CN113214130A - 手性吡咯烷酮衍生物的除草应用 - Google Patents

手性吡咯烷酮衍生物的除草应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了手性吡咯烷酮衍生物的除草应用。(S)‑3‑乙酰基‑4‑羟基‑5‑(S‑仲戊基)吡咯啉‑2‑酮或(S)‑3‑乙酰基‑4‑羟基‑5‑(S‑仲己基)吡咯啉‑2‑酮在制备除草剂中的应用。本发明2种化合物可以在仅为非单一手性化合物浓度的1/2甚至1/3时，能够产生与非单一手性化合物相同大小的病斑。由此可见本发明2种单一手性化合物对紫茎泽兰的毒害程度远远高于对应的非单一手性化合物。

Description

手性吡咯烷酮衍生物的除草应用
技术领域
本发明属于本发明属于化学和生物化学应用于农业农药和植物保护、防除农作物杂草的 技术领域，涉及手性吡咯烷酮衍生物的除草应用。
背景技术
利用自然界生物中具有生物活性的代谢产物开发成新型生物源除草剂是生物除草剂研发的一个重要途径和未来发展方向。3-乙酰基-4-羟基-5-仲丁基吡咯啉-2-酮(简称TeA)是强胜等从紫茎泽兰病原型链格孢菌代谢产物中分离出来的一种植物毒素。 其活性较高，对包括恶性杂草紫茎泽兰在内的主要单双子叶杂草(如马唐、反枝苋) 都有较好的杀灭作用，具有开发成为生物源化学除草剂的潜力(中国专利 ZL200510038263.2)。对TeA作用机理的研究表明其是一类全新的来源于真菌的光系统II抑 制剂，其活性中心是吡咯烷酮，主要与D1蛋白结合，改变其构象，影响其电子传递，导致 光合电子传递受阻，引起过能量化，导致活性氧爆发，损失叶绿体结构，最终导致细胞和组 织坏死(Chen et al.,2007；Chen et al.,2010)。但作用机制不同于传统的光系统II抑制剂如敌 草隆和阿特拉津，主要表现在作用强烈，杀草速度快，一般出现可见伤害症状在8h左右(Qiang et al.,2018)。其一个重要的作用机制差异是TeA通过产生作用强烈的单线态氧信号，再引起 活性氧的爆发(Chen&Qiang，2017)。根据绑定的生物学原理，针对其结构上的羰基氧、羟 基氧和5位的疏水性仲丁基碳链以及3-乙酰基等基团或结构进行生理合理性分子修饰，活性 大小与吡咯烷酮上的5位烷基侧链的长短和结构相关，侧链烷基越长以及分支位置越近活性 越高(Chen et al.,2007)。合成了一系列该毒素的具有生物活性的类似物(中国专利：ZL201410175454.2)。在这些TeA类似物中，通过系统的除草活性筛选，发现当5位侧链为仲戊基和仲己基时，化合物的活性最高。这两种化合物：3-乙酰基-4-羟基-5-仲戊基吡咯啉-2- 酮(简称仲戊基TeA)、3-乙酰基-4-羟基-5-仲己基吡咯啉-2-酮(简称仲己基TeA)。因此，该类化合物具有开发出系列新型仿生化学除草剂的潜力。目前已经获得了专利(美国专利：US9468209B2；欧洲专利：EP1997803B1；中国专利，专利公开号：CN111808008A)。 由于侧链烷基会伸入D1蛋白的疏水囊，并与256位甘氨酸发生相互作用，影响其结合的紧 密程度，导致D1蛋白构象变化，从而进一步影响TeA的光系统II抑制活性，不过，前期研 究利用TeA作为除草剂，TeA在5位和6位具有2个不对称碳，其空间的旋光异构是否影 响其与D1蛋白绑定的紧密程度以及对D1蛋白空间构象的影响，从而影响光系统II抑制活 性，并不清楚。如果有影响是如何影响的，5位和6位碳分别影响或是共同影响？只是， 我们前期研究发现，生物合成提取的和化学合成的TeA及其衍生物除草活性并不稳定， 有时相差数倍。本发明就是为了阐明最佳活性的TeA及其衍生物在5位和6位碳的旋光 异构体及其制备和应用方法。
在自然界中链格孢菌是利用L-异亮氨酸合成细交链格孢菌酮酸(TeA)的，TeA被预测为是PKS-NRPK复合酶催化的产物(Collemare et al.,2008)。事实上，由放射性 前体喂养实验，TeA被认为是由一分子的异亮氨酸和2分子的醋酸所组成(Stickings, 1959；Stickings&Townsend,1961)。而最近TeA的合成基因首次从稻瘟中被发现。TeA 是由TeA合成酶1(TAS1)催化异亮氨酸和乙酰辅酶A而成，TAS1是一种独特的 NPRS-PKS复合酶，其PKS部分只具有酮基合酶区域，是TAS1活性所在不可或缺的 部分，负责TeA最后的环化及释放(Yun et al.,2015；Chen&Qiang,2017)。前期文献 报道生物源TeA的5位和6位碳均是S型(Seitz,1984；Shephard et al.,1991；Hannes et al., 2013)，为单一手性。但是，并没有任何研究涉及除草活性与构型间的关系，因此，尚 不清楚究竟哪种构型是最佳构型。化学合成是产业化应用最重要的途径，而化学合成 会产生不同构型的同分异构化合物，为了应用需要明确构型与除草活性间的关系，以 便选择最佳构型。为此，合成不同构型的TeA及其5位烷基侧链延长模拟合成的仲戊 基TeA和仲己基TeA两种化合物，并进行除草活性的评价。达到进一步提高除草活性、 降低使用剂量。
