CN113170820A - 一种含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳及其制备方法 - Google Patents

一种含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳及其制备方法，属于发酵技术领域，本发明通过在牛乳中加入含有LA、LNA的食用油，利用脂肪酶酶解增加体系中的游离脂肪酸含量；并采用两段式发酵法，利用短双歧杆菌将游离脂肪酸转化生成CLA、CLNA，后加入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，优化发酵乳的风味。由于不需要添加外源共轭脂肪酸，降低工业成本，拓宽了乳品的功能性，形成新一类的功能性乳品。

Description

一种含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳及其制备方法，属于发酵技术领域。
背景技术
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是亚油酸(Linoleic acid，LA)在多个碳位上含有共轭双键的一系列十八碳二烯酸的总称。CLA因其生物功能而受到关注，其生理活性主要包括：抗癌、抗炎、减缓动脉粥样硬化、减肥等。不同的异构体具有不同的生理功能，其中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA是被公认的最具生理活性的共轭亚油酸异构体。
共轭亚麻酸(Conjugated linolenic acid，CLA)是亚麻酸(Linolenic acid，LNA)衍生得到的共轭二烯或共轭三烯型双键的十八碳三烯脂肪酸，被广泛认为具有抗癌、抗炎症、抗氧化、抗心血管疾病等多种生理功能。在共轭亚麻酸的各种立体异构体中，c9，t11，c15-CLNA(CLNA1)、t9，t11，c15-CLNA(CLNA2)、t10，c12，c15-CLNA和c6，c9，t11-CLNA被认为是最具生物活性的异构体。
天然的CLA和CLNA存在于瘤胃动物乳脂和植物种子中，难以对其实现分离和纯化，成本较高。目前已有化学合成法和生物转化法，但前者转化率低，各异构体的比例难以控制。后者包括微生物发酵法和基因工程法，其中微生物发酵法所转化的产物单体较唯一，转化率高，易于分离，更适合后期的综合利用。
由于CLA和CLNA是一种油状产品，目前只有相关的胶囊产品，缺少其他功能性食品应用方式。酸乳是日常生活中人们喜爱的饮品之一，其中的脂肪、蛋白质代谢由于牛奶，但由于牛乳原料中几乎不含LA、LNA，因此市面上也缺乏一款同时具有CLA、CLNA的酸乳产品。目前已有利用生物转化法生产含CLA的酸乳产品，记载于公开号CN105053188A、CN201731335A的专利申请文本中，但相关技术通过直接添加亚油酸LA至发酵基料中进行CLA生物转化，成本较高。
因此，如何通过发酵法直接制备同时含有共轭亚油酸和共轭亚麻酸的酸奶，成为研究的热点和难点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过在牛乳中加入含有LA、LNA的食用油，利用脂肪酶酶解增加体系中的游离脂肪酸含量；并采用两段式发酵法，利用短双歧杆菌将游离脂肪酸转化生成CLA、CLNA，后加入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，优化酸乳的风味。由于不需要添加外源共轭脂肪酸，降低工业成本，拓宽了乳品的功能性，形成新一类的功能性乳品。
本发明提供了一种制备含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将植物油与乳化剂溶液混合，制备得到植物油乳浊液；
(2)向牛乳中添加植物油乳浊液和甜味剂，得到发酵基料；
(3)向发酵基料中添加脂肪酶进行酶解，得到酶解液；
(4)向酶解液中添加短双歧杆菌进行发酵，得到发酵液；
(5)向发酵液中添加嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌进行发酵，制备得到发酵乳。
在本发明的一种实施方式中，所述牛乳为生牛乳或者脱脂乳。
在本发明的一种实施方式中，所述脱脂乳为：每110g水中加入11g脱脂乳粉制备11％(w/w)复原乳。
