CN113215112A - 分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒学、渔业生物技术及水产动物医学领域，更具体涉及分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用。所述的黄颡鱼杯状病毒的全基因组为SEQ ID NO.2所示，特异性序列为SEQ ID NO.1所示，针对该序列，申请人设计了检测引物YCCV‑NS‑F和YCCV‑NS‑R，当引物扩增到523 bp大小的核酸片段时，可诊断为被黄颡鱼杯状病毒YCCV所感染。本发明提供的基因序列和引物特别适合对养殖患出血病的黄颡鱼的早期诊断和分子流行病学调查，还适用于对不同水产动物杯状病毒的监测预警。

Description

分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用

技术领域

本发明属于病毒学、渔业生物技术及水产动物医学领域，更具体涉及分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用。

背景技术

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco肉质细嫩、营养丰富、养殖方式多样(单养、混养、网箱养殖)，是我国广泛养殖的肉食性为主的杂食性小型名优经济养殖鱼类[李明德.北京:海洋出版社,2011,116-122]。我国黄颡鱼养殖产业发展迅速，近些年来，黄颡鱼的病害研究大多集中于细菌、真菌和寄生虫等病原[周勇等.中国渔业质量与标准,2019,9(1):18-26；Ye SG,et al.Aquaculture,2009,292:6-10]。2020年3—4月浙江湖州、湖北枝江、潜江等黄颡鱼主养区域发生黄颡鱼暴发性疾病，随后，四川、重庆、湖南、广西、广东等地区相继暴发，给黄颡鱼养殖业造成了巨大经济的损失，但病因不明。

患病黄颡鱼临床症状主要表现为鱼体表颜色加深，下颌基部和体表出血，脾脏和肾脏坏死出血。与已报道的黄颡鱼疾病临床症状不同并且该病传播迅猛，发病率约40％～60％，死亡率高达70％～80％，病程一般为3～5d，发病水温20～24℃，抗生素药物治疗无效。

针对上述问题，申请人就近年引起我国黄颡鱼暴发性死亡的主要致病病原进行鉴定，申请人采用了高通量测序方法对患病黄颡鱼肾脏组织进行测序分析，结合人工感染实验、病毒组织表达分布、患病鱼组织原位杂交等实验，最终鉴定引起黄颡鱼出血性病毒病原为黄颡鱼杯状病毒病原，暂命名为Yellow catfish Calicivirus(YCCV)，该病毒是直接导致黄颡鱼体表出现出血性死亡特点的致病病毒病原。

至申请日目前，该病毒病原首次在鱼类中发现，而且与杯状病毒科其他成员属在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性，对该病毒病原的研究也尚属空白。因此，对引起黄颡鱼出血性疾病，高致死率的黄颡鱼杯状病毒YCCV开展诊断及流行病学调查、疾病防控、疾病早期预警模型等方面研究，不仅具有重要科学意义，且开发的相关产品能推广应用，为黄颡鱼的养殖业健康持续发展奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种分离的黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfishCalicivirus)，所述病毒的全基因组为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfishCalicivirus)的特异性序列，所述序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还有一个目的在于提供了用于检测SEQ ID NO.1所示特异性序列的引物。

本发明还有一个目的在于提供了SEQ ID NO.1所示序列或针对SEQ ID NO.1设计的引物在制备黄颡鱼杯状病毒诊断试剂中的应用。

本发明最后一个目的在于提供了全基因组为SEQ ID NO.2所示的黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfish Ca licivirus)的应用，包括用于黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfishCalicivirus)的标准对照品，或是作为黄颡鱼杯状病毒的疫苗。

为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施：

申请人从不同养殖场采集患出血性疾病的濒死黄颡鱼进行主要致病病原鉴定，透射电子显微镜结果显示患病黄颡鱼的组织细胞中存在大量球形无囊膜病毒样颗粒，直径约30～40nm；病毒粒子分布在宿主细胞的细胞质中，有的由单位膜包裹在包涵体中，而正常黄颡鱼组织中未观察到球形样病毒颗粒；进一步对脾脏和肾脏组织进行高通量测序，发现与现有杯状病毒进化相近的一株新病毒(Yellow catfish Calicivirus，YCCV)。YCCV首次在鱼类中发现，而且与杯状病毒科其他成员属在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性。基于高通量测序所得部分YCCV基因组序列，利用RACE和Overlap PCR技术进行病毒全基因组扩增，最终获得了SEQ ID NO.2所示的包括特异性序列在内的病毒全基因组序列。

