CN113167646A - 拉曼光谱仪 - Google Patents

Abstract

公开了用于测量样品(12)的拉曼光谱特征(52)的方法和装置(10)，其中例如由于环境光(14)的入射或由于可变荧光，从样品还接收到强度可变的背景光。在CCD器件(40)上定义检测像素(42)和存储像素(44)。激光探测光(22)被引导至样品。在第一间隔和第二间隔的重复循环中，在每个第一间隔中，在检测像素处接收背景光，并且在每个第二间隔中，在检测像素处接收背景光和散射的激光探测光。来自第一间隔和第二间隔中的每个间隔的累积信号分别在第二间隔和第一间隔期间被保持在存储像素中。在其他方面，激光探测光在第一间隔和第二间隔两者期间被引导至样品，但是在每个间隔中具有不同的波长。

Description

拉曼光谱仪

技术领域

本发明涉及用于测量样品的一个或多个拉曼光谱特征的方法和装置。例如，本发明的实施例可用于在手持装置中实施以在样品上进行拉曼光谱法，例如用于在实验室之外使用。

背景技术

拉曼光谱法是一种功能强大的分析方法，可用于确定各种样品的化学成分。该技术具有广泛的应用，包括材料表征、爆炸物检测、食品分析、药物分析、医学诊断、法医学、文化遗产和太空任务中的地外样品调查等。在实验室的受控环境中提供准确和有效的拉曼光谱分析的技术已得到很好的发展。

然而，在实验室外更实际的应用领域中，提供一种用于拉曼光谱分析和样品表征的鲁棒仪器提出了许多挑战，例如，给定拉曼散射的非常低的横截面，与通常其他散射和发射类型以及光子信号相比，如何提供足够快速的材料检测，如何提供足够轻便、便携但鲁棒的设备，如何避免不利的环境影响(例如振动和污染)等等。

样品的拉曼光谱法还可能受到样品的荧光的不利影响，特别是受到与用于检测拉曼光谱特征的样品相同的激光照射所激发的荧光的影响。

本发明试图解决相关现有技术的问题和限制。

发明内容

发明人已经注意到，由于拉曼光谱信号的性质非常弱，所以拉曼光谱分析非常容易受到环境光干扰的影响，这很容易使拉曼散射信号不堪重负。这样的环境光可被表征为落在样品上的光，该光不专门用于确定样品的拉曼光谱特征，例如直接或间接的日光，以及人造光源，例如室内灯和桌灯。特别地，这种环境光不包括出于检测表征样品的拉曼光谱特征的目的而指向样品的激光探测光，而是例如可以包括入射到样品上的所有其他光。

因此，拉曼光谱仪在通常的实验室环境之外的应用可能会受到不希望的光源(例如人造光或日光)的损害，这些光源也可能经受附加的背景移动/变化(例如，由于移动的物体、仪器或人员造成的阴影，光谱强度波动等)。

通常可以通过物理覆盖样品和仪器探头之间的接触区域来防止环境光进入拉曼仪器。然而，这并不总是有用或可行的，特别是在需要鲁棒且用户友好的便携式拉曼分析器的情况下。使用诸如利用短脉冲激光器结合选通等解决方案可能可以克服来自环境光的干扰，但是这种技术意味着高峰值功率，这可能会损坏敏感样品，并且这种方法固有的仪器复杂性也可能会干扰以合理的成本生产小型轻巧(例如手持式)设备的目标。

另一种方法可能是使用低于300nm的紫外光谱范围中的激光探测光，因为由于大气中的臭氧吸收，该区域中的太阳辐射被阻挡，但这可能会由于UV辐射而导致样品降解，并且除日光以外的其他环境光源可能仍然是问题。UV区域的这种使用也可能会限制一些特殊的拉曼形态(例如空间偏移拉曼光谱仪(SORS)或透射拉曼光谱仪)用于在混浊样品内部深探测，这依赖于通常在这个光谱区域中可能无法实现的基质的非吸收性。

当入射环境光的强度和/或光谱含量发生变化时，尤其是在这些变化与拉曼光谱的单个曝光或采集时段相比时间尺度相同或更快速的情况下，入射到样品上的环境光的影响可能更难以补偿。

因此，本发明人试图使用光谱(源自由激光探测光和环境光同时照射、以及仅环境光照射)的准同时采集并使用基于快速光学锁定检测的技术来解决环境光的快速和不规则变化的不利影响，基于快速光学锁定检测的技术使用电荷耦合器件(CCD)中的电荷移位操作，而电荷被保留在CCD芯片上。

所描述的技术还可以用于帮助补偿在测量拉曼光谱特征所花费的时间期间样品发射的荧光水平的变化。这样的变化可能例如是由于光致褪色(photobleaching)引起的，其中荧光信号随时间明显降低。由于用于获取拉曼光谱特征的激光束的照射，这种光致褪色特别可能发生。这种光致褪色可以涉及多种机制，例如，激发态荧光团与样品中其他分子接触时的失活。

由于每个记录的光谱需要的读出和模数转换步骤，以及典型的低拉曼信号强度，传统的基于CCD的探测器存在基本的技术限制，实际上将操作速度限制在小于大约10Hz。为了能够快速交替检测由包含期望的拉曼光谱特征的激光探测光产生的光谱与仅由环境光产生的光谱，因此，本发明寻求利用CCD电荷移位技术。在这种方法中，减慢了采集并向数据引入了附加的(读出)噪声的CCD读出和数字化步骤仅在拉曼和背景光谱信号累积的多个(例如数千个)循环之后才执行一次。简而言之，对于更长的总曝光时段的一个循环，CCD的特定区域曝光于包含激光探测光和从样品散射的环境光的收集光。

在同一循环中，通过将CCD芯片上的整个电荷沿一个方向移位一定数量(n)的行，累积的电荷被移位到非照射区域(例如，在活动照射区域上方)，并且CCD芯片上的先前照射区域现在仅曝光于通过关闭或阻挡样品之前的激光激发源而获取的环境光贡献。然后，循环继续进行，将整个电荷再移位n行，将先前获取的带有拉曼信号的电荷反向呈现回活动照射区域，并开始另一拉曼曝光，而先前获取的背景被转移到另一个非照射区域，例如活动照射区域下方。然后，在曝光时段的持续时间内重复该循环，该曝光时段例如可以是固定的或预定的时段，或者直到积聚了足够的电荷以使其被读取或接近CCD饱和水平为止。

由于在单个曝光时段的循环内没有任何数字化或从CCD的其他读出，并且仅涉及电荷在CCD芯片上上下移动，因此可以在几千赫兹的频率范围内便利电荷移位时段而实际上不会对移位电荷产生噪声损失，移位电荷可以在整个曝光时段中保持累积在CCD像素内。以这种方式，在许多例如几千个循环期间累积的电荷将允许以改善的高信噪比来检索光谱。从CCD最终读出光谱信号将只会对光谱引入一次读出噪声，考虑到该阶段的电荷信号高度，可以认为该噪声可忽略不计。

上述技术也可以实现在以下循环中，此循环包括：由于第一波长的激光激发引起的电荷累积、该电荷到非照射区域的移位、然后由于第二波长的激光激发引起的电荷累积，在两种情况下，样品也曝光于环境光，由于两个不同的激发波长而产生的光谱随后在很大程度上消除了环境光的影响的过程中被组合。

特别地，本发明提供了测量样品的拉曼光谱特征的方法，其中从样品还接收到背景光，特别是当预期该背景光是可变的时，例如在强度和/或光谱含量并且可能还有极化特性方面是可变的。在具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)上定义检测像素和存储像素，并且提供激光源，该激光源被布置为将激光探测光引导至样品。还提供了收集光学器件，该收集光学器件被布置为将来自样品的光引导至检测像素。例如，来自样品并由收集光学器件收集的光可以包括入射到样品上然后以多种方式散射(包括通过弹性和非弹性散射机制，通过漫反射和镜面反射，以及在样品表面处及其下方散射)的环境光的成分。

来自样品的光还可以或替代地包括其他成分，诸如例如在为了确定拉曼光谱特征的目的而被引导至样品的激光探测光的激发之后，从样品发射的荧光的成分。这种荧光可以是可变的，例如由于诸如光致褪色的过程，并且可以使用本发明以与本发明能够补偿环境光的变化相同的方式来实现对这种变化的补偿。

在第一方面中，所述方法包括，在曝光时段的持续时间内，重复至少第一间隔和第二间隔的循环，在第一间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光而没有激光探测光，以在这些像素处累积第一背景光谱信号，在第二间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和由样品散射的激光探测光，尤其是已经被样品拉曼散射的此类光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号。特别地，来自样品的背景光可以是或可以包括由样品散射的环境光，但是可以被认为不包括已经弹性地或非弹性地散射(特别是在样品处)的激光探测光的元素。

在第一间隔期间，由于环境光的入射，第一背景光谱信号累积在检测像素中，同时在存储像素中存储累积的第二拉曼光谱信号。在第二间隔期间，由于背景光和激光探测光的入射，第二拉曼光谱信号累积在检测像素中，同时在存储像素中存储累积的第一背景光谱信号。因此，累积的第二拉曼光谱信号包括来自在第二间隔期间在检测像素处接收的散射的激光探测光和背景光的贡献，而累积的第一背景光谱信号仅包括来自背景的贡献。

在第一方面中，在曝光时段期间激光探测光的波长保持恒定，尽管至少在第一间隔期间激光源被关闭或探测光被阻挡而无法到达样品。

在第二方面中，使用多于一个波长的激光探测光，特别是在每个第一间隔期间使用第一波长，并且在每个第二间隔期间使用与第一波长不同的第二波长。这些第一波长和第二波长在单个曝光时段中应分别保持恒定，并且通常还可以在多个曝光时段中保持恒定。

在第二方面中，所述方法包括，在曝光时段的持续时间内，重复至少第一间隔和第二间隔的循环，在第一间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和随后被样品散射的第一波长的激光探测光，尤其是已经被样品拉曼散射的此类光，以在这些像素处累积第一拉曼光谱信号，在第二间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和随后被样品散射的第二波长的激光探测光，特别是已经被样品拉曼散射的此类光，，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号，其中第二波长与第一波长不同。

特别地，来自样品的背景光可以是或可以包括被样品散射的环境光，和/或可以是或可以包括样品的荧光。然而，可以认为背景光不包括已经弹性或非弹性散射(特别是在样品处)的激光探测光的元素。例如，样品的这种荧光可以至少部分地由入射在样品上的激光探测光而激发，并且由于样品的光致褪色，特别是通过相同的激光而导致的样品的光致褪色，可能随时间而经受强度减弱。

在第一间隔期间，还在第一拉曼光谱信号累积在检测像素中的同时将累积的第二拉曼光谱信号存储在存储像素中。在第二间隔期间，在第二拉曼光谱信号累积在检测像素中的同时将累积的第一拉曼光谱信号存储在存储像素中。

在以上任一方面中，在曝光时段之后，可以从CCD读取在曝光时段期间累积的第一(背景或拉曼)光谱信号和第二(拉曼)光谱信号，例如按需包括数字化、电子倍增、空间平均或合并以及其他技术。

然后可以使用从一个或多个这样的曝光时段读取的第一光谱信号和第二光谱信号来计算补偿的拉曼光谱信号，已从该补偿的拉曼光谱信号在很大程度上去除了由于背景光导致的信号。然后可以根据来自一个或多个曝光时段的补偿的拉曼光谱信号来确定样品的一种或多种化学特性，例如，存在于样品处或样品中的一种或多种化学物质的鉴定和/或浓度。

可以通过各种方式从可用光谱信号中计算补偿的光谱信号。在第一方面中，可以简单地从第二拉曼光谱信号减去第一背景光谱信号。在第二方面中，有时可能涉及更多的补偿的光谱信号的计算，但是下面并且例如在US 8,570,507中描述了一些合适的技术。

对于第一方面，激光探测光可以在每个第二间隔期间入射在样品上，并且在每个第一间隔期间不存在于样品上，例如通过操作激光源以仅在每个第二间隔期间发射激光探测光，而不在每个第一间隔期间发射激光探测光。此外，当激光源不发射激光时，可以在第二间隔内提供保护时段，以减少污染背景光谱信号的机会。

