CN113171466B - 一种用于治疗急性肺损伤的复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种用于治疗急性肺损伤的复合物及其制备方法与应用。所述药物晶体通过将阳离子化的球蛋白包裹抗炎药物制得，该晶体生理条件下荷正电。抗氧化蛋白为酸性蛋白，生理条件下荷负电，能够与药物晶体通过静电作用结合形成复合物。所制备的复合物能够高效靶向至内皮细胞，以非溶酶体途径同时将小分子药物和蛋白药物递送到血管内皮细胞胞内，达到异步缓控释放药物的效果，特异性地蓄积于肺部，从而更好地修复血管内皮细胞，减轻炎症。

Description

一种用于治疗急性肺损伤的复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物及其制备方法与应用。
背景技术
急性肺损伤是一种由于脓毒症、肺炎或其他损伤引起的肺部炎症性疾病，后续可能会发展成急性呼吸窘迫综合征甚至会发展为肺纤维化。急性肺损伤作为一种危及生命的临床综合征，目前尚无特效药，致死率高达40％-50％。临床上主要是在原发病的治疗基础上，采取结合机械通气，抗炎等综合治疗的方法。应用于临床治疗的药物主要是激素类药物(如糖皮质激素)、阿司匹林、乌司他丁等，这些药物大多采用全身给药，治疗效果差且会引起许多伴随的副作用。目前急性肺损伤的治疗还停留在最基本的维持性治疗阶段，往往难以有效抵抗急性肺损伤的进程，导致死亡率居高不下。因此深入发展治疗急性肺损伤的新型药物和给药系统是极其有必要的。
目前，许多给药途径已经被应用于治疗急性肺损伤，包括肺吸入，静脉注射和腹腔注射等。直接全身给药，药物在许多不确定的因素下不稳定并且会产生非预期的药动学和全身性的毒副作用。肺吸入的给药方式能够局部治疗特定的肺部疾病，然而肺上皮的吸收表面积较大，药物会很快被吸收，导致肺部滞留时间短，局部治疗效果大大减弱。此外，肺吸入给药次数多，糖皮质激素被频繁吸入后，会沉积在患者的口腔和喉咙中，导致呼吸困难等副作用。因此，发展以聚合物、蛋白质、脂质等材料为基础的药物递送系统将药物靶向递送至肺部是很有必要的，能够延长药物在肺部的滞留时间从而降低给药频率，提高患者顺应性；增加肺部的药物蓄积量，减少药物全身吸收的量，减少副作用。以聚合物、脂质等材料为基础的微/纳米颗粒给药策略已经被广泛研究用于靶向递送药物至肺部治疗急性肺损伤，但现有给药系统往往会有稳定性差，载药量低，治疗效果不足，靶向性差，肺部滞留时间短，毒性大等缺点，大大限制了其应用。
同时现有的关于治疗急性肺损伤的治疗药物大多为单一的中药，中成药，化学药物，生物药物以及间充质干细胞等，以口服、吸入、注射等方式直接给药，但往往会存在单一药物疗效不足，直接给药造成全身性副作用等问题，治疗效果差强人意。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一种稳定并且安全的抗氧化蛋白递送载体。本发明使用，生物相容性好的阳离子化的β-乳球蛋白作为载体，包裹疏水性药物形成带正电荷的药物晶体，该药物晶体可通过非溶酶体途径递送药物至细胞内。
本发明的目的之二在于构建药物晶体-抗氧化蛋白复合物，该复合物通过静电作用制得，生物大分子药物可以保持原有活性且制备过程简单。
本发明的目的之三在于构建靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，具有靶向分子能够将药物精准递送至靶部位，提高病灶部位药量，减少毒副作用并且同时递送两种药物达到异步缓控释放的效果。
一种用于递送抗氧化蛋白的药物晶体，其特征在于：所述用于抗氧化蛋白(生理条件下荷负电)递送的药物晶体包括：一种疏水性药物和包裹在疏水药物外部的阳离子化蛋白。
所述的药物晶体，其特征在于：所述疏水性药物选自吲哚美辛、塞来西布、酮洛芬、地塞米松、黄岑素、辛伐他汀或匹伐他汀中的一种，优选吲哚美辛作为疏水药物；所述的阳离子化蛋白为阳离子化的β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白，优选阳离子化β-乳球蛋白作为包裹在疏水药物外部的阳离子化蛋白。
所述的药物晶体的制备方法，其特征在于：
疏水性药物吲哚美辛与阳离子化的β-乳球蛋白质量比为0.5：1-3：1；最优比例条件为质量比1：1；
1)最优比例条件下，所述药物晶体的粒径为160.5±1.23nm；
2)最优比例条件下，所述药物晶体的电位为30.1±0.15mV。
所述的药物晶体的制备方法为：
1)将疏水性药物吲哚美辛溶解于有机试剂(丙酮、乙醇、二甲基亚砜)中，优选有机相为丙酮，提前置于4℃环境中预冷；
2)将阳离子化β-乳球蛋白溶解于蒸馏水中作为水相，提前置于4℃环境中预冷；
3)将有机相在搅拌条件下逐滴加入水相中，冰浴条件下置于探头超声中处理15min；
4)减压蒸发除去残留的有机试剂丙酮，即得吲哚美辛晶体。
所述的药物晶体的制备方法，其特征在于：
1)步骤2)中阳离子化β-乳球蛋白制备方法为：将250mL乙二胺溶液(0.9M，pH4.75)逐滴缓慢加入2mLβ-乳球蛋白溶液(15％，w/v)中，并持续搅拌；待混合均匀后，加入70mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温条件下，持续搅拌2h。随后加入200μL醋酸盐缓冲液(4M，pH 4.75)终止反应并继续搅拌，30min后将反应液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，于聚乙二醇(分子量为20000Da)溶液中浓缩至10mL，再转移至蒸馏水中继续透析3天；将透析后的溶液进行冻干，即得阳离子化的β-乳球蛋白。