该病毒的非结构蛋白(Nonstructural protein,NS)是调控病毒复制的关键基因，针对该基因筛选出SEQ ID NO.1所示的特异性靶序列。

通过对本领域的常规手段，对上述靶序列的全部或者部分序列进行检测，可用于检测YCCV；

上述的检测试剂可以为引物，优选的，为YCCV-NS-F：5'-CGCCTAAAGTTCTCCTCCTTGTTGG-3'和YCCV-NS-R：5'-AAAGTTGGGTGGATTGGTTTGTCAT-3'，扩增出的序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明的保护内容还包括，全基因组为SEQ ID NO.2所示的黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfish Calicivi rus)的应用，包括用于黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfishCalicivirus)的标准对照品，或是作为黄颡鱼杯状病毒的疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明实现了对黄颡鱼出血性疾病、高死亡率病毒病高效和准确诊断。

2)本发明是基于新鉴定的黄颡鱼杯状病毒YCCV特异性序列，采用2条引物进行RT-PCR的扩增策略，在提高效率，简化过程、降低成本的同时，还能了解YCCV的分子流行病学特征，从而获得更丰富和更准确的信息与数据。

3)本发明提供的基因序列或其引物，可研发准确、快速、便捷的免疫检测技术和/或制剂，广泛用于在国内外黄颡鱼的健康评估、或病毒病流行调查及预警。

5)利用本发明提供的RT-PCR检测方法灵敏，待检样品中含YCCV基因量为0.1ng/μL可检出。

6)所扩增的基因YCCV-NS具有可预测的功能或保守结构域；基因大小适中，扩增后易于分析和判断。

7)本发明提供了YCCV全基因组序列，为下一步制备疫苗和病毒的分子流行病学调查研究提供参考。

附图说明

图1为濒死黄颡鱼脾脏和肾脏的超薄切片透射电镜图片示意图；

显示在濒死黄颡鱼脾脏和肾脏的超薄切片中，存在大量的杯状病毒颗粒。

图2 YCCV-NS在现有NCBI中与该目病毒成员属的同源性对比结果截图：

图中结果显示，YCCV-NS氨基酸序列与现有的小RNA病毒目中各个病毒科成员属，如杯状病毒科、小RNA病毒科、双顺子反子病毒科等有部分同源性(～30％)。

图3用YCCV-NS引物对患病黄颡鱼组织进行RT-PCR扩增产物的电泳图；

待检样品共三份，均显示黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfish calicivrus,YCCV)阳性；

所用引物分别是YCCV-NS-F/YCCV-NS-R。M：1000bp。结果在大小为523bp处，扩增出一条特异性的核酸条带。

图4用不同稀释浓度的YCCV cDNA模板进行RT-PCR产物电泳图；

图：待检模板DNA浓度依次为(10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10-¹、10-²、10-³或10-⁴)×0.1ng/μL。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

黄颡鱼杯状病毒的发现及特异性序列的获得：

申请人从不同黄颡鱼养殖场采集患出血性疾病濒死黄颡鱼，进行致病病原鉴定。结果显示患病黄颡鱼的脾脏和肾脏细胞坏死、出血。超微切片观察结果显示：患病黄颡鱼内脏组织的细胞中存在大量球形无囊膜病毒样颗粒，直径约30～40nm，在黄颡鱼的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、鳃等不同组织中分布，尤其是在脾脏和肾脏组织中有大量病毒增殖，经高通量测序后，发现该病毒病原为新的病毒病原，基因组序列与杯状病毒科其他成员有较大差异，但是进化关系相近，因此命名为黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfish calicivr us,YCCV)(图1)。因尚无可用于增值YCCV的细胞系，本发明的YCCV均是通过将该病毒匀浆组织接种至健康黄颡鱼后取其脾脏和肾脏组织进行YCCV相关实验。

将YCCV匀浆悬液注射到健康黄颡鱼体内3～10天后，可引起黄颡鱼死亡。收集人工接种YCCV后濒死的黄颡鱼组织，进行临床和超薄切片观察，其病变特征及所含病毒形态特征与自然发病黄颡鱼的检出特征相同。

在获得YCCV基因组核酸、完成其全基因组测序之后，对病毒基因组结构进行分析。结果显示YCCV全基因组RNA含7243bp(SEQ ID NO.2所示)，为单股正链RNA，推定编码3个开放阅读框(ORF)，在基因结构组成方面与杯状病毒科中部分成员属相似，但基因组同源性差异较大，在核苷酸层面无同源性，在氨基酸层面也仅有30％左右的同源性，是一株新的病毒株(图2)。