对于第二方面，可以操作激光源以在第一间隔期间仅发射第一波长，并且在第二间隔期间仅发射第二波长。可以使用以至少两个不同的波长操作的单个激光器，或者可以在激光源中包括分别以不同的波长操作的多个激光器。

在第二方面的一些实现方式中，可以在循环中包括第三间隔，在第三间隔中，在检测器像素处接收仅来自样品的背景光，以累积第三背景光谱信号。这些第三光谱信号在第一间隔和第二间隔期间被存储在存储像素中。在曝光时段结束时，读出所有三个光谱信号。然后使用所有三个第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号以及第三背景光谱信号计算补偿的光谱信号，以从补偿的拉曼光谱信号进一步改善地去除背景光信号(对前两个间隔，可能包括荧光信号)。

每个曝光时段可包括例如第一间隔、第二间隔、以及如果还使用的第三间隔、和另外间隔中的每种间隔的至少10个或至少100个或至少1000个。如果第一间隔和第二间隔(以及可选地一个或多个其他间隔)的组合是循环，则该循环可以例如以300Hz至3kHz之间的频率重复。第一间隔和第二间隔的长度和分布在曝光时段的每个循环中可以相同，但这不是必需的，而是可以使用规则或不规则的变化的长度和组合，只要不同的间隔在曝光时段内足够交错，以在不同间隔之间提供所需的交错水平而针对具有给定或预期变化水平的背景光充分补偿拉曼光谱信号。

曝光时段的持续时间可以根据获取具有足够信噪比的拉曼光谱信号(足以用足够的精度水平确定样品的目标特性)所需的期望时间来选择或预先选择，或者可以在装置中预设，或者可以根据需要由装置确定，例如以满足目标性能水平。通常，每个曝光时段可以具有至少0.1秒或至少一秒的持续时间。

收集光学器件可以包括光谱仪，该光谱仪被布置为使从样品散射的光在检测像素上以光谱方式分散，从而形成在空间上分散的光谱。

所描述的方法中的一些或全部可以由手持式设备执行。例如，可以提供手持式设备，以仅执行探测光的生成、传递和收集以及光谱信号的采集，光谱信号然后传递到另一个设备或计算机系统以进行进一步的分析和显示，或者手持式设备还可提供光谱分析并显示根据光谱确定的样品特性。

重复的循环可以进一步包括另一间隔，在该另一间隔期间，在检测像素处接收具有不同性质的收集光(例如包括已经被参考样品散射的激光探测光)，以累积另外或其他光谱信号，例如参考光谱信号。这可以使拉曼光谱信号能够被更准确地分析，例如结合参考光谱信号使用光谱差分技术。

可以通过使CCD的像素的电荷成分行移位来在检测像素和存储像素之间移动光谱信号。在本文档中引用行的地方旨在指代CCD上的像素的一维阵列，其可以沿垂直于扩展阵列维度的维度整体移位，并且无论这通常在特定CCD类型的上下文中称为“行”还是某个其他术语。垂直维度通常也可以是在读出操作中沿着其读取CCD像素的维度，但是并非必须如此。

可以由布置在检测像素的相对侧的至少第一组和第二组存储像素(例如，连续块)来提供存储像素，检测像素也可以提供为连续块，第一组用于存储累积的第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号，第二组用于存储累积的第二拉曼光谱信号。可以为第三或另外的光谱信号提供另外的存储像素组。

如果存储像素包括被布置在检测像素的相对侧的至少第一组和第二组存储像素，则所述方法可以包括：在第一曝光时段期间，第一组用于存储累积的第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号，第二组用于存储累积的第二拉曼光谱信号；在第二曝光时段期间，第一组用于存储累积的第二拉曼光谱信号，第二组用于存储累积的第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号。以这种方式，可以在随后的分析中(例如，通过组合第一曝光时段和第二曝光时段的结果)更容易地补偿两个存储像素块之间的不对称性，或者光谱信号进入和离开两个块的移动之间的不对称性。这种不对称性的一个原因可能是收集光在检测像素上的不对称投影。

为此，所述方法还可以包括在第一曝光时段和第二曝光时段中的每个结束时从CCD读取累积的第一光谱信号和第二光谱信号；将来自两个曝光时段的累积的第一光谱信号组合在一起；将来自两个曝光时段的累积的第二光谱信号组合在一起；以及使用来自两个曝光时段的组合的第一光谱信号和组合的第二光谱信号来计算补偿的拉曼光谱信号。

存储像素可以包括在检测像素行的行或块之间交错的像素行的行或块。尽管这种交错可以减小光谱信号在间隔之间需要在CCD上进行行移位的距离，并且可以减少所需的存储像素空间量，但是可能会导致需要提供遮罩，该遮罩被布置来阻挡从样品散射的光在存储像素处被接收。

激光源可以被布置为将激光探测光引导至样品的表面上的照射区域，并且收集光学器件可以被布置为引导从样品表面上的收集区域散射的光。这些照射区域和收集区域中的一者或两者可以是固定的或可移动的。在一些实施例中，收集区域可以与照射区域在空间上相偏移，并且在一些实施例中，可以例如控制此偏移以便进行空间偏移拉曼光谱法，从而确定样品的一个或多个表面下方特性，可选地根据到样品中的深度。样品表面上的照射区域和收集区域中的一者或两者可以是连续的，或者可以由多个分开的子区域组成。尽管射入区域和收集区域通常可以是圆形或椭圆形的，但是它们可以采取多种其他形状和构造。

特别地，所述的方法可以包括在多个曝光时段中的每个期间既累积第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号又累积第二拉曼光谱信号，但是使用在照射区域和收集区域之间的空间偏移，该空间偏移对于每个曝光时段是不同的。然后，可以通过将针对每个偏移的第一光谱信号和第二光谱信号与样品内的不同的深度或深度分布相关联，来为样品的一个或多个表面下方区域确定一个或多个补偿的拉曼光谱特征或与这些光谱特征相关的一个或多个化学特性。

本发明还提供了对应于并布置成实现所描述的方法的各个方面的装置。例如，结合以上第一方面，本发明提供了一种用于检测样品的拉曼光谱特征的装置，样品例如处于可变环境光的条件下，从样品还接收到背景光，所述装置包括：具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)，这些像素包括检测像素和存储像素；激光源，被布置为将激光探测光引导至样品；收集光学器件，被布置为将从样品散射的光引导至检测像素；以及控制器，被布置为实施曝光时段，在曝光时段期间，多个第一间隔和多个第二间隔交错，在多个第一间隔中，在检测像素处接收来自样品的背景光而没有激光探测光，以在这些像素处累积第一背景光谱信号，在多个第二间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和由样品散射的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号，使得在每个第一间隔期间，还在第一背景光谱信号累积在所述检测像素中的同时将累积的第二拉曼光谱信号存储在存储像素中，并且使得在每个第二间隔期间，还在第二拉曼光谱信号累积在检测像素中的同时将累积的第一背景光谱信号存储在存储像素中。特别地，来自样品的背景光可以是或可以包括由样品散射的环境光。

特别地，在该第一方面中，激光源可以在第二间隔期间发射激光探测光，而不在第一间隔期间发射激光探测光。

结合以上第二方面，本发明提供了一种用于检测样品的拉曼光谱特征的装置，样品例如处于可变环境光和/或可变荧光的条件下，从样品还接收到背景光，所述装置包括：具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)，这些像素包括检测像素和存储像素；激光源，被布置为将第一波长或第二波长的激光探测光引导至样品；收集光学器件，被布置为将从样品散射的光引导至检测像素；控制器，被布置为实施曝光时段，在曝光时段期间，多个第一间隔和多个第二间隔交错，在多个第一间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和由样品散射的第一波长的激光探测光，以在这些像素处累积第一拉曼光谱信号，在多个第二间隔期间，在检测像素处接收来自样品的背景光和由样品散射的第二波长的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号。

特别地，来自样品的背景光可以是或可以包括由样品散射的环境光，和/或可以是或可以包括样品的荧光。例如，样品的这种荧光可以至少部分地由入射在样品上的激光探测光引起，并且由于导致的样品的光致褪色而随时间经受强度减弱。

在该第二方面中，所述装置被布置为使得在第一间隔期间，还在第一拉曼光谱信号被累积在检测像素中的同时将累积的第二拉曼光谱信号存储在存储像素中，并且使得在第二间隔期间，还在第二拉曼光谱信号被累积在检测像素中的同时将累积的第一拉曼光谱信号存储在存储像素中。

在该第二方面中，激光源可以在第一间隔期间发射第一波长的激光探测光，并且在第二间隔期间发射第二波长的激光探测光。例如，这可以使用单个可切换波长的激光器或多个激光器(每个布置为发射不同波长)来实现。

在任一方面中，所述装置还可包括分析器，该分析器被布置为在曝光时段之后从CCD接收在曝光时段期间累积的第一光谱信号和第二光谱信号，并从累积的光谱信号中计算补偿的拉曼光谱信号，该补偿的拉曼光谱信号经补偿以去除由于背景光引起的部分或全部信号。这样的分析器可以被布置为输出根据补偿的拉曼光谱信号确定的样品的特性。

特别地，所述装置可以是手持式或便携式设备，例如适合由在诸如机场、工厂、野外等环境中工作的安全人员、军事人员、工业人员或其他人员使用。

收集光学器件可以包括光谱仪，该光谱仪被布置为将从样品散射的光以光谱方式分散在检测像素上。

在使用聚四氟乙烯(PTFE)作为样品材料的实验中，本发明的实施例表现出优异的能力来处理环境光背景中的不规则波动，特别是在具有狭窄和强烈光谱贡献的环境光源的情况下。基于库的光谱匹配证明：除了较高质量的重建光谱之外，本发明的实施例还受益于单独光谱重建的更高再现性。

测量时间优势(比下面讨论的实验中的“常规”读出快高达60％)和数据量优势(实验中高达小18倍的文件大小)是上述技术的进一步优势。在这些实验中，将PTFE用作测试样品，并在用附加的荧光灯或白炽灯照射的830nm激发下记录拉曼光谱。结果表明体现本发明(并在这些实验中以在1000Hz下进行切换的第一和第二间隔操作)的操作模式比“常规”模式(实际上限于≤10Hz的单模式曝光时段)具有明显的优势，因为从拉曼光谱中去除动态变化的环境光贡献。基于库的光谱匹配显示出卓越的重建性能，并使用“电荷移位”模式改善了单独光谱的再现性，特别是对于具有光谱上狭窄的线和空间上不均匀的发射轮廓的干涉光。

因此，所描述的装置和方法克服了常规CCD操作的基本技术限制，并且对于在通常实验室环境之外在动态变化的照射条件下应用的移动拉曼系统特别有利。

附图说明

现在将参考附图仅以举例的方式描述本发明的实施例，其中：

图1示意性地示出了用于在样品处于可变背景光(从样品接收到例如可变环境光和/或样品的荧光(在曝光时段内由于光致褪色而减弱))的条件下检测样品的拉曼光谱特征的装置；

图2a展示了在图1的装置的操作中背景光谱信号B和拉曼光谱信号R在各组CCD像素行之间的行移位；

图2b类似于图2a，但是其中使用两个不同的激光探测光波长而累积的第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2在各组CCD像素行之间进行行移位；

图3提供了图2a或2b所示的操作的时序图；

图4示出了一对CCD图像，它们以对称对的形式包含背景光谱信号和拉曼光谱信号；

图5示出了背景光谱信号B和拉曼光谱信号R(或类似的R1和R2，参见上面的图2a)如何可以在CCD像素中交错和移位；

图6展示了在CCD上交错的第三组光谱信号F的实现方式；

图7a和7b示出了可以如何实现本发明的方面以提供空间偏移拉曼光谱法；

图8更详细地示出了可以如何实现图1的布置；

图9a和9b针对CCD在50、100和500毫秒曝光时段下的各种“常规”操作模式以及使用本发明的“电荷移位”技术(CS)显示了PTFE样品的拉曼信号与环境光强度比相对于HQI光谱匹配质量指标(横坐标)。图9a显示了环境光变化最小的“静态”条件的结果，而图9b显示了环境光的“动态”条件(更确切地说，更加可变条件)的结果。在这些实验中，环境光是由紧凑型荧光灯管提供的；

