CN113203716A - 超分辨三维扫描成像系统 - Google Patents

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王继光
李永红
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Abstract

本发明公开了一种超分辨三维扫描成像系统，包括：三维平移台，其用以放置样品；无限远校正光学系统，其按照对样品扫描成像的传输方向依次包括物镜、角度放大器和第一聚焦透镜，角度放大器靠近物镜设置；圆形针孔，其位于第一聚焦透镜的焦点处，经第一聚焦透镜汇聚后的光穿过圆形针孔，被探测器接收，以便获得样品的超分辨图像；其中，物镜和第一聚焦透镜之间的距离以可调节的方式设置，以便于增大物镜和第一聚焦透镜的距离时减少位于物镜非焦点、并经过物镜的光穿过圆形针孔。该成像系统既能够减少位于物镜的非焦点、并经过物镜的光穿过圆形针孔，也能够突破光轴方向的光学衍射极限，增加光轴上的轴向分辨率。

Description

超分辨三维扫描成像系统
技术领域
本发明涉及显微镜成像技术领域。更具体地说，本发明涉及一种超分辨三维扫描成像系统。
背景技术
现在，三维扫描成像的应用越来越普遍。但是，目前的共聚焦成像系统只能在垂直方向上改变显微物镜的位置，或者改变样品的位置，以实现对样品的三维扫描成像。对于单点扫描共聚焦或现有超分辨的光路来说，物镜和筒镜的距离是固定的(大概200mm)，以及扫描透镜和聚焦透镜的距离也是200mm左右，因此，所有的人都认为系统的Z像分辨率仅由物镜的数值孔径NA和针孔的大小决定。发光点位于物镜焦点时，其发射的光从物镜和扫描透镜出来的都是平行光，即增加扫描透镜和聚焦透镜的距离不会影响穿过针孔的比例，即探测器得到信号强度始终保持一致。物镜和筒镜的距离不能随意增加，两者的距离一般为两者的焦距的和。但是，当发光点在物镜焦点的前后时，其发射的光从物镜和扫描透镜出来的都不再是平行光。扫描透镜和聚焦透镜的距离越大，与物镜焦点的距离小于物镜的轴向分辨率的发光点发射的光穿过针孔的比例越小，即探测器得到信号强度越来越弱。当距离足够大时，可认为任何不在焦点上的发光点发射的光都不能穿过针孔，即探测器得到信号强度约等于0。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种超分辨三维扫描成像系统，该成像系统既能够减少位于物镜的非焦点、并经过所述物镜的光穿过圆形针孔，也能够突破光轴方向的光学衍射极限，增加光轴上的轴向分辨率。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种超分辨三维扫描成像系统，包括：
三维平移台，其用以放置样品；
无限远校正光学系统，其按照对样品扫描成像的传输方向依次包括物镜、角度放大器和第一聚焦透镜，所述角度放大器靠近所述物镜设置；
圆形针孔，其位于所述第一聚焦透镜的焦点处，经所述第一聚焦透镜汇聚后的光穿过所述圆形针孔，被探测器接收，以便获得样品的超分辨图像；
其中，所述物镜和所述第一聚焦透镜之间的距离以可调节的方式设置，以便于增大所述物镜和所述第一聚焦透镜的距离时减少位于所述物镜非焦点、并经过所述物镜的光穿过所述圆形针孔。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，在所述物镜和所述角度放大器之间，按照对所述样品扫描成像传输方向还依次设置有筒镜、扫描透镜和XY扫描振镜，以便于逐点扫描位于所述三维平移台上的样品。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述三维平移台上的样品被激光激发后发射荧光，样品发射的荧光经过所述物镜成像。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括：
光纤，其用以传输激光；
准直镜，其对从光纤输出的激光进行准直，变成准直的激光；
二色分光镜和第二聚焦透镜，准直的激光依次经过所述二色分光镜和所述第二聚焦透镜后，再依次经过所述圆形针孔、所述第一聚焦透镜、所述角度放大器、所述XY扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜和所述物镜，然后对位于所述三维平移台上的样品进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔被探测器接收具体包括：穿过所述圆形针孔后，先透过所述第二聚焦透镜，然后所述二色分光镜将样品发射的荧光从准直的激光中分离出来，转向所述探测器。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括：
光源，其用以发射激光；
扩束镜，其用以对光源发射的激光进行扩束；