经序列比对，最终筛选黄颡鱼杯状病毒的非结构蛋白序列YCCV-NS用于诊断检测黄颡鱼杯状病毒，其序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

针对YCCV-NS的特异性序列设计的引物在制备黄颡鱼杯状病毒(Yellow catfishcalicivrus,YCCV)检测试剂盒中的应用：

针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物为：YCCV-NS-F：5'-CGCCTAAAGTTCTCCTCCTTGTTGG-3'和YCCV-NS-R：5'-AAAGTTGGGTGGATTGGTTTGTCAT-3'。

扩增体系为：

待检样品cDNA 1μl(0.1μg)，引物YCCV-NS-F/YCCV-NS-R每条各加1μl 10μM；加2μl、10mM的dNTP Mix；加5μl 10×TranStart Taq Buffer(Mg²⁺)和1μl TranStart Taq DNAPolymerase(北京全式金生物技术有限公司产品)，加ddH2O，使终体积为50μl，混匀后，离心15s使反应组分集中在管底。

进行PCR扩增，循环程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，32个循环，72℃延伸5min,12℃保存。

扩增结束后，向体系中加入3μl 6×Loading buffer，混匀，取5μl上样至1％浓度琼脂糖凝胶孔中，199V，97mA，电泳30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入1％浓度的EB液中，浸泡5min，在凝胶成像系统(GBOX全自动凝胶成像及分析系统，美国SYNGENE公司生产)中成像。

判定：

由引物YCCV-NS-R/YCCV-NS-R扩增，当待检cDNA样品中含YCCV基因，其产物电泳后出现1条分子量为523bp(SEQ ID NO.3所示)的核酸条带(图3)。

实施例3：

针对YCCV-NS的特异性序列设计的引物的灵敏度：

将黄颡鱼杯状病毒YCCV(Yellow catfish calicivrus,YCCV)基因组cDNA依次10倍系列稀释：原液0.1ng/μL、10-¹…至10-⁴，作为模板cDNA。

2)按照实施例2中的方法进行RT-PCR扩增；

4)该引物对YCCV的检测限可达0.1ng/μL(图4)。

实施例4：

针对YCCV-NS的特异性序列设计的引物的特异性：

针对目前水生动物流行的主要病毒病原，如草鱼呼长孤病毒、鲤疱疹病毒II型、黄鳝弹状病毒和大鲵虹彩病毒设计引物(见表1)，用实施例2的引物和方法对表1中的待检的病毒核酸样品进行扩增。结果除黄颡鱼杯状病毒的核酸样品能被扩增(523bp)，其它引物扩增结果均为阴性。

表1水生动物主要病毒病原信息

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5060

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgttcttat tgctattaga tcattgtttt ttgcattgcg gtgcatttca cctgttctta 60