图10a和10b提供了与图9a和9b对应的结果，但是具有由白炽灯泡提供的环境光。

具体实施方式

现在参考图1，示意性地示出了用于在来自样品的可变背景光的条件下检测样品12的拉曼光谱特征的装置10。主要关于补偿可变环境光14的挑战描述了实施例，但是实施例也适用于从样品接收的背景光包括不同或另外的可变成分(例如样品的荧光)的情况。例如，由于在曝光时段内样品的光致褪色，这种荧光可能减弱。

因此，在提及从样品散射或从样品接收的环境光的情况下，这通常可以被认为是除了激光的弹性和非弹性散射成分外而从样品接收的背景光，其中拉曼散射成分对确定拉曼光谱特征以及因此确定样品的特性特别感兴趣。

到达样品的环境光可能来自各种自然光源，例如太阳，和/或各种人工光源，例如白炽灯、荧光灯和LED照明，并且可能由于例如装置周围的人和物体的移动、装置和/或样品的移动、云在天空中的移动、灯的开和关或强度和光谱输出的变化等而变化。即使没有环境光到达样品，样品也会发出可变水平的荧光。

从样品12获取足以确定样品的一种或多种化学特性的拉曼散射光而避免过多的激光照射强度(过多的激光照射强度可能损坏样品)通常可能需要至少0.1秒的曝光时段，更通常需要几秒到几十秒的曝光时段，并且在任何情况下更长的曝光时间通常将导致确定此类特征的准确性更高。在不容易或不方便从样品中排除所有环境光14的情况下，在这样的曝光时间内，环境光在强度和/或光谱含量上的显著变化可能使从样品散射的光中的拉曼光谱特征的准确测量更加困难。即使从样品中排除了环境光，在这样的曝光时间内样品的荧光的显著变化也可能使从样品散射的光中的拉曼光谱特征的准确测量更加困难。

如果装置10整体上是手持式或便携式或自包含设备，或者装置10的探测部分16是手持式的(例如通过光纤连接功能性地连接到装置的其余部分)，则这种困难尤其会出现。这种装置例如在机场、仓库、在安全或军事情况下(例如当安全、海关或执法人员或军事人员等怀疑爆炸物、毒素或其他危险材料时)特别有用。

装置10包括激光源20，其生成激光探测光22并将激光探测光22引导至样品12的表面上的一个或多个照射点或区域24。收集光学器件30然后接收从样品12的表面的一个或多个收集区域34散射的收集光32。此收集光32包括激光探测光22的两个元素，包括该光的弹性散射部分和拉曼散射部分，以及环境光14的元素，特别是已经从样品散射的这种元素。

激光源20通常可以包括一个或多个激光器26，以及可以用于以各种方式调节激光器的输出并将调节后的输出导向至样品12的源光学器件28。一个或多个激光器26通常可以由近红外激光器提供，该近红外激光器在电磁光谱的近红外区域中(例如，在约800nm的波长处)发射激光探测光束。

在一些实施例中，仅需要单个激光波长，并且可以方便地由单个激光器26提供。在一些其他实施例中，需要一个以上波长的激光，并且例如可以由具有可控波长输出的单个激光器26或由布置为以不同波长输出的多个激光器26、26'提供。

源光学器件28可包括一个或多个合适的带通滤波器和其他用于调节光束的组件，以及布置为引导激光探测光22入射在样品表面上的照射区域24处的一个或多个光纤和/或透镜。如果装置10包括手持式或类似的探测部分16，则可以使用这样的光纤将激光探测光22携带到探测部分16，以随后传递到样品的照射区域24上。

在第一方面，激光源20由控制器60控制，使得激光探测光22在操作的第二时间间隔期间而不在操作的第一时间间隔期间入射在样品上并散射以形成收集光32的一部分，这些间隔在下面更详细地描述。这通常可以通过控制激光器26在第二间隔期间而不在第一间隔期间生成激光探测光22来实现，例如通过将激光器的输入电流分别改变为高于和低于激光阈值电流。在图1中，这被示出为由激光调制信号62控制。然而，也可以替代地或还使用其他技术，例如包括使用机械或光学布置来遮挡激光器26的输出，将激光探测光22重定向到其他地方，例如重定向到样品上几乎或根本不发生收集光学器件30的收集的不同位置，等等。

在第二方面，激光源20由控制器60控制，使得激光探测光22在操作的第一时间间隔和第二时间间隔期间都入射到样品上并且散射以形成收集光32的一部分，但是在第一间隔和第二间隔中的每一个中不同波长的激光探测光被引导至样品。

收集光学器件30被布置为从样品表面上的一个或多个收集区域34收集光32，并且将收集光引导至电荷耦合器件(CCD)40形式的像素化成像光检测器的检测像素42。在第二间隔期间，被引导至检测像素的收集光包括散射的激光探测光22，而在第一间隔期间，被引导至检测像素的收集光不包括散射的激光探测光22。

收集光学器件30通常可以包括接收光学器件36，该接收光学器件36被布置为接收来自样品的收集区域34(诸如合适的光纤和/或透镜)的光，并且诸如通过使用一个或多个边缘滤波器来执行任何所需的光谱滤波，以排除不在拉曼散射波长范围内被检测和测量的光。如果装置10包括手持式或类似的探测部分16，则接收光学器件36的光纤可用于承载来自探测部分16的收集光32，以随后传递到CCD 40的检测像素上。

可以通过光谱仪38将收集光32传递到CCD 40的检测像素42，该光谱仪38被布置为将收集光30分散在检测像素上以形成包括拉曼光谱特征(例如拉曼峰和/或线)的光谱，或以其他方式在这些像素之间分布收集光的光谱特征。光谱仪38可以包括例如一个或多个光谱色散光栅或折射元件，例如全息透射光栅，或者更复杂的光谱仪部件，例如来自KaiserOptical Systems的Holospec设备。在一些实施例中，可以使用光谱滤波技术以及色散光谱仪38或代替色散光谱仪38，以使光谱特征能够分布在检测像素上。

在一些布置和操作模式中，可能希望(一个或多个)照射区域24和(一个或多个)收集区域34精确地重合，或尽可能接近重合和完全重叠，以使最大量的激光探测光22被散射到收集光32中。然而，装置10整体(如果设置为手持式或便携式设备)或者装置的手持式探针16通常可以被布置为通过保持得接近样品但与之隔开而使用，这将使这种精确或紧密的对准具有挑战性。为此，可以提供一个或多个对准机构17作为装置、设备或探针的一部分，以帮助控制样品表面上的照射区域和收集区域的对准，例如通过机械定位元件，例如从设备或探针延伸并接触或挤压到样品的锥形或框架，或提供适当引导的光学布置，例如可见光点。

照射区域24和收集区域34的形式可以近似为圆形或椭圆形，但是可以使用其他形状，例如环形、由多个分开的子区域形成的区域等等。在一些布置中，如下面更详细地讨论的，照射区域和收集区域可以通过空间偏移故意地间隔开，以便使用SORS技术确定样品的一个或多个表面下方区域的特性。通过针对多个这样的偏移中的每个偏移而重复频谱测量，来自每个这样的偏移的拉曼光谱信号可以与样品内的不同深度或深度分布相关联，例如，如WO2006/061566中所讨论的。

上面已经提到，在一些方面，控制器60用于控制激光源20，使得在每个第一间隔期间，在收集光32中基本上仅发现环境光贡献，而在每个第二间隔期间，收集光32还包含来自散射在样品12处的激光探测光22的贡献。第一间隔和第二间隔的定时也例如通过如图1所示的相应的外部触发信号64被传送到CCD 40。

上面已经提到，在某些方面，控制器60用于控制激光源20，使得在每个第一间隔期间，在收集的光32中基本上只发现环境光的贡献，而在每个第二间隔期间，收集光32还包含来自在样品12处散射的激光探测光22的贡献。第一间隔和第二间隔的定时也例如通过如图1所示的相应的外部触发信号64被传送到CCD 40。

至少独立的第一组累积信号和第二组累积信号被保持在CCD的像素中。在每个第一间隔的开始，将第一组累积信号(称为背景光谱信号50)加载到检测像素42中，使得在第一间隔期间，由于包含环境光贡献但没有激光探测光贡献的收集光32的入射，这些像素中的电荷累积，并且因此由像素电荷表示的这些背景光谱信号50在每个第一间隔期间累积。在每个第二间隔的开始，第二组累积信号(称为拉曼光谱信号52)加载到检测像素42中，使得在每个第二间隔期间，由于包含环境和激光探测光贡献的收集光的入射，这些像素中的电荷增加，并且因此由累积电荷表示的这些拉曼光谱信号52也累积。

当未加载到检测像素中时，一组光谱信号50、52被存储在CCD的其他像素中，通常将其称为存储像素44。这些存储像素在CCD像素的阵列中的位置的详细的各种选项在下面讨论。在第一间隔和第二间隔中的每者之间，可以使用CCD像素的行移位来实现在检测像素和存储像素之间的背景光谱信号和拉曼光谱信号的传输，从而使整个像素行在CCD像素阵列中上下移动，如下面更详细讨论的。响应于控制器60指示第一间隔和第二间隔的定时，可以通过CCD的控制电路46的适当编程和/或控制来实现像素组的这种移动。

在其他方面中，在第一间隔期间，第一波长的激光以及环境光入射在样品上，并且在第二间隔期间，第二波长的激光以及环境光入射在样品上，在这种情况下这两组累积和存储的光谱信号可以被称为相应的第一拉曼信号和第二拉曼信号，而不是背景信号和拉曼信号。即使从样品中排除了环境光，也可以使用类似的技术，以补偿从样品接收的其他背景光，尤其是在测量或曝光时段的持续时间内可能例如由于光致褪色而变化的荧光。

存储像素44可以方便地设置在分别具有相同像素阵列大小的两个块中，这两个块分别在检测像素的行的上方和下方，检测像素也被提供为具有与每个存储块相同像素阵列大小的像素块，如图1所示，但是可以使用下面例如在图2a至6的讨论中进一步讨论的其他布置。

在一些布置中，可能需要遮罩45以确保收集光22不入射在存储像素上。这样的遮罩45可以由收集光学器件30内或在收集光学器件与CCD40之间的遮罩组件提供。可替代地或另外地，遮罩45可以例如通过向CCD的存储像素上方添加一个或多个不透明层(例如金属化)而直接实现在CCD上。在图1所示的存储像素的布置中，这可能不是必需的，因为存储像素被提供在与检测像素42的块分开的连续像素块中，但是在例如检测像素行和存储像素行单独地或以较小的块交错的其他布置中，这样的遮罩45可能是必需的。

在曝光时段结束时，CCD的读出电路48用于读出在曝光时段的第一间隔内累积的第一光谱信号50(背景或第一拉曼光谱信号)(在图1中仅表示为B，尽管术语R1可以用于第一拉曼光谱信号)和在曝光时段的第二间隔内累积的第二光谱信号52(拉曼或第二拉曼光谱信号)(在图1中表示为R，尽管术语R2可以用于第二拉曼光谱信号)。这可以是响应于来自控制器60或者在CCD内由CCD内部触发的读出触发信号66，而不是将读出触发信号66发送到控制器60以指示读出操作的开始。

然后将读出的光谱信号传递到分析器61，分析器61可以各种方式使用这些信号。然后可以重置CCD的各个像素，并且可以开始另一曝光时段，以与之前相同的方式累积新的背景光谱信号和拉曼光谱信号(或者第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号)。

该分析器可以由一个或多个计算机系统提供，该计算机系统可以是通用计算机系统或专门布置用于本文所述分析目的的计算机系统。此类计算机系统通常可包括至少一个微处理器、合适的数据输入和输出设施、以及存储用于在一个或多个计算机系统上执行以执行所描述的分析方面的计算机程序指令的存储器。为此，代表各种光谱信号的数据可以传递到分析器，并存储在存储器中，以便使用计算机程序指令进行处理。诸如补偿的光谱信号和/或从光谱信号得出的样品的化学特性之类的分析结果可以存储在存储器中和/或以各种方式输出，例如通过分析器的可视显示器的显示，通过例如在数据网络上传递给其他计算机系统，通过存储在可移除计算机可读介质中等。

