CN113201472A - Streptococcus sp.121的分离鉴定及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为：Streptococcus sp.121，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：61195。本发明的链球菌Streptococcus sp.121进行发酵培养后可产生较强的抑菌活性物质，对肺炎克雷伯菌和痢疾志贺菌等都有较明显的抑菌作用，在对肺炎克雷伯菌和痢疾志贺菌等所致疾病的防治中具有广阔的发展空间，在抗菌药物方面具有很好的开发应用前景。

Description

Streptococcus sp.121的分离鉴定及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及Streptococcus sp.121的分离鉴定及其应用。
背景技术
链球菌属(Streptococcus)是厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)链球菌科(Streptococcaceae)的模式属。该菌属细菌是化脓性球菌的一类常见细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，大多数不致病。医学上重要的链球菌主要包括化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌等。随着细菌分离鉴定方法的不断进步和发展，特别是分子分类鉴定方法的广泛应用，越来越多的链球菌被发现。同时，截止2020年，该属已经包括了160个种和29个亚种(http://www.bacterio.net/streptococcus.htmL)，近年来有许多动物来源，尤其是野生动物来源的链球菌新种的研究报道。
近年来随着分子水平分类学研究的发展，尤其是16S rRNA序列同源性和化学分类的应用使得链球菌属的分类发生了重大改变。1995年Kawamura首先基于16S rRNA序列的分子系统学研究将链球菌属分为6个群“species groups”，分别为酿脓群(Pyogenic group)、缓症群(Mitis group)、咽峡炎群(Anginosus group)、变异群(Mutans group)、唾液群(Salivarius group)、牛群(Bovis group)。其中缓症群细菌包括缓症链球菌、血液链球菌(有3种生物型)、副血链球菌、格氏链球菌、嵴链球菌、口腔链球菌和肺炎链球菌。咽峡炎群包括的菌种有咽峡炎链球菌、星群链球菌和中间链球菌。变异群包括变异链球菌、表兄链球菌、大鼠链球菌、鼠链球菌、汗毛链球菌和猕猴链球菌等。唾液群包括唾液链球菌、前庭链球菌和嗜热链球菌。牛群包括牛链球菌、非解乳糖链球菌、马链球菌。但能产生α溶血的少酸链球菌(S.acidominimus)和猪链球菌(S.suis，在马血培养基上呈β溶血)仍未分群，而从大鼠体内分离到的野鼠链球菌(S.ferus)可能是包括在变形群的候选株，有待于进行明确的分类。之后先后有学者采用16S rRNA序列以外的其它基因序列如groEL、gyrB等基因序列评估链球菌属内的系统发育关系，将链球菌属分群进一步修正，原来的咽峡炎群包括的咽峡炎链球菌、星群链球菌和中间链球菌归为缓症群A群，野鼠链球菌(S.ferus)归为变异群，少酸链球菌(S.acidominimus)和猪链球菌(S.suis)归为猪链群，到目前为止，公认的链球菌属分群包括酿脓群、缓症群(细分为A群和B群)、变异群、唾液群、牛群和猪链群。Pontigl在2015年发表的《Molecular phylogeny and a taxonomic proposal for the genusStreptococcus》一文中提出在已分群的基础上，把S.gordonii,S.pluranimalium和S.sobrinus建立一个新的群。
抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质。抗菌药物为临床上普遍应用且较为重要的一类药物，随着抗菌药的长期使用，环境细菌不断对之产生抗药性，因此要求不断开发新的抗菌药物以应对这一局面。
目前临床使用的大多数抗菌化合物大多来自陆生土壤和海洋微生物所生产的初级及次级代谢产物，它们种类繁多功能各异，为人类社会的健康事业发展做出了相当大的贡献。但随着人们长期的研究开发，获得新型的抗菌活性物质逐渐变成微生物筛选所存在的一大难题。
近年来，有关鼠类肠道微生物的多样性和生物学功能的研究报道逐渐增多。肠道微生物种类丰富，数量巨大，对宿主的营养代谢、生长发育、生殖繁衍和免疫防御等方面起着重要的作用。鼠类作为野生动物的主要类群，可长期生活在阴暗潮湿且存在大量病原菌的环境中，具有生命力顽强、繁殖力强和抗逆抗病等能力，提示这可能与其肠道内存在丰富的微生物菌群能抵制外来微生物(包括病原菌)的侵染有关。《Cell》上曾发表论文表明野生鼠肠道微生物菌群促进宿主健康并改善抗病性，说明野生鼠适应外界环境，防御外来病原菌入侵的能力与肠道内链球菌的抗菌活性可能存在密切关系。