第二聚焦透镜和二色分光镜，激光被扩束后依次经过所述第二聚焦透镜和所述二色分光镜后，再依次经过所述圆形针孔、所述第一聚焦透镜、所述角度放大器、所述XY扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜和所述物镜，然后对位于所述三维平移台上的样品进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔被探测器接收具体包括：穿过所述圆形针孔后，所述二色分光镜将样品发射的荧光从扩束后的激光中分离出来，转向第三聚焦透镜，经过所述第三聚焦透镜后进入所述探测器。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括一发射滤光镜，其设置在所述探测器的前面，用以将其它波段的杂光过滤掉，使所述探测器只接收样品发射的荧光。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述三维平移台以可旋转的方式设置，且所述物镜的光轴与所述三维平移台平面呈倾斜设置，旋转所述三维平移台至0度、120度和240度三个位置，在这三个位置均对样品进行XYZ方向扫描，得到三组在物镜光轴方向上的XYZ图像，计算机对获得的三组XYZ图像进行计算，重构得到超分辨三维扫描图像。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述物镜的光轴与所述三维平移台平面之间的夹角为35.264度，以便于从三个互相垂直的方向分别对样品进行XYZ的三维扫描成像。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述探测器为光电探测器，所述光电探测器接收被激发的样品发射的荧光并将其转为电信号。
优选的是，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述圆形针孔的直径为
Figure BDA0002994583220000031
其中，NA为所述第一聚焦透镜的数值孔径，λ为样品发射的荧光的波长；在所述物镜和所述筒镜之间还设置有反射镜。
本发明至少包括以下有益效果：本发明在所述物镜和所述第一聚焦透镜之间设置了角度放大器，能够放大来自于位于物镜非焦点、并经过物镜的光的偏转角和发散角，以减少位于物镜非焦点、并经过物镜的光穿过圆形针孔；且所述物镜和所述第一聚焦透镜之间的距离以可调节的方式设置，能够方便地调节物镜和第一聚焦透镜之间的距离，以便于增大所述物镜和所述第一聚焦透镜的距离时进一步减少位于所述物镜非焦点、并经过所述物镜的光穿过所述圆形针孔，同时提高了Z轴的分辨率。当所述物镜和所述第一聚焦透镜的距离增加得足够大时，总能使物镜视场里两个点之间任意小的轴向距离通过第一聚焦透镜的作用得到成像放大，也就是说本发明的设置能够使轴向分辨率达到任意需要的尺寸。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一实施例中超分辨三维扫描成像系统结构示意图；
图2为本发明另一实施例中超分辨三维扫描成像系统结构示意图；
图3为本发明实其中一施例中旋转三维平移台至三个不同角度的位置示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
如图1所示，本发明实施例提供了一种超分辨三维扫描成像系统，包括：三维平移台1，其用以放置样品2；无限远校正光学系统，其按照对样品扫描成像的传输方向依次包括物镜3、角度放大器8和第一聚焦透镜9，所述角度放大器8靠近所述物镜3设置；圆形针孔10，其位于所述第一聚焦透镜9的焦点处，经所述第一聚焦透镜9汇聚后的光穿过所述圆形针孔10，被探测器16接收，以便获得样品的超分辨图像；其中，所述物镜3和所述第一聚焦透镜9之间的距离以可调节的方式设置，以便于增大所述物镜3和所述第一聚焦透镜9的距离时减少位于所述物镜非焦点、并经过所述物镜3的光穿过所述圆形针孔10。
在上述实施例中，本发明在所述物镜3和所述第一聚焦透镜9之间设置了角度放大器8，能够放大来自于位于物镜非焦点、并经过物镜的光的偏转角和发散角，以减少位于物镜非焦点、并经过物镜的光穿过圆形针孔；且所述物镜3和所述第一聚焦透镜9之间的距离以可调节的方式设置，能够方便地调节物镜3和第一聚焦透镜9之间的距离，以便于增大所述物镜3和所述第一聚焦透镜9的距离时进一步减少位于所述物镜非焦点、并经过所述物镜的光穿过所述圆形针孔，同时提高了Z轴的分辨率。当所述物镜3和所述第一聚焦透镜9的距离增加得足够大时，总能使物镜视场里两个点之间任意小的轴向距离通过第一聚焦透镜的作用得到成像放大，也就是说本发明的设置能够使轴向分辨率达到任意需要的尺寸。
需要说明的是，关于增加两个聚焦透镜之间的距离能够提高光轴上两个点成像分辨率的问题，现列举具体的例子来进行说明。根据成像公式1/u+1/v＝1/f计算，u是物距，v是像距，f是透镜的焦距，若使用两个f＝50mm、NA＝0.02，相距500mm的透镜，对光轴上位置为52mm和50mm的两个荧光点成像(波长为488nm)，成像得到的两个光斑相距2.94mm；而当两个f＝50mm、透镜的距离缩短为100mm时，成像得到的两个光斑相距2.00mm。因为NA＝0.02时，透镜的轴向分辨率2nλ/NA2＝2.44mm，其中，n为透镜的折射率，所以，两个透镜相距500mm的成像系统可以分辨光轴上两个位置为52mm和50mm的荧光点，而两个透镜相距100mm的成像系统不可以分辨光轴上位置为52mm和50mm的两个荧光点。若使用两个f＝200mm、NA＝0.02，相距500mm的透镜，对光轴上两个位置为202mm和200mm的荧光点成像(488nm)，成像得到的两个光斑相距2.01mm。因为NA＝0.02时，透镜的轴向分辨率2nλ/NA2＝2.44mm，所以，相距500mm的两个f＝200mm、NA＝0.02透镜组成的成像系统，不可以分辨光轴上两个位置为52mm和50mm的荧光点。因此，能不能分辨光轴上两个位置的荧光点，和透镜之间的距离，轴向的分辨率，透镜的焦距都有很大的关系。
