CN113186129B - 皮肤共生菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了皮肤共生菌及其应用。该皮肤共生菌为粘质沙雷氏菌粘质亚种(Serratia marcescens subsp.marcescens)。申请人在实验中筛选出了新型的皮肤共生菌，通过检测这类皮肤共生菌的培养上清液发现其对于革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌的生物被膜的形成能力具有高效抑制作用，能够用于防控铜绿假单胞菌引发的感染。

Description

皮肤共生菌及其应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，尤其是涉及皮肤共生菌及其应用。

背景技术

生物被膜(Biofilm)是由集聚在物体表面生长的微生物通过分泌胞外多聚基质构成。细菌的生物被膜是细菌适应恶劣环境而形成的一种保护模式。细菌在形成生物被膜后对抗生素的抗性会大大提高，并产生多种选择性的表型突变，使其对宿主的免疫反应不敏感，导致感染性疾病迁延不愈。条件致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有极强的生存能力，极易形成生物被膜，是研究生物被膜的模式生物之一。该菌极易感染免疫力较弱的患者，如患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者(如癌症、大面积烧伤、HIV等)，导致极高的发病率和致死率。另一类生物被膜形成的常见菌种是金黄色葡萄球菌，通常能引发皮肤感染以及危及生命的疾病(如心内膜炎和肺炎等)。

微生物被膜抑制剂能够专性抑制微生物的生物被膜结构而不对微生物本身杀灭，因而不会对微生物的生存产生压力，也就不会导致新的“耐药性”产生。因此，有必要设计针对铜绿假单胞菌的微生物被膜抑制剂。然而，在铜绿假单胞菌的抗菌化合物相关研究中，大多通过化合物库筛选，而抗铜绿化合物往往存在人体药物敏感的潜在药物毒性的问题。相比较而言，益生菌特别是与人体共生的皮肤菌对于人体有着良好的适应性，如果用于抑制铜绿假单胞菌被膜结构不会产生药物毒性问题。所以，开发能够作为铜绿假单胞菌被膜抑制剂使用的皮肤共生菌具有广阔的应用前景。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出能够抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成以及抗金黄色葡萄球菌生长使用的皮肤共生菌及其应用。

本申请的第一方面，提供皮肤共生菌，该皮肤共生菌命名为粘质沙雷氏菌粘质亚种(Serratia marcescens subsp.marcescens)，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61315，保藏日期为2020年11月26日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

根据本申请实施例的皮肤共生菌，至少具有如下有益效果：

申请人在实验中筛选出了新型的特异性皮肤共生菌，通过检测这类皮肤共生菌的培养上清发现其对于革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌的生物被膜的形成能力具有高效抑制作用，能够用于应对铜绿假单胞菌引发的感染。

本申请的第二方面，提供组合物，该组合物为包括上述的皮肤共生菌，或该组合物的制备原料包括上述的皮肤共生菌。以上述皮肤共生菌作为制备原料制备得到的组合物具体可以例举出以上述皮肤共生菌培养得到的上清，或上清的浓缩产物，或上清的干燥产物，或由上述产品为活性成分、添加其它本领域常用的配料、添加剂等得到的产品。

本申请的第三方面，提供上述的皮肤共生菌或上述的组合物在制备下述a～c中任一种产品中的应用：

a.防治细菌感染的产品；

b.抑制细菌生物被膜形成的产品；

c.抑制细菌生长的产品。

其中，防治细菌的感染的产品是指能够通过直接抑制细菌的生长、或抑制细菌形成生物被膜等方式避免其侵入宿主引起感染。细菌生物被膜的形成包括运动的细菌接近物体表面，发生可逆粘附；随后分裂的细菌形成群落并不断发展产生胞外基质使细菌群落不可逆附着在介质表面；最后成熟的生物被膜扩散，部分细胞游离脱落，向新的部位定殖。抑制细菌形成生物被膜即是在上述三个阶段中任一种对生物被膜的形成进行抑制。抑制细菌形成生物被膜进一步可以解释为抑制其形成生物被膜但不对细菌本身进行杀灭作用即不抑制其本身的生长，在这种情况下，不会对细菌的生存产生压力，也就不会导致新的“耐药性”的产生。

