CN113215298A

CN113215298A - 一种用于鉴定椰子高矮品种的snp位点及应用

Info

Publication number: CN113215298A
Application number: CN202110607720.4A
Authority: CN
Inventors: 罗杰; 王守创; 杨君; 郭昊; 刘贤青; 龙湍; 孙丽松
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-06-01
Filing date: 2021-06-01
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-06-01
Also published as: CN113215298B

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定椰子高矮品种的SNP位点及应用，本发明发现椰子Cn.GA20ox基因上游启动子序列的一个多态性位点与椰子株高表型存在紧密关联，通过检测这个多态性位点可以高效鉴定高矮椰子品种，本发明还公开了高矮椰子品种分子水平的鉴定方法，通过提取椰子基因组DNA，以提取得到的DNA为模板，设计基于SNP的KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)引物，和通用反向引物一起进行PCR扩增目的片段，利用荧光探针可实现SNP的分型，从而达到高效精准鉴定高矮椰子品种的目的。

Description

一种用于鉴定椰子高矮品种的SNP位点及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定椰子高矮品种的SNP位点及应用。

背景技术

椰子(Cocos nucifera L.)为棕榈科椰子属植物，为重要的热带木本油料作物，具有极高的经济价值，全株各部分都有用途：椰肉可榨油、生食、作菜，也可制成椰奶、椰蓉、椰丝、椰子酱罐头和椰子糖、饼干，椰子水可作清凉饮料，椰纤维可制毛刷、地毯、缆绳等，椰壳可制成各种工艺品、高级活性炭，树干可作建筑材料，叶子可盖屋顶或编织，椰子树形优美，是热带地区绿化美化环境的优良树种，椰子根可入药，椰子水除饮用外，因含有生长物质，是组织培养的良好促进剂。

椰子分为高种椰子和矮种椰子，其中高种椰子是世界上种植量最大的商品性椰子。高种椰子植株高15-30米，基部膨大，异株授粉，7-8年开始结果，含油率高，经济寿命长达70-80年。矮种椰子按果实和叶片颜色分为红矮、黄矮和绿矮三类。植株高约5-15米，自花授粉，3-4年开始结果，果小而多，椰肉薄、软，含油率低，经济寿命30-40年，主要作水果、杂交亲本和观赏用。我国椰子种植已有2000多年的历史，从上世纪50年代就开始有少量引进，在80年代后大量引种，并在中国热带农业科学院椰子研究所建立了椰子种质圃。现椰子种植主要在海南省的文昌县、琼海市、万宁县、陵水县、三亚市等,广东上川与下川岛、云南西双版纳、广西北海、台湾南部等地也有零星种植。目前我国椰子种植面积为50万亩，年产椰果2.43亿个，加工需求量却超过25亿个果实，所以我国椰子产业发展在很大程度上依赖进口提供。

株高是椰子育种最重要的农艺性状之一，直接决定椰子的产量。目前椰子育种主要采用传统育种方式，存在周期长、效率低等缺点，基于SNP的分子标记育种可以在DNA水平上进行快速筛选，显著提高椰子高矮的鉴定效率和准确度，并且可以在椰子苗期鉴定出具有优良性状的个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。由此发现用于鉴定椰子高矮品种的SNP位点，提高了筛选效果就成本亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效准确鉴定椰子高矮品种的SNP位点及其应用。

本发明的技术方案为：椰子高矮性状相关单核苷酸多态性SNP位点，位于椰子Cn.GA20ox基因启动子上游，定位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的第382位，该位点碱基由T/C，此位点的多态性与株高性状显著关联。

上述所述的SNP位点在椰子高矮性状选育上的应用。

进一步地，提取待鉴定椰子基因组DNA，以提取得到的基因组DNA为模板，设计基于该SNP的KASP正向引物F1、F2和通用反向引物R一起进行PCR扩增目的片段，利用荧光探针实现SNP的分型，当基因型为TT时为高种椰子品种，当基因型为CC时为矮种椰子品种。

进一步地，KASP正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，KASP正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，KASP通用反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述正向引物F1前端为FAM标记，正向引物F2前端为HEX标记。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现椰子Cn.GA20ox基因上游启动子序列的SNP多态性位点与椰子株高表型存在紧密关联，通过检测这个多态性位点可以高效鉴定高矮椰子品种，本发明还公开了高矮椰子品种分子水平的鉴定方法，通过基于SNP的KASP分型方法，能够达到便宜而精确的基因SNP分型，从而达到高效精准鉴定高矮椰子品种的目的。

