CN113215280A - 一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引物及其应用 - Google Patents

一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引物及其应用。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的个体，为遗传雄性棘头梅童鱼。该遗传性别分子标记具有对南部群体和北部群体通用，对鱼体伤害小，适用整个生活史，适用材料范围更广等优点。

Description

一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引 物及其应用
技术领域
本发明涉及水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，尤其涉及一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引物及其应用。
背景技术
染色体水平的研究具有宏观与直观的优势，与各种组学和分子生物学研究链接并互补，是遗传研究的重要内容。性染色体的识别、结构特征与进化研究是遗传学和进化生物学的研究热点之一。鱼类作为低等脊椎动物，具有丰富多样的性别决定模式，是研究脊椎动物性染色体结构与进化的理想模式系统。了解其性别决定机制可以改进性别控制和生殖控制技术。另外，鱼类的性别还与其繁殖及许多重要经济性状紧密相关，因此性别控制在水产养殖中受到了广泛关注。
随着分子生物学技术的发展，目前已有多种类型的DNA分子标记被开发出来，其中主要包括(1)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)；(2)随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)；(3)扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)；(4)微卫星标记(microsatellite)；(5)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。利用上述分子标记技术，已经有许多物种的性别特异的分子标记被开发出来，但不同物种其基因组序列结构不同，一个物种的性别特异分子标记通常不能用于其他物种的遗传性别进行鉴定。特定物种的性别特异分子标记通常需要专门开发。
棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)属鲈形目，石首鱼科，梅童鱼属，主要分布于西太平洋区，包括中国、朝鲜半岛西海岸、日本、菲律宾沿岸等，是亚洲沿海地区广泛食用的一种重要的海洋鱼类。棘头梅童鱼体型大小存在雌雄二态，雌性个体大于雄性个体，性别控制相关技术具有商业应用潜力。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的性别分子标记，以及用于鉴定或辅助鉴定南部群体和北部群体的棘头梅童鱼的性别的引物。
为实现上述目的，本发明提供一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的个体，为遗传雄性棘头梅童鱼。
本发明还提供一种用于检测所述遗传性别分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种用于检测所述分子标记的试剂盒，其特征在于，包括所述引物。
本发明还提供一种鉴定棘头梅童鱼南北群体性别的分子标记的方法，其特征在于，使用所述的引物或试剂盒中的引物，对待测的南北群体棘头梅童鱼进行所述分子标记的检测，以确定所述待测南北群体棘头梅童鱼的遗传性别。
进一步，方法为，
获取待检测棘头梅童鱼的DNA；
使用所述的引物进行PCR扩增；
电泳检测并判断。
进一步，所述PCR扩增的体系为：当反应总体积为20μL时，具体反应体系为ddH2O13.4μL；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP 1.6μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL的DNA模板2μL。
进一步，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后，接着72℃延伸10min。
进一步，所述判断为如果PCR只出现一条带，且为310bp，其为雌性棘头梅童鱼；如果PCR只出现两条带，一条带为310bp，另一条带为282bp，其为雄性棘头梅童鱼。
本发明还保护所述分子标记或所述引物或所述试剂盒在棘头梅童鱼育种中的用途。
本发明以在中国浙江省舟山捕捞的棘头梅童鱼为北部群体样本构建各11组雌雄棘头梅童鱼基因组重测序数据，和以中国福建省宁德捕捞的棘头梅童鱼为南部群体样本构建各12组雌雄棘头梅童鱼基因组重测序数据。利用多地群体的重测序数据进行全基因组关联分析(结果见图1)其中雄鱼中28bp的特异性缺失在参考基因组上以深色区段标记，对最终筛查到的雄性特异缺失片段设计相应的引物(见图2)。所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
分析发现，雄性棘头梅童鱼缺失而雌性棘头梅童鱼有的序列如SEQ ID NO:1所示：
GCGATATATCGAATATACTCGATATATC。
所述引物F为：5’-TTCGGTGGGTTGGATGGGTCT-3’；SEQ ID NO:2。
所述引物R为：5’-CGCAGGGGATTTTTCTGGGTG-3’；SEQ ID NO:3。