在本发明的一种实施方式中，所述短双歧杆菌为：短双歧杆菌GDMCC No.60386；所述短双歧杆菌GDMCC No.60386记载于公开号为CN108949640B的发明专利文本中。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)为：将乳化剂与水混合后，在50～70℃溶解，制备得到乳化剂溶液；将乳化剂溶液与植物油按照1：5～1：7的比例混合，制备得到植物油乳浊液。
在本发明的一种实施方式中，所述乳化剂包括聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸甘油酯。
在本发明的一种实施方式中，所述乳化剂的浓度为：50％(w/w)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述植物油包括：亚麻籽油、菜籽油、大豆油、核桃油、花生油、玉米油。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述脂肪酶来源于米曲霉(300000U/g)，型号L140441，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶在发酵基料中的添加量为20～200U/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述酶解的温度为37℃、时间为3h。
在本发明的一种实施方式中，所述甜味剂包括蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、果葡糖浆、果糖中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中的发酵条件为：37℃，16h；步骤(5)中的发酵条件为：40℃，4h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中的嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌菌粉的添加量分别为0.01g/L。
本发明还提供了利用上述方法制备得到的发酵乳。
有益效果
(1)本发明提供了一种制备发酵乳的方法，使用此方法仅需将短双歧杆菌GDMCCNo.60386接种至添加植物油、酶解处理的牛乳中进行发酵，即可获得含共轭脂肪酸的发酵乳，步骤简单，并且本发明采用价格便宜的植物油代替价格昂贵的亚油酸和亚麻酸为原料，制备得到同时含有共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳，成本低，营养价值高，因此，本发明的技术方案在工业生产中能够得到广泛应用。
(2)采用本发明的技术方案发酵获得的发酵乳中，共轭亚油酸含量达0.42～2.60mg/mL，共轭亚麻酸含量达0.20～2.34mg/mL。
(3)采用本发明的技术方案发酵获得的发酵乳，颜色和质地较为均匀，组织细腻，发酵风味细腻浓郁，伴有原料特有的香味，综合感官评分高。
附图说明
图1：短双歧杆菌GDMCC No.60386的发酵上清液制备共轭亚油酸的转化率及共轭亚油酸总浓度随培养时间的变化曲线。
图2：短双歧杆菌GDMCC No.60386经培养72小时后培养液、胞内的共轭亚油酸的分布图。
图3：短双歧杆菌GDMCC No.60386的发酵上清液制备共轭亚麻酸的转化率及共轭亚油酸总浓度随培养时间的变化曲线。
图4：短双歧杆菌GDMCC No.60386经培养72小时后培养液、胞内的共轭亚麻酸的分布图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的短双歧杆菌GDMCC No.60386记载于公开号为CN108949640B的专利文本中；下述实施例中的脂肪酶购自阿拉丁公司。下述实施例中所涉及的亚麻籽油、菜籽油、大豆油、核桃油购自江苏无锡欧尚超市，下述实施例中所涉及的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌直投式菌粉购自丹尼斯克有限公司。
下述实施例中，在没有特殊说明的情况下，本发明涉及的百分数均为质量百分数。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的双歧杆菌菌菌体的制备方法如下：