进一步的，如果TeA及其衍生物5位和6位碳的同分异构体对除草活性有影响， 活性异构体的制备方法也是未知的。(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲戊基TeA)和(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)- 仲己基TeA)未见报道可以被微生物合成，因此，本发明探索利用合成TeA的链格孢 菌生物合成TeA的衍生物。进一步，尽可能的提高生物合成效率是产业化的另一个重 要的技术问题。化学合成过程中，不对称碳取决于初始原料的构象，更是与维持构型 的合适的反应条件有关。因此，也需要进行大量的试验进行探索。
本发明是通过微生物培养合成以及利用单一手性的L-氨基酸：(2S,3S)-2-氨基-3- 甲基己酸和(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸，来生物或化学合成单一手性的(S)-3-乙酰基-4- 羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲戊基TeA)和(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S- 仲己基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲己基TeA)。通过系统评价它们的活性，以获得最 高除草活性的化合物。
发明内容
本发明的目的是生物和化学两条途径制备单一手性的吡咯烷酮衍生物并在除草上的应 用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
式(I)所示的吡咯烷酮衍生物空间结构的制备及其在除草剂中的应用，
Figure BDA0003012766330000031
其中，R＝CH2CH2CH3或CH2CH2CH2CH3,5位和6位的空间构象是S型，其化合物为 3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲戊基TeA)和3-乙酰基-4- 羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲己基TeA)。
作为本发明的一种优选，所述的式(I)所示的吡咯烷酮衍生物在制备防除阔叶杂草、 禾本科杂草或莎草的除草剂中的应用。
一种除草剂，以式(I)所示的吡咯烷酮衍生物作为有效成分，且有效成分浓度为10-200 μg·mL-1。
作为本发明的一种优选，所述的有效成分浓度为10-80μg·mL-1。
有益效果：
本发明通过系统的进行TeA的衍生物3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮 (简称(5S,6S)-仲戊基TeA)和3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2-酮2种化合物在 5位和6位的2个不对称碳，R型和S型构象以及它们的组合，进行D1蛋白绑定和除草活性的系统比较研究，首次，明确了S型构象的化合物与D1蛋白绑定的紧密程度最高，结合最 为稳定，对D1蛋白构象的影响最大，从而，对其功能影响也最大，光系统II抑制活性最高。 其除草活性比R型或R型和S型混合型高出2～3倍，可以显著提高活性，降低除草剂用 量，减少产品的成本，减轻环境污染压力。进一步还发展了生物合成和化学合成两条 合成路线，获得高活性S型构象的(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮(简称(5S,6S)-仲戊基TeA)和(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2-酮简称(5S,6S)-仲己 基TeA化合物。
具体实施方式
本发明的实质性特点可以从下述的实施方案和实施例中得以体现，但这些不应视为是对发明的任何限制。