2)步骤3)中的搅拌条件为转速1500-2000r/min，最优条件为1500-1600r/min；超声功率为300-400W，最优条件为350-400W。
所述的药物晶体-抗氧化蛋白复合物由药物晶体与抗氧化蛋白通过静电作用结合形成。
所述的药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于：所述的抗氧化蛋白为等电点小于7.5且生理条件下荷负电的蛋白质，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽。
所述的药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于：
1)阳离子化β-乳球蛋白与抗氧化蛋白质量比为1：1-64：1，最优比例条件为质量比为32：1；
2)将最优比例条件下的抗氧化蛋白逐滴加入到等体积的药物晶体中，室温条件下静置30min，即得药物晶体-抗氧化蛋白复合物；
3)最优比例条件下，所述药物晶体-抗氧化蛋白复合物粒径为170.8±2.15nm；
4)最优比例条件下，所述药物晶体-抗氧化蛋白复合物电位为20.3±0.53mV。
所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物由靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物通过静电作用结合形成。
所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于：所述的靶向分子为等电点小于7.5且生理条件下荷负电的能够靶向至血管内皮细胞的抗体药物，包括细胞间黏附分子-1抗体、血管细胞黏附分子-1抗体或血小板内皮细胞黏附分子-1抗体、L-选择素抗体或P-选择素抗体等，优选靶向分子为细胞间黏附分子-1抗体。
所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于：
1)阳离子化β-乳球蛋白、抗氧化蛋白与靶向分子质量比为32：1：0.5-32：1：4，最优比例条件为质量比为32：1：1；
2)将最优比例条件下的靶向分子逐滴加入到药物晶体-抗氧化蛋白复合物中，室温条件下孵育一个小时，即得靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物；
3)最优比例条件下，所述靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物粒径为237.0±1.16nm；
4)最优比例条件下，所述靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物电位为9.9±0.37mV。
所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物在体外和体内治疗急性肺损伤中的应用。
作用原理
在急性肺损伤的病理条件下，肺内皮细胞是控制炎症和伴随的氧化应激的主要治疗靶点，因此将药物靶向递送至肺部内皮细胞是一潜在的治疗策略。药物的内皮细胞亲和力低以及易被血液清除是其实现的主要阻碍，将与内皮细胞的受体具有亲和力的配体同药物分子或药物递送系统结合能够克服这些缺陷。细胞间黏附分子-1稳定表达在血管内皮细胞，且在病理条件下，表达水平上调50倍左右，本发明将细胞间黏附分子-1抗体与药物递送系统结合，能够显著增加复合物在肺部的特异性蓄积，增强药物治疗效果，减少毒副作用。治疗急性肺损伤主要是抑制急性炎症和伴随的氧化应激，本发明将抗炎药物吲哚美辛和抗氧化蛋白超氧化物歧化酶共同递送至肺内皮细胞，实现异步释放，两种药物产生协同作用，放大抗炎和抵抗氧化损伤的作用。此外，复合物呈棒状，有研究表明，连接靶向分子的棒状的递送系统与等同条件下的球形递送系统相比，对内皮细胞的亲和力更高，在肺部特异性蓄积显著增加。有研究结果证明，棒状复合物能够以避开溶酶体途径进入内皮细胞，减少药物的损失，增强治疗作用。
有益效果
1、急性肺损伤的治疗目前还停滞在氧疗和其他支持治疗阶段，尚无有效治疗手段，因此，本发明有望高效治疗该疾病。治疗急性肺损伤药物主要为合成化学药物和生物药物，其中大分子生物药物如酶具有稳定性差、易降解、易失活等问题，本发明能够有效提高大分子药物的稳定性、保护其不被降解、延长在体内停留的时间，以及通过控制纳米制剂的形状和大小等性质，使药物递送系统以非溶酶体途径进入细胞，能够增加到达作用部位的有效的药量，提高药效，减少给药次数。急性肺损伤的关键治疗靶点之一是肺血管内皮细胞，递送抗氧化酶或其衍生物至血管内皮细胞内能够迅速有效的清除胞内的活性氧。但由于这些生物大分子治疗药物不具有内皮细胞亲和力而不能被充分地递送至所需发挥作用的部位。通过与具有内皮细胞亲和力的且在静止和病理状态下改变的内皮细胞表面表达的细胞粘附分子的配体结合，能够提高向内皮细胞的靶向性输送，达到精准定点的靶向递送效果，然而仅依靠单种治疗药物所产生的药效是不足够的，本发明同时递送小分子抗炎药物和大分子抗氧化蛋白，以不同的作用时间和作用程度于两种不同的通路协同发挥药效，能够进一步提高治疗作用。此外，本发明的药物递送系统以棒状为特征，能够有效解决靶部位滞留时间短的缺点，在肺部产生高特异性的蓄积。