ttgcatttcc acaattattt tataatctta caacgactgc gtattaattt ccttgatacg 120

atgtcccaat ccaagaacac cgtgggatcc acgagaagtg cgcgccatta tagatgctgt 180

aatgtgcggg accactttca ctgccccaca aaggaaacat tggagctgag aggcttcaaa 240

tcatttatgt catccgctgc caccagaata gccaacgcct ttaactgctc cacagcccgt 300

gagggttttg caacactcac tggacttgag gaggacttga ggacgatgga catgatgacc 360

agtatccggg agctcttcac acagtggcaa cacaggccac tgttgaagtt tctggaagac 420

accctagcca aagcagcagc agcaacgctt gtggctaaat caagggatac catctccttg 480

atttgttcta tttttttgtt ggccagggag atgggagcac ttgattttct atccctcctc 540

accggagcta actgctgtcc cagtctctct tctatatgcg ccaaggcgcg ggacctgacc 600

ctatttggtg agtctgatga ggagtcttat gatctcttgt cgttggctgt gtcccttgtc 660

gcgaccctat tgttcaccct tttccttgga aagggttgtg gacggttggc ggcgacagtt 720

gtcacggcac tcaacctgac tggaacacgt gtccacattg agaaaacaac aaaggcatta 780

gttggtgccg ttaaagacaa gatcatggag atgtggcact gggtcacaaa cacgacaccc 840

agtccggatg ctgatgagct tgctaaacaa ctttatgggg tgggaactgc aaccttcctt 900

ttgaatgtgc gtgaactcct gcaggataga cctatcctca cccctgagaa catcaccaaa 960

gtatccaaca tgcatctcga ggcaaaggat cgccatttat ggtgcacaca gaatgatggg 1020

gcctattgga ccaagcccct acaagaagct atcttagatc tgaaaacttt tcttgattgc 1080

gcaaaatcct ctgtaaggca aacgcctaaa gttctcctcc ttgttggtgg accgggtacg 1140

ggaaagacag tttcatctga atccttcatc aacaagttgg ctgctgagct taatctttcg 1200

aatgtgcaca atgctggaga ctttgtctac taccgcaacc caagtgaaaa gttctggtcg 1260

ggttacactg ggcagagggt tgtcgtgtac gatgatgcgt ggaacacgtg ttcggatgaa 1320

ttaaatgctg agctgctcaa cgttgtcaac accgctggca tggtcaccca ccaggctggc 1380

gttgacaaca aaggtaacat aatcctacaa gctacacatg ttgtcatcac atccaatcac 1440

ctacccagag gaaccaagag aggtgcaaag ctcgaggctg tgaccagaag atgccatgaa 1500

gcttatgagg tgcgtagagt gggcacatac ccaacttttc atgctctcaa aaaggaagat 1560

ggcctcttcc tacaactttc tgatggaacc ccggtttcag atgacaaacc aatccaccca 1620

actttcatat tctcggggtg ggtgcgtcct ctgctagaga gtgatgaaat agtcgacatc 1680

ttttccactg aggcgagtgg ggattcagat ataattcttg aagctgaggg cgttgaaggt 1740

tcctctgaga cactcgagct caggggtgat gagtcctgtg ggggttgtgc ggatggcacc 1800

cactattctc atgacattaa cgtcaccatt gacaacaacc aactaagtct tgccaatttc 1860

ctcgagaggc aacttgcata taatcccaca cctcaggctt gccacctggc tttctctgat 1920

gacattttcc ccttattgac tgaaggggca caaatgactt gtatcaacgg tctgacccag 1980

acactcgaac tccgaggtgg aatgggaaag ttatgcaagt cgccctttaa acctgacttg 2040

atattgaaag tgccagacga tgttgacctt ctctatggta aggtctgtgt ggatgatgag 2100

tgctgtcttg agcacctcga ctcaactttt cttgtatctt gcccacaaga cgacaggatg 2160

ttgtgggtca actctttggt taacctatgc gcccctggta acagactggt tggtccccct 2220

ctacggttct catgtaatgg gagccgtatc tcagttaaaa catcttcacg acatggtggg 2280

agctctctcc attgcgaact tgatatcaaa agtgagactg aaagtctcat cactctgggg 2340

gaaccaccct atttcccacg cccaaaagca aacctcacct actgggaaag agccgttgcc 2400

tggatgatca ataacaagtg gaacatactc attggagcat ttgccgttgg tttgggtact 2460

ctggctttag ctggcctctt caaacttttc tctttcatct tctccccatt gaaaaccctt 2520

gccttaaggg cttggggaga tgaagccgtc agcgatgacg acgatggtgc tcaggtgccc 2580