本发明的两种化合物可通过生物发酵和化学合成两种方法得到。生物合成的方法是利用链格孢菌通过液体培养的方式，后通过分离提纯得到(I-i)和(I-ii)；而化学合成的方法这是利用单一手性的原料：(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸和(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸合成得到化合物：(I-i)和(I-ii)
Figure BDA0003012766330000041
制备实施例1本发明两种化合物的生物合成及提取方法
(1)菌株活化：将链格孢菌从石蜡斜面接种到培养基中，25℃培养7d，传代两次，得到活化菌株。所述的培养基为PDA培养基(土豆100g/L，蔗糖10g/L，琼脂7.5g/L)
(2)制备种子液：用5mm打孔器沿活化好的菌落边缘打取链格孢菌菌饼，接入种 子培养基中，接菌量为每100mL，1个菌饼；培养条件为25℃；摇床转速为140rpm， 得到种子液。所述的种子液培养基为察氏培养基(葡萄糖40g/L，NaNO3 1g/L，NH4Cl 0.25g，K2HPO4 1g/L，KCl 0.25g/L，NaCl 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O0.01g/L，酵母膏1g/L)。
(3)5位和6位S型构象不对称碳吡咯烷酮衍生物的发酵：将链格孢菌菌株的种子液接入 到含有发酵培养基(察氏培养基)的发酵罐中进行培养，发酵罐体积为50L，培养条件为25℃， 搅拌转速为140rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为30％，在培养7天后收集发酵液，进行 化合物的提取。
(4)目标产物的分离提纯
将培养液减压抽滤，得到培养滤液，滤液于60℃下减压浓缩至原体积的1/3，然后用乙酸 乙酯等体积萃取5次。将乙酸乙酯相回收，然后于旋转蒸发仪上40℃减压浓缩，得到棕色浸 膏，即为粗毒素。
柱层析法：
采用湿法装柱，称取硅胶(200-300目)，在大烧杯中用石油醚(沸程为60-90℃) 浸泡搅拌至无气泡的流动匀浆，倒入预先装入适量石油醚的直径为2cm的具砂芯 玻璃层析柱中，然后打开活塞，缓缓将硅胶石油醚均浆倒入层析柱中，并用洗耳 球轻轻叩击柱壁，防止产生气泡；填装紧实后备用。
上样：采用干法上样，称取制备好的粗毒素样品，均匀撒于已装好的层析柱上， 然后再于其上撒一薄层预处理好的硅胶以防止添加洗脱剂是使样品平面收到破坏 而影响分离效果。
洗脱：每50mL收集一次，以标准品作为指示，薄层层析法监测洗脱进程，当 (5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA全部洗脱出后停止洗脱。
HPLC法：
利用高效液相色谱对链格孢菌粗毒素进行分离提纯，洗脱条件为A:35％水(含0.1％甲酸和2mM醋酸铵)，B：65％乙腈，经过多次分离，可以除去粗毒素中的 杂质，得到单一组分的(I-i)和(I-ii)，此方法可以有效的分离链格孢菌粗毒素中的 TeA及两种衍生物。
分离得到的TeA、(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA利用核磁对其结构 进行鉴定。
TeA：1H NMR(400MHz,Methanol-d4):δ3.86(s,1H,NHCH),2.43(s,3H,COCH3),1.99-1.85(m,1H,MeCH),1.49-1.19(m,2H,MeCH2),1.01(d,J＝8.0Hz,3H,CH3CH),0.92 (t,J＝8.0Hz,3H,CH3CH2).13C NMR(101MHz,Methanol-d4):δ196.91(COCH3),186.01 (C＝COH),174.05(C-C＝O),102.40(C-C＝O),66.17(CHNH),37.02(MeCH),23.56(COCH3), 19.04(MeCH2),14.69(CH3CH),10.98(CH3CH2)。
(5S,6S)-仲戊基TeA：1H NMR(400MHz,Methanol-d4):δ3.90(d,J＝4.0Hz,1H,NHCH),2.44(s,3H,COCH3),2.10-2.05(m,1H,MeCH),1.49-1.35(m,4H,MeCH2 CH2), 0.97(t,J＝8.0Hz,3H,CH3CH2),0.81(d,J＝4.0Hz,3H,CH3CH).13C NMR(100MHz, Methanol-d4):δ198.04(COCH3),186.32(C＝COH),175.26(C-C＝O),102.53(C-C＝O),65.07 (CHNH),35.57(MeCH2CH2),34.40(MeCH),32.77(COCH3),19.94(MeCH2),15.00 (CH3CH),12.93(CH3CH2).