本发明提供一种能够将性质完全不同的抗炎性化学药物与抗氧化性生物药物共同递送的棒状复合物，并利用具有靶向性的配体加以修饰，使治疗药物精准到达病灶，增加药物在肺部的特异性蓄积量，减少毒副作用，产生两种药物的协同治疗作用，最终达到降低肺毛细血管通透性，减轻肺水肿、肺部炎症和氧化应激等治疗效果。此外，本发明的制备不涉及复杂的化学合成，采用的稳定剂材料安全无毒，且利用药物本身为载体实现共递送，具有广阔的临床转化和应用前景。
具体而言：
本发明中的康氧化蛋白指等电点小于7.5且生理条件下荷负电的蛋白质，优选的康氧化蛋白超氧化物歧化酶等电点为4.95，生理条件下带负电荷能够与带正电荷的药物晶体通过静电作用结合，不会改变大分子药物的结构而使其保持原有活性。超氧化物歧化酶是一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与急性肺损伤的发生发展密不可分。肺血管内皮细胞是肺损伤发生发展中主要的损伤部位，因此及时有效的修复内皮细胞是治疗肺损伤的关键措施。炎性介质诱导发生的过程中，内皮细胞内会涌入大量超氧化阴离子，同时会激活NADPH氧化酶，超氧化阴离子与活化的NADPH氧化酶混合，介导细胞内信号传递，导致促炎性内皮细胞活化。抗氧化剂如超氧化物歧化酶有效地递送至内皮细胞中能够抑制此病理途径，因此将超氧化物歧化酶有效递送至内皮细胞是一种治疗急性肺损伤的有潜力的方法。
急性肺损伤主要损伤部位之一的肺部血管内皮细胞表面会表达许多细胞黏附分子，如细胞间黏附分子-1。以细胞间黏附分子-1抗体作为靶向基团能够产生非靶向无法获得的治疗效果。在静态水平下，细胞间黏附分子-1在内皮细胞中表达水平较低，但在炎症发生时，细胞间黏附分子-1表达会上调50倍以上。尽管细胞间黏附分子-1在成纤维细胞、上皮细胞和肌肉细胞中表达水平与内皮细胞相当，然而这些血管外细胞不易接触到循环大分子和载体，因此不会与内皮细胞竞争靶向作用。
药物晶体是指药物活性成分与稳定剂形成的棒状的晶体；本发明中，将采用反溶剂-超声沉淀法使疏水性药物与稳定剂通过疏水作用形成的纳米级别的棒状的晶体定义为药物晶体。
溶酶体途径是降解细胞外来蛋白质的主要途径，本发明中的复合物能通过非溶酶体的小窝蛋白/脂筏摄取途径进入血管内皮细胞，避免了溶酶体对大分子药物的降解，能够显著提高药效。
本发明中的复合物能够实现小分子化学药物与生物大分子药物的异步缓控释放，即指两种药物非同步地以不同的释放速度、不同的释放程度在不同部位释放药物。
附图说明
图1为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物制备流程示意图。
图2为本发明中阳离子化β-乳球蛋白与吲哚美辛的质量比对药物晶体粒径电位影响图。
图3为本发明中药物晶体的透射电镜图像。
图4为本发明中阳离子化球蛋白与超氧化物歧化酶的质量比对药物晶体-抗氧化蛋白复合物粒径电位影响图。
图5为本发明中药物晶体-抗氧化蛋白复合物非变性聚丙酰胺凝胶电泳结果图。
图6为本发明中阳离子化球蛋白与抗氧化蛋白的质量比对靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物粒径电位影响图。
图7为靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物的透射电镜结果图。
图8为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物中疏水性药物的释放结果。
图9为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物中抗氧化蛋白的体外释放结果图。
图10为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物细胞摄取流式细胞仪结果图。
图11为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物细胞摄取激光扫描共聚焦显微镜结果图
图12为本发明中游离抗氧化蛋白、药物晶体-抗氧化蛋白复合物、靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物对细胞摄取抗氧化蛋白影响的流式细胞仪结果图
图13为本发明中游离抗氧化蛋白、药物晶体-抗氧化蛋白复合物、靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物对细胞摄取抗氧化蛋白影响的激光扫描共聚焦显微镜结果图
图14为本发明中细胞对靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物摄取机制的流式细胞仪结果图。
图15为本发明中细胞对靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物摄取机制的激光扫描共聚焦显微镜结果图。
图16为本发明中靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物体内治疗急性肺损伤的药效结果图。