本研究从海南岛中部山区野生褐家鼠肠道样本中分离到未知链球菌新种Streptococcus sp.121，该菌可产生具有抗菌活性的天然物质，且抗菌谱较广，在褐家鼠抵御外来病原菌入侵的过程中发挥重要的作用。研究该菌，有利于从热带环境的啮齿类动物肠道这一特殊环境种获取新的天然活性物质的链球菌资源提供指导。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种链球菌Streptococcussp.121，具有较强的抑菌活性，在抗菌药物方面具有良好的开发应用前景。
本发明的第一个方面是提供一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为：Streptococcus sp.121，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：61195。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在拮抗肺炎克雷伯菌中的应用。
本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在制备防治肺炎克雷伯菌所致病症药物中的应用。
本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在拮抗痢疾志贺菌中的应用。
本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在制备防治痢疾志贺菌所致病症药物中的应用。
本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物。
本发明的第七个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在拮抗肺炎克雷伯菌中的应用。
本发明的第八个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在制备防治肺炎克雷伯菌所致病症药物中的应用。
本发明的第九个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在拮抗痢疾志贺菌中的应用。
本发明的第十个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在制备防治痢疾志贺菌所致病症药物中的应用。
本发明的链球菌Streptococcus sp.121为革兰阳性，过氧化氢酶阴性，卵圆形，链状排列。采用PCR技术对其进行16S rRNA序列测定，并与Genbank中核苷酸序列进行Blast比对，结果表明Streptococcus sp.121与Streptococcus danieliae,Streptococcussanguinis,Streptococcus koreensis和Streptococcus cristatus的16SrRNA序列相似度最高，identity值分别为97.72％、97.14％、96.75％和96.68％。运用保守基因gyrB进一步开展辅助鉴定，其扩增序列与Genbank中序列进行Blast，结果显示，Streptococcus sp.121的gyrB基因与Streptococcus peroris的相似相似度最高(77.40％)。通过对Streptococcus sp.121进行Pacbio全基因组测序分析，DNA-DNA分子杂交实验表明Streptococcus sp.121与其他已知链球菌的杂交比值介于21.4％～29.3％之间，均低于70％的阈值。对其表型特征和系统发育研究表明Streptococcus sp.121是一个链球菌属新种，基因组大小为2,011,914bp，包含1967个基因，GC含量为42.5mol％。
本发明的链球菌Streptococcus sp.121进行发酵培养后可产生较强的抑菌活性物质，对肺炎克雷伯菌和痢疾志贺菌等都有较明显的抑菌作用，在对肺炎克雷伯菌和痢疾志贺菌等所致疾病的防治中具有广阔的发展空间，在抗菌药物方面具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为Streptococcus sp.121在脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板菌落形态图。
图2为Streptococcus sp.121革兰染色图。
图3为Streptococcus sp.121透视电镜图。
图4为基于16SrRNA基因序列构建的Streptococcus sp.121和链球菌属主要群模式株系统发生关系图。
图5为基于保守基因序列构建的Streptococcus sp.121的进化树。
图6为Streptococcus sp.121的发酵液对肺炎克雷伯菌的抑菌试验结果图。