特别地，分析器61可以使用背景光谱信号B和拉曼光谱信号R或者第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2(无论是来自单个曝光时段，还是来自多个曝光时段的组合)来执行各种数据分析过程。特别地，可以例如通过从拉曼信号中直接或按比例地减去背景信号或其他技术，从背景光谱信号和拉曼光谱信号中计算补偿的拉曼光谱信号R’，从该补偿的拉曼光谱信号R’中已在很大程度上去除了环境光的贡献。类似地，可以使用各种技术从第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2计算补偿的拉曼光谱信号R’。

在累积和输出第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2的情况下，这些光谱信号将包含由样品的化学性质引起但彼此之间在波长上移位了激光探测光的不同的第一波长和第二波长之间的波长差的相应光谱特征。对于这些目的，不同激光探测光波长之间的波长差(其为纳米的仅十分之几或者甚至仅百分之几)就足够了。

然后，分析器可以组合或比较第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2(并且如果可用，如下所讨论的还使用另外的背景光谱信号B)，以便确定补偿的拉曼光谱信号。由于来自样品的荧光的光谱和强度基本上不受第一波长的激光探测光和第二波长的激光探测光之间所需的小波长差影响，因此该技术还具有允许从补偿的拉曼光谱信号中很大程度上去除荧光的优点。该技术还能够从补偿的拉曼光谱信号中很大程度上去除任何环境光的光谱信号，因为在第一拉曼信号的和第二拉曼信号的每个中存在的任何环境光信号基本上是相同的，并且信号之间的唯一系统差异因此是由于第一间隔和第二间隔之间的不同激光探测光波长。

注意，不管是否从样品接收到环境光，以这种方式组合第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2还具有帮助补偿在曝光时段内从样品接收的荧光的变化的效果。因此，该技术可用于提供补偿了光致褪色和类似效果的拉曼光谱信号(包括在其中环境光被大部分或完全从样品中排除的装置和方法中进行这种提供)。

可以从补偿的拉曼光谱信号R’得出样品的一种或多种特性，特别是化学特性C，例如通过建立各种化学物种的拉曼签名中预期的特定光谱峰或线的幅度。这样的化学特性可以包括例如样品中化学物种的身份和/或浓度。

如上所述，通过在随后读出CCD之前在CCD的曝光时段上对拉曼光谱信号和背景光谱信号的检测进行多次交错，更容易优化每个相应间隔的长度，使得背景光谱信号可以更准确地反映环境光对拉曼光谱信号的贡献。类似地，如果分别在第一间隔和第二间隔中的每个间隔中累积第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号，则各个间隔可以更准确地反映环境光(和/或样品荧光)的同样的贡献。此外，在两种情况下，从CCD的读出操作的次数也大大减少，从而也降低了读出噪声的水平。

诸如光谱、光谱特征强度或幅度以及补偿的拉曼光谱信号R’的其他方面的数据、和/或描述样品的特定化学特性C(例如提供特定物种的浓度或指示特定物种的存在)的数据可以使用装置10的显示器65呈现，或存储在装置10中，例如存储在固定或可移除数据存储介质中，或输出到通过网络连接或更直接地连接到装置10的其他数据处理设备，例如其他计算机(图1中未显示)。

在曝光时段内，可能存在大量的第一间隔和第二间隔，例如，每种间隔至少10个，每个间隔至少100个，或者每个间隔至少1000个，并且例如第一间隔和第二间隔在重复的循环中交替。在字母B和R代表背景光谱信号和拉曼光谱信号在其间累积的间隔的情况下，这样的循环可以写为[B,R]。但是，并非一定要在单个曝光时段内每个间隔的编号完全相同(例如，即使严格交替，编号相差一也可能是常见的)，如果存在更多的第一间隔和第二间隔，则可以使用稍微不同的编号，如下所述。对于在第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2在其间累积的间隔的其他方面同样适用。

通常，第一间隔和第二间隔可以具有相同的持续时间，例如每个持续约1毫秒，尽管如果需要的话，第一间隔可以与第二间隔具有不同的长度。例如，可以使用具有大约1kHz的频率的到CCD的外部触发信号64。行移位时段(在行移位时段期间，背景(或第一拉曼)光谱信号50或拉曼(或第二拉曼光谱)光谱信号52在检测像素42和存储像素44之间沿任一方向移位)的持续时间将取决于各种因素，但与第一间隔或第二间隔的持续时间相比可能是显著的。例如，如果CCD能够以1MHz的速率在相邻像素行之间移位数据，并且检测像素形成80行的块，则任何两个间隔之间的行移位时段将花费约0.08毫秒。如果从外部触发输入的后续重复之间可用的1毫秒时段中减去此时间段，则对于第一间隔和第二间隔中的每个只有约0.9毫秒可用。

在图1的布置中，在第一间隔和第二间隔之间的行移位时段中没有实现CCD的关停，从而在这些时间期间收集光32将继续入射在检测像素上。为了避免在行移位时段期间激光探测光22入射到检测像素上并由此污染背景光谱信号的风险，优选在没有激光探测光22引导至样品的第二间隔的开始和结束时确保足够的时间缓冲，例如通过在这些缓冲时段内关闭或关停激光器24。合适的缓冲时段例如可以是在每个第二间隔的开始和结束时大约50毫秒。牢记这一点，很明显，在许多情况下，例如在这样的缓冲时段期间，至少在每个第二间隔的一部分内，没有激光探测光会入射到检测像素上。

如果使用机械的、光学的或电子的快门机构来防止收集光32除了在第二间隔期间以外到达检测器像素，则可以大大避免这种缓冲时段。如果需要的话，这种快门也可以用来防止收集光在行移位时段期间的时段到达检测器。

尽管如上所述，图1的装置可用于累积代表背景(例如环境光14)的背景光谱信号50以及代表激光探测光22和背景/环境光14的拉曼光谱信号52，如在收集光32中所接收的或者替代地如上所讨论的第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号，但也可以在重复循环中的一个或多个另外的间隔上累积一个或多个另外的光谱信号。在这种情况下，两个或更多个这样的光谱信号通常将保留在存储像素中，而光谱信号之一保留在检测像素中。

这样的布置的示例是当曝光时段包括重复的第三间隔时，并且在每个第三间隔期间，激光探测光22被参考样品而不是样品12散射到收集光32中。这可以通过将参考样品放入装置10中并适当地调整激光源20和/或收集光学器件30、或者通过例如使用可移动或旋转台将样品和参考样品重复地交换到探测光中和从探测光中换出来实现。然后，可以由CCD在曝光时段结束时输出所得的累积的参考光谱信号F，以供分析器61通过将拉曼光谱信号52和参考光谱信号进行比较来确定差异光谱信号，其中拉曼光谱信号和/或差异光谱信号使用背景光谱信号补偿背景或环境光的影响。以这种方式，代表来自样品和参考样品的光谱信号之间的差异的拉曼差异光谱信号可以被确定，并且如上所述，还可以提供对背景或环境光的补偿。

在其他布置中，在第一间隔和第二间隔中收集第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号的情况下，第三间隔可能涉及以类似于上面讨论的背景光谱信号的收集的方式，仅收集从样品散射的背景或环境光，而在该第三时段中没有激光探测光入射到样品上。

如果以这种方式使用三个或更多个不同的间隔来测量CCD处三个或更多个不同的光谱信号以在曝光时段结束时输出，则对于三个或更多个不同的间隔的重复循环，存在各种选择。如果间隔分别由字母B、R、F表示，这些字母对应于在这些间隔期间累积的背景光谱信号、拉曼光谱信号和参考光谱信号，则循环可以包括重复的[B,R,F,R]、[B,R,F,B,R,F]和其他各种排列，注意，循环中每个间隔的数目不一定要求相同，并且间隔的长度可以不同，而且可以在循环之间变化。

如果在这种情况下，第一、第二和第三间隔由对应于在这些间隔期间累积的背景光谱信号、第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号的字母B、R1、R2表示，则循环可以包括重复的[B,R1,R2]、[B,R1,B,R2]和其他各种排列，注意，循环中每个间隔的数目不一定要求相同，并且间隔的长度可以不同，而且可以在循环之间变化。

在以上示例中，第三激光探测光波长和可选地另外不同的激光探测光波长可以使用来获得第三拉曼光谱信号R3和可选地另外的(R4等)拉曼光谱信号，其中每个拉曼光谱信号被组合在一起，可选地与一个或更多背景光谱信号组合，以计算补偿的拉曼光谱信号。在这种情况下，循环可能包含重复的间隔，例如[R1,R2,R3]、[B,R1,R2,R3]、[B,R1,B,R2,B,R3]、[R1,R2,R3,R4]或其他各种排列，每个光谱信号在相应间隔内累积在检测像素中，并在其他时间存储在存储像素中。

可以操作单个激光器26以提供所需的两个或更多个不同波长的激光探测光，或者为此目的可以在探测光源20中包括多个激光器26。

各种数学和分析技术可以用于将第一、第二和可选地另外的拉曼光谱信号可选地与背景光谱信号组合以确定补偿的拉曼光谱信号，例如，如US 8,570,507中所讨论的，其内容通过引用为此特定和所有其他目的并入本文。例如，一个选择是对第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号进行成比例减法，并且在许多情况下，此过程将是可以接受的，因为所得的类导数的补偿的拉曼光谱信号具有足够的质量并且可以经受进一步数据分析。在一些情况下，可能有必要从类导数的补偿的拉曼光谱信号计算重建光谱，以提高光谱质量，例如在信噪比方面。这可以通过差异拉曼光谱信号的简单积分过程来实现，例如，如在Matousek等人,Appl.Spectrosc.2005,59,848-851中所讨论的，其内容为了特定和所有其他目的通过引用并入本文。

根据具体应用，可能同样需要更高级的用于重建补偿的拉曼光谱信号的算法。作为示例，WO2011/033017(其内容通过引用为此特定和所有其他目的并入本文)描述了这样的过程，其中在强度值方面，第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号相对于彼此标准化。随后计算第一差异光谱信号，计算第二差异光谱信号，第一差异光谱信号转换为第一变换光谱信号，第二差异光谱信号转换为第二变换光谱信号，最后通过将第一变换光谱信号和第二变换光谱信号相加来计算补偿的拉曼光谱信号。

具有足够灵敏度的合适的CCD器件40通常可以冷却到低温，例如使用珀耳帖元件或液氮，以降低噪声，并且通常可以具有行和列方向上尺寸为几百到几千个像素的像素阵列。于是，检测器像素46通常可以包括几十行像素，例如80行，并且通常是全行长度(例如1000个像素)，尽管可以使用较短的像素行。然后，收集光学器件用于沿着上面讨论的检测像素行的方向上对收集光32进行以光谱方式分散。为了当光谱信号不在检测器像素中时存储光谱信号，对于每个这样的光谱信号通常需要存储像素的至少一个相应子集，每个子集通常在尺寸和几何形状上对应于检测像素。因此，如果通过80个像素的全长度行提供检测像素，则存储像素应该提供具有80个像素的全长度行的两个相应区域。

在每个光谱信号被存储在多行CCD像素中的情况下，这些行可以在传送到分析器61之前在CCD本身上平均或求和。这通常会在像素电荷的数字化之前进行。如果需要，还可以对沿行的相邻像素执行相似组合，以通过平均有效地降低光谱分辨率但是改善噪声特性。替代地，可以在分析器处执行对像素的这样的求和、平均和其他组合，尤其是多行的组合。

在图1中，检测像素和存储像素的几何形状被描绘为由第一块和第二块提供，存储像素44的多个连续行中的每一个位于检测像素的连续行的块的上方和下方。图2a示出了随着在曝光时段期间重复第一间隔和第二间隔的循环，背景光谱信号和拉曼光谱信号如何在这三个大小相等的像素块之间移动。

相同的原理和细节适用于以下情况：在激光探测光具有相应的两个不同波长(拉曼光谱信号R1、R2，代替背景光谱信号B和拉曼光谱信号R)的间隔期间，如上所述累积第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号。这在图2b的相应面板(i)至(iv)中示出，其中入射在图2a中的检测像素42上的“环境”和“环境+探测”光被“环境+探测λ1”和“环境+探测λ2”取代。