将短双歧杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液于4℃、6000×g的条件下离心10min，得到短双歧杆菌菌体。
下述实施例中涉及的总脂肪酸及游离脂肪酸含量检测方法如下：
脂肪酸提取：取200μL样品加入4mL氯仿甲醇混合液(2:1，v/v)，以及100μL的十五烷酸甲酯内标物，充分混合均匀后3500r/min离心5min，下层氯仿层与0.86％的NaCl溶液混合并静置分层；搜集有机层过滤，氮吹除去有机试剂，将提脂瓶保存于-20℃冰箱中；
游离脂肪酸甲酯化：将氮吹干后的样品重悬于400μL甲醇，添加适量重氮甲烷进行直接甲酯化，待黄色维持15min后氮吹，重悬于1mL正己烷，转移至样品瓶，过0.22μm有机滤膜后进行气相色谱分析；
总脂肪酸甲酯化：将氮吹后的样品加入0.5mol/L的氢氧化钠—甲醇溶液1mL，置于65℃的水浴锅中恒温保持15min后氮气吹干，重悬于1mL正己烷，转移至样品瓶，过0.22μm有机滤膜后进行气相色谱分析；
其中，脂肪酸甲酯采用气质联用色谱仪进行检测；岛津气相色谱仪(GC2010plus)，气相柱Rtx-wax(30m×0.25mm×0.25μm)，质谱仪(岛津Ultra QP2010)；程序升温条件：初始150℃，以5℃/min的速率升温至200℃，保持10min，后以4℃/min升温至240℃，保持10min；采用分流进样，进样量为1μL，分流比为10:1(v/v)，氦气作为载气；进样器温度和检测器温度均为240℃；离子源220℃，强度为70eV。
由GC-MS测得的谱图在NIST11标准谱图的检索及标准品比对进行物质定性，用面机归一法定量，得到样品中的总脂肪酸及游离脂肪酸含量。
实施例1：短双歧杆菌GDMCC No.60386在制备共轭亚油酸中的应用
具体步骤如下：
(1)菌株活化
从-80℃冰箱取出保有短双歧杆菌GDMCC No.60386的甘油管，取菌液划线于MRS固体培养基上，厌氧环境下37℃培养48h；挑取长出的单菌落并接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h，连续活化3代，得到菌液。
(2)亚油酸母液的配制
称取300mg亚油酸(LA)和200mg Tween-80溶于水并定容至10mL，充分搅拌乳化后，经0.45μm无菌滤膜过滤除菌后，得到浓度为0.64mg/mL的亚油酸母液，将亚油酸母液于-20℃避光保存。
(3)与亚油酸共培养
以添加等量亚油酸母液而不添加菌液的培养基为对照，将步骤(1)中活化好的菌液按照2％(v/v)接种量接种至含210μL步骤(2)中的亚油酸母液的10mL MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养72h，培养过程中，分别取于第0、12、24、48、72h对发酵液进行取样，将样本添加至干净离心管中，5000rpm离心5min取菌体待用。
(4)脂肪酸提取
发酵液中脂肪酸的提取：向步骤(3)中得到的发酵液中分别添加十七烷酸(C17:0)至终浓度为0.075mg/mL作内标，然后添加2mL异丙醇，充分振荡30s；再添加3mL正己烷，充分振荡30s；5000rpm离心3min，吸取正己烷层至干净提脂瓶中，氮气吹干，得到脂肪酸；检测培养0、12、24、48、72h时得到的发酵液中的脂肪酸含量，结果如表1所示。
菌体中的脂肪酸提取：步骤3离心所得菌体用2mL盐溶液(0.137mol/L NaCl，7.0mmol/L K2HPO4，2.5mmoL/L KH2PO4)洗涤，4000rpm离心5min，重复洗涤步骤；再将菌体重悬于2mL前述盐溶液中，添加十七烷酸C17:0至终浓度为0.0575mg/mL，按与发酵液相同的方法进行脂肪酸提取及氮气吹干，到脂肪酸；检测培养72h时得到的菌体中的脂肪酸含量，结果如表2所示：
表1：短双歧杆菌发酵液在不同培养时间下的共轭亚油酸总浓度
Figure BDA0003075931610000051
表2：短双歧杆菌培养72h后发酵液、菌体中的共轭亚油酸分布
Figure BDA0003075931610000061
实验结果表明：CLA的积累过程中，短双歧杆菌GDMCC No.60386在含有0.64mg/mLLA的MRS中生长，培养12h时开始产CLA，随着菌体生长，在培养12-36h时共轭亚油酸的含量逐渐增加，培养36h后发酵液中共轭亚油酸的浓度趋于饱和(如图1所示)。培养72h左右，CLA的总含量达到了0.4612mg/mL，以底物LA总量计CLA的总转化率为72.06％。