在本申请的一些实施方式中，细菌为革兰氏阴性菌。

在本申请的一些实施方式中，革兰氏阴性菌选自假单胞菌属的细菌。上述的皮肤共生菌或组合物能够防治这些革兰氏阴性菌的感染，或抑制这些革兰氏阴性菌形成生物被膜，或抑制这些革兰氏阴性菌的生长。

在本申请的一些实施方式中，革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌。

本申请的第四方面，提供上述的皮肤共生菌或上述的组合物在制备预防和/或治疗因细菌感染引起的疾病的产品中的应用。

以铜绿假单胞菌为例，铜绿假单胞菌感染引起的疾病包括皮肤软组织感染、尿路感染、消化道感染(如盲肠炎、直肠脓肿)、呼吸道感染(如继发性肺炎)、心内膜炎、中枢神经感染(如脑膜炎、脑脓肿)、全身感染(如败血症、脓毒血症)等。

本申请的第五方面，提供抑制介质表面的细菌形成生物被膜的方法，该方法包括以下步骤：使上述的皮肤共生菌或上述的组合物与介质表面相接触，该方法用于非疾病的诊断或治疗目的。

其中，“介质表面”中介质是指任选的具备或不具备生物活性的固形介质，用于非疾病的诊断或治疗目的是指该方法不直接作用于有生命的人体或动物体，或不直接用于消除病因或病灶。

在本申请的一些实施方式中，上述方法中的细菌是革兰氏阴性菌。

在本申请的一些实施方式中，革兰氏阴性菌选自假单胞菌属的细菌。

在本申请的一些实施方式中，革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例1中皮肤共生菌C5-3的单菌落显微照片。

图2是本申请的实施例1中皮肤共生菌C5-3的色素实验结果。

图3是本申请的实施例2中铜绿假单胞菌的生长曲线。

图4是本申请的实施例3中铜绿假单胞菌的生物被膜形成实验结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

菌株的筛选与鉴定

采集自上体贴身穿戴衣物，贴于人工汗液固体培养基培养，挑取单菌落转接至LBAgar平板上培养，分离出单一菌株后保种到-80℃冰箱。

将菌株划线在LB Agar平板上，置于37℃培养箱培养过夜，第二天挑单菌落于LB液体培养基中置于37℃摇床200rpm培养过夜，第三天将菌液调OD至1后1：100稀释至ABTGC培养基中，过夜培养后，将菌液离心，收集上清液，用0.22μm的过滤器过滤后得到对应菌株的培养基上清液。

将过夜培养的铜绿假单胞菌菌液调节OD₆₀₀至0.02，种于96孔PE培养板中，每孔50μL，再加入50μL过滤后的上清液，37℃培养箱中静置培养72h。吸弃孔板内的菌液，用纯水洗两遍，晾干后每孔加入125μL 0.1％的结晶紫染液，室温孵育10min，吸弃染液，用纯水洗两遍，晾干后，每孔加130μL 30％的乙酸溶液，室温孵育10min，将溶液转移至新的96孔板中，检测OD₅₅₀吸光度。

根据培养基上清对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成能力影响结果筛选出具有高效抑制作用的皮肤共生菌，编号为C5-3。

1.形态学及生理生化检测

C5-3接种于LB固体培养基上37℃恒温培养14h，观察菌落形态、大小、色泽等。另外，对C5-3的ONPG试验、精氨酸试验、赖氨酸试验、鸟氨酸试验、柠檬酸试验、硫化氢试验、明胶液化、甘露醇试验、山梨醇试验、蔗糖试验、脲酶试验、乳糖试验、吲哚试验、V-P反应、葡萄糖试验、肌醇试验、鼠李糖试验、蜜二糖试验、苦杏仁忒试验、阿拉伯糖试验、氧化酶试验等指标进行检测，详细检测指标和检测方法参考青岛海博生物技术有限公司的博检革兰氏阴性细菌鉴定系统试剂盒。