在图2a的面板(i)中，描绘了检测像素42的中心块(以实线示出)，其中存储像素的第一块44’和第二块44”(以粗虚线示出)位于CCD像素网格上的中心块的上方和下方。每个块可以例如是高度上大约80个相邻像素行和长度上大约1000个相邻像素行。可以在每个块之间提供不用作检测像素或存储像素的一个或多个行的保护区域47，例如以更好地防止收集光32入射到存储像素上。

在面板(i)中，将累积的背景光谱信号B保持在检测像素42中，使得背景光谱信号在来自收集光32中从样品散射的以光谱方式分散的环境光的照射下累积，但是没有来自散射激光探测光的任何贡献。拉曼光谱信号R被保持存储像素44”的未从收集光32照射的下部块中。因此，图2a对应于如上所述的第一间隔。

图2a的面板(ii)描绘了随后的行移位时段，在此期间拉曼光谱信号被向上行移位到检测像素42中，并且背景光谱信号被向上移位到存储像素44’的上部块中。在该行移位时段的结束时，第二间隔开始，如面板(iii)中所示，使得拉曼光谱信号在以光谱方式分散的收集光32的照射下在检测像素42中累积，对于第二间隔的至少一部分，收集光32包括从样品散射的激光探测光22以及背景或环境光。

在面板(iv)中，可以看到在第二间隔结束之后，拉曼光谱信号被向下移位回到存储像素44”的下部块，并且背景光谱信号被向下移位至检测像素42，这样就可以开始第一间隔和第二间隔中的下一个循环。

尽管在图2a的面板(i)到(iv)中，光谱信号被描述为比在不同时间存储它们的像素块稍小的块，但这只是为了清楚起见以使得各种组分可以更清晰地在图中看到。

图3是示出图2a或图2b的事件如何随着时间从图的左到右发展的时序图。尽管下面的讨论将集中在图2a的时序上，但可以很容易地看出它是如何转换为图2b处理的时序的。在图的顶部，将表示或控制间隔的循环的时序的信号表示为EXT-T，例如可以是上面结合图1讨论的外部触发信号64。在图的左侧，该触发信号中的峰值会导致或指示第一行移位时段80-1的开始，例如图2a的面板(iv)所示，其中背景光谱信号被行移位到检测器像素中，随后是第一间隔I1的实例开始。该第一间隔的结束由EXT-T信号中的第二峰值触发或指示，该峰值导致或指示第二行移位时段80-2的开始，在该时段中，拉曼光谱信号被行移位到检测器像素，并且第二间隔I2的实例开始。在曝光时段内，该循环重复多次，然后从CCD读取分别在第一间隔和第二间隔期间累积的背景光谱信号和拉曼光谱信号中的每一个。

因为在没有某种其他快门机制的情况下在行移位时段期间检测像素42仍被背景或环境光照射，并且因为可能难以将分散的收集光32完全均匀地投射到检测像素上(例如，没有某种“微笑”图案或其他失真)，所以累积的光谱信号可能会受到伪影的某种微小影响，这些伪影是由哪些光谱信号存储在检测像素块上方以及哪些光谱信号存储在检测像素块下方引起的。因此，为了减少这种不对称性对装置输出的影响，包括如图2a或2b所示的循环并且其中诸如背景光谱信号之类的一组信号存储在检测像素上方的每个曝光时段可以通过包括相似的循环但诸如背景光谱信号之类的相同的一组信号存储在检测像素下方的曝光时段来平衡。

因此，图4示出了在两个不同曝光时段结束时从CCD读取的数据。上面的面板显示了由像素组成的读出的“图像”90-1，其中上面的块B包含累积的背景光谱信号，下面的块R包含累积的拉曼光谱信号，而下面的面板显示了由像素形成的读出的“图像”90-2，其中上面的块R包含累积的拉曼光谱信号，下面的块B包含累积的背景光谱信号。

交错(interleave)对应于图4中90-1和90-2的交替曝光时段可能是有利的，以便可以将相邻的此类数据集进行配对和组合以更好地减少上述伪像，但在任何情况下，更一般而言，使用交替位置存储背景信号和拉曼信号的相等或相似数量的曝光时段应被组合或用于数据的进一步分析，例如，使用背景光谱信号对拉曼光谱信号进行补偿。

图4所示和上面讨论的技术同样适用于使用两个不同波长的激光探测光累积第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2的情况，如上所述，而不是如图所示的背景光谱信号B和拉曼光谱信号R的情况。

图5a和5b示出了用于布置检测像素和存储像素的替代方案。在这种布置中，有检测像素42的多个块，这些块与存储像素的相应块交错，每个块的行比图2和4的示例少。每个块的高度可以小到一个像素行，或者可以大到数十个像素或更高的高度。通常，就像素而言，存储像素的每个块具有与每个检测块相同的大小。然后，图5a表示第一间隔，在该第一间隔期间，检测像素42的每个块包含用于在以光谱方式分散的收集光32的照射下累积的背景光谱信号B，并且每个存储块44包含未照射的拉曼光谱信号R。

图5b表示在第一间隔结束时的行移位时段，在此期间，每个检测像素块中的背景光谱信号B被向下行移位到下方的存储块44，并且每个存储像素块中的拉曼光谱信号R向下行移位到下方的检测块42。然后发生第二间隔以累积拉曼光谱信号，随后在与图5b相反的方向上或者可选地在相同方向上进一步移位，以返回到随后的第一间隔的开始，如图5a所示。连续间隔之间的移位顺序可以遵循二进制-向上-向下-向上-向下-方案，或者替代地涉及在相同方向上进行连续移位的不同方案，例如，-向上-向上-向下-向下-，尽管这很有可能使用更多像素块用于存储和检测。

图5a和5b中所示的布置还适用于其中使用两个不同波长的激光探测光在检测像素中累积第一拉曼信号R1和第二拉曼信号R2而不是如图所示的背景光谱信号和拉曼光谱信号的情况。

在检测像素的块和存储像素的块交错的布置中，可能需要更复杂或更精细的遮罩45(参见图1)，以确保存储像素免受收集光的照射。保护区域47中的像素的数量也可以适于类似的目的。如上所述，可以通过直接在CCD器件上或在CCD器件中或在装置中的其他地方实现的遮罩层来实现这样的遮罩45。

如果检测像素或存储像素的每个交错块的高度仅是一行像素，则这最小化了距离，并因此最小化完成后续间隔之间的行移位时段所需的时间。然而，仅实现一行或几行的块可能使实现对存储像素的适当掩蔽更加困难，使得高度为几个像素(例如为十个像素)的块可能更方便。另一方面，如果仅使用检测像素的单个块，如图1、2a和2b所示，则具有以下优点：与散布在交错的检测器像素块和存储像素块上相比，收集光可以特别集中到该块并且更有效地使用。

上面已经提到，装置可以使用一个或多个另外的间隔来累积多于两组的光谱信号(背景光谱信号和拉曼光谱信号，或者来自不同波长的激光探测光的第一拉曼信号和第二拉曼信号)。上面讨论的一个示例是，在循环的每个第三间隔中，激光探测光22由参考样品而不是样品12散射到收集光32中。然后，可以由CCD在曝光时段结束时输出得到的累积参考光谱信号F。图6示出了可以实现这种第三间隔或另外的间隔以及相应的光谱信号的一种方式。代替如图5所示的检测器像素和存储像素的交错的单个块，图6显示了在检测器像素的每对块对之间交错的存储像素的两个块。

通过这些块的适当的行移位序列，当在检测像素42中存在三组光谱信号B、F、R时，三组光谱信号B、F、R中的每一个在每个循环的相应间隔期间可以被累积，而在其他间隔期间被保留在存储块44’、44”中。例如，此处合适的移位顺序可以是“–向下–向下–向上+向上–向下–向下–向上+向上–”，其中“向上+向上”表示光谱信号在该行移位时段中被移位了通常距离的两倍，即，两个块的距离。

通过在检测器像素块的上方和/或下方添加一个或多个其他存储像素块，也可以使用沿着图1和2a-2d所示的线的单个检测器像素块来实现两组以上的光谱信号。

图6的布置还适用于要累积三个(或更多)不同信号的其他组合的情况，例如，背景光谱信号B以及使用两个不同波长的激光探测光累积的第一拉曼光谱信号R1和第二拉曼光谱信号R2。另一个示例是没有背景光谱信号，但是使用三个不同波长的激光探测光累积了第一、第二和第三拉曼光谱信号R1、R2、R3。

上面已经提到，如图1所示的照射区域24和收集区域34可以有意地间隔开一空间偏移，以便使用SORS技术确定样品的一个或多个表面下方区域的特性。通过使用多个曝光时段(各自具有不同的这样的偏移)，来自每个这样的偏移的拉曼光谱信号可以与样品内的不同深度或深度分布相关联，例如，如WO2006/061566中所讨论的。当样品12被漫散射并且激光探测光22可以穿透样品的表面以在例如至少数毫米的显著距离上漫散射时，这种技术特别相关。

与弹性散射的散射比例相比，激光探测光22在非弹性拉曼散射的漫散射样品12内的散射比例通常很小，通常大小相差很多数量级。结果，探测光的大多数光子在漫散射样品中没有被拉曼散射。但是，在样品中拉曼散射的探测光的每个光子也随后会弹性散射大量次数，从而导致光子随机穿过样品。在照射区域24和收集区域34之间的随机穿过样品的表面下方体积的平均路径取决于这些区域之间的空间偏移。可以看出，对于较大的空间偏移，路径的平均深度在样品内将更深。

使用该原理，照射区域和收集区域之间的间距可以由装置10控制或调节，以便控制发生拉曼散射的深度的分布。该技术被称为空间偏移拉曼光谱法(SORS)，并且在WO2006/061565和WO2006/061566中进行了详细讨论，其内容出于所有目的通过引用并入本文，包括用于说明如何可以在样品中的特定深度和深度分布处确定样品的特性。

在以上专利公开中讨论了一些方式，其中可以组合来自不同空间偏移的拉曼光谱特征或相关信息以得出针对一个或多个深度或一个或多个深度分布选择的样品的特性，但是可以包括简单的减法方案(例如其中从一个或多个较大偏移的光谱特征中减去小或零偏移的光谱特征)，或更复杂的多元分析(例如主成分分析)(其中在多个偏移处检测到的光谱特征之间的统计关系用于得出深度、深度分布、或多个这样的深度或深度分布的样品特性)。

因此，根据空间偏移拉曼光谱法的原理，照射区域和收集区域可以具有各种尺寸和形状，并且对于任何特定的空间偏移，这些区域可以分别由样品表面上的单个连续或多个离散段形成。在图7a和7b中描绘了这种区域的一些示例。

在图7a中，照射区域24设置在固定位置，并且多个收集区域34a-34e设置成与单个照射区域的空间偏移逐渐增加。可选地，所示的收集区域34a之一与照射区域24重合或重叠，以形成零偏移或零间距。该零偏移可以方便地提供代表样品表面的信号，以补偿从较大信号中导出的信号。例如，这可以通过从针对一个或多个较大间距检测到的拉曼特征中减去针对零间距检测到的拉曼特征来完成。

以图7a的布置为例，将会看到，区域和收集区域之间可以使用任何数量的空间偏移，例如从一个偏移到十个或更多偏移，通常在每个偏移的单独曝光时间间隔期间检测到拉曼特征。尽管在图7a中照射区域相对于样品保持固定并且收集区域被移动，但是照射区域可以替代地或与收集区域一起被移动。图7a中的区域的形状基本上是圆形或椭圆形的，通常通过方便实现递送和收集光学器件来确定，可以使用各种其他形状。在图7a中，收集区域34b-34e没有一个与照射区域重叠，但是可以允许一些重叠。

在图7b中，使用了同心布置，其中中心收集区域34位于周围的照射区域24a内，该照射区域可以是连续的或断续的环的形式。其优点在于，照射区域相对较大，因此可以使用较低的照射强度来提供以避免损坏样品。然后可以通过改变照射区域的半径来提供多个空间偏移，如同心照射区域24a和24b所描绘的。

为了提供探测光的足够散射以能够检测源于样品深度的拉曼光谱特征，样品可以是漫散射的或混乱的或强漫射的。这种散射的程度将取决于样品，并且可以根据传输长度来定义，传输长度是探测光的光子的传播方向被随机化的长度。本领域技术人员知道，漫散射的传输长度l*可视为通过以下表达式与平均自由程相关：

l*＝l/(1-g)