具体实施方式
以下用附图和具体实施例，进一步说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明但本发明不受其限制。
IND：吲哚美辛
CLG：阳离子化β-乳球蛋白
SOD：超氧化物歧化酶
ICAM-1：细胞间黏附分子-1
INRs：吲哚美辛药物晶体
INRplex：吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物
Anti-ICAM-1-INRplex：细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛晶体-超氧化物歧化酶复合物
RITC：异硫氰酸罗丹明
FITC：异硫氰酸荧光素
LPS：脂多糖
Saline：生理盐水
IND/SOD：吲哚美辛/超氧化物歧化酶混合物
实施例1：吲哚美辛药物晶体
(1)制备流程图如图1所示，吲哚美辛药物晶体的处方优化工艺如下：
称取不同质量的吲哚美辛(5mg、10mg、20mg、30mg)原料药分别溶解于0.2ml丙酮中作为有机相；称取10mg阳离子化β-乳球蛋白溶解于10ml蒸馏水中作为水相；将有机相和水相均置于4℃环境中进行预冷；冰浴条件下，在1500r/min的搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，立刻进行探头超声，超声条件为超声功率为360W，超声模式为开3s、关5s，超声总时间为15min.采用减压蒸发法除去残留的有机溶剂丙酮，即制得吲哚美辛药物晶体。
粒径及电位结果如图2所示，由图可以得出当阳离子化β-乳球蛋白与吲哚美辛的质量比为1：1时，吲哚美辛药物晶体粒径最小，电位最大，因此最优处方为质量比为1：1。
(2)吲哚美辛药物晶体制备工艺：
Figure BDA0003073163780000091
制备工艺：
称取10mg吲哚美辛，用0.2ml丙酮溶解后，置于4℃环境中进行预冷，作为有机相；称取10mg阳离子化β-乳球蛋白，用10ml蒸馏水溶解后，置于置于4℃环境中进行预冷，作为水相。冰浴条件下，在1500r/min的搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，立刻进行探头超声，超声条件为超声功率为360W，超声模式为开3s、关5s，超声总时间为15min。采用减压蒸发法除去残留的有机溶剂丙酮，即制得吲哚美辛药物晶体。制得的吲哚美辛纳米棒药物晶体粒径为170.8±2.15nm；电位为20.3±0.53mV。
吲哚美辛药物晶体的透射电镜图像结果如图3所示，吲哚美辛药物晶体呈棒状。
实施例2：吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物
(1)吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的处方优化工艺如下：
纳米棒选择实施例1(2)中的吲哚美辛药物晶体，抗氧化蛋白选用超氧化物歧化酶。
称取适量的超氧化物歧化酶，用蒸馏水溶解并稀释为不同浓度的溶液，使阳离子化β-乳球蛋白与超氧化物歧化酶质量比为1.0、2.0、4.0、16.0、32.0和64.0，涡旋条件下分别逐滴加入至等体积的实施例1(2)中的吲哚美辛药物晶体，室温静置30min后，即得吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物。
制得的吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的粒径及电位结果如图4所示，其中阳离子化β-乳球蛋白与超氧化物歧化酶的质量比为32：1时，复合物的粒径最小为170.8±1.23nm，电位为20.3mV，因此选择质量比为32：1为最优处方。
(2)吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物制备工艺
药物晶体选择实施例1(2)中的吲哚美辛药物晶体，抗氧化蛋白选用超氧化物歧化酶。
称取适量的超氧化物歧化酶，用蒸馏水溶解并稀释为31.25ug/ml，涡旋条件下逐滴加入至等体积的实施例1(2)中的吲哚美辛纳米棒中，室温下静置30min，即得吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物。
实施例3：非变性聚丙酰胺凝胶电泳验证吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的形成
分别制备阳离子化β-乳球蛋白与超氧化物歧化酶质量比为1.0、2.0、4.0、16.0、32.0和64.0的吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物，以游离超氧化物歧化酶为对照，采用非变性聚丙酰胺凝胶电泳分析。具体方法如下：分别配制3％丙烯酰胺/二丙烯酰胺的浓缩胶(0.25M Tris-HCl，pH 6.8)和12.7％丙烯酰胺/二丙烯酰胺的分离胶(0.75M Tris-HCl，pH 8.8)，超氧化物歧化酶的每孔上样量为1μg，上样后以20mA的电流进行电泳，当条带到达分离胶时，增大电流至30mA电泳分离1h。电泳结束后，将凝胶转移至考马斯亮蓝染色液中染色过夜，并用脱色液清洗后在高灵敏度化学发光成像仪下进行扫描。