图7为Streptococcus sp.121的发酵液对痢疾志贺菌的抑菌试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
本发明提供了一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为：Streptococcussp.121，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：61195，保藏日期为2020-09-16。本发明的链球菌Streptococcus sp.121从海南岛中部山区褐家鼠肠道样本中分离、筛选得到。
1 链球菌新种形态学观察
1.1 菌株来源
海南岛褐家鼠肠道标本。取健康成年褐家鼠肠道粘膜标本，采用无菌操作剪取褐家鼠肠段组织置入研磨器中进行研磨(约20mg)，研磨后的粘膜匀浆用300μl脑心浸液(BHI)稀释，然后转移已装有1.5ml PBS的2ml无菌离心管内高速涡旋，之后低速离心，小心吸取约两百微升上清液，用涂布棒均匀涂布于BHI羊血平板上，置于5％CO2培养箱37℃培养，一式三份。
脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板配制方法：牛脑浸粉4.0g，牛心浸粉4.0g，蛋白胨5.0g，酪蛋白胨16.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.5g，琼脂13.5g，加水调总量至1000ml。121℃，15分钟高压蒸汽灭菌，冷却至50℃左右，缓慢加入脱纤维羊血80ml并倾注平板，配成8％的BHI羊血琼脂平板。
1.2形态学观察
将经分离纯化的链球菌新种转接到脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板上，置5％CO2培养箱37℃培养24-48h。Streptococcus sp.121在脑心浸液(BHI)羊血琼脂培养基上37℃培养24h后形成直径0.6-1.0mm，灰白色、圆形隆起、湿润、边缘整齐的针尖状细小菌落(图1)，持续培养48h后，在其菌落周围出现1mm左右的草绿色溶血环。光学显微镜下观察该菌革兰阳性，单个菌体呈球形，成对或数个短链状排列(图2)。电镜下观察该菌呈链球菌典型特征：单个菌体呈现球形或卵圆形，直径约0.5-1.0μm，菌体成对或数个短链状排列，无芽胞、无鞭毛(图3)。
1.3Streptococcus sp.121氯化钠耐受实验
表1 Streptococcus sp.121氯化钠耐受结果
Figure BDA0003032057680000051
Figure BDA0003032057680000061
Streptococcus sp.121在含2.5％NaCl的BHI培养基上生长，在超过2.5％NaCl的BHI培养基上不生长。
1.4Streptococcus sp.121温度耐受实验
表2 Streptococcus sp.121温度耐受结果
4℃ 15℃ 22℃ 35℃ 37℃ 42℃
Streptococcus sp.121 － +(48h后) + +++ ++++ ++
Streptococcus sp.121在22、35、37、42℃培养时生长，4、15℃时不生长。
从形态学方面鉴定可以初步判定Streptococcus sp.121属于链球菌属。但仅从菌落形态和显微观察还不能具体它们属于链球菌属的哪个种为了进一步确定其分类地位，必需对其进行生化及分子生物学的分析。
2生化实验鉴定
2.1API Rapid ID 32Strep生化反应鉴定
将分纯的菌体接种到脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板，置于CO2培养箱37℃培养18-24h。首先记录溶血类型(α或β)和产色素情况(作为补充实验)。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到2ml的API悬浮培养基安瓿瓶里，采用比浊计测定，得到4.0麦氏浊度菌悬液，然后将该菌悬液分装到各反应孔中，每孔55μl，轻微震荡混匀，盖上反应盖，置于CO2培养箱37℃培养4-4.5h之后观察结果，见表1。
2.2API 50CHB生化反应鉴定
将分纯的菌体接种到脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板，置于CO2培养箱37℃培养18-24h。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到1ml蒸馏水中，采用比浊计测定，得到4.0麦氏浊度菌悬液，然后将该菌悬液转移到API50 CHB培养基安瓿瓶中，混匀，然后将该悬液分装到各反应孔中，每孔100μl，最后每孔滴加甘油保湿，盖上反应盖，置于CO2培养箱37℃培养24h之后观察结果，见表1。
2.3API ZYM生化反应鉴定