gactgggctg acctttcaac gcgtgttagc gacgggtttg aagacaatat caacgaagag 2640

gtctccaaga agaccgggga tcccattggt tgcacctgct tcacttgtta ccaaatgagg 2700

agagccctaa gaaacgcacg tcgttccagg aaaactcgga cccgtaagac caaggcagct 2760

ggatcaaaaa ctctgaagct caagggtatt gccgaaacta atgccgcttc gatctctgac 2820

tcattttggt ttggtagtgt tgtcggtaaa ctggatggga aaggggtaca ctgctccacc 2880

aatgttgtgc aggttgactc caacttttgt tacgcaccgg cacatttgtt tcgtggttat 2940

ggacccttct cggtgaaact cacacgtggg cttcatcggg gcgggaaact agagagacag 3000

gaactgaatt tctccctggt tgaagggaag aatatcattc tggattacaa aagggatatc 3060

gctgtttttt cctccaagga cctgccctca aagaggagca tattaaattt ctttcgtgat 3120

caccatgacc caaaagctaa atacatgttg ctccataaga gctcagcaag attggaacac 3180

gcagctgttc ttgaggcaat atccaacctc cgacgtgagg attgttatgt ccctagagtg 3240

gtggctggtg gcaaggcaga aagctacaaa ttggaaacct tcattggctc atccacagcc 3300

acagtcgact tcggtgactg tggctcgctt ctactttcag attgcgacaa catcaccatc 3360

catgggcatg ttttgtcggc atttgatgac gttgaggagg tggtgtgcgc cccagtcact 3420

agatcggatt tggaggatat ggtctcacag ttcaccaccc caatattgaa ccccaaaggc 3480

aaatactcca acgtcagtga ggtggattgg atggaaacac acttgcccct gggtacagct 3540

ggtgccctca caccaactag caacaacaag acaagccaca tcacccaatc caacctgcaa 3600

ccaagttccg tgaacggtat gatgcagaaa ggatatggat tcccaaagaa gattccagcg 3660

gccatgaatg ttacagcact cataaaagcc attgacaagt ggtccttgcc aacttccgat 3720

gggaacataa tcaatgcgcc ggcttatgag aatgccatgg gcgtggtcca gaggatggcg 3780

acacgcttta aagtcggttc caacacacct gccatttgta agatccagaa tgctgtgaag 3840

ggttttcgtg gctcaggccc tttttgcaag gtcacgtcat gtggatcggg atggcccaaa 3900

aagaaaaccg actacataga ctttgagcag ggtacagttt gccccgaatt agagcgtgct 3960

tgctcacaac tgtgggaaga ttatgagcaa ggggattacc cgagatcagt tttcaaagct 4020

gcactcaagg atgagaagcg tcccgtggac aaggtggccc agaataaaac ccgtgttgta 4080

tttggttcac cacttcataa atctttggtg gaccgaatgc tgttttgttg gctcattgag 4140

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agcaaaatcg ccaacaggca catgtccgcc ccacacgcgc gggagggcca tttttctatt 4260

gactactctg gcttcgactc tacccaggcg tcaggtgtcg cttttgatat cataacagcc 4320

atagccaagg ggtccggagc caccaccaag cataccaaaa tgatgcaggc ttcaatatta 4380

gattgttaca agagttgtct ggatgtgtat ggcaacacgt ttgttaaaaa cgcgggaatg 4440

ccttcagggg cggttatgac cacgtgcatg aatacatggt acaactgctt tctgaacgcg 4500

tacgcctact tcaatgctgt cccaggagcc acctcagact ctttcctgtc tgaacacatt 4560

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aactctgtga gagtcttcgg taccactgcc actagtgcca ccaagcaagg tgaaatcctc 4680

aaaaccccct tggaggaggt tgtcttcctc tccagaggat ttagatcatc tgatgagggg 4740

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atgtacttca gtgacgccaa aagcacactt gatgatgaag tcaacacctt gagaaatgtg 4860

ttgaaggaat tggccttgca cggagaagag acctatttcc agttcgcgcg cttttgtacc 4920

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ccgcagccag gaacccggaa 5060

<210> 2

<211> 7432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttcatatt agatcattgt tttttgcatt gcggtgcaat ttaactgttc ttattgctat 60