从CLA各异构体含量来看，所得发酵产物只有CLA1和CLA2两种异构体。菌株在培养12h后开始转化CLA1，随着菌体生长，异构体CLA1在12h-36h内快速累积，在36h后趋于饱和，而CLA2在菌株开始积累CLA(24h)含量较低，随着培养时间的延长，该异构体的浓度也进一步增加。培养72h后，CLA1的浓度高达为0.4131mg/mL，占总CLA产量的89.58％(如图2所示)。
实施例2：短双歧杆菌GDMCC No.60386在制备共轭亚麻酸中的应用
(1)菌株活化
从-80℃冰箱取出保有短双歧杆菌GDMCC No.60386的甘油管，取菌液划线于MRS固体培养基上，厌氧环境下37℃培养48h；挑取长出的单菌落并接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h，连续活化3代，得到菌液。
(2)亚麻酸母液的配制
称取300mgα-亚麻酸(α-LNA)和200mg Tween-80溶于水并定容至10mL，充分搅拌乳化后，经0.45μm无菌滤膜过滤除菌，得到浓度为0.38mg/mL亚麻酸母液，将亚麻酸母液于-20℃避光保存。
(3)与亚麻酸共培养
以添加等量亚麻酸而不添加菌液的培养基为对照，将步骤(1)中活化好的菌液按照2％(v/v)接种量接种至含步骤(2)中的亚麻酸母液的10mL MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养72h，得到发酵液，培养过程中，分别于第0、12、24、48、72h时对发酵液进行取样，将样本添加至干净离心管中，5000rpm离心5min取菌体待用。
4、脂肪酸提取
发酵液中脂肪酸的提取：向步骤(3)中得到的发酵液中添加十七烷酸(C17:0)至终浓度为0.0767mg/mL作内标，然后添加2mL异丙醇，充分振荡30s；再添加3mL正己烷，充分振荡30s；5000rpm离心3min，吸收正己烷层至干净提脂瓶中，氮气吹干，得到脂肪酸，检测培养0、12、24、48、72h时得到的发酵液中的脂肪酸含量，结果如表3所示。
菌体中脂肪酸提取：步骤3离心所得菌体用2mL盐溶液(含0.137mol/L NaCl，7.0mmol/L K2HPO4，2.5mmoL/L K2HPO4洗涤，4000rpm离心5min，重复洗涤步骤。所得菌体重悬于2mL上述盐溶液中，添加十七烷酸(C17:0)至终浓度为0.0575mg/mL，按与发酵液相同的处理方法进行脂肪酸提取及氮气吹干，得到脂肪酸，检测培养72h时得到的发酵液中的脂肪酸含量。结果如表4所示：
表3：短双歧杆菌发酵液在不同培养时间下的共轭亚麻酸总浓度
Figure BDA0003075931610000071
表4：短双歧杆菌培养72h后发酵液、菌体中的共轭亚麻酸分布
Figure BDA0003075931610000072
实验结果表明：GDMCC No.60386在含有0.38mg/mLα-LNA的MRS培养基中生长12h时开始产CLNA，随着菌体生长共轭亚麻酸的含量逐渐增加(24h、36h)，培养36h后共轭亚麻酸的含量趋于饱和(如图3)；培养72h左右，CLNA的总含量达到了0.2591mg/mL，以底物α-LNA总量计其转化率为68.18％。
实验结果表明：经过CLNA各异构体含量分析，所得产物中只有CLNA1和CLNA2两种.菌株在培养12h后开始转化共轭亚麻酸，随着菌体生长，异构体CLNA1在12h～36h内快速累积，CLNA1的含量在菌株培养36h后趋于饱和，而CLAN2在菌株开始积累CLNA(24h)含量较低，随着培养时间的延长，该异构体的浓度也进一步增加，最终CLNA1浓度为0.2192mg/mL(如图4所示)。
实施例3：发酵乳的制备(亚麻籽油)
具体步骤如下：
(1)将聚甘油脂肪酸酯与水按照质量体积比为1：1的比例混合后在50℃条件下溶解，制成质量分数为50％(w/w)的乳化剂溶液。将乳化剂溶液与亚麻籽油按照1：6(v/v)混合，搅拌均匀后在温度60～70℃，压力55Mpa下乳化均质，制成亚麻籽油乳浊液。
(2)在生牛乳或11％(w/w)脱脂乳粉复原乳(制备方法：每110g水中加入11g脱脂乳粉，充分搅拌溶解)中加入5.0％(w/w)亚麻籽油乳浊液和8％(w/w)蔗糖，搅拌均匀后在60℃、20Mpa下均质，得到发酵基料。