附图说明

图1：高矮种椰子株高表型及植株节间距测量。附图标记说明：图1中的A图为高种椰子成年时期的表型；图1中的B图为矮种椰子成年时期的表型；图1中的C图为高矮种椰子植株节间距的测量。

图2：节间距GWAS分析定位基因Cn.GA20ox分析。附图标记说明：图2中的A图为80份高种椰子和矮种椰子节间距测量表型基于全基因组的定位分析结果；图2中的B图为高矮种椰子中Cn.GA20ox启动子区域的SNP的基因型分析。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。

图3：高矮种椰子苗期表型考察和细胞学切片分析。附图标记说明：图3中的A图为生长9个月的高矮种椰子苗期株高表型考察；图3中的B图为生长9个月的高矮种椰子苗期株高测量统计结果；图3中的C图为节间距GWAS分析定位基因Cn.GA20ox在高矮种椰子中的表达量分析。图3中的统计数据均基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。

图4：高矮种椰子成年期顶部叶片细胞学切片分析。附图标记说明：图4中的A图为高矮种椰子叶片的横切面观察分析，从左往右放大倍数依次增加；图4中的B图为高矮种椰子叶片纵向切片观察分析。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明利用新型农艺性状叶间节距进行GWAS定位，筛选到决定椰子株高的GA20ox基因，发现其启动子区域的SNP影响基因表达量，可以作为分子标记用于椰子高矮品种的鉴定。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：高矮种椰子节间距测量及GWAS定位Cn.GA20ox基因

申请人对生长年份相近的80份高种椰子和矮种椰子(材料来自中国农业科学院海南省文昌市椰子研究所，为常规实验材料)相同高度区域的叶节间距进行测量(图1)，对测量数据进行统计分析，整合群体重测序数据进行全基因组关联分析，结果发现椰子的节间与12号染色体的一个基因型存在显著关联(p<1.53e-25)，表明椰子株高的自然变异主要受12号染色体的位点调控(图2中A)。我们对高矮种椰子的基因型进行比较分析，发现位于Cn.GA20ox(GZ12G0245770)的启动子区域上游存在一个SNP单核苷酸多态性位点，初步认为Cn.GA20ox的单核苷酸多态性导致表型差异。进一步的，我们发现GZ12G0245770编码区上游的SNP(snp:12g138067872)(SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第382位)确实是与椰子的节间距离密切关联(图2中B)，箱线图(barplot)显示该基因型为T型时，椰子的节间显著(p<9.56e-26)大于该基因型为C型时的节间距，因此这个SNP可以代表这个基因型的功能多态性，是Cn.GA20ox的自然遗传变异造成椰子群体的高矮差异(图2)。

实施例2：高矮种椰子株高测量及Cn.GA20ox基因在高矮种椰子中表达量分析

申请人将发芽相同程度(芽长5cm左右)的高矮椰子，种植9个月后对植株的生长状况进行观察，发现种植相同时间后高种椰子株高明显高于矮种椰子(见图3中A)，分别对高矮椰子植株的株高进行测量并统计结果，测量数据显示高种椰子株高显著高于矮种椰子株高(见图3中B)。

为检测Cn.GA20ox基因在高矮种椰子中的表达量，申请人采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)将高矮椰子植株苗叶心幼嫩组织提取总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA，反应条件：65℃5min，50℃100min，70℃10min。用Cn.GA20ox基因靠近3-UTR的引物进行检测Cn.GA20ox基因的表达量，检测引物的序列为qRT-F：5’-TTCTCCCATCTTTGCCTTCCC-3’，qRT-R：5’-AAGGAGTGCTGTGATGGAGAG-3’，同时用引物序列(Cn_Actin_qRT-F：5’-GTGCCTGCCATGTATGTTGC-3’和Cn_Actin_qRT-R：5’-TGCGGTAGGGCATATCCTTC-3’)对椰子actin基因(06G0125390)作特异性扩增，以作为内对照进行定量分析。反应条件：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，共40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(按常规方法)，可以看到，以椰子Actin基因为内参，Cn.GA20ox基因在高种椰子植株叶组织的表达量高于矮种椰子植株叶组织的表达量(图3中C)。

实施例3：高矮种椰子叶片细胞学切片分析

将高矮椰子植株苗叶心幼嫩组织固定液固定后进行叶片横向切片。可以发现椰子包含棕榈科植株叶组织结构的上表皮、厚壁组织、木质部、韧皮部、下表皮和叶肉细胞，可以观察到高种椰子植株叶片厚度大于矮种椰子植株叶片厚度，高种椰子植株叶片下表皮细胞大于矮种椰子植株叶片下表皮细胞，高种椰子植株叶片导管细胞大于矮种椰子植株叶片导管细胞(图4中A)。而对叶梗进行纵向切片观察，可以看到高种椰子植株叶梗细胞长度长于矮种椰子植株叶梗细胞(图4中B)。