(5S,6S)-仲己基TeA：1H NMR(400MHz,Methanol-d4):δ3.91(d,J＝4.0Hz,1H,NHCH),2.44(s,3H,COCH3),2.07-2.19(m,1H,MeCH),1.40-1.31(m,6H,CH2 CH2 CH2), 0.97–0.93(t,J＝6Hz,3H,CH3CH2),0.80–0.77(d,J＝12Hz,3H,CH3CH).13C NMR(100 MHz,Methanol-d4):δ197.89(COCH3),186.23(C＝COH),174.82(C-C＝O),102.19(C-C＝O),65.28(CHNH),34.70(MeCH2CH2CH2),33.12(MeCH),30.26(COCH3),29.24(MeCH2CH2), 22.37(MeCH2),15.16(CH3CH),13.10(CH3CH2)
(5)本发明两种化合物绝对构型的测定
取本发明的两种化合物，用少量甲醇溶解。在室温下将样品放置在0.1mm 池径的石英比色皿中，扫描波长为200-700nm。随后通过TDDFT理论(含时密度 泛函理论)，采用理论ECD图谱与试验结果比对确定化合物的绝对构型。
由表1电子圆二色谱(ECD)的实验结果可以看出(5S,6S)-仲戊基TeA在200-300 nm处出现两个正的CE效应(科顿效应Cotton effect)两个峰的峰值分别为228nm和 278nm。(5S,6S)-仲己基TeA在200-300nm处也出现两个正的CE效应(科顿效应Cotton effect)两个峰的峰值分别为225nm和280nm。随后通过计算机模拟出(5S,6S)-仲戊 基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA的ECD图谱可以看出(5S,6S)-仲戊基TeA的理论值 在200-300nm处出现了两个正的CE效应，两个峰分别在237nm和269nm处出现；(5S, 6S)-仲己基TeA的理论值在200-300nm处同样出现了两个正的CE效应，两个峰分别 在228nm和275nm处出现。实验值和理论值可以较好的拟合，说明本发明两种化合物 的的绝对构型为SS型。
表1 SS构型的仲戊基TeA和仲己基TeA理论值和实验值在ECD谱中的出峰位置
Figure BDA0003012766330000061
制备实施例2(本发明两种化合物的化学合成方法)
可以按照以下步骤合成上述两种化合物：L-氨基酸为初始物和甲醇在酸性条 件下反应，用甲醇钠中和产物后再与双乙烯酮或酰卤反应，最后在醇钠存在下反 应得到产物。
Figure BDA0003012766330000071
其中，R＝CH2CH2CH3或CH2CH2CH2CH3。
制备实施例3：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成
在1000mL三口瓶中加入500mL无水甲醇，于冰盐浴中冷至-8℃，搅拌下 缓慢滴加1.2mol(143g)氯化亚砜(滴加时温度保持在0℃以下)，滴完后在0℃ 以下搅拌反应1h,加1mol(145.2g)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸，升温至室温(内 温25℃左右)搅拌反应3h，加热回流(内温65℃左右)反应4h。
减压抽去未反应氯化亚砜和HCl,抽干后再加入无水甲醇，继续减压抽出未 反应氯化亚砜和HCl,反复数次，直到无氯化亚砜和HCl为止。剩余物为无色 (2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐结晶体。用乙酸乙酯重结晶，抽滤，干燥， 得(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐结晶。
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加入(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双 乙烯酮(1.05mol)，室温搅拌16h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2 次，水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取，Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例4：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成同实施例3
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流3h，减压脱溶，加水50mL，用乙醚反复 萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙醚萃取，Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉-2-酮 ((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例5：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3。
