CN113186311A - 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用 - Google Patents

阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113186311A
CN113186311A CN202110458431.2A CN202110458431A CN113186311A CN 113186311 A CN113186311 A CN 113186311A CN 202110458431 A CN202110458431 A CN 202110458431A CN 113186311 A CN113186311 A CN 113186311A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus
clostridium
pelvic pain
chronic pelvic
reuteri
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110458431.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113186311B (zh
Inventor
王姝
钞晓培
刘阳
郎景和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences filed Critical Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority to CN202110458431.2A priority Critical patent/CN113186311B/zh
Publication of CN113186311A publication Critical patent/CN113186311A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113186311B publication Critical patent/CN113186311B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其针对阴道微生物在慢性盆腔痛综合征(CPPS)鉴别诊断中的应用。本发明提供检测慢性盆腔痛综合征生物标志物含量的试剂在制备慢性盆腔痛综合征鉴别产品中的用途。本发明提供一组子宫内膜异位症(EM)/子宫腺肌症(AM)相关CPP的生物标志物，Clostridium disporicum，Lactobacillus reuteri和/或CA125可用于EM/AM相关CPP的早期诊断和鉴别诊断，检测特异性好，灵敏度高，用于EM/AM相关CPP患者的鉴别、指导临床治疗，使该类患者能从治疗中获得更佳治疗效果。

Description

阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用。
背景技术
慢性盆腔痛综合征(Chronic Pelvic Pain Syndrome，CPPS)是女性常见的疼痛问题之一，与多种妇科疾病有关，其定义为持续至少6个月的小腹或盆腔间歇性或连续性疼痛。以CPP为主诉的患者占所有妇科门诊就诊人数的2-10％，其中约20％接受了腹腔镜探查手术，10-15％的妇女接受了子宫切除术。但是，人们对CPP的认识仍然匮乏，并且CPP的诊断较为困难。
CPPS是一种多因素综合征，其病因多样，并含有包括感染，炎症、其它一些关键因素在内的潜在致病原因。根据英国皇家妇产科学院(RCOG)的研究，导致疼痛的病因可分为妇科和非妇科因素。前者包括子宫内膜异位/子宫腺肌病(EM/AM)，盆腔充血综合征，平滑肌瘤，恶性疾病，盆腔炎，粘连等。目前关于AM及EM有明确有效的治疗方案，但在诊断不明时则不能为该类患者提供有效的非手术治疗。若可将EM/AM相关CPP从其它病因所致CPP患者中鉴别出来，则可使EM/AM相关CPP患者得到更有效的治疗，充分缓解其临床症状，改善其生活质量。目前对EM及AM的诊断主要依赖于影像学检查，包括B超及核磁共振(MRI)。在AM的诊断中，B超诊断的敏感性为75％-88％、特异性为67％-93％，而MRI的准确率为85％-95％，特异性为67％-99％。MRI由于成本高，临床应用受限。此外，值得注意的是，B超和MRI在诊断AM、EM时多处于疾病的晚期，不能实现早诊早治。
随着微生物学的发展以及对微生物在疾病中作用的理解，研究人员开始意识到微生物作为疾病诊断的潜在生物标记物的价值。目前，尚无经过验证的生物标记物可将EM/AM相关的CPP与其他疾病引起的CPPS区分开。模棱两可的诊断不能使该类患者获得更具针对性及有效性的非手术治疗。因此，应探索更加精准、无创的生物标志物，实现临床对EM/AM相关CPP的鉴别诊断，为临床医生更具针对性的治疗方案提供依据。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种用于EM/AM所致CPP的早期诊断和/或鉴别诊断的生物标志物，并阐述了其临床的应用价值。
本发明的目的之二在于提供一种敏感度高、操作简单、无创快速的微生物检测试剂盒，用于EM/AM相关CPP患者的鉴别、指导临床治疗。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了检测慢性盆腔痛综合征生物标志物含量的试剂在制备慢性盆腔痛综合征诊断产品中的用途，所述生物标记物选自以下微生物标志物中一种或多种组合：Alloscardovia_omnicolens、Clostridium_disporicum、Lactobacillus_jensenii、Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_iners、Veillonella_montpellierensis、Clostridium_butyricum。
优选地，所述诊断包括鉴别诊断和/或早期诊断。
优选地，所述慢性盆腔痛综合征包括EM/AM相关CPP和其他疾病引起的CPP。
在本发明的一些实施方式中，所述鉴别诊断微生物标志物为Clostridium_disporicum和Lactobacillus_reuteri。
优选地，所述鉴别诊断生物标志物还包括血清标志物CA125。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物标志物含量的测定方法包括16S测序或qPCR定量检测；