实施例4：鉴定高矮椰子品种的方法

利用CTAB抽提法提取已知的高矮椰子品种基因组DNA，提取方法如为：将2ml灭过菌的管子，装入两粒小钢珠，放入1-2cm长剪碎的高矮椰子植株苗叶心幼嫩组织，打样机打磨成粉末；10000rpm离心30s使粉末到达管底，加入750μL1.5×CTAB抽提液；65℃水浴30min，期间颠倒数次；加入等体积氯仿:异戊醇(体积比24:1)上下颠倒混匀后放摇床上摇15min；10000rpm室温离心10min，吸上清500μL至新的1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中静置30min以上；10000rpm离心10min，弃上清，再用75％乙醇洗涤沉淀；10000rpm离心5min，弃上清，自然风干，加入100μLddH2O溶解DNA。设计基于SNP的KASP引物，其中高种椰子基因型正向引物用FAM标记为KASP引物F1，矮种椰子基因型正向引物用HEX标记为KASP引物F2，高矮种基因型反向引物相同为KASP通用引物R，引物序列，KASP引物F1:5'GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGAGTTTCACTGGACTGAGACACT 3'(SEQ ID NO:2，T型，引物前端为FAM标记)，KASP引物F2:

5'GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGAGTTTCACTGGACTGAGACACC 3'(SEQ ID NO:3，C型，引物前端为HEX标记)，KASP通用引物R:5'GAAACTCATGATCAGAGAGTCCCA 3'(SEQ ID NO:4)。反应体系：1μL总DNA作为模板，2.5μLKASP PCR MIX，0.075μL引物mix(F1:F2:R＝1:1:1)，加ddH2O至5μL进行荧光定量PCR扩增。扩增条件：

扩增结束后使用荧光定量仪器可进行SNP分型，低值单倍型则为矮种椰子品种，高值单倍型为高种椰子品种。一个小时可完成380份样品检测，此检测手段可以进行批量鉴定实验。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种用于鉴定椰子高矮品种的SNP位点及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 809

<212> DNA

<213> Cocos nucifera

<400> 1

tcgaggtcaa gaagatgaat tatacggtaa ctatatgcca tgggttcatc gatgttatat 60

tataattatt cgacctatcc ggatgttgga taccattgct agatggtcct attaattgat 120

acagaaaatt agtttctatg ctatcggctt aggattcgaa cctataggat cacacataat 180

aggagtttct acctgatctg atgactgata ttgagtctcg atgacctagg actctatggt 240

caagagtctc attggactga aattctatga tcaagaattc cactggactg agactctgag 300

tccttcatgt ccgagactct ctgatcgaga gtcctgatga tatggaactc tatggtcaag 360

agtttcactg gactgagaca ctgtgaccaa gagtcctaat ggattgagac tttgagtcct 420

actcatttgg gactctctga tcatgagttt cactggtctg ggactctatg atctcgagat 480

ccattcattt aggacattgg gttcaagagt cccattggat taggactctt caggagtttc 540

aggttgatga aactttaatg ctcgataacc catccaatta gaactctaat atttttgaag 600

gattaattag taatttgatt actgattagc tcaatttgat tgagcgatga tgatttgatt 660

aagtctaatt gaatttgatt caattgggtt tgacccaatt aggtcatgag atgatctaat 720

cgctaagaaa gattcgatct tgatttgatc agaatctaat taatttttaa tttaattaga 780

attttattga tttgaattaa gtctaattt 809

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc taagagtttc actggactga gacact 46

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat taagagtttc actggactga gacacc 46

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaactcatg atcagagagt ccca 24

Claims

1.椰子高矮性状相关单核苷酸多态性SNP位点，位于椰子Cn.GA20ox基因启动子上游，定位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的第382位，该位点碱基为T/C，此位点多态性与株高性状显著关联。

2.权利要求1所述的SNP位点在椰子高矮性状选育上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，提取待鉴定椰子基因组DNA，以提取得到的基因组DNA为模板，设计基于该SNP的KASP正向引物F1、F2和通用反向引物R一起进行PCR扩增目的片段，利用荧光探针实现SNP的分型，当基因型为TT时为高种椰子品种，当基因型为CC时为矮种椰子品种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，KASP正向引物F1的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，KASP正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，KASP通用反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述正向引物F1前端为FAM标记，正向引物F2前端为HEX标记。