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成同实施例3。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(1mol)，回流5h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯反 复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例6：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加入(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双 乙烯酮(1.5mol)，室温搅拌16h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2次， 水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例7：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加入(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双 乙烯酮(1.05mol)，-10℃搅拌24h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2 次，水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例8：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加入(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双 乙烯酮(1.05mol)，50℃搅拌8h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2次， 水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例9：(5S,6S)-仲戊基TeA(I-i)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐的合成同实施例3
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加入(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双 乙烯酮(1.05mol)，100℃搅拌2h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2 次，水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲戊基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基己酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(-S-仲戊基)吡咯啉 -2-酮((5S,6S)-仲戊基TeA)。
制备实施例10：(5S,6S)-仲己基TeA(I-ii)的合成
(1)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯盐酸盐的合成
在1000mL三口瓶中加入500mL无水甲醇，于冰盐浴中冷至-8℃，搅拌下 缓慢滴加1.2mol(190.8g)氯化亚砜(滴加时温度保持在0℃以下)，滴完后在0℃ 以下搅拌反应1h,加1mol(159g)(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸，升温至室温(内 温25℃左右)搅拌反应3h，加热回流(内温65℃左右)反应4h。
减压抽去未反应氯化亚砜和HCl,抽干后再加入无水甲醇，继续减压抽出未 反应氯化亚砜和HCl,反复数次，直到无氯化亚砜和HCl为止。剩余物为无色 (2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯盐酸盐结晶体。用乙酸乙酯重结晶，抽滤，干燥， 得(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯盐酸盐结晶。
(2)N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的1000mL四口瓶中加(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯盐酸盐(1mol)，滴加双乙 烯酮(1.05mol)，室温搅拌16h，用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2次， 水洗至中性，Na2SO4干燥，抽滤，减压脱溶，得黄色油状物。