(3)在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200U/mL的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，分别制备得到酶解液1-1～1-8。
(4)分别将制备得到的短双歧杆菌菌体重悬至步骤(3)制备得到的酶解液中，此时，菌浓为4×107～7×107CFU/mL，将酶解液置于37℃发酵16h，分别制备得到发酵液1-1～1-8。
(5)将嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合菌粉，按照在发酵乳中的终浓度为0.01g/L的浓度，添加至步骤(4)制备得到的发酵液中，在40℃发酵4h，分别得到发酵乳1-1～1-8。
分别测定发酵乳1-1～1-8的pH、活菌数和游离脂肪酸含量，结果如表5所示。
表5含亚麻籽油的共轭脂肪酸发酵乳参数
Figure BDA0003075931610000081
由表5可知，脂肪酶的添加量增加后，牛乳中的游离脂肪酸含量增加，但同时伴随着活菌数的下降；综合考虑活菌数及转化率，我们发现当脂肪酶添加量为80U/mL时，发酵乳中CLA和CLNA的转化率最高，分别达68.8％、66.9％。此时发酵乳1-5的pH＝4.55±0.01，活菌数达5.40×108CFU/mL，终产品亚麻籽油发酵乳中的CLA含量为0.44±0.05mg/mL，CLNA含量为1.78±0.02mg/mL。
实施例4：发酵乳的制备(大豆油)
具体步骤如下：
(1)将蔗糖脂肪酸甘油酯与水按照质量体积比为1：1的比例混合后在50℃条件下溶解，制成质量分数为50％(w/w)的乳化剂溶液。将乳化剂溶液与大豆油按照1：5(v/v)混合，搅拌均匀后在温度60～70℃，压力55Mpa下乳化均质，制成大豆油乳浊液。
(2)在生牛乳或11％(w/w)脱脂乳粉复原乳(制备方法：每110g水中加入11g脱脂乳粉，充分搅拌溶解)中加入6.0％(w/w)大豆油乳浊液和8％(w/w)蔗糖，搅拌均匀后在60℃、20Mpa下均质，得到发酵基料。
(3)在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200U/mL的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，分别得到酶解液2-1～2-8；
(4)分别将制备得到的短双歧杆菌菌体重悬至步骤(3)制备得到的酶解液中，此时，菌浓为4×107～7×107CFU/mL，将酶解液置于37℃发酵16h，分别制备得到发酵液2-1～2-8。
(5)将嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合菌粉，按照在发酵乳中的终浓度为0.01g/L的浓度，添加至步骤(4)制备得到的发酵液中，在40℃发酵4h，分别得到发酵乳2-1～2-8。
分别测定发酵乳2-1～2-8的pH、活菌数和游离脂肪酸含量，结果如表6所示。
表6：含大豆油的共轭脂肪酸发酵乳参数
Figure BDA0003075931610000091
由表6可知，脂肪酶的添加量增加后，牛乳中的游离脂肪酸含量增加，但同时伴随着活菌数的下降；综合考虑活菌数及转化率，我们发现当脂肪酶添加量为60U/mL时，发酵乳中CLA和CLNA的转化率最高，分别达70.5％、62.9％。此时发酵乳2-4的pH＝4.49±0.03，活菌数达3.90×108CFU/mL，终产品大豆油发酵乳中的CLA含量为1.77±0.06mg/mL，CLNA含量为0.22±0.03mg/mL。
实施例5：发酵乳的制备(菜籽油)
具体步骤如下：
(1)将聚甘油脂肪酸酯与水按照质量体积比为1：1的比例混合后在50℃条件下溶解，制成质量分数为50％(w/w)的乳化剂溶液。将乳化剂溶液与菜籽油按照1：6(v/v)混合，搅拌均匀后在温度60～70℃，压力55Mpa下乳化均质，制成菜籽油乳浊液。
(2)在生牛乳或11％(w/w)脱脂乳粉复原乳(制备方法：每110g水中加入11g脱脂乳粉，充分搅拌溶解)中加入4.0％(w/w)菜籽油乳浊液和8％(w/w)蔗糖，搅拌均匀后在60℃、20Mpa下均质，得到发酵基料。
