无不溶物出现。本实验共重复3次。
(6)将提取液减压旋蒸至25mL，转移至分液漏斗中，加入75mL的氯仿，摇匀，静置12h后，除去下层萃取液。
(7)重复步骤(6)三次，将萃取后的提取液减压旋蒸至干，加入10mL甲醇，用0.45μm有机系滤膜过滤，滤液置于4℃下低温保存。
(8)将(7)所得提取液稀释10倍制得杜仲叶提取物样品a，进行HPLC梯度洗脱。
杜仲叶有效成分鉴定：
(1)根据PDG的特性，选择用弱极性的大孔吸附树脂AB-8进行分离。将AB-8大孔吸附树脂置于烧杯中，加入无水乙醇浸泡24h。
(2)将浸泡好的AB-8大孔吸附树脂采用湿法加到层析柱中，至层析柱高度2/3处，使用加压泵将树脂层压实，排除气泡。从层析柱上方注入去离子水反复淋洗，直至洗出液无乙醇味道。
(3)量取7mL杜仲叶提取物样品加入层析柱中，使液面与树脂层齐平，静置6h。
(4)样品洗脱。
①使用水-乙醇梯度洗脱，分别配置乙醇体积为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的洗脱液，每个溶液体积为20mL，按照乙醇浓度从低到高的洗脱顺序依次进行梯度洗脱。
②使用石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯体积比为1：1，每30mL等量收集样品。
③使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，分别配置乙酸乙酯体积为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的洗脱液，每个溶液体积为20mL，按照乙酸乙酯浓度从低到高的洗脱顺序依次进行梯度洗脱。
(5)采用薄层色谱检测洗脱液中PDG的含量。采用25×100mm的硅胶板，选择三氯甲烷-正丁醇-水-乙酸(1：7：1：1)作为展开剂，对洗脱液进行薄层色谱分离。
本实施例采样大孔吸附树脂洗脱。
本发明中，整个预处理都是在低温条件下进行的，有效成分的损失比较小，尤其是相比于高温干燥、断丝等工艺，不仅保留了更多的有效成分，而且整个工艺较为简单，易于操作，为后期的提取、鉴定奠定了基础。同时，所采用的原料为陕南杜仲叶，不仅提高了杜仲药材的利用率，减小了杜仲的资源浪费，且相比于杜仲皮环剥技术，采用杜仲叶为原料降低了杜仲的采样成本，具有更高的经济效益。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)低温干燥：在真空冷冻条件下，利用第一温度T1干燥新鲜叶片，得到干燥无水叶片；
2)低温断丝：将干燥无水叶片剪成片状后，在第二温度T2下冷冻进行断丝处理；
3)低温粉碎：将断丝后的叶片在第三温度T3下粉碎得到褐绿色的杜仲叶粉末；
所述第三温度T3<10℃，所述第三温度T3>第二温度T2>第一温度T1。
2.根据权利要求1所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温干燥步骤之前，还包括杜仲叶的筛选清洗步骤，具体为：筛选表面干净、无虫孔、无干枯的新鲜叶片，经冲洗后冷冻保存待用。
3.根据权利要求1所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温干燥步骤中，所述第一温度T1具体为-60℃至-80℃，所述低温干燥的时间为48-52h。
4.根据权利要求3所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温干燥步骤中，具体为将新鲜的绿色叶片低温干燥后，得到褐色、无水分的干燥叶片。
5.根据权利要求1所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温断丝步骤具体为：将干燥无水叶片，采用剪切工艺，剪成面积为干燥叶片面积五分之一至十分之一的断面叶片，将所述断面叶片低温冷冻并进行断丝处理。
6.根据权利要求5所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述断面叶片的面积为2-3cm2。
7.根据权利要求6所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温断丝步骤中，所述低温冷冻温度为-20℃至-10℃，冷冻时间0.5-1.5h。
8.根据权利要求1所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述低温粉碎步骤具体为：断丝后的叶片，经细胞级超微粉碎工艺粉碎，得到颗粒粒径平均值为9.7μm，中位数为8.7μm的杜仲叶粉末，避光保存。
9.根据权利要求1所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述第三温度T3具体为2℃-6℃，粉碎时间为50-70min。
10.根据权利要求9所述的自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法，其特征在于，所述第三温度T3具体为4℃，粉碎时间为60min。
CN202110472823.4A 2021-04-29 2021-04-29 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法 Pending CN113230301A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110472823.4A CN113230301A (zh) 2021-04-29 2021-04-29 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110472823.4A CN113230301A (zh) 2021-04-29 2021-04-29 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113230301A true CN113230301A (zh) 2021-08-10