所述的微生物标志物含量是通过扩增受试者样本中的微生物标志物的每一种的片段来确定的；优选地，所述片段是16S核糖体核酸基因的片段。
所述血清标志物含量的测定方法包括免疫分析方法，如化学发光微粒子免疫分析方法(CMIA)。
优选地，所述检测样本为阴道分泌物和/或血清样本。
第二方面，本发明提供了一种用于鉴别诊断EM/AM相关CPP的微生物试剂盒，所述试剂盒包括检测Clostridium_disporicum和Lactobacillus_reuteri的含量的试剂。
在本发明的一些实施方式中，当所述试剂盒检测样本中Clostridium disporicum的相对丰度高于0.001105％，而Lactobacillus reuteri的相对丰度小于0.1911349％，所述样本诊断为EM/AM相关CPP阳性。
第三方面，本发明提供了一种用于鉴别诊断EM/AM相关CPP的微生物试剂盒，所述试剂盒包括检测Clostridium_disporicum、Lactobacillus_reuteri和CA125的含量的试剂。
在本发明的一些实施方式中，当所述试剂盒检测样本中Clostridium disporicum的相对丰度高于0.001105％，同时Lactobacillus reuteri的相对丰度低于0.1911349％，血清CA125溶度超过35U/mL，所述样本诊断为EM/AM相关CPP阳性。
第四方面，本发明提供了所述微生物标志物Clostridium_disporicum、Lactobacillus_reuteri和/或血清标志物CA125在构建预测EM/AM相关CPP风险模型中的用途。
优选地，所述风险模型的输入变量为所述微生物标志物和血清标志物的含量。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一组EM/AM相关CPP的生物标志物，Clostridium disporicum，Lactobacillus reuteri和/或CA125可用于EM/AM相关CPP的早期诊断和鉴别诊断，检测特异性好，灵敏度高。
本发明提供一种敏感度高、操作简单、无创快速的微生物检测试剂盒，所述试剂盒包括Clostridium disporicum，Lactobacillus reuteri含量检测试剂，用于EM/AM相关CPP患者的鉴别、指导临床治疗。在训练集中，该试剂盒的敏感性为81.1％，特异性52.0％。CA125诊断的敏感性为40.5％、特异性为100％。当该试剂盒与CA125相联合时，诊断的敏感性提高至89.2％。在验证集中，该试剂盒诊断EM/AM相关CPP的敏感性为70.0％、特异性为53.6％。CA125诊断的敏感性为46％、特异性为100％。两者联合时，敏感性高达86.0％。
附图说明
图1阴道细菌的群落组成。(a)门水平相对丰度排名前10的的菌群柱状图。(b)属水平相对丰度排名前10的的菌群柱状图。(c)属水平相对丰度排名前30的的菌群柱状图。(d)种水平相对丰度排名前10的的菌群柱状图。
图2α多样性分析。(a)阴道微生物组多样性的稀释曲线，误差棒代表标准偏差。α多样性分析显示三组内观察到的物种差异，A组：总共626种，B组：总共409种，C组：总共465种。(b)微生物群落多样性的柱状图。
图3阴道微生物群组成。(a)基于加权平均数的unifrac距离矩阵热图，该距离图显示了三组之间的组间差异。图中的数字是两个样本之间的差系数。差异系数越小，微生物组多样性的差异就越小。(b)基于Anosim分析的阴道微生物种组间差异柱状图。(c)基于MetaStat分析各组中属水平丰度差异显著。(d)基于t检验分析各种组中属和种水平丰度差异显著。(e)对三组患者的阴道微生物群进行LEfSe分析。LEfSe可以识别出组间差异显著物种情况。该图中均具有统计学意义(P<0.05)，并且LDA得分>±4，。前缀代表每个分类单元的分类等级的缩写：门(p_)，类别(c_)，顺序(o_)，科(f_)，属(g_)，种类(s_)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1筛选与EM/AM相关的慢性盆腔痛相关的微生物标志物
1、研究对象
纳入2017年7月至2018年12月在北京协和医院妇产科门诊就诊的CPPS患者并行妇科手术的患者。
纳入标准：纳入非月经期、非妊娠期、非产褥期的绝经前妇女。在所有入组患者中，经腹腔镜探查或手术病理证实为EM/AM的CPPS的37例被定义为A组。25例经腹腔镜探查为盆腔粘连、输卵管积水或不育的CPPS患者被定义为B组。66例无CPPS的患者被纳入为正常对照(其中大多数接受了例行检查或孕前咨询)，定义为C组。所有参与者的宫颈人乳头瘤病毒(HPV)检测均为阴性。
排除标准如下：(I)无性生活的女性；(II)绝经后妇女；(III)宫颈HPV感染，发热(>37.5℃)或有恶性疾病史的妇女；(四)被诊断患有急性下生殖道炎症或下尿路或消化道疾病的妇女；(V)患有自身免疫性疾病或糖尿病的妇女。此外，所有参与者还应满足以下要求：采样前14天内无全身抗生素或抗真菌药物使用或阴道栓剂的使用；采样前3天内没有同房，或采样前2天内没有进行阴道冲洗。
2、标本采集
患者首次就诊时采集标本。采用一次性未蘸润滑剂的无菌窥器充分暴露阴道和宫颈，用无菌拭子从阴道后穹窿取得阴道分泌物。将无菌拭子样本立即保存在-80℃冰箱中，用于随后的DNA提取。同时采集了TCT及HPV的样本用于检测。
3、16S rRNA测序
3.1基因组DNA的提取和PCR扩增
采用SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。
以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的
Figure BDA0003041354560000061
High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
引物对应区域：
16S V4区引物(515F和806R)：鉴定细菌多样性；
3.2PCR产物的混样和纯化
PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
3.3文库构建和上机测序
使用
Figure BDA0003041354560000062
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用Hiseq2500进行上机测序。测序实验由北京诺禾致源公司完成。