其中，g是不对称系数(大量散射事件中散射角的平均值)，l是平均自由程。适用于本发明的一些样品的漫散射传输长度可以为约100μm至几mm。

为此，以上关于图1至图6描述的装置和方法因此可以在照射区域和收集区域之间具有一个或多个空间偏移的情况下使用。这样的偏移通常可以在大约1mm至大约50mm的范围内，并且更通常地可以在大约3mm至大约20mm的范围内，并且用于确定在样品内的深度在大约1mm至大约30mm的范围内并且更通常地在大约2mm至大约15mm的范围内时样品的特性。本发明的实施例可以布置为仅在一个深度或深度分布处确定这样的特性，例如使用照射区域和收集区域之间的单个空间偏移，或者可以布置为在多个深度或深度分布中的每个处确定这样的特性。实施例也可以使用零或无偏移，以便确定样品表面的特性。

图1、7a和7b描绘了照射区域和收集区域，它们在大体上平坦的或仅适度弯曲的表面上相邻、邻近或间隔开。可以将这种布置描述为背散射配置，因为在激光探测光的光子穿透样品并且在表面下方区域中进行了拉曼散射之后，激光探测光的光子被反向散射至样品的表面，以通过收集光学器件进行收集。但是，照射区域和收集区域也可以位于表面彼此远离共面的部分上，具有基本不同的表面法线，例如，法线在相隔90度的范围内，甚至在相隔180度的范围内，或者任何其他角度或角度范围。

例如，照射区域和收集区域可以布置在样品的相对侧上，或者使得其特征由本发明确定的表面下方体积直接位于照射区域和收集区域之间，并且这样的布置可以描述为透射配置。在样品小的情况下，例如，对于强散射样品，直径或厚度仅为大约5mm至大约50mm的数量级，其中样品的材料直接位于照射区域和收集区域之间的透射布置可能会特别感兴趣，尽管照射区域和收集区域之间的较大的直径或间距可用于更透明的样品。

在包括WO2007/113566的现有技术中，可以找到可用于本发明的实施例中以确定样品的表面下方区域的pH的此类布置的透射几何形状和其他细节的进一步讨论，该专利的全部内容通过引用并入本文，以说明如何布置用于本发明以及用于所有其他目的的合适的透射几何形状。

图8描绘了上述装置和方法如何可以更详细地实现的一些方式，尽管为清楚起见在该图中未示出从CCD输出的光谱信号或随后的分析的细节。该图示出了如何可以在曝光时段的第一间隔和第二间隔期间累积背景光谱信号和拉曼光谱信号，但是可以容易地进行调整，以使得代替地在第一间隔和第二间隔期间分别累积第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号(其中不同第一波长和第二波长的激光探测光分别在第一间隔和第二间隔中入射在样品上)。

在激光源20中，激光器26由发射830nm的准直光束的微系统二极管激光器模块(Ferdinand-Braun-Institut,Leibniz-Institut für

Berlin,Germany)提供。在源光学器件中，线偏振激光穿过两个带通滤波器122(Semrock,Inc.)，然后通过四分之一波片124转换为圆偏振光。尽管在以下描述的实验中使用了圆偏振光，但这对检测模式没有特别的影响，并且使用线偏振光或任何其他稳定的偏振态将获得同样好的结果。激光模块的温度由控制器60的温度控制器162(5240TECSource,ArroyoInstruments)调节到25℃，并且注入电流由也形成控制器60的一部分的激光驱动器(LD)164(4220-DR LaserSource,Arroyo Instruments)控制。

在源光学系统中，然后焦距为50mm的透镜126将激光辐射聚焦到样品12上。在下面描述的实验中，样品由220μm厚的PTFE层提供。

从样品12背散射的激光辐射通过具有100mm焦距的消色差透镜132收集在收集光学器件30中。随后，两个拉曼边缘滤波器134(Semrock,Inc.)仅透射拉曼斯托克斯移位分量，同时拒绝弹性散射和反斯托克斯贡献。焦距为60mm的消色差透镜136将光聚焦到圆形到线性的光纤束137(BFL200LS02,Thorlabs,Inc.)中，然后光纤束137将检测到的光传输到光谱仪138(Holospec 1.8i,Kaiser Optical Systems,Inc.)中，其中附带的电荷移位CCD 40(DU420A-BR-DD-9UW,Andor Technology)热电冷却至-70℃，并由运行Andor“Solis”软件(版本4.28.30052.0,Andor Technology)的PC控制。CCD是标准的光谱CCD，没有硬件修改。通过定制“Solis”软件，促进了如上所述的CCD中的行移位模式操作。

使用黑色铝箔盖(BKF12,Thorlabs,Inc.)将激光源光学器件20和收集光学器件30遮蔽，使其免受环境光的影响。

为了使激光探测光22的发射与曝光时段的间隔循环和随后的数据读出同步，第一数字延迟发生器166(DG 645,Stanford Research Systems)的输出端口之一连接到CCD的外部触发输入64，而另一个连接到激光驱动器164的调制输入。CCD的快门输出66连接到第二数字延迟发生器168(型号555,Berkeley Nucleonics Corporation(BNC))的输入。第二延迟发生器的输出连接到第一数字延迟发生器166的“禁止”输入，以仅在第二间隔期间允许激光发射，而不在第一间隔或最终数据读出阶段期间允许激光发射。

在曝光时段期间，在此示例中频率为1kHz的外部触发信号触发背景光谱信号(第一循环为空或为零)从用作存储像素44的CCD像素的第一块到用作检测像素42的CCD像素的第二块的行移动，以及拉曼光谱信号(在曝光时段的第一循环开始时为空或为零)从检测像素42到第二块的存储像素44(见图2d)的行移动。在随后的第一间隔期间检测像素42的块被环境光贡献照射(见图2a)。因此，所产生的电荷累积对应于背景光谱信号的累积。每个存储块可以例如与检测像素42的块偏移大约80行，每个存储块在相反的方向上与检测像素的块偏移，例如，如上面的图2a-2d所示。

当接收到随后的触发信号时，在相反方向上拉曼光谱信号从第二块的存储像素到检测像素的行移位以及背景光谱信号到第一块的存储像素行移位被触发，第二间隔开始(也参见图2b)，然后对于第二间隔的至少一些，通过由两种环境光条件以及从样品散射的激光探测光22的照射在检测像素42中通过电荷的累积而累积拉曼光谱信号(参见图2c)。

电荷移位和第一间隔和第二间隔的这个循环被重复很多次，例如在下面讨论的示例中为大约2500次，这对应于大约5秒的总曝光时间(包括间隔之间的电荷移位时段)。

在曝光时段结束时，代表背景光谱信号和拉曼光谱信号而在CCD芯片(例如在成像模式下操作，施加16个像素的垂直合并)上的累积电荷被读出并数字化。由于检测像素的块的照射条件可以有或没有激光探测光22，因此存在两种不同的存储像素的几何形状，其中背景光谱信号或拉曼光谱信号存储在距CCD像素阵列的读出侧更远的存储块中。再次参考关于图4的相关讨论，可以将它们称为“a”(最终图像下部区域的激光发射–参见图4的顶部)和“b”(最终图像上部区域的激光发射–参见图4的下部)。在下面讨论的实验示例中，始终在“a”和“b”几何形状的曝光时段对中记录光谱信号，导致对于两个曝光时段的组合的总采集时间为10秒。

在下面讨论的实验示例中，激光驱动器164被设置为560mA的注入电流，该注入电流低于激光阈值(对应于“激光关闭”状态)，并由第一数字延迟发生器以500Hz的频率进行调制，即当拉曼光谱信号位于检测像素中时仅在曝光时段的第二间隔期间开射。施加1V的调制电压会导致660mA的“激光开启”状态下的激光注入电流，从而在样品位置产生52mW的光功率。为了避免行移位时段期间的激光发射(这会导致信号混入背景光谱信号中)，在CCD触发信号和激光脉冲输出之间施加了680μs的脉冲延迟。受直至下一个脉冲到达之前可用的时间(即1毫秒)的限制，激光脉冲宽度被设置为319μs。

CCD 40所需的外部触发信号64由第一数字延迟发生器提供。应当注意的是，相应的脉冲输出不受“禁止”功能的影响，因此会以选定的1kHz频率向CCD的“EXT TRIG(外部触发)”输入提供连续的脉冲序列。当在Solis软件中开始第一间隔和第二间隔的多个循环的曝光时段时，CCD“快门”输出66将向第二数字延迟发生器168的输入发送触发信号。当没有接收到触发信号(即激光器处于“关闭”状态)时，此延迟发生器被设置为TTL高配置，以激活第一延迟发生器166的激光输出的“禁止”功能。在从CCD接收到触发信号66时，第二延迟发生器168输出选定持续时间(例如5秒)的脉冲，以禁用第一延迟发生器166的“禁止”功能，并因此在该特定持续时间使能激光输出。当达到第一间隔和第二间隔的预设循环数(在Solis软件中预设)时，整个序列完成，然后CCD经历背景光谱信号和拉曼光谱信号的读出阶段。

在该读出阶段期间，可以将CCD编程为垂直地(沿列)以例如16个像素为组进行归组。如果检测像素块和存储像素的第一块和第二块中的每个块的高度为64个像素，则这会导致来自CCD的四行背景光谱信号和四行拉曼光谱信号的输出(对于归组在一起的16个像素的每个子块，存在一行)。

为了比较使用描述的曝光时段操作图7的装置与使用第一间隔和第二间隔的多个循环(在此将其称为“电荷移位模式”)操作图7的装置的实验结果，装置还以“更常规”模式进行操作用于比较。在这种常规模式下，使用了50ms、100ms和500ms的曝光时段。执行两个调整步骤以匹配电荷移位和常规模式下的照射条件。首先，通过在常规读出模式下选择合适数量的曝光时段来匹配在总采集时间期间撞击检测像素的环境光的总量。其次，对于给定数量的总曝光时段，通过选择合适的激光脉冲宽度来匹配使各个曝光时段期间撞击样品的激光光子总数。

为了避免在常规模式操作的读出阶段期间CCD的照射，将激光脉冲的定时调整为在每个曝光时段的中心，即，选择相对于CCD触发脉冲的适当的激光脉冲延迟。为了模拟电荷移位模式的读出条件，在多轨迹模式下使用4个轨迹(每个在列方向上包含16个像素)获取背景光谱信号和拉曼光谱信号。此外，CCD由第一延迟发生器166从外部触发，以记录一系列循环，每个循环具有背景光谱信号和然后的拉曼光谱信号，它们与“激光开启”和“激光关闭”状态相对应。

上面已经指出，到达样品的环境光可能来自各种自然光源，例如太阳，和/或各种人工光源，例如白炽灯、荧光灯和LED照明，并且可能由于例如装置周围的人和物体的移动、装置和/或样品的移动、云在天空中的移动、灯的开和关或输出的变化等而受到影响。为了说明所描述的装置和方法，使用35W卤素灯泡(作为宽带光源)或紧凑型荧光灯管(作为窄带光源)直接照射样品区域。由于紧凑型荧光灯管(具有几条窄的发射线)发出的光强度较低，其除了直接照射样品区域外，还使用镜面朝着样品表面被反射。注意到上面关于图8描述的PTFE样品，设置了两种环境光的强度，以使734cm^-1处的主要PTFE拉曼带与最强的环境光信号之比在0.008至0.026的范围内。在“静态照射条件”下，使用环境光而没有进一步的物理干扰，而在“动态照射条件”下，通过在相应光源正下方挥动操作员的手粗糙地模仿测量区域或光源本身周围的人、其他物体的移动，来调制光强度。对于处于“常规”操作模式和“电荷移位”操作模式的两种光源，在“静态”和“动态”照射下，进行了6组重复实验，并在每个实验中记录了10组独立的背景光谱信号和拉曼光谱信号。

对于“常规模式”，对在与CCD像素行81-144相对应的四个单独轨迹上获取的光谱信号进行平均，并累积动力学序列中针对两种情况下(“激光开启”/“激光关闭”)的单独光谱，导致平均光谱，即，一个包含PTFE拉曼信号和环境光信号，另一个仅包含环境光贡献。然后两个光谱中每个光谱的最小值被相减，之后归一化为环境光源的最强特征，即，荧光灯在1098cm^-1处的清晰信号的顶部(3个数据点的平均值)或白炽灯在947cm^-1和973cm^-1之间的宽发射分布的顶部(15个数据点的平均值)。最后，取两个对应光谱之间的差异。