(3)(5S,6S)-仲己基TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌(密封)、恒压滴液漏斗、带CaCl2干燥管的回流 管的250mL四口瓶中加入N-乙酰乙酰基-(2S,3S)-2-氨基-3-甲基庚酸甲酯(0.1 mol)，甲醇，甲醇钠(0.95mol)，回流2h，减压脱溶，加水50mL，用乙酸乙酯 反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3M HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取， Na2SO4干燥，抽滤，脱溶，得橙色固体(S)-3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2- 酮((5S,6S)-仲己基TeA)。
制备实施例11单一手性的TeA、仲戊基TeA、仲己基TeA及非单一手性的 (5RS,6RS)-TeA、(5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己基TeA的合成
按照实施例2中的步骤合成上述化合物：对应手性的氨基酸为初始物和甲醇 在酸性条件下反应，用甲醇钠中和产物后再与双乙烯酮或酰卤反应，最后在醇钠 存在下反应得到产物。
表2.根据以上方法合成的TeA、仲戊基TeA和仲己基TeA几种不同旋光异构体其物理表征
Figure BDA0003012766330000111
Figure BDA0003012766330000121
除草活性实施例12：不同种处理对紫茎泽兰的致毒性比较
取TeA、仲戊基TeA和仲己基TeA的对应4种单一构型化合物及分单一手 性的(5RS,6RS)–TeA、(5RS,6RS)-仲戊基TeA、(5RS,6RS)-仲己基TeA，先用少量 甲醇溶解后，再用去离子水配制25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1浓度的溶液，同时设相当浓度甲醇溶剂对照和清水对照。取紫茎泽兰植株生长一 致的叶片若干，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗，吸干叶面水分，将叶片背 面朝上放在铺有湿润滤纸的培养皿里；在叶背面离叶缘1-2cm处用解剖针针刺造 成轻微伤害；用200μL移液器移取20μL不同浓度的毒素溶液滴加于针刺孔处， 每处理重复6次以上，在25℃、自然光照下保湿放置48h后测量病斑直径。
表3表明本发明2种化合物对紫茎泽兰有较高的致毒性，且随着浓度的提高 紫茎泽兰病斑变大。单一手性化合物：(5S,6S)-TeA、(5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)- 仲己基TeA在25μg·mL-1浓度下即分别形成6.10mm、16.93mm和18.53mm的病 斑，在最高浓度200μg·mL-1下(5S,6S)-TeA可致使紫茎泽兰产生直径大于15mm 的病斑，(5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA可致使紫茎泽兰产生直径大于 30mm的病斑，病斑基本蔓延了整个叶片。而构型为(5R,6S)和(5S,6R)的三种对 应化合物的活性就明显弱于(5S,6S)构型化合物，构型为(5R,6R)的三种化合物活性 最弱，对紫茎泽兰的致病性最小。对于非单一手性化合物：(5RS,6RS)-TeA、 (5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己基TeA。由于它们都含有构型为(5S,6S)的 活性成分，也表现出一定的致病性，但是在最高浓度下的病斑直径也明显小于对应的 SS构型化合物，也就是说，本发明2种化合物可以在仅为非单一手性化合物浓度 的1/2甚至1/3时，能够产生与非单一手性化合物相同大小的病斑。由此可见本 发明2种(5S,6S)构型化合物对紫茎泽兰的毒害程度远远高于对应的非单一手性及 其他构型的化合物。
表3不同处理对紫茎泽兰的致毒性比较
Figure BDA0003012766330000122
Figure BDA0003012766330000131
Figure BDA0003012766330000141
除草活性实施例13：4种化合物对不同杂草叶片的致病性
取(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA、(5RS,6RS)-仲戊基TeA、(5RS,6RS)-仲己基TeA，先用少量甲醇溶解后，再用去离子水配制成100μg·mL-1浓度的溶液， 同时设相当浓度甲醇溶剂对照和清水对照。取不同杂草叶片若干，用自来水冲洗 干净，再用无菌水冲洗，吸干叶面水分，将叶片背面朝上放在铺有湿润滤纸的培 养皿里；在叶背面离叶缘1-2cm处用解剖针针刺造成轻微伤害；用200μL移液 器移取20μL不同浓度的毒素溶液滴加于针刺孔处，每个处理重复6次以上，在 25℃、自然光照下保湿放置48h后测量病斑直径。
由表4数据可以看出，在100μg·mL-1浓度下，由(5S,6S)-仲戊基TeA处理后 的各供试杂草叶片，所产生的的病斑直径均在18mm以上；(5S,6S)-仲己基TeA 处理后的各供试杂草叶片，所产生的的病斑直径均在21mm以上。同一处理条件 下单一手性的化合物所产生的病斑直径是对应的非单一手性化合物的2倍以上。
表4 4种处理对不同杂草的致毒性比较
Figure BDA0003012766330000142
Figure BDA0003012766330000151