4、数据分析
对于临床数据分析，使用了SPSS 23.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)。符合正态分布的连续变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。当P<0.05时认为有统计学差异。
4.1测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；拼接得到的RawTags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程，进行如下操作：a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75％的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。
4.2OTU聚类和物种注释
利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部Effective Tags进行聚类，默认以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE(Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
4.3样本复杂度分析(Alpha Diversity)
使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线，Rank abundance曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析；Alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
Alpha多样性指数具体描述如下：
计算菌群丰度(Community richness)的指数有:
Chao-the Chao1 estimator
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1)；
ACE-the ACE estimator
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace)；
计算菌群多样性(Community diversity)的指数有:
Shannon-the Shannon index
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon)；
Simpson-the Simpson index
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson)；
测序深度指数有:
Coverage-the Good’s coverage
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage)；
系统发育多样性的指数有：
PD_whole_tree-PD_whole_tree index
(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.faith_pd.html？highlight＝pd#skbio.diversity.alpha.faith_pd)
4.4多样本比较分析(Beta Diversity)
用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离、构建UPGMA样本聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCA，PCoA和NMDS图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包，NMDS分析使用R软件的vegan软件包。使用R软件进行Beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
LEfSe分析使用LEfSe软件，默认设置LDA Score的筛选值为4。Metastats分析使用R软件在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species)下，做组间的permutation test，得到p值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法对于p值进行修正，得到q值。Anosim，MRPP和Adonis分析分别使用R vegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。AMOVA分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用R软件做组间T_test检验并作图。
5、结果
5.1临床信息统计
A组平均年龄为39.89±6.24岁，B组为37.56±5.48，C组为38.23±7.80，三组之间无显著差异(P＝0.368)。此外，三组在孕次、产次、月经期、避孕方法上均无显著差异(P值分别为0.077、0.191、0.270和0.216)。表1显示了三组患者的临床信息特征。
表1患者人口学资料
Figure BDA0003041354560000091
简写：IUD，宫内节育器；SD，标准偏差。
注意：P值是采用卡方和t检验计算值。
5.2微生物群落多样性
(1)阴道微生物群的鉴定
在本发明中，共检测到57个门，1017个属，919个种。不同水平上的阴道细菌分布如图1所示。
(2)3组中阴道微生物组的结构
从样品中确定3组中微生物OTU的α-多样性。从图2a中可以看出，A组微生物物种多样性最高，其次是C组，然后是B组。从图2b可得知，基于PD_whole_tree分析，A组阴道微生物群的多样性显著高于B组或C组，但B组和C组之间没有显着差异(Avs.B，P＝0.0278；A vs.C，P＝0.0430；B vs.C，P＝0.7396)。
(3)3组中阴道微生物组成分布
通过LEfSe算法，t检验分析和MetaState分析发现，相对丰度位于前30的属中，共有26个菌种在A和B组之间相对丰度有显著的差异，其中3个相对丰度均高于0.1％。A和C组之间36个物种的相对丰度有显着差异，而6个的相对丰度在0.1％以上。B组和C组之间共有22种物种表现出显着差异，没有相对丰度超过0.1％的物种(表2)(图3c，3d，3e)。