将分纯的菌体接种到脑心浸液(BHI)羊血琼脂平板，置于CO2培养箱37℃培养18-24h。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到2ml的API悬浮培养基安瓿瓶里，制备浊度为6.0麦氏浊度菌悬液，然后将该菌悬液分装到各反应孔中，每孔65μl，轻微震荡混匀，盖上反应盖，置于CO2培养箱37℃培养4-4.5h之后观察结果，见表1。
表1 Streptococcus sp.121与其他近源链球菌生化反应结果比较
Figure BDA0003032057680000071
3链球菌新种16S rRNA分类鉴定
用无菌Tip头或灭菌牙签挑取疑似新种的单菌落(依据菌落大小、形态、颜色初步判断)作为PCR反应模板，采用引物27F-1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGYTACCTTGTTACGAC TT-3′)进行菌落PCR扩增。扩增产物送广州天一辉远生物科技有限公司测序。
将测序结果放到GenBank中，与GenBank中已知核酸序列进行BLAST比对，结果发现Streptococcus sp.121与所有核酸序列的identity值均低于98％。其中与Streptococcusdanieliae,Streptococcus sanguinis,Streptococcus koreensis和Streptococcuscristatus的16S rRNA序列相似度最高，identity值分别为97.72％、97.14％、96.75％和96.68％。根据Identities≧94.5％判定为同一个属，Identities≧98.7％判定为同一个种的原则，初步判定Streptococcus sp.121为一个链球菌属疑似新种。
采用SeqMan软件、DNA star软件对所得序列进行拼接，正反向检测，并去除载体和引物序列。之后使用MAGA 7.0软件，采用邻近-连接法和最大似然法构建系统进化发生树，最后对所生成的进化树运用Bootstrap进行检验。以肠球菌属Enterococcus faecalisATCC 19433T作为外群。结果如图4所示，可以看出Streptococcus sp.121在聚类树上处在一个独立的进化分支，与Streptococcus danieliae聚成一簇，其Bootstrap支持率是98％，显示出较近的亲缘关系。Streptococcus sp.121与链球菌属其它已知种Blast比对的identity值均低于98％，亲缘关系较远。研究表明从16S rRNA分类水平支持Streptococcussp.121属于链球菌属里一个新种。
4链球菌新种保守基因分类鉴定
为了进一步鉴定链球菌新种的分类地位，研究它们与已知链球菌的亲缘关系远近，本课题针对其保守基因gyrB开展了分类鉴定研究。
Streptococcus sp.121的gyrB扩增序列与Genbank中序列进行Blast比对分析，结果显示与其identity值高的近源种均属于链球菌属的“Mitis group”。由图5可以看出Streptococcus sp.121作为一个单独分支，与Streptococcus danieliae聚成一簇，其Bootstrap支持率是100％，显示出较近的亲缘关系(见图5)，表明从保守基因gyrB分类水平支持Streptococcus sp.121属于链球菌属里一个新种，该菌与Streptococcus danieliae有较近的亲缘关系。该结果与其16S rRNA序列构建的进化树结果相一致。
5链球菌新种基因组学分析
本课题在获得Streptococcus sp.121的纯培养后，进行了全基因组测序，对其基因组基本特征进行了预测分析，并对模式株与链球菌属其他已知种进行了遗传进化分析。
6.1全基因组测序及组装
Streptococcus sp.121的全基因组测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。采用三代测序平台Pacific Biosciences的单分子实时测序技术对Streptococcussp.121全基因组进行测定，采用SMRT Analysis 2.3.0软件包对测序数据进行质控过滤，拼接组装成完整的环状基因组序列。
6.2基因组基本特征分析
运用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/)软件进行编码基因CDS预测，运用tRNAscan-SE和rRNAmmer软件预测基因组中tRNAs和rRNA。运用IslandPath-DIOMB软件进行基因岛预测。本研究通过三代测序平台Pacific Biosciences(PacBio)对从海南岛褐家鼠肠道样本分离到的Streptococcus sp.121进行全基因组测序。Streptococcus sp.121基因组全长2,011,914bp，G+C含量为42.5mol％，编码1,967个基因。
6基因组DNA-DNA杂交