还需要说明的是，关于如何调节所述物镜3和所述第一聚焦透镜9之间的距离，本发明实施例不做具体限定，只要是能实现该功能的调节装置均可。
为了便于扫描样品，在其中一具体实施方式中，所述的超分辨三维扫描成像系统，在所述物镜和所述角度放大器之间，按照对所述样品扫描成像传输方向还依次设置有筒镜、扫描透镜和XY扫描振镜，以便于逐点扫描位于所述三维平移台上的样品。
在其中一具体实施方式中，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述三维平移台1上的样品2被激光激发后发射荧光，样品发射的荧光经过所述物镜3成像。除了被激光激发发射的荧光，样品的反射光或者自发光，均可，本发明并不做具体的限定。
在其中一具体实施方式中，如图1所示，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括：
光纤14，其用以传输激光；
准直镜13，其对从光纤14输出的激光进行准直，变成准直的激光；
二色分光镜12和第二聚焦透镜11，准直的激光依次经过所述二色分光镜12和所述第二聚焦透镜11后，再依次经过所述圆形针孔10、所述第一聚焦透镜9、所述角度放大器8、所述XY扫描振镜7、所述扫描透镜6、所述筒镜5和所述物镜3，然后对位于所述三维平移台1上的样品2进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔10被探测器16接收具体包括：穿过所述圆形针孔10后，先透过所述第二聚焦透镜11，然后所述二色分光12镜将样品发射的荧光从准直的激光中分离出来，转向所述探测器16。
在其中一具体实施方式中，如图2所示，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括：
光源18，其用以发射激光；
扩束镜17，其用以对光源发射的激光进行扩束；
第二聚焦透镜11和二色分光镜12，激光被扩束后依次经过所述第二聚焦透镜11和所述二色分光镜12后，再依次经过所述圆形针孔10、所述第一聚焦透镜9、所述角度放大器8、所述XY扫描振镜7、所述扫描透镜6、所述筒镜5和所述物镜3，然后对位于所述三维平移台1上的样品2进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔10被探测器16接收具体包括：穿过所述圆形针孔10后，所述二色分光镜12将样品发射的荧光从扩束后的激光中分离出来，转向第三聚焦透镜19，经过所述第三聚焦透镜19后进入所述探测器16。
在其中一具体实施方式中，所述的超分辨三维扫描成像系统，还包括一发射滤光镜15，其设置在所述探测器16的前面，用以将其它波段的杂光过滤掉，使所述探测器16只接收样品发射的荧光。
在其中一具体实施方式中，如图3(a)，3(b)，3(c)所示，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述三维平移台1以可旋转的方式设置，且所述物镜的光轴与所述三维平移台平面呈倾斜设置所述物镜3的光轴与所述三维平移台1平面呈倾斜设置，旋转所述三维平移台1至0度、120度和240度三个位置，在这三个位置均对样品进行XYZ方向扫描，得到三组在物镜光轴方向上的XYZ图像，计算机对获得的三组XYZ图像进行计算，重构得到超分辨三维扫描图像。对于三维平移台旋转的角度，本发明实施例并不做具体的限定，旋转三维平移台至0度、120度和240度三个位置，只是列举了优选的三个位置；旋转不同的角度，或者选取多于三个的位置，如四个或者五个均可。
在其中一具体实施方式中，如图3(a)，3(b)，3(c)所示，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述物镜的光轴与所述三维平移台平面之间的夹角为35.264度，以便于从三个互相垂直的方向分别对样品进行XYZ的三维扫描成像。当旋转所述三维平移台1至0度、120度和240度三个位置，且物镜3的光轴与三维平移台1平面之间的夹角为35.264度时，正好能使XYZ相互垂直，这样得到的三维扫描图像分辨率更高，若三个扫描方向不互相垂直，分辨率会降低。
在其中一具体实施方式中，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述探测器16为光电探测器，所述光电探测器接收被激发的样品发射的荧光并将其转为电信号。
在其中一具体实施方式中，所述的超分辨三维扫描成像系统，所述圆形针孔10的直径为
Figure BDA0002994583220000071