如表2显示，A与B组相比，Alloscardovia_omnicolens、Clostridium_disporicum的相对丰度显著增加，Lactobacillus_jensenii的相对丰度显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；A与C组相比，Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_iners、Lactobacillus_jensenii、Sneathia_amnii的相对丰度显著下降，Veillonella_montpellierensis、Alloscardovia_omnicolens的相对丰度显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表2组间前30属中属和种差异统计
Figure BDA0003041354560000101
Figure BDA0003041354560000111
*，Q值；#，P值；&，Kruskal-Wallis检验P值。
当对这三个组进行一起分析时，发现Lactobacillus_jensenii的相对丰度在A组中最低，而Clostridium_butyricum在A组中相对丰度明显较高(表3)。
表3 3组组间前30属中属和种差异统计
Figure BDA0003041354560000112
综上，通过LEfSe、t检验、MetaState分析，在丰度位于前30个属内的种水平上，共在三组中发现7个显著差异的物种，分别为Alloscardovia_omnicolens↑,Clostridium_disporicum↑,Clostridium_butyricum↑,Veillonella_montpellierensis↑,Lactobacillus_jensenii↓,Lactobacillus_iners↓,Lactobacillus_reuteri↓。
因此，该7种差异物种可以作为微生物标志物应用于慢性盆腔痛综合征的早期和/或鉴别诊断。
6、阴道微生物组的诊断功效
发明人应用了ROC曲线来确定潜在微生物组生物标志物的临界相对丰度，以帮助将EM/AM相关CPP从CPPS中其他类型的区分开。
发明人对上述的差异种进行单个、两个组合去计算各种组合鉴别EM/AM相关CPP患者的敏感性和特异性，结果发现，其敏感性及特异性情况如下所示：
Figure BDA0003041354560000121
Figure BDA0003041354560000131
最终发现，当Clostridium_disporicum的相对丰度超过0.001105％，而Lactobacillus_reuteri的相对丰度低于0.1911349％时，对EM/AM相关的CPP的鉴别诊断敏感性和特异性分别为81.1％和52.0％。进一步结合目前临床上常用的用于辅助诊断AM和EM的血清CA125，发现当微生物标志物和CA125结合时，诊断的敏感性进一步提高至89.2％(表4，训练集)。
表4诊断EM/AM相关CPPS的不同方法的比较
Figure BDA0003041354560000132
方法A是指Clostridium disporicum的相对丰度大于0.001105％，而Lactobacillus reuteri的相对丰度小于0.1911349％；方法B是血清CA125溶度超过35U/mL；方法C指Clostridium disporicum的相对丰度超过0.001105％，Lactobacillusreuteri的相对丰度在0.1911349％以下，血清CA125溶度超过35U/mL。SEN：敏感性，SPE：特异性，PPN：阳性预测值，NPV：阴性预测值。
综上所述，Clostridium_butyricum,Clostridium_disporicum,Alloscardovia_omnicolens和Veillonella_montpellierensis作为优势菌群，而同时Lactobacillus_jensenii,Lactobacillus_reuteri和Lactobacillus_iners相对丰度较低时，可能与EM/AM相关CPP疾病相关，也可能被认为是潜在的致病菌和潜在的生物标志物。当发明人将Clostridium_disporicum和Lactobacillus_reuteri与血清CA125结合使用时，能显著提高鉴别EM/AM相关CPP的诊断效果，这些发现为EM/AM相关CPP疾病的病因和表现提供了重要数据支持，并为EM/AM相关CPP的鉴别诊断甚至早诊提供了可靠的生物标志物的开发方法。
实施例2验证Clostridium disporicum和Lactobacillus reuteri微生物标志物与EM/AM相关CPP之间的相关性
按照实施例1收集样本方式，选择CPP的患者，术前留取阴拭子，根据手术探查所见和/或病理诊断分为“EM/AM相关CPP组”59例和“其它CPP组”16例，16S rRNA测序方法测定靶向微生物的相对浓度。根据实施例1所定的cut-off值，将患者定为“是”、“否”，再根据金标准诊断进行比对，从而计算敏感性和特异性。
检测结果显示，Clostridium disporicum丰度水平显著增加，Lactobacillusreuteri丰度水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。ROC曲线结果显示，当Clostridium_disporicum的相对丰度超过0.001105％且Lactobacillus_reuteri低于0.1911349％时，将EM/AM相关CPP从CPPS中分离出来的诊断敏感性和特异性分别为70.00％和53.62％。而基于血清CA125的诊断敏感性和特异性分别为46％和100.00％，但是将血清CA125和阴道生物标志物联合使用时，敏感性增至86.00％(表4，验证集)。