结果如图5所示，阳离子化β-乳球蛋白与超氧化物歧化酶质量比32-64时形成吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物。
实施例4：细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物
(1)细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的处方优化工艺如下：
药物晶体-抗氧化蛋白复合物选择实施例2(2)中的吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物，靶向分子选择细胞间黏附分子-1抗体。
量取100ul不同浓度的细胞间黏附分子-1抗体，使阳离子化β-乳球蛋白、超氧化物歧化酶及抗体质量比为32：1：0.5，32：1：1，32：1：2，32：1：4，涡旋条件下分别逐滴加入至等体积的实施例2(2)中的吲哚美辛纳米棒-超氧化物歧化酶复合物，室温静置1h后，即得细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物。
制得的细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的粒径及电位结果如图6所示，其中阳离子化β-乳球蛋白、超氧化物歧化酶及靶向分子质量比为32：1：1时，复合物的电位绝对值最小为9.89±0.68mV，粒径为237.0±2.17nm，因此选择质量比为32：1：1为最优处方。
制得的细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的透射电镜显微图像如图7所示，符合呈棒状。
(2)细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物制备工艺
药物晶体-抗氧化蛋白复合物选择实施例2(2)中的吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物，靶向分子选择细胞间黏附分子-1抗体。
量取100ul不同浓度的细胞间黏附分子-1抗体，使阳离子化β-乳球蛋白、超氧化物歧化酶及抗体质量比为32：1：1，涡旋条件下逐滴加入至等体积的实施例2(2)中的吲哚美辛药物纳米棒-超氧化物歧化酶复合物中，室温下静置1h，即得细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物。
实施例5：细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的体外释放评价
测定实施例4(2)细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物中的吲哚美辛及超氧化物歧化酶的体外释放情况。
取实施例4(2)制备的复合物1ml至3500Da透析袋中，分别置于30ml的pH7.4和6.8的PBS释放介质中，37℃水浴恒温振荡(100r/min)，于预定时间点分别取出1mL释放介质，并补充相应等体积新鲜释放介质。采用高效液相色谱法测定释放介质中的吲哚美辛含量。取实施例4(2)制备的复合物1ml至100kDa透析袋中，分别置于30mLpH7.4和6.8的PBS释放介质中，37℃水浴恒温振荡(100r/min)，于预定时间点分别取出1mL释放介质，并补充相应等体积新鲜释放介质。采用荧光分光光度计测定释放介质中超氧化物歧化酶的含量，计算累积释放百分率。
细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物中吲哚美辛的释放结果如图8所示，pH7.4条件下24h内吲哚美辛累计释放量约60％，pH6.8条件下24小时内吲哚美辛累计释放量约70％。
细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物中超氧化物歧化酶的释放结果如图9所示，pH7.4条件下24小时内超氧化物歧化酶累计释放量约60％，pH6.8条件下24小时内超氧化物歧化酶累计释放量约65％。
实施例6：人脐静脉血管内皮细胞对细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的体外细胞摄取考察
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔2×105个细胞接种于12孔板中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入1ml含细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的培养基，置于培养箱分别培养1h、2h、4h后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，使用流式细胞仪测定细胞不同时间点的荧光强度。
结果如图10所示，细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物随着时间增加荧光强度也增强，说明复合物的摄取呈时间依赖性。