其中，NA为所述第一聚焦透镜9的数值孔径，λ为样品发射的荧光的波长；在所述物镜3和所述筒镜5之间还设置有反射镜4。保证成像于第一聚焦透镜9焦点的光斑的能量基本都能穿过圆形针孔10，进而被探测器16检测到，成像于轴上第一聚焦透镜9焦点附近的光斑只有一半的能量能通过针孔，即能分辨物镜视场里两个在轴上距离很近的点。
综上，本发明实施例既能够减少位于物镜的非焦点、并经过所述物镜的光穿过圆形针孔，也能够突破光轴方向的光学衍射极限，增加光轴上的轴向分辨率。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，包括：
三维平移台，其用以放置样品；
无限远校正光学系统，其按照对样品扫描成像的传输方向依次包括物镜、角度放大器和第一聚焦透镜，所述角度放大器靠近所述物镜设置；
圆形针孔，其位于所述第一聚焦透镜的焦点处，经所述第一聚焦透镜汇聚后的光穿过所述圆形针孔，被探测器接收，以便获得样品的超分辨图像；
其中，所述物镜和所述第一聚焦透镜之间的距离以可调节的方式设置，以便于增大所述物镜和所述第一聚焦透镜的距离时减少位于所述物镜非焦点、并经过所述物镜的光穿过所述圆形针孔。
2.如权利要求1所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，在所述物镜和所述角度放大器之间，按照对所述样品扫描成像传输方向还依次设置有筒镜、扫描透镜和XY扫描振镜，以便于逐点扫描位于所述三维平移台上的样品。
3.如权利要求2所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，所述三维平移台上的样品被激光激发后发射荧光，样品发射的荧光经过所述物镜成像。
4.如权利要求3所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，还包括：
光纤，其用以传输激光；
准直镜，其对从光纤输出的激光进行准直，变成准直的激光；
二色分光镜和第二聚焦透镜，准直的激光依次经过所述二色分光镜和所述第二聚焦透镜后，再依次经过所述圆形针孔、所述第一聚焦透镜、所述角度放大器、所述XY扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜和所述物镜，然后对位于所述三维平移台上的样品进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔被探测器接收具体包括：穿过所述圆形针孔后，先透过所述第二聚焦透镜，然后所述二色分光镜将样品发射的荧光从准直的激光中分离出来，转向所述探测器。
5.如权利要求3所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，还包括：
光源，其用以发射激光；
扩束镜，其用以对光源发射的激光进行扩束；
第二聚焦透镜和二色分光镜，激光被扩束后依次经过所述第二聚焦透镜和所述二色分光镜后，再依次经过所述圆形针孔、所述第一聚焦透镜、所述角度放大器、所述XY扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜和所述物镜，然后对位于所述三维平移台上的样品进行激光激发；
其中，汇聚后的光穿过所述圆形针孔被探测器接收具体包括：穿过所述圆形针孔后，所述二色分光镜将样品发射的荧光从扩束后的激光中分离出来，转向第三聚焦透镜，经过所述第三聚焦透镜后进入所述探测器。
6.如权利要求4或5所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，还包括一发射滤光镜，其设置在所述探测器的前面，用以将其它波段的杂光过滤掉，使所述探测器只接收样品发射的荧光。
7.如权利要求2所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，所述三维平移台以可旋转的方式设置，且所述物镜的光轴与所述三维平移台平面呈倾斜设置，旋转所述三维平移台至0度、120度和240度三个位置，在这三个位置均对样品进行XYZ方向扫描，得到三组在物镜光轴方向上的XYZ图像，计算机对获得的三组XYZ图像进行计算，重构得到超分辨三维扫描图像。
8.如权利要求7所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，所述物镜的光轴与所述三维平移台平面之间的夹角为35.264度，以便于从三个互相垂直的方向分别对样品进行XYZ的三维扫描成像。
9.如权利要求6所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，所述探测器为光电探测器，所述光电探测器接收被激发的样品发射的荧光并将其转为电信号。
10.如权利要求6所述的超分辨三维扫描成像系统，其特征在于，所述圆形针孔的直径为
Figure FDA0002994583210000021
其中，NA为所述第一聚焦透镜的数值孔径，λ为样品发射的荧光的波长；在所述物镜和所述筒镜之间还设置有反射镜。
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