Family

ID=77131477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110472823.4A Pending CN113230301A (zh) 2021-04-29 2021-04-29 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113230301A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113413426A (zh) * 2021-05-10 2021-09-21 赵君朋 一种针对消毒剂用带有疏水绒毛的败酱草预处理装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104147083A (zh) * 2014-08-25 2014-11-19 济南康众医药科技开发有限公司 冻干技术在杜仲叶干燥中的应用
CN104288207A (zh) * 2014-10-14 2015-01-21 南江县百草中药材有限公司 一种杜仲饮片的炮制方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104147083A (zh) * 2014-08-25 2014-11-19 济南康众医药科技开发有限公司 冻干技术在杜仲叶干燥中的应用
CN104288207A (zh) * 2014-10-14 2015-01-21 南江县百草中药材有限公司 一种杜仲饮片的炮制方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郑艳萍，等: "不同干燥方式对杜仲叶4 种活性成分含量的影响" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113413426A (zh) * 2021-05-10 2021-09-21 赵君朋 一种针对消毒剂用带有疏水绒毛的败酱草预处理装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111494449B (zh) 一种金银花真空冷冻干燥工艺
CN105273094B (zh) 一种川芎多糖快速分离的方法
CN102716348B (zh) 真空冷冻干燥制备超细天麻粉的方法
CN101461852A (zh) 一种玫瑰花超细粉体的制备方法
CN113230301A (zh) 自杜仲叶提取松脂醇二葡萄糖苷的杜仲叶预处理方法
CN111333691B (zh) 一种罗汉果甜苷ⅴ的制备方法
CN102080108A (zh) 用真空酶解技术提取虎杖中大黄素、虎杖甙及白藜芦醇的方法
CN109966327A (zh) 一种超声波、微波双辅助提取西番莲种籽油粕总黄酮的方法
CN102499464A (zh) 一种烟灰棒在造纸法再造烟叶中的应用方法
CN1256318C (zh) 一种利用菊苣制备菊苣酸的工艺
CN115463181B (zh) 一种沉香叶提取物的制备方法
CN105037747A (zh) 一种厨余垃圾发酵产物中黄腐酸的提取方法
CN112826852B (zh) 一种高含量黄连粉的制备方法
CN108743653A (zh) 一种甘草皂苷制备方法
CN114468285A (zh) 一种桑黄菌丝体冻干粉加工工艺
CN106728408A (zh) 一种采用微切助互作方式提高金花茶提取物黄酮溶出度的方法
CN104761426B (zh) 从烟草花蕾中提取游离氨基酸的方法
CN107156272A (zh) 一种枸杞烘干粉碎的方法
CN113321749A (zh) 一种高纯度香菇多糖的快速提取方法
CN1391911A (zh) 一种用于治疗前列腺疾病的高效花粉提取物的制备方法
CN101306027B (zh) 药用红树植物老鼠簕总黄酮的提取方法
CN111116766A (zh) 一种利用超高压技术提取枸杞多糖的方法
CN215736727U (zh) 桑叶固体速溶饮料的制备工艺平台
CN114470082A (zh) 一种半夏产地加工制备工艺
CN116474015A (zh) 一种黄芪提取物的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210810

RJ01 Rejection of invention patent application after publication