使用DNA-DNA杂交在线软件(genome and genome distance calculator，GGDC)对Streptococcus sp.121的全基因组序列与目前GenBank库中能检索到的链球菌属不同种的代表序列进行在线基因组杂交，DNA-DNA杂交相似性大于70％被划分为同一个种，结果见表2。
从表2可以看出，Streptococcus sp.121与其他已知链球菌的杂交比值介于21.4％～29.3％之间，均低于70％的阈值，说明Streptococcus sp.121不属于任何已知种，是链球菌属的一个新种。
表2链球菌Streptococcus sp.121与已知链球菌不同种基因组杂交结果
Figure BDA0003032057680000091
Figure BDA0003032057680000101
Figure BDA0003032057680000111
7抑菌活性
采用LB发酵培养基对Streptococcus sp.121进行发酵培养获得相应的抗菌活性物质，以滤纸片琼脂扩散法测定发酵液的抑菌作用，具体操作步骤如下，结果见图6和图7，具体分析结果见表3。
7.1Streptococcus sp.121发酵提取物的制备：
用接种环分别在血琼脂平板上挑取形态相似的Streptococcus sp.121单菌落10～15个，接种于1500ml LB发酵培养液(LB发酵培养液包括以下成分的重量配比：胰蛋白胨10.0g/L；酵母提取物5.0g/L；NaCl 10.0g/L；pH7.0)中，每种发酵培养液各1500ml，置37℃摇床以150r/min摇瓶培养60h。发酵培养液以13,000r/min离心15min后，取上清发酵液用乙酸乙酯(1:1)萃取，将得到的乙酸乙酯提取物进行旋蒸浓缩并称重，得到130mg发酵提取物，将发酵提取物用甲醇溶解稀释为1mg/10μl，置于4℃保存备用。
7.2测试菌株(肺炎克雷伯菌、痢疾志贺菌)MH平板的制备：
用接种环分别在血琼脂平板上挑取形态相似的肺炎克雷伯菌、痢疾志贺菌5～10个，分别接种于LB液体培养基中，过夜培养后，用灭菌蒸馏水进行倍比稀释，将菌液浓度调整为108CFU/ml。然后用无菌棉签沾取肺炎克雷伯菌、痢疾志贺菌菌液，在管壁上挤去多余的菌液后，分别涂布于MH平板上，待干。
7.3测试方法(滤纸片琼脂扩散法)：
分别取三张直径0.6cm的无菌滤纸片：一张滴加50μl甲醇溶液(作为阴性对照)，一张滴加50μl浓度为1mg/ml的氨苄青霉素(作为测试菌株肺炎克雷伯菌的阳性对照)或50μl浓度为1mg/ml的卡那霉素(作为测试菌株痢疾志贺菌的阳性对照)，一张滴加50μl浓度为1mg/10μl的Streptococcus sp.121的发酵提取物。用无菌镊子分别夹取这三张滤纸片，贴到已经涂布测试菌株菌液的MH平板上。完成上述操作后，将培养皿于37℃培养箱培养16-20h后，用游标卡尺测量各抑菌圈大小，平行测定3次，计算取其平均值。
表3 Streptococcus sp.121发酵提取物的抑菌结果
Figure BDA0003032057680000121
Figure BDA0003032057680000131
从表3的抑菌活性分析结果可以看出，本发明的Streptococcus sp.121菌株在LB发酵培养液中进行培养，产生较强的抑菌活性物质，对肺炎克雷伯菌和痢疾志贺菌都有较明显的抑菌作用。因此，本发明的菌株在抗菌药物方面具有潜在的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种链球菌，其特征在于，命名为：Streptococcus sp.121，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：61195。
2.如权利要求1所述的链球菌在拮抗肺炎克雷伯菌中的应用。
3.如权利要求1所述的链球菌在制备防治肺炎克雷伯菌所致病症药物中的应用。
4.如权利要求1所述的链球菌在拮抗痢疾志贺菌中的应用。
5.如权利要求1所述的链球菌在制备防治痢疾志贺菌所致病症药物中的应用。
6.权利要求1所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物。
7.如权利要求6所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在拮抗肺炎克雷伯菌中的应用。
8.如权利要求6所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在制备防治肺炎克雷伯菌所致病症药物中的应用。
9.如权利要求6所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在拮抗痢疾志贺菌中的应用。
10.如权利要求6所述的链球菌的发酵液、或发酵液离心后的上清发酵液、或上清发酵液的提取物在制备防治痢疾志贺菌所致病症药物中的应用。
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