提示将Clostridium disporicum和Lactobacillus reuteri用于EM/AM相关CPP鉴别诊断具有较高的诊断效能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.检测慢性盆腔痛综合征生物标志物含量的试剂在制备慢性盆腔痛综合征诊断产品中的用途，所述生物标记物选自以下微生物标志物中一种或多种组合：Alloscardovia_omnicolens、Clostridium_disporicum、Lactobacillus_jensenii、Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_iners、Veillonella_montpellierensis、Clostridium_butyricum。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断包括鉴别诊断和/或早期诊断。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性盆腔痛综合征包括子宫内膜异位症(EM)/子宫腺肌症(AM)所致慢性盆腔痛和其他病因所引起的慢性盆腔痛。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鉴别诊断微生物标志物为Clostridium_disporicum和Lactobacillus_reuteri。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鉴别诊断生物标志物还包括血清标志物CA125。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微生物标志物含量的测定方法包括16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或多种；所述血清标志物含量的测定方法包括免疫分析法。
7.一种用于鉴别诊断EM/AM相关CPP的微生物试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测Clostridium_disporicum和Lactobacillus_reuteri的含量的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒检测样本中Clostridiumdisporicum的相对丰度高于0.001105％，而Lactobacillus reuteri的相对丰度低于0.1911349％，所述样本诊断为EM/AM相关CPP阳性。
9.一种用于鉴别诊断EM/AM相关CPP的微生物试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测Clostridium_disporicum、Lactobacillus_reuteri和CA125的含量的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒检测样本中Clostridiumdisporicum的相对丰度高于0.001105％，Lactobacillus reuteri的相对丰度低于0.1911349％，血清CA125溶度超过35U/mL，所述样本诊断为EM/AM相关CPP阳性。
CN202110458431.2A 2021-04-27 2021-04-27 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用 Active CN113186311B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110458431.2A CN113186311B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110458431.2A CN113186311B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113186311A true CN113186311A (zh) 2021-07-30
CN113186311B CN113186311B (zh) 2022-05-10

Family

ID=76979515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110458431.2A Active CN113186311B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113186311B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116312796A (zh) * 2022-12-27 2023-06-23 江苏先声医学诊断有限公司 一种基于期望最大化算法的宏基因组丰度估计方法及系统
WO2023128720A1 (ko) * 2022-01-03 2023-07-06 연세대학교 산학협력단 자궁내막증 진단을 위한 정보 제공 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170114396A1 (en) * 2014-06-30 2017-04-27 The Chinese University Of Hong Kong Detecting bacterial taxa for predicting adverse pregnancy outcomes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170114396A1 (en) * 2014-06-30 2017-04-27 The Chinese University Of Hong Kong Detecting bacterial taxa for predicting adverse pregnancy outcomes

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO, XP等: "The role of the vaginal microbiome in distinguishing female chronic pelvic pain caused by endometriosis/adenomyosis", 《ANNALS OF TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