(3)在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200U/mL的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，分别制备得到酶解液3-1～3-8；
(4)分别将制备得到的短双歧杆菌菌体重悬至步骤(3)制备得到的酶解液中，此时，菌浓为4×107～7×107CFU/mL，将酶解液置于37℃发酵16h，分别制备得到发酵液3-1～3-8。
(5)将嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合菌粉，按照在发酵乳中的终浓度为0.01g/L的浓度，添加至步骤(4)制备得到的发酵液中，在40℃发酵4h，分别得到发酵乳3-1～3-8。
分别测定发酵乳3-1～3-8的pH、活菌数和游离脂肪酸含量，结果如表7所示。
表7：含菜籽油的共轭脂肪酸发酵乳参数
Figure BDA0003075931610000101
由表7可知，脂肪酶的添加量增加后，牛乳中的游离脂肪酸含量增加，但同时伴随着活菌数的下降；综合考虑活菌数及转化率，我们发现当脂肪酶添加量为60U/mL时，发酵乳中CLA和CLNA的转化率最高，分别达69.6％、60.6％。此时发酵乳3-4的pH＝4.38±0.05，活菌数达5.89×108CFU/mL，终产品菜籽油发酵乳中的CLA含量为0.39±0.06mg/mL，CLNA含量为0.20±0.08mg/mL。
实施例6：发酵乳的制备(核桃油)
具体步骤如下：
(1)将蔗糖脂肪酸甘油酯与水按照质量体积比为1：1的比例混合后在50℃条件下溶解，制成质量分数为50％(w/w)的乳化剂溶液。将乳化剂溶液与核桃油按照1：7(v/v)混合，搅拌均匀后在温度60～70℃，压力55Mpa下乳化均质，制成大豆油乳浊液。
(2)在生牛乳或11％(w/w)脱脂乳粉复原乳(制备方法：每110g水中加入11g脱脂乳粉，充分搅拌溶解)中加入4.5％(w/w)核桃油乳浊液和8％(w/w)蔗糖，搅拌均匀后在60℃、20Mpa下均质，得到发酵基料。
(3)在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200U/mL的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，分别制备得到酶解液4-1～4-8；
(4)分别将制备得到的短双歧杆菌菌体重悬至步骤(3)制备得到的酶解液中，此时，菌浓为4×107～7×107CFU/mL，将酶解液置于37℃发酵16h，分别制备得到发酵液4-1～4-8。
(5)将嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合菌粉，按照在发酵乳中的终浓度为0.01g/L的浓度，添加至步骤(4)制备得到的发酵液中，在40℃发酵4h，分别得到发酵乳4-1～4-8。
分别测定发酵乳4-1～4-8的pH、活菌数和游离脂肪酸含量，结果如表8所示。
表8：含核桃油的共轭脂肪酸发酵乳参数
Figure BDA0003075931610000111
由表8可知，脂肪酶的添加量增加后，牛乳中的游离脂肪酸含量增加，但同时伴随着活菌数的下降；综合考虑活菌数及转化率，我们发现当脂肪酶添加量为80U/mL时，发酵乳中CLA和CLNA的转化率最高，分别达69.4％、65.9％。此时发酵乳4-5的pH＝4.45±0.06，活菌数达6.76×108CFU/mL，终产品核桃油发酵乳中的CLA含量为2.15±0.05mg/mL，CLNA含量为0.27±0.03mg/mL。
对比例1：
具体实施方式同实施例3，区别在于：
将步骤(3)调整为：在发酵基料中添加60U/mL的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，制备得到酶解液；
将步骤(4)调整为：将嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合菌粉，按照在发酵乳中的终浓度为0.01g/L的浓度，添加至步骤(3)制备得到的酶解液中，在40℃发酵4h，得到发酵乳1；
步骤(5)为：分别将制备得到的短双歧杆菌菌体重悬至步骤(4)制备得到的发酵乳1中，此时，短双歧杆菌在发酵乳1中的菌浓为4×107～7×107CFU/mL，在37℃发酵16h，制备得到发酵乳。
测定发酵乳的pH及活菌数，结果显示(以下数据均以实施例3中的添加60U/mL的脂肪酶制备得到的发酵乳进行对比)，其分别为pH＝4.81±0.03，2.81×108CFU/mL，较实施例3有所下降。