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔1×105个细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入1ml含细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的培养基，置于培养箱分别培养1h、2h、4h后，弃去培养基，用PBS洗涤3次。加入1ml免疫固定液，室温固定10min，用PBS洗涤3次后，加入DAPI室温染色15min，弃去DAPI溶液，用PBS洗涤3次后，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞在不同时间点的摄取情况。
结果如图11所示，细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物随着时间增加被细胞摄取的量也增加，说明复合物的摄取呈时间依赖性。
实施例7：人脐静脉血管内皮细胞对游离超氧化物歧化酶、吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物、细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的摄取
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔2×105个细胞接种于12孔板中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入1ml分别含有游离超氧化物歧化酶、吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物、细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的培养基，置于培养箱培养4h后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，使用流式细胞仪测定各组细胞的荧光强度。
结果如图12所示，细胞摄取复合物的量高于游离的抗氧化蛋白，说明复合物能够显著提高抗氧化蛋白的入胞效率；细胞摄取细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物明显高于其他各组，说明细胞间黏附分子-1抗体能够起到高效靶向至血管内皮细胞，提高入胞效率的作用。
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔1×105个细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入1ml分别含有游离超氧化物歧化酶、吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物、细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的培养基，置于培养箱培养4h后，用PBS洗涤3次。加入1ml免疫固定液，室温固定10min，用PBS洗涤3次后，加入DAPI室温染色15min，弃去DAPI溶液，用PBS洗涤3次后，用激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞的摄取情况。
结果如图13所示，细胞摄取复合物的量高于游离的抗氧化蛋白，说明复合物能够显著提高抗氧化蛋白的入胞效率；细胞摄取细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物明显高于其他各组，说明细胞间黏附分子-1抗体能够起到高效靶向至血管内皮细胞，提高入胞效率的作用。
实施例8：细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的细胞摄取机制验证
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔2×105个细胞接种于12孔板中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入含有制霉菌素(10μM)和甲基-β-环糊精(2.5mM)的培养基，于37℃条件下孵育0.5h，弃去含有各种细胞摄取抑制剂的培养基，用PBS洗涤3次，加入含有细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的1ml培养基在37℃条件下孵育4h后，用PBS洗涤，胰酶消化，使用流式细胞仪记录各组的荧光强度。
结果如图14所示，用细胞摄取抑制剂预孵育的细胞相较于未使用抑制剂预孵育的对照组细胞，对复合物的摄取量有所降低，表明小窝蛋白抑制剂对细胞摄取复合物有抑制作用，说明小窝蛋白介导的细胞内吞途径是细胞对细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的主要摄取方式，而非溶酶体途径。