结果表明，C5-3为球形至短杆形，直径为0.5～1μm，革兰氏染色阴性，在LB固体培养基上菌落呈圆形，表面光滑湿润，边沿整齐，表面隆起，具有粘性，参考图1所示的显微照片。部分生理生化指标结果如下：ONPG试验、精氨酸试验、赖氨酸试验、鸟氨酸试验、柠檬酸试验、V-P反应、明胶液化、甘露醇试验、肌醇试验、山梨醇试验、蔗糖试验均为阳性，硫化氢试验、脲酶试验、乳糖试验、吲哚试验、葡萄糖试验、鼠李糖试验、蜜二糖试验、苦杏仁忒试验、阿拉伯糖试验、氧化酶试验均为阴性。

另外，如图2所示，上侧为对照用棉布，下侧为C-5人工汗液培养基培养处理后的棉布，可以看到，该皮肤共生菌能够在棉布上产生红色色素。

2.16S rDNA检测

提取C5-3的DNA后采用16S rDNA序列同源性分析的方法鉴定菌株。结果表明，C5-3与Serratia marcescens subsp.marcescensDb11的同源性最高(99.72％)。

综合形态学、生理生化以及16S rDNA的检测结果，将C5-3鉴定为粘质沙雷氏菌粘质亚种(Serratia marcescens subsp.marcescens)。

实施例2

铜绿假单胞菌生长曲线

设置空白对照组、ABTGC培养基组、铜绿假单胞菌PAO1组和C5-3组，每组6个重复，各组具体设置如下：空白对照组中加入200μl的ABTGC培养基，ABTGC组中加入100μl的ABTGC培养基和100μl的铜绿假单胞菌菌液，PAO1组加入100μl的铜绿假单胞菌培养上清和100μl的铜绿假单胞菌菌液，C5-3组加入100μl的C5-3的培养基上清和100μl的铜绿假单胞菌菌液。其中，铜绿假单胞菌培养上清是将铜绿假单胞菌PAO1的LB培养基菌液的OD调至1后加入ABTGC培养基按照1：100的比例稀释，过夜培养离心得到的菌液上清。按照上述设置种于培养板，将板放入酶标仪中，37℃每半小时测量一次OD₆₀₀，测量24h。结果如图3所示。

从图中可以看出，额外加入皮肤共生菌C5-3的培养基上清液的C5-3组和单独的铜绿假单胞菌的生长速率和对应的变化趋势接近一致。该结果表明，皮肤共生菌培养基上清液的加入并不会对铜绿假单胞菌PAO1的生长造成非常明显的影响。

实施例3

铜绿假单胞菌的生物被膜形成实验

按照实施例2中的方法设置空白对照组、ABTGC组、PAO1组和C5-3组，种板完成后，将板放入37℃CO₂培养箱中培养72h。吸弃孔板内的菌液，用纯水洗两遍，晾干后每孔加入125μL 0.1％的结晶紫染液，室温孵育10min，吸弃染液，用纯水洗两遍，晾干后，每孔加130μL30％的乙酸溶液，室温孵育10min，将溶液转移至新的96孔板中，检测OD₅₅₀吸光度。结果如图4所示。

从图中可以看出，C5-3组的OD₅₅₀值相比于PAO1组或ABTGC组都显著更低。该结果表明，在加入上述菌株的上清液后，铜绿假单胞菌PAO1形成生物被膜的量大大减少，C5-3的培养基上清具有抑制PAO1形成生物被膜的作用。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (5)

1.皮肤共生菌，其特征在于，命名为粘质沙雷氏菌粘质亚种(Serratia marcescenssubsp.marcescens)，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61315。

2.组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的皮肤共生菌，或所述组合物的制备原料包括权利要求1所述的皮肤共生菌。

3.权利要求1所述的皮肤共生菌或权利要求2所述的组合物在制备下述a～b中任一种产品中的应用：

a.防治细菌感染的产品；

b.抑制细菌生物被膜形成的产品；

其中，所述细菌为铜绿假单胞菌。

4.权利要求1所述的皮肤共生菌或权利要求2所述的组合物在制备预防和/或治疗因细菌感染引起的疾病的产品中的应用，所述细菌为铜绿假单胞菌。

5.抑制介质表面的细菌形成生物被膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：使权利要求1所述的皮肤共生菌或权利要求2所述的组合物与所述介质表面相接触，所述方法用于非疾病的诊断或治疗目的，所述细菌为铜绿假单胞菌。

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