tagatcattg ttttttgcat tgcggtgcat ttcacctgtt cttattgcat ttccacaatt 120

attttataat cttacaacga ctgcgtatta atttccttga tacgatgtcc caatccaaga 180

acaccgtggg atccacgaga agtgcgcgcc attatagatg ctgtaatgtg cgggaccact 240

ttcactgccc cacaaaggaa acattggagc tgagaggctt caaatcattt atgtcatccg 300

ctgccaccag aatagccaac gcctttaact gctccacagc ccgtgagggt tttgcaacac 360

tcactggact tgaggaggac ttgaggacga tggacatgat gaccagtatc cgggagctct 420

tcacacagtg gcaacacagg ccactgttga agtttctgga agacacccta gccaaagcag 480

cagcagcaac gcttgtggct aaatcaaggg ataccatctc cttgatttgt tctatttttt 540

tgttggccag ggagatggga gcacttgatt ttctatccct cctcaccgga gctaactgct 600

gtcccagtct ctcttctata tgcgccaagg cgcgggacct gaccctattt ggtgagtctg 660

atgaggagtc ttatgatctc ttgtcgttgg ctgtgtccct tgtcgcgacc ctattgttca 720

cccttttcct tggaaagggt tgtggacggt tggcggcgac agttgtcacg gcactcaacc 780

tgactggaac acgtgtccac attgagaaaa caacaaaggc attagttggt gccgttaaag 840

acaagatcat ggagatgtgg cactgggtca caaacacgac acccagtccg gatgctgatg 900

agcttgctaa acaactttat ggggtgggaa ctgcaacctt ccttttgaat gtgcgtgaac 960

tcctgcagga tagacctatc ctcacccctg agaacatcac caaagtatcc aacatgcatc 1020

tcgaggcaaa ggatcgccat ttatggtgca cacagaatga tggggcctat tggaccaagc 1080

ccctacaaga agctatctta gatctgaaaa cttttcttga ttgcgcaaaa tcctctgtaa 1140

ggcaaacgcc taaagttctc ctccttgttg gtggaccggg tacgggaaag acagtttcat 1200

ctgaatcctt catcaacaag ttggctgctg agcttaatct ttcgaatgtg cacaatgctg 1260

gagactttgt ctactaccgc aacccaagtg aaaagttctg gtcgggttac actgggcaga 1320

gggttgtcgt gtacgatgat gcgtggaaca cgtgttcgga tgaattaaat gctgagctgc 1380

tcaacgttgt caacaccgct ggcatggtca cccaccaggc tggcgttgac aacaaaggta 1440

acataatcct acaagctaca catgttgtca tcacatccaa tcacctaccc agaggaacca 1500

agagaggtgc aaagctcgag gctgtgacca gaagatgcca tgaagcttat gaggtgcgta 1560

gagtgggcac atacccaact tttcatgctc tcaaaaagga agatggcctc ttcctacaac 1620

tttctgatgg aaccccggtt tcagatgaca aaccaatcca cccaactttc atattctcgg 1680

ggtgggtgcg tcctctgcta gagagtgatg aaatagtcga catcttttcc actgaggcga 1740

gtggggattc agatataatt cttgaagctg agggcgttga aggttcctct gagacactcg 1800

agctcagggg tgatgagtcc tgtgggggtt gtgcggatgg cacccactat tctcatgaca 1860

ttaacgtcac cattgacaac aaccaactaa gtcttgccaa tttcctcgag aggcaacttg 1920

catataatcc cacacctcag gcttgccacc tggctttctc tgatgacatt ttccccttat 1980

tgactgaagg ggcacaaatg acttgtatca acggtctgac ccagacactc gaactccgag 2040

gtggaatggg aaagttatgc aagtcgccct ttaaacctga cttgatattg aaagtgccag 2100

acgatgttga ccttctctat ggtaaggtct gtgtggatga tgagtgctgt cttgagcacc 2160

tcgactcaac ttttcttgta tcttgcccac aagacgacag gatgttgtgg gtcaactctt 2220

tggttaacct atgcgcccct ggtaacagac tggttggtcc ccctctacgg ttctcatgta 2280

atgggagccg tatctcagtt aaaacatctt cacgacatgg tgggagctct ctccattgcg 2340

aacttgatat caaaagtgag actgaaagtc tcatcactct gggggaacca ccctatttcc 2400

cacgcccaaa agcaaacctc acctactggg aaagagccgt tgcctggatg atcaataaca 2460

agtggaacat actcattgga gcatttgccg ttggtttggg tactctggct ttagctggcc 2520

tcttcaaact tttctctttc atcttctccc cattgaaaac ccttgcctta agggcttggg 2580

gagatgaagc cgtcagcgat gacgacgatg gtgctcaggt gcccgactgg gctgaccttt 2640

caacgcgtgt tagcgacggg tttgaagaca atatcaacga agaggtctcc aagaagaccg 2700

gggatcccat tggttgcacc tgcttcactt gttaccaaat gaggagagcc ctaagaaacg 2760

cacgtcgttc caggaaaact cggacccgta agaccaaggc agctggatca aaaactctga 2820

agctcaaggg tattgccgaa actaatgccg cttcgatctc tgactcattt tggtttggta 2880