除草活性实施例14：4种化合物对不同杂草叶片光合作用的影响
取(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA、(5RS,6RS)-仲戊基TeA、(5RS,6RS)-仲己基TeA各1g，分别用10mL甲醇溶解后再用蒸馏水分别配制6μg·mL-1、12 μg·mL-1、24μg·mL-1、48μg·mL-1溶液；取马唐、拟南芥、紫茎泽兰、反枝苋叶 片，用打孔器将4种叶片打成直径为7mm的叶圆片，分别放入配制好的(5S,6S)- 仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA、(5RS,6RS)-仲戊基TeA、(5RS,6RS)-仲己基TeA 中，真空抽虑15min，400μmol(photos)m-2s-1光强条件下25℃分别处理6h后， 利用植物效率仪(HandyPEA)，测定叶绿素荧光参数。每个浓度测试30个叶圆 片。
表5-6中的测试结果表明，随着供试化合物浓度的增加，对4种杂草的光合 作用抑制程度增强，本发明2种化合物的抑制强度远大于其他化合物且(5S,6S)- 仲己基TeA的抑制程度最高。例如，当供试化合物的浓度为6μg·mL-1时，本发 明2种化合物对杂草的综合性能指数PIABS和光系统II电子向QA以后部位传递的效 率ΨEo已经降为空白对照组的30％-50％。而对于其余2种非单一手性化合物，此 时的两个参数与对照相比降低的幅度明显小于前两者，说明对杂草的光合作用抑 制程度较弱。当供试化合物的浓度逐步增大至24μg·mL-1时，本发明2种化合物 对杂草的PIABS和ΨEo迅速下降；而其他2种化合物随着浓度的增加对杂草的PIABS和ΨEo仅是缓慢下降，且下降幅度明显低于本发明2种化合物。当供试化合物的 浓度达到48μg·mL-1时，本发明2种化合物对杂草的PIABS值接近1甚至小于1， ΨEo接近0。以紫茎泽兰为例，当供试化合物浓度为48μg·mL-1时，本发明2种化 合物的PIABS值分别为1.04、0.47，ΨEo分别为0.02和0.01，说明此时2种化合物 对紫茎泽兰的光合作用抑制程度已经很强了。而对于其余2种对照化合物，PIABS和ΨEo虽然有所下降，但是它们对紫茎泽兰的光合作用抑制程度要远远弱于本发 明的(5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA。
表5 4种化合物对不同杂草叶片光合特征参数PIABS的影响
Figure BDA0003012766330000161
表6 4种化合物对不同杂草叶片光合特征参数ΨEo的影响
Figure BDA0003012766330000171
另外，发明人对4种化合物对4种杂草叶片光合作用的半抑制浓度也进行了 测试，测试结果见表7-8。由表7-8中的数据可以看出，本发明2种化合物对杂草 的光合作用的半抑制浓度均明显低于对照化合物。
表7 4种化合物对4种杂草叶片光合参数PIABS半抑制浓度(I50)比较
Figure BDA0003012766330000172
表8 4种化合物对4种杂草叶片光合参数ΨEo半抑制浓度(I50)比较
Figure BDA0003012766330000181
综合以上数据可知，达到相同的抑制程度，2种供试化合物所需的用量仅为 对应两种非单一手性化合物的1/3-1/2。
除草活性实施例15：(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA对植物放氧速率的影响
分别取少量(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA，先用少量甲醇溶解后， 再用去离子水配制成6μg·mL-1、12μg·mL-1、24μg·mL-1、48μg·mL-1浓度的溶 液，同时设相当浓度的(5RS,6RS)-仲戊基TeA、(5RS,6RS)-仲己基TeA对照、甲醇 溶剂对照和清水对照，用不同浓度的化合物处理4种杂草的类囊体，加入反应介 质(5mM NH4Cl、4mM K3Fe(CN)6、2mM对苯二胺，50mM Hepes-KOH(pH＝7.6)， 利用氧电极测定放氧速率。试验统计结果见表9。
表9中的测试结果表明，随着供试化合物浓度的增加，对4种杂草的PSII 放氧速率的抑制程度增强，本发明2种化合物的抑制强度远大于其他化合物。以 最敏感的紫茎泽兰为例，当浓度为48μg·mL-1时，由本发明2种化合物处理后的 紫茎泽兰类囊体PSII的放氧活性分别为5.21μmol O2 mg-1Chl h-1和2.35μmol O2 mg-1Chl h-1，分别为空白对照的3.8％和1.7％，说明此时2种化合物对紫茎泽兰的 放氧速率抑制程度已经很强了。而对于其余2种化合物放氧活性参数虽然有所下 降，但是它们的抑制程度要远远弱于本发明2种化合物。
表9 4种化合物对不同杂草类囊体PSII放氧速率的影响
Figure BDA0003012766330000182
Figure BDA0003012766330000191
另外，发明人对4种化合物对4种杂草叶片光合作用的半抑制浓度也进行了测试，测试结果见表10。由表10中的数据可以看出，本发明2种化合物对杂草放氧速率的半 抑制浓度均明显低于对照化合物，仅为对应非单一手性的1/2-1/3。
表10 4种化合物对不同杂草类囊体放氧速率半抑制浓度(I50)的影响