DANIEL A SHOSKES等: "Analysis of Gut Microbiome Reveals Significant Differences between Men with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome and Controls", 《J UROL》 *
J CURTIS NICKEL等: "Assessment of the Lower Urinary Tract Microbiota during Symptom Flare in Women with Urologic Chronic Pelvic Pain Syndrome: A MAPP Network Study", 《JOURNAL OF UROLOGY》 *
WEIXIA WEI等: "Microbiota composition and distribution along the female reproductive tract of women with endometriosis", 《ANN CLIN MICROBIOL ANTIMICROB》 *
黄菊等: "慢性子宫内膜炎在生殖领域中的研究进展", 《中华生殖与避孕杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023128720A1 (ko) * 2022-01-03 2023-07-06 연세대학교 산학협력단 자궁내막증 진단을 위한 정보 제공 방법
CN116312796A (zh) * 2022-12-27 2023-06-23 江苏先声医学诊断有限公司 一种基于期望最大化算法的宏基因组丰度估计方法及系统
CN116312796B (zh) * 2022-12-27 2023-11-14 江苏先声医学诊断有限公司 一种基于期望最大化算法的宏基因组丰度估计方法及系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN113186311B (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Winters et al. Does the endometrial cavity have a molecular microbial signature?
Liu et al. Endometrial microbiota in infertile women with and without chronic endometritis as diagnosed using a quantitative and reference range-based method
CN113186311B (zh) 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用
CN110423804B (zh) 一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法
CN114898808A (zh) 一种预测肺炎克雷伯菌对头孢吡肟敏感性的方法及系统
Benny et al. Placentas delivered by pre‐pregnant obese women have reduced abundance and diversity in the microbiome
WO2018062743A1 (ko) 질 내 미생물을 포함하는 조성물
Kunaseth et al. Vaginal microbiome of women with adenomyosis: A case-control study
CN112941215A (zh) 泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用
JP6860771B2 (ja) 絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット、アッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法
Chen et al. The study of endometriosis and adenomyosis related microbiota in female lower genital tract in Northern Chinese population
CN113652489A (zh) 阴道微生物在鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变中的应用
CN114214438B (zh) 胆道菌群检测试剂在制备预测胆道结石术后早期复发的试剂中的应用
CN114058695B (zh) 泌尿道菌群检测在女性泌尿道结石诊断中的应用
CN114606317B (zh) 一种预测胃癌淋巴结转移的菌群标志物及其应用
US20170260571A1 (en) Methods and materials for treating endometrial cancer
CN114959085B (zh) 用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的标志物的应用
WO2021153789A1 (ja) 子宮内感染の検出方法
US20240068058A1 (en) HPV Detection from urine analyte in male, non-binary and transgender patients
WO2021112236A1 (ja) 絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
Li et al. Clinical indicators and reproductive tract microbiota abnormalities indicate the occurrence of endometriosis
CN111733265A (zh) 与复发性流产相关的阴道菌群及其应用
CN111733206A (zh) 阴道微生物在复发性流产中的应用
WO2021112237A1 (ja) 絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
CN118072818A (zh) 一种细菌性阴道病的诊断模型的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant