CN113166694A - 色素沉积皮肤模型及其制造方法、以及用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种色素沉积皮肤模型,包含:被接种于第1细胞培养基材上的、包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群;以及被应用于上述第1细胞群上的、包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群。此外,本发明提供制造色素沉积皮肤模型的方法、和使用了色素沉积皮肤模型的用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法。
Description
技术领域
本发明涉及色素沉积皮肤模型以及制造该模型的方法。此外,本发明涉及使用了色素沉积皮肤模型的用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法。
背景技术
皮肤为覆盖将生物体内与生物体外的环境分开的体表的器官。皮肤作为物理性屏障起作用,进行守护避免干燥、有害物质向生物体内侵入,发挥对于生命的维持而言不可缺少的作用。
高等脊椎动物的皮肤如果从最外层起进行大致区分则由表皮、真皮、皮下组织的层形成。表皮主要由被称为角质形成细胞(keratinocyte)的细胞构成,在表皮的最深部(基底层)角质形成细胞一边分裂,一边朝向上层向棘层、颗粒层、进而角质层进行分化一边向表面移动,最后变为垢而脱落。
在表皮的基底层存在黑素细胞,通过黑素细胞内的黑素体而生成黑素。所生成的黑素被周围的角质形成细胞摄入。被摄入的黑素随着角质形成细胞的周转而移动到角质层,经约40天而被排出到生物体外。
可以认为皮肤的斑/雀斑等色素沉积的原因是通过激素的异常、紫外线曝露、局部的炎症等,从而由黑素细胞过度地形成黑素、黑素颗粒在表皮基底层的角质形成细胞内沉积等。虽然开发了治疗或预防色素沉积、例如由年龄增长引起的老年性色素斑等的方法、治疗剂(美白剂),但存在得不到期待的效果,或虽然获得暂时的效果,但具有效果不持续而复发等课题,开发新的治疗法或预防法、治疗剂的需求持续存在。
在那样的状况下,为了开发新的治疗法,代替现有的动物模型,近年来开发并利用了模仿了皮肤的结构及其功能的色素沉积皮肤模型(例如,专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特许第6113393号公报
发明内容
发明所要解决的课题
现有的色素沉积皮肤模型在制作的模型间具有色素沉积的偏差,此外,难以长期稳定地培养。作为其原因,除了作为制作方法,在真皮模型上直接接种包含角质形成细胞、黑素细胞的表皮细胞群,因此真皮模型的品质大大影响表皮层形成以外,在将色素沉积皮肤模型进行维持培养的过程中,不能进行将真皮模型、表皮模型分离而变更条件的操作、在不同的真皮模型上转移表皮模型这样的操作,实验范围具有限制。因此,本发明的目的是提供能够稳定地长期培养的新的色素沉积皮肤模型和制造该色素沉积皮肤模型的方法,除此以外在将色素沉积皮肤模型进行培养维持的过程中可以进行单独真皮模型或表皮模型的条件变更、自由转移真皮模型与表皮模型,此外,本发明的目的是提供对使用了新的色素沉积皮肤模型的用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子进行评价的方法。
用于解决课题的方法
本发明者们进行了深入研究,结果发现,通过在包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群,可以开发能够稳定地长期培养的色素沉积皮肤模型。即,本发明包含以下发明。
[1]一种色素沉积皮肤模型,包含:
被接种于第1细胞培养基材上的、包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群;以及
被应用于上述第1细胞群上的、包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群。
[2]根据[1]所述的色素沉积皮肤模型,上述通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞是在光敏剂的存在下通过紫外光的照射而造成了损伤的成纤维细胞。
[3]根据[2]所述的色素沉积皮肤模型,上述光敏剂选自补骨脂素、NAD、核黄素、色氨酸、叶酸、卟啉、亚甲蓝、被硫醇基保护了的金纳米簇(AUxSRy)。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的色素沉积皮肤模型,上述光照射为UVA的光照射。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的色素沉积皮肤模型,上述第2细胞群是被接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材上的第2细胞群。
[6]根据[1]~[5]中任一项所述的色素沉积皮肤模型,上述第1细胞培养基材是具有多孔膜的细胞培养基材。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的色素沉积皮肤模型,上述第1细胞群是与水凝胶形成剂一起接种而得的第1细胞群。
[8]根据[7]所述的色素沉积皮肤模型,上述水凝胶形成剂选自胶原、明胶、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、纤维素、果胶、淀粉、层粘连蛋白、血纤蛋白原/凝血酶、原纤蛋白、弹性蛋白、树胶、纤维素、琼脂、谷蛋白、酪蛋白、白蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白(entactin/nidogen)、糖蛋白、糖胺聚糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、Matrigel以及它们的组合。
[9]一种色素沉积皮肤模型的制造方法,其包含下述工序:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群进行培养;
工序(2),将在上述工序(1)中获得的第1细胞群在第1细胞培养基材上进行培养;以及
工序(3),在上述工序(2)中获得的第1细胞群上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群,进行培养。
[10]根据[9]所述的方法,上述通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞是在光敏剂的存在下通过紫外光的照射而造成了损伤的成纤维细胞。
[11]根据[10]所述的方法,上述光敏剂选自补骨脂素、NAD、核黄素、色氨酸、叶酸、卟啉、亚甲蓝、被硫醇基保护了的金纳米簇(AUxSRy)。
[12]根据[9]~[11]中任一项所述的方法,上述光照射为UVA的光照射。
[13]根据[9]~[12]中任一项所述的方法,上述第2细胞群是被接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材上的第2细胞群。
[14]根据[9]~[13]中任一项所述的方法,上述第1细胞培养基材是具有多孔膜的细胞培养基材。
[15]根据[9]~[14]中任一项所述的方法,上述第1细胞群是与水凝胶形成剂一起接种而得的第1细胞群。
[16]根据[15]所述的方法,上述水凝胶形成剂选自胶原、明胶、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、纤维素、果胶、淀粉、层粘连蛋白、血纤蛋白原/凝血酶、原纤蛋白、弹性蛋白、树胶、纤维素、琼脂、谷蛋白、酪蛋白、白蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白(entactin/nidogen)、糖蛋白、糖胺聚糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、Matrigel以及它们的组合。
[17]根据[9]~[16]中任一项所述的方法,上述工序(2)在抗坏血酸、抗坏血酸衍生物或它们的盐的存在下实施。
[18]一种色素沉积皮肤模型,其通过[9]~[17]中任一项所述的方法而获得。
[19]一种用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法,其包含下述工序:
工序(1),对[1]~[8]和[18]中任一项所述的色素沉积皮肤模型应用候选因子,进行培养,
工序(2),以上述色素沉积皮肤模型中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对上述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
[20]一种用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法,其包含下述工序:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群进行培养,
工序(2),将在上述工序(1)中获得的第1细胞群在第1细胞培养基材上进行培养,
工序(3),在上述工序(2)中获得的第1细胞群上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群,进行培养,
工序(4),在包含候选因子的基材上,转移在上述工序(3)中获得的上述第2细胞培养群,进行培养,
工序(5),以上述第2细胞群中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对上述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
[21]根据[20]所述的方法,上述候选因子是成纤维细胞。
发明的效果
通过本发明,提供能够稳定地长期培养的色素沉积皮肤模型,通过使用该色素沉积皮肤模型,能够进行用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的探索、评价。
附图说明
图1是显示一实施方式的色素沉积皮肤模型的制造方法的概略图。各构成要素主要表示截面。
图2是显示一实施方式的色素沉积皮肤模型的制造方法的概略图。各构成要素主要表示截面。
图3显示PUVA处理或未处理的成纤维细胞的增殖性的不同。(A)进行了单层培养的PUVA处理或未处理(对照)的成纤维细胞的图像(培养第1天、第4天、第7天)。(B)PUVA处理后的成纤维细胞的增殖图。
图4显示PUVA处理或未处理(对照)的成纤维细胞中的衰老相关因子SA-β-gal的产生水平的不同。(A)进行了单层培养的成纤维细胞的溶解物中的SA-β-gal的酶活性值。(B)SA-β-gal的染色图像。SA-β-gal阳性细胞染成蓝绿色。
图5显示PUVA处理或未处理(对照)的成纤维细胞中的黑素生成促进因子SCF(干细胞因子,Stem Cell Factor)的产生水平的不同。(A)显示SCF产生量的经时变动的图。(B)使用了SCF抗体的SCF染色、使用了DAPI的核染色、SCF染色和核染色的融合图像(Merge)(各2幅)。
图6显示PUVA处理或未处理(对照)的成纤维细胞中的黑素生成促进因子HGF(肝细胞生长因子,Hepatocyte growth factor)的产生水平的不同。(A)使用了HGF抗体的HGF染色、使用了DAPI的核染色、HGF染色和核染色的融合图像(Merge)(各2幅)。
图7是显示PUVA处理或未处理的色素沉积皮肤模型的色素沉积的图。(A)进行了PUVA处理的色素沉积皮肤模型中的、表皮模型的图像(培养第0天、培养第21天)。(B)PUVA未处理的色素沉积皮肤模型中的、表皮模型的图像(培养第0天、培养第21天)。