Figure BDA0003012766330000192
除草活性实施例16：本发明2种化合物生测
取少量(5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA，先用少量甲醇溶解后，用 去离子水配制成10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1浓 度的溶液，同时设相当浓度的(5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己基TeA对照 和清水对照。取温室盆钵种植的紫茎泽兰倒5叶叶片，针刺点滴3μL药剂，每个 处理重复4次，施药后5d统计发病情况。病害统计结果见表11。
表11 4种化合物引起紫茎泽兰叶片病斑统计(直径mm)
Figure BDA0003012766330000201
由表11中的数据可知，(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA对紫茎泽兰叶 片具有明显的致病性，且高于它们的消旋的混合物。从10μg·mL-1处理就显现出明显 的病斑。不受理论的限制，产生这种效果可能是由于本发明2种化合物的具有单一手 性，因此它们和D1蛋白的结合更紧密。
除草活性实施例17：本发明2种化合物对盆钵幼苗的有效性
取少量(5S,6S)-仲戊基TeA和(5S,6S)-仲己基TeA用甲醇溶解，后用去离子水 配制成62.5μg·mL-1、125μg·mL-1、250μg·mL-1、500μg·mL-1、1000μg·mL-1浓度的 溶液，同时设相当浓度的(5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己基TeA对照和清 水对照。对温室盆钵种植的不同种类三叶期杂草幼苗进行茎叶处理。用药量为 100mL/m2，每个处理重复4次，施药后5d统计发病情况。病害统计结果见表12。
表12表明施药后5d，(5S,6S)-仲戊基TeA、(5S,6S)-仲己基TeA对16种供试 杂草的致病性随其浓度的增大而增强。由表12中的ED50值和ED90值可以看出， 本发明2种化合物的ED50和ED90要明显低于(5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)- 仲己基TeA，说明达到相同的控草效果，(5RS,6RS)-仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己 基TeA所需的浓度是本发明两种化合物的2-3倍。以马唐为例，经(5S,6S)-仲戊基 TeA和(5S,6S)-仲己基TeA处理后的马唐，其ED50分别为74.97μg·mL-1和60.75 μg·mL-1，ED90分别为185.82μg·mL-1、145.76μg·mL-1，相同条件下经(5RS,6RS)- 仲戊基TeA和(5RS,6RS)-仲己基TeA处理后，马唐的ED50为238.96μg·mL-1、194.42 μg·mL-1；ED90为408.80μg·mL-1、364.41μg·mL-1。综上所述，单一手性的两种化 合物与非单一手性相比药效的确提高2-3倍，达到相同的除草效果本发明的2种 供试化合物的用量仅为同种非单一手性化合物的1/3-1/2。
由表12中的数据可知，包含本发明2种化合物的除草剂可以广谱地防除农 田主要杂草，尤其用于防除禾本科杂草，阔叶杂草及莎草等，并且这些化合物的 除草活性明显高于对应的非单一手性化合物。这2种单一手性化合物光合作用抑 制活性和除草活性的都更高。不受理论的限制，产生这种效果可能是由于本发明 2种化合物的具有单一手性，因此它们和D1蛋白的结合更紧密。
表12 4种化合物对不同杂草进行茎叶处理后ED50和ED90的比较
Figure BDA0003012766330000211
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Claims (4)

1.式(I)所示的吡咯烷酮衍生物旋光异构体在制备除草剂中的应用，
Figure FDA0003012766320000011
其中，R选自CH2CH2CH3或CH2CH2CH2CH3，5位和6位的空间构象是S型旋光异构体，所述的吡咯烷酮衍生物旋光异构体分别为3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲戊基)吡咯啉-2-酮和3-乙酰基-4-羟基-5-(S-仲己基)吡咯啉-2-酮。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的式(I)所示的吡咯烷酮衍生物5位和6位的空间构象是S型旋光异构体在制备防除阔叶杂草、禾本科杂草或莎草的除草剂中的应用。
3.一种除草剂，其特征在于以权利要求1中式(I)所示的吡咯烷酮衍生物5位和6位的空间构象是S型旋光异构体作为有效成分，且有效成分浓度为10-200μg·mL-1。
4.根据权利要求3所述的除草剂，其特征在于所述的有效成分浓度为10-80μg·mL-1。
CN202110380568.0A 2021-04-09 2021-04-09 手性吡咯烷酮衍生物的除草应用 Pending CN113214130A (zh)

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