“电荷移位”光谱信号的处理方式与“常规”读出中的光谱信号类似。但是，这里在顶部(像素行81-144)和底部(像素行1-64)区域中获取的强度在初始步骤中取平均值，并且在进行差值计算(顶部区域减去底部区域)之后，通过从“a”光谱减去“b”光谱添加最后的重建步骤。

为了获得PTFE胶带的参考光谱，关闭所有环境光，使用10秒的积分时间记录两个高信噪比光谱，并对10个单独的光谱均进行平均。随后，直接从与“激光开启”状态(660mA注入电流)对应的光谱中减去与“激光关闭”状态(560mA注入电流)对应的光谱。

从由PTFE拉曼信号和环境光共同贡献的光谱中，确定特征光谱特征的强度。C–F和C–C对称拉伸带在734cm^-1处的PTFE拉曼带强度被计算为基线上方峰中心三个点的强度的平均值，如使用Microsoft Excel(Microsoft,Redmond,WA)由该带左右的5个点的平均强度确定的。以相同的方式确定荧光灯的环境光强度，但是使用在1098cm^-1处最强的发射线。在白炽灯的情况下，通过从947cm^-1和973cm^-1之间区域的平均强度减去70cm^-1和98cm^-1之间范围中背景的平均强度，来计算宽发射的最大强度。为了计算恢复光谱的PTFE信噪比(S/N比)，在810cm^-1至860cm^-1的光谱范围内确定背景噪声值，该范围不含来自PTFE或任何荧光发射线的信号。

为了定量评估光谱重建，如Rodriguez等人,Anal.Chem.2011,83,4061-4067中讨论的(其内容出于该特定和所有其他目的通过引用并入本文)，命中质量指数(HQI)被用作各个重建光谱与PTFE参考光谱之间的光谱相似性的指示器。为了考虑到环境光强度水平的潜在变化(这在动态照射条件下尤其是不可避免的)，在图9a、9b、10a和10b中，相对于PTFE信号与环境光强度比绘制HQI。

在“常规”模式的情况下，只需从“激光开启”光谱中按比例减去“激光关闭”光谱即可执行光谱重建。然而，对于“电荷移位”模式，记录的两个分开的轨迹(即拉曼光谱信号(包括环境光)和背景光谱信号(仅环境光))的按比例相减留下了荧光发射线的明显残留。残留的光谱图案类似于一阶导数的形式，表明在电荷移位过程中可能已经存在环境光发射线的移位。可以通过成像摄谱仪固有的众所周知的“微笑”图案来理解这种效果，其中平面光栅会产生直入射狭缝的弯曲图像。

在“常规”模式下，这似乎不是问题，因为CCD像素电荷仅在一个方向上(即在实际读出阶段期间(每次曝光的持续时间约为90毫秒))移位。因此，在有和没有开启激光的情况下记录的连续光谱会经历完全相同的失真量，并且在减法过程中会抵消各自的影响。然而，在“电荷移位”模式下，电荷在曝光阶段期间在两个方向上移位，并且由于相对大数量的80个移位行，无法完全补偿“微笑”效应引起的失真。应当注意，该效应相对而言很小，因为大约1100cm^-1处的最大残留强度仅占顶部和底部轨迹光谱中荧光发射线原始强度的不到6％。

然而，使用以上针对图4讨论的技术有助于克服该失真。由起始触发信号确定，源自PTFE样品的拉曼散射光在“电荷移位”模式下成像在顶部轨迹(“a”光谱)或底部轨迹(“b”光谱)上。在两种情况下，从顶部轨迹减去底部会导致对于“a”差异获得正拉曼强度，而对于“b”差异获得负拉曼强度。由于两种情况下的光谱失真相等，因此可以通过相互减去两个差异光谱来有效消除光谱失真，导致重建的PTFE光谱。在目前描述的实验中，重建光谱与参考光谱的比较突出了所获得光谱的高质量，仅留下了非常小的残留失真。

“静态”照射条件下的平均重建光谱在“常规”模式和“电荷移位”模式下显示出非常相似的图样。在所有情况下，荧光干扰均被有效消除，而仅保留了以前非常强烈的发射线的微小贡献，并实现了重建光谱的良好再现性(如标准偏差所示)。然而，关于重建光谱的信噪比，在常规读出模式和电荷移位模式下，各个采集时间之间存在明显差异。在干扰光源在几乎平坦的背景上主要具有尖锐和强烈的发射线的情况下，可以根据各个采集的次数在读出噪声方面解释这种影响。虽然在“电荷移位”模式下仅发生了两次读出，但在“常规”模式下，对于500、100和50毫秒的子采集时间，读出循环数分别为18、74和122。在500毫秒的采集时间，由于采集的次数相对较少，累积的读出噪声的不利影响消失，因为所获得的S/N比与“电荷移位”模式相同。

在“动态”照射条件下，与“电荷移位”模式相比，“常规”读出模式的重建光谱的标准偏差要大得多。尤其是在100毫秒的子采集时间的情况下，荧光发射线的残留很明显。进一步的测试表明，该观察结果是由于荧光灯泡的相对大的有效表面(两个独立的U形放电管，分别为10mm直径和94mm长度)导致光谱发射分布的空间变化。当在动态照射条件下在光源和实验装置之间移动手时，收集光学器件在不同时间捕获的光谱分布略有不同。由于手的移动与CCD读出频率不同步，因此光谱失真未均匀地分布到动力学序列中的相邻光谱上。因此，光谱重建过程无法有效消除这些失真。在施加的手挥动频率处，50毫秒和500毫秒的子采集时间导致更好的重构性能，但应注意，对于不同的调制频率，情况可能并非如此。克服这一基本问题的唯一方式是“电荷移位”模式(例如以1kHz的频率运行)有效地在曝光时段的第一间隔和第二间隔之间均匀分布背景水平的快速变化的能力，从而随后的光谱重建可以有效地消除这些干扰。由于撞击CCD的荧光绝对强度较低，因此S/N比在所有情况下增加，但仍显示出在“静态”照射条件下已经观察到的相同趋势。

为了定量评估“常规”模式和“电荷移位”模式下的恢复光谱，图9a和9b中相对于命中质量指数(HQI)绘制了PTFE与荧光强度比，具有与为1的HQI相对应的完美光谱匹配。

在图9a的“静态”照射条件下，“常规”模式和“电荷移位”模式之间的重建性能差异不大，可以实现非常好的重建。但是，对于“常规”读出，存在随着子采集时间增加重建更好的趋势。从以500毫秒记录的18个独立光谱系列重建的光谱显示出最佳性能，并且在同等的PTFE信号与环境光强度比下，实际上与从“电荷移位”模式重建的光谱相同。由于通过荧光发射利用其几乎平坦的基线没有大量散粒噪声添加到光谱中，因此可以在较短的子采集时间中累积的读出噪声的增加量方面来理解这种效果。如对于不变的背景所期望的，在1.7-7.5Hz范围内的频率下的“常规”模式能够有效地拒绝那些静态贡献。

图9b显示，然而在“动态”照射的情况下，“电荷移位”模式在解决环境光干扰的快速变化调制方面表现出色，从而获得了最佳的重建(最高的HQI)和最佳的再现性(每组10个光谱内最低的标准偏差)。应当指出，在“常规”条件下以100毫秒曝光时段记录的两个光谱的重建导致非常差的结果，并且为了表示清晰起见，已删除了那些离群值。结果表明，受限于小于10Hz的频率的“常规”模式(由于各个采集之间不可避免的读出相位)不能有效且再现地解决环境光干扰的不规则调制/变化。在材料识别方面，用于确认目的的典型最小HQI为0.95(参见Rodriguez等人，上面的参考)。应用此阈值，对于子采集时间为50、100和500毫秒的“常规”模式，所调查的PTFE样品的正确分类率分别为57％、68％和82％。相反，“电荷移位”模式的出色光谱重建性能导致100％正确的分类率，即在60例的60例中，样品被鉴定为PTFE。

两种模式之间的一个主要差异在于，在常规模式下，对于所有调查的子采集时间，重建性能从“静态”照射条件到“动态”照射条件降低(降低1.0-3.2％)，而电荷移位模式的情况则相反(增加0.8％)。此外，在“常规”模式下，对于50、100和500毫秒的子采集时间，光谱重建的再现性分别降低了4.3、12.2和5.4倍，而“电荷移位”模式则未观察到变化。可以通过两个抵消作用来解释此行为。在“静态”照射下，测量过程中累积的荧光强度较高(但稳定)，而在“动态”照射条件下，则捕获了变化(但总体上较低)的环境光量。由于“电荷移位”模式(在这种情况下以1kHz运行)具有出色的处理调制背景的能力，因此较小的绝对荧光强度在“动态”照射条件下导致更好的光谱重建。相反，“常规”模式不能很好地处理背景变化，因此在这种情况下，无法利用较低绝对强度的好处，从而导致重建性能下降和变化增加。

白炽光源具有宽而强烈的光谱发射，为记录的光谱增加了显著的背景。因此，在“静态”照射条件下的重建光谱与具有同等峰值强度的荧光灯相比显示出约低一个数量级的S/N。在这种情况下，与荧光灯相反，在“常规”模式下，对于子采集时间没有观察到S/N比的趋势。由于白炽光的光谱特性，光谱中包含的光子散粒噪声的量比累积的读出噪声大得多，因此可以认为是主要的噪声源。

在“动态”照射条件下，由光强度的调制引起的光谱失真是造成变化的另一个原因。在“常规”模式下，由于这种配置处理变化背景的能力有限，所以相对于静态照射，此效果导致低波数区和高波数区中(即，为光谱重建执行归一化的区域之外)标准偏差增加。但是，对于“电荷移位”模式，与“静态”照射条件相比，由于总体光强度降低，所以有效拒绝这种类型的变化的能力导致标准偏差显著降低。关于由精细的像素间噪声控制的S/N比，在各种工作模式之间没有可观察到的差异。但是，与“静态”照射条件相比，绝对值增加了约1.4-1.6倍，因为白炽灯的整体强度降低，导致更低的散粒噪声贡献。

图10a显示了“静态”照射条件下PTFE信号与白炽灯强度比。在此配置中，所有重建的光谱在误差裕度内都是相同的，从而突出表明在任何选定的子采集时间，“电荷移位”模式与“常规”模式相比性能同等地好。由于光谱中存在大量散粒噪声，因此与荧光干扰(HQI＝0.94-0.98)相比，HQI的绝对值明显降低(HQI＝0.40-0.55)。

如图10b所示，在“动态”照射条件下，“电荷移位”方法展示了其有效拒绝变化背景的能力，从而导致了这种情况下最佳的光谱重建和最低的可变性。与选择的子采集时间无关，“常规”模式的光谱重建性能较差，并且由于光谱重建后仍然存在残留失真而显示出较大的变化。特别是对于“电荷移位”模式光谱，显而易见的是，在获得的HQI和PTFE信号与白炽灯强度比之间存在直接比例关系。由于减少散粒噪声的影响时可以实现更好的光谱匹配，因此可以期待这种效果。

与荧光光源引入的光谱窄失真相反，由白炽灯引起的重建光谱的变化可以被视为信号背景的光谱宽调制。因此，对于“常规”模式，已尝试通过7阶多项式拟合(MATLABR2013a)消除光谱缓慢变化的基线。随后，借助HQI对校正后的光谱的光谱重建性能进行评估。尽管失真光谱的光谱重建(在“动态”照射下以“常规”模式记录)显示出与“电荷移位”模式相比性能和再现性下降，但在多项式基线校正后这种差异消失。尽管这种方法对于具有清晰且良好分离的拉曼带的样品(在这种情况下为PTFE)似乎是成功的，但应注意的是，在更具挑战性的样品中，例如在生物组织中，存在通过多项式拟合将大量伪像添加到光谱的风险。