gtgttgtcgg taaactggat gggaaagggg tacactgctc caccaatgtt gtgcaggttg 2940

actccaactt ttgttacgca ccggcacatt tgtttcgtgg ttatggaccc ttctcggtga 3000

aactcacacg tgggcttcat cggggcggga aactagagag acaggaactg aatttctccc 3060

tggttgaagg gaagaatatc attctggatt acaaaaggga tatcgctgtt ttttcctcca 3120

aggacctgcc ctcaaagagg agcatattaa atttctttcg tgatcaccat gacccaaaag 3180

ctaaatacat gttgctccat aagagctcag caagattgga acacgcagct gttcttgagg 3240

caatatccaa cctccgacgt gaggattgtt atgtccctag agtggtggct ggtggcaagg 3300

cagaaagcta caaattggaa accttcattg gctcatccac agccacagtc gacttcggtg 3360

actgtggctc gcttctactt tcagattgcg acaacatcac catccatggg catgttttgt 3420

cggcatttga tgacgttgag gaggtggtgt gcgccccagt cactagatcg gatttggagg 3480

atatggtctc acagttcacc accccaatat tgaaccccaa aggcaaatac tccaacgtca 3540

gtgaggtgga ttggatggaa acacacttgc ccctgggtac agctggtgcc ctcacaccaa 3600

ctagcaacaa caagacaagc cacatcaccc aatccaacct gcaaccaagt tccgtgaacg 3660

gtatgatgca gaaaggatat ggattcccaa agaagattcc agcggccatg aatgttacag 3720

cactcataaa agccattgac aagtggtcct tgccaacttc cgatgggaac ataatcaatg 3780

cgccggctta tgagaatgcc atgggcgtgg tccagaggat ggcgacacgc tttaaagtcg 3840

gttccaacac acctgccatt tgtaagatcc agaatgctgt gaagggtttt cgtggctcag 3900

gccctttttg caaggtcacg tcatgtggat cgggatggcc caaaaagaaa accgactaca 3960

tagactttga gcagggtaca gtttgccccg aattagagcg tgcttgctca caactgtggg 4020

aagattatga gcaaggggat tacccgagat cagttttcaa agctgcactc aaggatgaga 4080

agcgtcccgt ggacaaggtg gcccagaata aaacccgtgt tgtatttggt tcaccacttc 4140

ataaatcttt ggtggaccga atgctgtttt gttggctcat tgagggttca aagaaagagt 4200

tcaagtggta cgcccctggc tgcaacccaa caagcaccga ctggagcaaa atcgccaaca 4260

ggcacatgtc cgccccacac gcgcgggagg gccatttttc tattgactac tctggcttcg 4320

actctaccca ggcgtcaggt gtcgcttttg atatcataac agccatagcc aaggggtccg 4380

gagccaccac caagcatacc aaaatgatgc aggcttcaat attagattgt tacaagagtt 4440

gtctggatgt gtatggcaac acgtttgtta aaaacgcggg aatgccttca ggggcggtta 4500

tgaccacgtg catgaataca tggtacaact gctttctgaa cgcgtacgcc tacttcaatg 4560

ctgtcccagg agccacctca gactctttcc tgtctgaaca cattttcacg gcctatggag 4620

atgatgttgt catcacatcc ccaatcacag tcgaggggtt ctgcaactct gtgagagtct 4680

tcggtaccac tgccactagt gccaccaagc aaggtgaaat cctcaaaacc cccttggagg 4740

aggttgtctt cctctccaga ggatttagat catctgatga ggggggcgcc aggggctcca 4800

tgttttggtt cgcaccatta tcattggaat ctattgtgcc ctgcatgtac ttcagtgacg 4860

ccaaaagcac acttgatgat gaagtcaaca ccttgagaaa tgtgttgaag gaattggcct 4920

tgcacggaga agagacctat ttccagttcg cgcgcttttg tacctctgca gacttcctga 4980

gaaaattgcc ccacgacttg gaagtcgcct acatttatga agagtcgaga ggcgcatgtg 5040

gaaaaccaca caaacactga tggttttggt accatcactc ctggccgcag ccaggaaccc 5100

ggaatttaag aatatctgta atagacttta tcttcaaatc ctcagcttca ccgctcaagt 5160

gaaacttact tttttcacaa ttctaattga ttcaaagtta aaactaatca ataaacatgt 5220

catccaaaat tgagtgcccc acccagccag aggttgagtc gtctgagttg acctgttggg 5280

attggtcgcc tctactcctt aggagtttgg ccgattacat tgaagttcag gctcttaaaa 5340

agaaaggcct ggttttccac atcctcaaca aatgcagggc cattccggga tctatctctt 5400

attccctggt gaatcggttt aaaacggtac tcatgtactt cttccccaaa atgaagtgct 5460

tcagggggaa aagaactgat ctggtggagc ccatcacagt tgtgtcaatg ggcacctcct 5520

ttaacggttt tttgaccccc cagaatgagt tttattgccc ggacttctat ggagagtcca 5580

taacactttc tgatccacct cgtcccaggc ttttggagct acgtggtgat acaggggggt 5640

gttcaataac atgcagagct tgcggggtca agatcaagaa gtctaacctg ctcaagcatc 5700

tccaagtgtg ccccaagagg acccagccac ccagaccccc ttgtcctcca aagatgacat 5760