将生长状态良好的人脐静脉血管内皮细胞，用胰蛋白酶溶液消化，吹悬细胞并计数，以每孔2×105个细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养48h，弃去培养基，加入含有制霉菌素(10μM)和甲基-β-环糊精(2.5mM)的培养基，于37℃条件下孵育0.5h，弃去含有各种细胞摄取抑制剂的培养基，用PBS洗涤3次，加入含有细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的1ml培养基在37℃条件下孵育4h后，用PBS洗涤3次。加入1ml免疫固定液，室温固定10min，用PBS洗涤3次后，加入DAPI室温染色15min，弃去DAPI溶液，用PBS洗涤3次后，用激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞的摄取情况。
结果如图15所示，用细胞摄取抑制剂预孵育的细胞相较于未使用抑制剂预孵育的对照组细胞，对复合物的摄取量有所降低，表明小窝蛋白抑制剂对细胞摄取复合物有抑制作用，说明小窝蛋白介导的细胞内吞途径是细胞对细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的主要摄取方式，而非溶酶体途径。
实施例9：细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的治疗急性肺损伤。
药效学评价：以6–8周雄性BALB/c小鼠(20-25g)为动物模型，对细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物的抗炎作用效果进行考察。
1)急性肺损伤小鼠模型的建立：尾静脉注射脂多糖(0.8mg/kg)诱导急性肺损伤模型。
2)实验动物的分组和处理：将小鼠随机分为4组，每组5只，分别注射吲哚美辛与超氧化物歧化酶混合物和细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物，以注射生理盐水为对照组。给药5h后，进行取血以及采集肺部组织。
3)分别测定各组血清中和肺部组织中肿瘤坏死因子-α和白介素-6的水平。
实验结果见图16，细胞间黏附分子-1抗体-吲哚美辛药物晶体-超氧化物歧化酶复合物治疗组的两种炎症因子的表达水平最低，显示出最好的药效。

Claims (5)

1.一种靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于，药物晶体由阳离子化的β-乳球蛋白和吲哚美辛制备获得；药物晶体与抗氧化蛋白通过静电作用形成药物晶体-抗氧化蛋白复合物；药物晶体-抗氧化蛋白复合物再与靶向分子以静电作用结合形成靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物；将药物晶体与抗氧化蛋白按照质量比1:1-64:1进行混合，混合后室温孵育30 min，得到药物晶体-抗氧化蛋白复合物；抗氧化蛋白为等电点小于7.5的且生理条件下带净负电荷的蛋白质，包括：超氧化物歧化酶；
所述的药物晶体由如下步骤制备获得
1)疏水性药物吲哚美辛与阳离子化的β-乳球蛋白质量比为0.5：1-3：1；
2)将吲哚美辛原料药溶解到有机溶剂中，所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或二甲基亚砜；
3)将阳离子化的β-乳球蛋白溶解到水中，置于4℃环境中预冷；
4)搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，冰浴条件下探头超声15 min；
5)通过减压蒸馏法除去残留的有机溶剂，得到吲哚美辛药物晶体。
2.根据权利要求1所述的一种靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于
步骤3)中阳离子化的β乳球蛋白制备方法为：将0 .9 M，pH 4 .75的250 mL乙二胺溶液逐滴缓慢加入2 mL 15 % w/v β-乳球蛋白溶液中，并持续搅拌；待混合均匀后，加入70 mg的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温条件下，持续搅拌2 h；随后加入200μL 4 M，pH 4 .75醋酸盐缓冲液终止反应并继续搅拌，30 min后将反应液转移至截留分子量为3500 Da的透析袋中，于分子量为20000 Da为聚乙二醇溶液中浓缩至10 mL，再转移至蒸馏水中继续透析3天；将透析后的溶液进行冻干，即得阳离子化的β-乳球蛋白；
步骤4)中所述的搅拌条件为转速1500-2000 r/min；超声功率为300-400 W。
3.根据权利要求1所述的一种靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于，其中所述的靶向分子包括细胞间黏附分子-1抗体、血管细胞黏附分子-1抗体、血小板内皮细胞黏附分子-1抗体、L-选择素抗体或P-选择素抗体。
4.根据权利要求1所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物，其特征在于：
阳离子化的β-乳球蛋白，抗氧化蛋白与靶向分子质量比为32：1：0.5-32：1：4，将靶向分子与药物晶体-抗氧化蛋白复合物按照比例进行混合，混合后室温孵育1 h，得到靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的靶向分子-药物晶体-抗氧化蛋白复合物在制备治疗肺部损伤药物中的应用。
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