本发明提供一种基于PCR的南北群体棘头梅童鱼性别鉴定分子标记，具有对南部群体和北部群体通用，对鱼体伤害小，适用整个生活史，适用材料范围更广等优点。具体表现为，1)对南部群体和北部群体的棘头梅童鱼通用：已有的棘头梅童鱼的性别分子标记仅适用于南部群体，而不适用于北部群体。而本发明在分析中加入了北部群体的重测序数据，开发的标记位于南北群体共有的重组抑制区，且南北雄鱼均带有相同的特异性缺失片段，从而满足此性别分子标记的南北通用性。此种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记，弥补了此前棘头梅童鱼遗传性别分子标记的使用区域的局限性；2)对鱼体伤害小：与当前使用的解剖检查性腺法相比，本发法提供方法无需杀死实验对象，仅需取15毫克尾鳍。特别适用于需要保活的对象；3)适用于整个生活史：与当前使用的解剖检查性腺法相比，本发明方法不仅可以适用于性腺分化清晰的生活阶段，也适用于性腺尚未发育或分化的早期阶段，不受环境、个体差异影响；4)适用材料范围更广：与当前使用的解剖检查性腺法相比，本发明方法不仅可以鉴别鱼体的性别，还可以用于一些特殊的材料，如超雄鱼、精子和BAC克隆等。
附图说明
图1是南北群体基因组中雌雄样本间的序列比对图。
图2是针对雄性特异缺失片段进行相应的引物设计结构图。
图3是实施例1验证棘头梅童鱼性别的电泳结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
利用本发明标记对初步确认性别(剖查性腺)的南北群体的棘头梅童鱼基因组DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳图谱比较，验证本发明方法的准确性和特异性。具体方法步骤如下：
在棘头梅童鱼繁殖季节采样，取解剖检查鉴定棘头梅童鱼北部群体(中国浙江省舟山捕捞的棘头梅童鱼)和南部群体(中国福建省宁德捕捞的棘头梅童鱼)的雌性和雄性的棘头梅童鱼各10尾(可通过性腺表型分辨雌雄)，剪取部分鳍条，存于无水乙醇，-20℃保存用于基因组的提取；采用酚氯仿法提取基因组DNA，所得的基因组DNA统一稀释到30ng/μL作为模板备用；
所述引物F为：5’-TTCGGTGGGTTGGATGGGTCT-3’；SEQ ID NO:2。
所述引物R为：5’-CGCAGGGGATTTTTCTGGGTG-3’；SEQ ID NO:3。
以所述引物进行PCR扩增反应体系:反应总体积20μL，具体反应体系为ddH2O 13.4μL；10×Buffer 2μL；dNTP(2.5mM)1.6μL；引物F(10mM)0.4μL；引物R(10mM)0.4μL；Taq酶0.2μL；DNA模板(30ng/μL)2μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后，接着72℃延伸10min。
将扩增的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶的浓度为3％，电泳时间大约为1h，电压130v，电流115mA。电泳结束后进行成像处理，并对图片的条带进行分析。
电泳结果(请参见图3)显示，全部雌性棘头梅童鱼均出现一条带，为310bp；而雄性棘头梅童鱼则出现两条带，与2000bp量程的Marker对比，一条带为310bp，另一条带为282bp。结果符合100％预期要求。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0003105270300000051
Figure BDA0003105270300000061
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记、引物及其应用
<130> JMDXL-21024-CNI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 棘头梅童鱼
<400> 1
gcgatatatc gaatatactc gatatatc 28
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcggtgggt tggatgggtc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcaggggat ttttctgggt g 21

Claims (9)

1.一种鉴别棘头梅童鱼南北群体通用的遗传性别分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的个体，为遗传雄性棘头梅童鱼。
2.一种用于检测权利要求1所述遗传性别分子标记的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
3.一种用于检测所述分子标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物。
4.一种鉴定棘头梅童鱼南北群体性别的分子标记的方法，其特征在于，使用权利要求2所述的引物或权利要求3试剂盒中的引物，对待测的南北群体棘头梅童鱼进行所述分子标记的检测，以确定所述待测南北群体棘头梅童鱼的遗传性别。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，方法为，
获取待检测棘头梅童鱼的DNA；
使用权利要求2所述的引物进行PCR扩增；
电泳检测并判断。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：当反应总体积为20μL时，具体反应体系为ddH2O 13.4μL；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP 1.6μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL的DNA模板2μL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后，接着72℃延伸10min。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述判断为如果PCR只出现一条带，且为310bp，其为雌性棘头梅童鱼；如果PCR只出现两条带，一条带为310bp，另一条带为282bp，其为雄性棘头梅童鱼。
9.一种权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在棘头梅童鱼育种中的用途。
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