acaaaaagac acctgcagga caacttaaag tgaaacaagc tggccccaag caaatagccc 5820

ccataccaat gcgtgatgat cccaagggaa agggtaggtg gtggatttct tccaacctcg 5880

ctgcctattc cccagcccat gctgaccaac acaaggggtt ggcctgtggt gaccgtggta 5940

agtcacttaa atggactgat gtggtggaga aatcctacac atttaatgag gttggagacc 6000

tcctggtcct gggaactggg cttgtggagt caccgtatgc agtggtggca accaaagatg 6060

ggttaacgtc cactggatct acccttccag acattttcca ccccgtgatg tgtgtgggag 6120

tgaatgacag agatgaagac gacctggatg tcactggatc gaaagacgac tccaagctgg 6180

tcataacaaa aatgtttgac acacctgaaa gtcatgaaaa acaccgcatg gttggaagct 6240

ccatcactat cacagtaagt ggagaagctg gcagagtgaa catcgccgaa ctcacctctg 6300

gacctgagaa ggacgatttg aaaaccgtcc acatgaccag attacaccaa actgacggtc 6360

atacagcaca taatgggaag gagggcctct acatcatcag taagccagca catgatcatg 6420

atccaaccaa ctggatggat aatggtgatg tgatcccagc actgacatcc ctggtttcta 6480

tggaagatgg aggtgccgac aaggagcaca acatcacctg gaagactgca gaggcaatgc 6540

atctgagcgg acgcgggctg cagttcgcga agcttgatgg ggtgcacgct ggtgtgactg 6600

ttactgttaa ggttgtgctg cacatggagt acaaggttga cccaacccac tcccatgcca 6660

ggtacctcac ccctacaaac gtagtcggag gagttcctgg ggcggcccat cgcaacgtgt 6720

accagcgcat ttggtctggc tacccagccc attacaacga cctcaagggc ttcttagcag 6780

gtcttgcaag tgtgctagcg tcaatcggag ctatcgttgc tgtcttcatc ccccctgcag 6840

gagccgtaat tggagccgtg ggcgcagggg ttggtggcgt cgcagcaatc ctctaaattg 6900

aaccaaaaac caaccaacat caaccctctc ataattcgaa gtttgtaact actctcttct 6960

tactcatttg aggtttgcta gcatttcaac cataatggaa agagagcaca ggtagtgcct 7020

caagtacaaa agccccatac aaccagtgtg ttgcgggatc agatacctga actaaacaga 7080

acgggaacgg taactgagtt gattgctgca aattctttcg ctgaggcagg gaaacataaa 7140

atttcctact ttctttccca tccttcctca gcggatacct ttaatgcgtg tgtccacccc 7200

agtggtgtac cacgcatctc cttcagtata tctgtgggac gtctcaaagg cgtttcaaca 7260

cggatctcct gtggggggaa accgtgttct caaggcttgt caccaaaggt ggcgtgcaat 7320

gggtgcacgt tacttttccc cctcgggggg ttcatggtga atatgcttat ttgagacaga 7380

aatacacttc ttttataaac atcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7432

<210> 3

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcctaaagt tctcctcctt gttggtggac cgggtacggg aaagacagtt tcatctgaat 60

ccttcatcaa caagttggct gctgagctta atctttcgaa tgtgcacaat gctggagact 120

ttgtctacta ccgcaaccca agtgaaaagt tctggtcggg ttacactggg cagagggttg 180

tcgtgtacga tgatgcgtgg aacacgtgtt cggatgaatt aaatgctgag ctgctcaacg 240

ttgtcaacac cgctggcatg gtcacccacc aggctggcgt tgacaacaaa ggtaacataa 300

tcctacaagc tacacatgtt gtcatcacat ccaatcacct acccagagga accaagagag 360

gtgcaaagct cgaggctgtg accagaagat gccatgaagc ttatgaggtg cgtagagtgg 420

gcacataccc aacttttcat gctctcaaaa aggaagatgg cctcttccta caactttctg 480

atggaacccc ggtttcagat gacaaaccaa tccacccaac ttt 523

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcctaaagt tctcctcctt gttgg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaagttgggt ggattggttt gtcat 25

Claims (7)

1.本发明的目的在于提供了一种分离的黄颡鱼杯状病毒（Yellow catfish Calicivirus），所述病毒的全基因组为SEQ ID NO.2所示。

2.黄颡鱼杯状病毒（Yellow catfish Calicivirus）的特异性序列，所述序列为SEQ IDNO.1所示。

3.检测SEQ ID NO.1所示特异性序列的全部或者部分序列的引物。

4.权利要求3所述的引物在制备黄颡鱼杯状病毒诊断试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的引物为YCCV-NS-F：5'-CGCCTAAAGTTCTCCTCCTTGTTGG-3'和YCCV-NS-R：5'-AAAGTTGGGTGGATTGGTTTGTCAT-3'。

6.权利要求1所述的黄颡鱼杯状病毒在作为黄颡鱼杯状病毒标准对照品中的应用。

7.权利要求1所述的黄颡鱼杯状病毒在制备为预防或治疗黄颡鱼杯状病毒感染的疫苗中的应用。

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