表1列出了“常规”模式和“电荷移位”模式在一次采集所需的文件大小和测量时间方面的比较，一次采集对应于电荷移位模式中的一个曝光时段。为了解决环境光强度的快速变化，使用最快的可用CCD调制频率可能是有益的。对于“常规”模式，在50毫秒的子采集时间内为7.5Hz，而在“电荷移位”模式下，可实现的1kHz频率要快两个数量级，因此具有明显的优势。由于在通常的实验室环境之外(即在将使用便携式仪器的地方)特别需要消除环境光干扰，因此，由于数据存储容量可能会受到限制，因此在生成的数据量方面也应小心。

表1

如表1所示，从CCD读取的组合的背景光谱信号和拉曼光谱信号的数据文件大小随撞击CCD的环境光的总量而变化。总体而言，从CCD软件获得的“常规”模式下的原始文件大小与“电荷移位”模式相比大高达18倍(对于7.5Hz操作)。以白炽灯为例，在7.5Hz频率下，“常规”模式下50个光谱的总文件大小为153.4MB，而“电荷移位”模式下仅为9.0MB。因此，“常规”模式的主要局限性是只能在动力学模式下补偿环境光的快速变化，但这需要读出并存储动力学序列的每个单个子采集。由于在大多数情况下不需要访问每个单独的子采集，因此在这方面，“电荷移位”技术通过将数据限制为光谱重建所需的量而受益。

最后，不仅要生成的数据量而且完成测量所需的时间也是重要因素。从表1中可以看出，与“电荷移位”模式相比，常规模式分别在50毫秒、100毫秒和500毫秒时慢63％、37％和6％。再次以采集50个光谱为例，在“常规”模式下以7.5Hz需要花费13:35分钟，而使用“电荷移位”技术则仅需要8:20分钟。可以通过在“常规”模式下应用较低的频率来减少测量时间，但这将以无法再有效地解决环境光的快速变化为代价。

尽管已经描述了本发明的特定实施例和应用，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种修改和变更。

例如，所描述的技术可以用于通过在多个连续的时间帧处确定关于样品的补偿的拉曼光谱信号来实现时间分辨的拉曼光谱法，所述多个连续的时间帧例如可以以十分之一秒到一秒之间的间隔彼此相隔。所描述的技术还可以用于拉曼成像或宽视场拉曼成像，其中在整个像平面上检测诸如单独的拉曼带的拉曼光谱特征。

Claims (37)

1.一种测量样品的拉曼光谱特征的方法，其中环境光被入射到所述样品上，所述方法包括：

在具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)上定义检测像素和与所述检测像素分开的存储像素；

提供激光源，所述激光源被布置为将激光探测光引导至所述样品；

提供收集光学器件，所述收集光学器件被布置为将从所述样品散射的光引导至所述检测像素；

在曝光时段的持续期间内，重复至少第一间隔和第二间隔的循环，在所述第一间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光而没有激光探测光，以在这些像素处累积第一背景光谱信号，在所述第二间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品拉曼散射的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号；

在所述第一间隔期间，还在所述检测像素中累积所述第一背景光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第二拉曼光谱信号；

在所述第二间隔期间，还在所述检测像素中累积所述第二拉曼光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第一背景光谱信号，

其中，来自所述样品的背景光包括由所述样品散射的环境光。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述激光探测光在每个第二间隔期间入射在所述样品上，并且在每个第一间隔期间不存在于所述样品上。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述激光源被操作为仅在每个所述第二间隔期间发射所述激光探测光，而不在每个所述第一间隔期间发射所述激光探测光。

4.一种测量样品的拉曼光谱特征的方法，包括：

在具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)上定义检测像素和与所述检测像素分开的存储像素；

提供激光源，所述激光源被布置为将多种不同波长的激光探测光引导至所述样品；

提供收集光学器件，所述收集光学器件被布置为将从所述样品散射的光引导至所述检测像素；

在曝光时段的持续期间内，重复至少第一间隔和第二间隔的循环，在所述第一间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的第一波长的激光探测光，以在这些像素处累积第一拉曼光谱信号，在所述第二间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的第二波长的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号，所述第二波长不同于所述第一波长；

在所述第一间隔期间，还在所述检测像素中累积所述第一拉曼光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第二拉曼光谱信号；

在所述第二间隔期间，还在所述检测像素中累积所述第二拉曼光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第一拉曼光谱信号。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述循环还包括至少第三间隔，在所述第三间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的第三波长的激光探测光，以在这些像素处累积第三拉曼光谱信号，所述方法还包括：

在所述第一间隔和所述第二间隔期间，将累积的所述第三拉曼光谱信号存储在所述存储像素中；和

在所述第三间隔期间，还在所述检测像素中累积所述第三拉曼光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第一拉曼光谱信号和所述第二拉曼光谱信号。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中：

所述循环还包括至少另外的间隔，在所述另外的间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光而没有由所述样品散射的激光探测光，以在这些像素处累积另外的背景光谱信号，所述方法还包括：

在所述第一间隔和所述第二间隔期间，将累积的所述另外的背景光谱信号存储在所述存储像素中；并且

在所述另外的间隔期间，还在所述检测像素中累积所述另一背景光谱信号的同时在所述存储像素中存储累积的所述第一拉曼光谱信号和所述第二拉曼光谱信号。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，在还从所述样品接收到散射的激光探测光的间隔期间接收的来自所述样品的背景光包括所述样品的荧光。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中，所述样品的荧光是响应于入射在所述样品上的激光探测光而发射的。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中，来自所述样品的背景光包括入射到所述样品上并由所述样品散射的环境光。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：

在所述曝光时段之后，从所述CCD读取在所述曝光时段期间累积的光谱信号；并且

使用从一个或多个这样的曝光时段读取的累积的光谱信号来计算补偿的拉曼光谱信号，所述补偿的拉曼光谱信号经补偿以去除所述背景光的信号。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括：根据来自一个或多个曝光时段的所述补偿的拉曼光谱信号来确定所述样品的化学特性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述收集光学器件包括光谱仪，所述光谱仪被布置为将从所述样品散射的光以光谱方式分散在所述检测像素上。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法由手持式设备执行。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，重复的所述循环还包括另外的间隔，在所述另外的间隔期间，在所述检测像素处接收由参考样品散射的激光探测光，以累积参考光谱信号。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过对所述CCD的像素的电荷含量进行行移位来在所述检测像素与所述存储像素之间移动所述光谱信号。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述存储像素包括布置在所述检测像素的相对侧的至少第一组存储像素和第二组存储像素，所述第一组用于存储累积的所述第一背景光谱信号或所述第一拉曼光谱信号，所述第二组用于存储累积的所述第二拉曼信号。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中：

所述存储像素包括布置在所述检测像素的相对侧的至少第一组存储像素和第二组存储像素；

在第一曝光时段期间，使用所述第一组来存储累积的所述第一背景光谱信号或所述第一拉曼光谱信号，并且使用所述第二组来存储累积的所述第二拉曼光谱信号；

在第二曝光时段期间，使用所述第一组来存储累积的所述第二拉曼光谱信号，并且使用所述第二组来存储累积的所述第一背景光谱信号。

18.根据权利要求17所述的方法，包括：

在所述第一曝光时段和所述第二曝光时段中的每个曝光时段的结束时，从所述CCD读取累积的第一和第二光谱信号；

将来自两个曝光时段的累积的第一光谱信号组合在一起；

将来自两个曝光时段的累积的第二光谱信号组合在一起；和

使用来自两个曝光时段的组合的第一光谱信号和组合的第二光谱信号，计算补偿的拉曼光谱信号，所述补偿的拉曼光谱信号经补偿以去除所述背景光的信号。

19.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述存储像素包括在所述检测像素的行或块之间交错的像素行或像素块。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述收集光学器件包括遮罩，所述遮罩被布置为阻挡从所述样品散射的光在所述存储像素处被接收。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述曝光时段包括所述第一间隔和所述第二间隔各至少10个或至少100个。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述曝光时段具有至少1秒的持续时间。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述激光源被布置为将所述激光探测光引导至所述样品的表面上的照射区域，并且所述收集光学器件被布置为收集从样品表面上的收集区域散射的光以用于在所述检测像素处接收，所述收集区域在空间上与所述照射区域相偏移。

24.根据权利要求23所述的方法，包括：在多个曝光时段中的每个曝光时段期间既累积第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号又累积第二拉曼光谱信号，所述照射区域和所述收集区域之间的空间偏移对于所述曝光时段中的每个曝光时段是不同的。

25.根据权利要求24所述的方法，还包括：通过将针对每个偏移的光谱信号与所述样品内的不同深度或深度分布相关联来确定所述样品的一个或多个表面下方区域的化学特性。

26.一种用于检测处于可变环境光条件下的样品的拉曼光谱特征的装置，包括：

具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)，所述像素包括检测像素和存储像素；

激光源，被布置为将激光探测光引导至所述样品；

收集光学器件，被布置为将从所述样品散射的光引导至所述检测像素；

控制器，被布置为实施曝光时段，在所述曝光时段期间，多个第一间隔和多个第二间隔交错，在所述多个第一间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光而没有激光探测光，以在这些像素处累积第一背景光谱信号，在所述多个第二间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号，

使得在每个第一间隔期间，还在所述第一背景光谱信号被累积在所述检测像素中的同时将累积的所述第二拉曼光谱信号存储在所述存储像素中，并且

使得在每个第二间隔期间，还在所述第二拉曼光谱信号被累积在所述检测像素中的同时将累积的所述第一背景光谱信号存储在所述存储像素中，

其中，来自所述样品的背景光包括由所述样品散射的环境光。

27.根据权利要求26所述的装置，该装置被布置为使得所述激光探测光在每个第二间隔期间入射在所述样品上，并且在每个第一间隔期间不存在于所述样品上。

28.根据权利要求26或27所述的装置，该装置被布置为使得所述激光源在所述第二间隔期间发射所述激光探测光而不在所述第一间隔期间发射所述激光探测光。

29.一种用于检测样品的拉曼光谱特征的装置，包括：

具有多个像素的电荷耦合器件(CCD)，所述像素包括检测像素和存储像素；

激光源，被布置为将第一波长或第二波长的激光探测光引导至所述样品；

收集光学器件，被布置为将从所述样品散射的光引导至所述检测像素；

控制器，被布置为实施曝光时段，在所述曝光时段期间，多个第一间隔和多个第二间隔交错，在所述多个第一间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的第一波长的激光探测光，以在这些像素处累积第一拉曼光谱信号，在所述多个第二间隔期间，在所述检测像素处接收来自所述样品的背景光和由所述样品散射的第二波长的激光探测光，以在这些像素处累积第二拉曼光谱信号，

使得在所述第一间隔期间，还在所述第一拉曼光谱信号被累积在所述检测像素中的同时将累积的所述第二拉曼光谱信号存储在所述存储像素中，并且

使得在所述第二间隔期间，还在所述第二拉曼光谱信号被累积在所述检测像素中的同时将累积的所述第一拉曼光谱信号存储在所述存储像素中。

30.根据权利要求29所述的装置，其中，来自所述样品的背景光包括所述样品的荧光。

31.根据权利要求29或30所述的装置，其中，所述样品的荧光是响应于入射在所述样品上的激光探测光而发射的。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的装置，其中，来自所述样品的背景光包括入射到所述样品上并由所述样品散射的环境光。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的装置，该装置被布置为使得所述激光源在所述第一间隔期间发射第一波长的激光探测光，并且在所述第二间隔期间发射第二波长的激光探测光。

34.根据权利要求26至33中任一项所述的装置，还包括分析器，所述分析器被布置为在所述曝光时段之后从所述CCD接收在所述曝光时段期间累积的第一背景光谱信号或第一拉曼光谱信号和第二拉曼光谱信号，以及从第一光谱信号和第二光谱信号计算补偿的拉曼光谱信号，所述补偿的拉曼光谱信号经补偿以去除所述背景光的信号。

35.根据权利要求34所述的装置，其中，所述分析器被布置为输出根据所述补偿的拉曼光谱信号确定的所述样品的化学特性。

36.根据权利要求26至35中任一项所述的装置，其中，所述收集光学器件包括光谱仪，所述光谱仪被布置为将从所述样品散射的光以光谱方式分散在所述检测像素上。

37.一种手持式分析设备，包括根据权利要求26至36中任一项所述的装置。

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