采用脂肪酶对发酵基料酶解后，发酵前游离脂肪酸的含量分别为：LA＝0.65±0.04mg/mL，LNA＝2.66±0.06mg/mL，与实施例3相比，其含量未显著变化；但发酵后共轭脂肪酸的含量较实施例3显著下降，分别为CLA＝0.23±0.07mg/mL，CLNA＝1.08±0.03mg/mL，CLA和CLNA的转化率仅为35.3％、40.6％，说明两段式发酵的顺序调换影响短双歧杆菌在发酵乳中的增殖活性，从而影响共轭脂肪酸的转化率。
对比例2：
具体实施例方式同实施例3，区别在于，调整短双歧杆菌为CGMCC No.11828，调整脂肪酶的浓度为60U/mL的脂肪酶，制备得到发酵乳；以下数据均以实施例3中的添加60U/mL的脂肪酶制备得到的发酵乳进行对比。
测定发酵乳的pH及活菌数，结果显示其分别为pH＝4.52±0.03，8.73±0.02CFU/mL，较实施例3无显著变化，说明短双歧杆菌CGMCC No.11828在发酵体系中生长较好。
采用脂肪酶对发酵基料酶解后，发酵前游离脂肪酸的含量分别为：LA＝0.63±0.07mg/mL，LNA＝2.68±0.03mg/mL；结果显示未显著变化，但发酵后共轭脂肪酸的含量较实施例3显著下降；共轭脂肪酸的含量分别为：CLA＝0.06±0.02mg/mL，CLNA＝0.46±0.04mg/mL，CLA和CLNA的转化率仅为10.1％、17.1％；
上述实验说明将本实验的短双歧杆菌CGMCC No.60386替换为短双歧杆菌CGMCCNo.11828之后，制备得到的发酵乳中，共轭脂肪酸的含量显著降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备含共轭亚油酸和共轭亚麻酸的发酵乳的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将植物油与乳化剂溶液混合，制备得到植物油乳浊液；
(2)向牛乳中添加植物油乳浊液和甜味剂，得到发酵基料；
(3)向发酵基料中添加脂肪酶进行酶解，得到酶解液；
(4)向酶解液中添加短双歧杆菌进行发酵，得到发酵液；
(5)向发酵液中添加嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌进行发酵，制备得到发酵乳。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短双歧杆菌为：短双歧杆菌GDMCCNo.60386。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：将乳化剂与水混合后，在50～70℃溶解，制备得到乳化剂溶液；将乳化剂溶液与植物油按照1：5～1：7的比例混合，制备得到植物油乳浊液。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述植物油包括：亚麻籽油、菜籽油、大豆油、核桃油、花生油、玉米油。
5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述乳化剂包括聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸甘油酯。
6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶在发酵基料中的添加量为20～200U/mL。
7.如权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶酶解的温度为35～45℃、时间为1～3h。
8.如权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述甜味剂包括蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、果葡糖浆、果糖中的一种或多种。
9.如权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵条件为：37℃，16h；步骤(5)中的发酵条件为：42℃，4h。
10.利用权利要求1～9任一所述的方法制备得到的发酵乳。
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