图8是将与PUVA处理的真皮模型进行了约10天共培养的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了约10天培养后的、表皮模型的图像。
图9显示PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)的色素沉积。(A)在相位差显微镜的明视场中固定观察条件而拍摄到的表皮模型的图像。(B)将(A)的图像进行二值化处理,将色素沉积区域的比例定量化了的图。
图10显示PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型、和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)中的黑素颗粒。(A)通过Fontana-Masson染色法将表皮模型切片的黑素颗粒染色。(B)将(A)的图像进行二值化处理,将黑素颗粒区域的比例定量化了的图。
图11显示PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型、和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)中的活化黑素细胞。(A)使用TRP2(Tyrosine Related Protein 2)抗体将表皮模型切片的活化黑素细胞染色、和通过苏木精染色法进行了核染色的图像。(B)从(A)的图像将活化黑素细胞的比例定量化了的图。
具体实施方式
以下,参照附图等对关于实施本发明的方式进行说明,但本发明的技术范围不仅仅限定于下述方式。
在本说明书中,“第1”“第2”“第3”等术语用于将1个要素与另1个要素区别,例如,也可以将第1要素表达为第2要素、同样地可以将第2要素表达为第1要素,这并不造成超出本发明的范围。
只要没有特别的定义,在本说明书中使用的术语(技术术语和科学术语)具有与本领域技术人员一般理解的术语相同的含义。
<色素沉积皮肤模型及其制造方法>
图1是对一实施方式中的色素沉积皮肤模型1和制造该色素沉积皮肤模型1的方法进行说明的概略图。在一实施方式中,色素沉积皮肤模型1包含:
被接种于第1细胞培养基材11上的、包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群100;以及
被应用于上述第1细胞群100上的、包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群200(例如,参照图1(D))。
此外,一实施方式中的色素沉积皮肤模型1可以通过下述方法提供,所述方法包括以下工序:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群100进行培养,
工序(2),将在上述工序(1)中获得的第1细胞群100在第1细胞培养基材11上进行培养,
工序(3),在上述工序(2)中获得的第1细胞群100上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群200,进行培养。
在本说明书中,色素沉积皮肤模型1中的包含第1细胞群100或第3细胞群100a的结构模仿皮肤的真皮的结构,因此有时称为“真皮模型”(第1真皮模型或第2真皮模型)。此外,在本说明书中,色素沉积皮肤模型1中的包含第2细胞群200的结构模仿皮肤的表皮的结构,因此有时称为“表皮模型”。
色素沉积皮肤模型1可以是第2细胞群200被直接接种或叠层在第1细胞群100上而得的结构,也可以如图1那样是在第2细胞群200与第1细胞群100之间设置了存在培养基的空间的结构。在后者的情况下,为了第1细胞群100和第2细胞群200分泌的液性成分可以相互通过,优选第2细胞群200是接种于多孔膜(相当于图1的第2多孔膜210)上的。
在制造一实施方式中的色素沉积皮肤模型1的方法的工序(3)中,在工序(2)中获得的第1细胞群100上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群200的工序可以是将第2细胞群200直接接种或叠层在第1细胞群100上的工序,也可以是将接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材21上的第2细胞群200,应用于第1细胞群100上的工序。
在色素沉积皮肤模型1中,接种第1细胞群100的第1细胞培养基材11可以使用能够培养成纤维细胞的公知的培养基材,但优选为具有多孔膜的细胞培养基材,更优选为细胞培养插件。只要第1细胞培养基材11具有第1多孔膜110,就可以从接种于第1多孔膜110上的细胞的上下两方供给营养、氧。
在一实施方式的色素沉积皮肤模型1中,接种第2细胞群200的第2细胞培养基材21可以使用能够培养黑素细胞和角质形成细胞的公知的培养基材,但优选为具有多孔膜的细胞培养基材,更优选为细胞培养插件。只要第2细胞培养基材21具有第2多孔膜210,就不仅可以从接种于第2多孔膜210上的细胞的上下两方供给营养、氧,而且可以使第1细胞群100和第2细胞群200分泌的液性成分相互通过。此外,只要第2细胞培养基材21具有第2多孔膜210,就能够在将色素沉积皮肤模型1维持培养的过程中,将真皮模型与表皮模型分离,将各自在其它条件下培养,此外,也能够在不同的真皮模型上转移表皮模型进行培养。采用表皮细胞群的表皮层的形成影响真皮模型的品质,因此通过在色素沉积皮肤模型1中向具有任意品质的真皮模型交换,也能够控制表皮模型的品质。
第1多孔膜110和第2多孔膜210(也被应用于后述第3多孔膜110a)的平均孔径可以适当选择,可以为例如,约0.01μm~约100μm的平均孔径(例如,0.01μm~100μm、0.01μm~50μm、0.01μm~10μm、0.1μm~50μm、或0.1μm~10μm)。此外,第1多孔膜110和第2多孔膜210(也被应用于后述第3多孔膜110a)的细孔的密度也可以适当选择,可以为例如,1×104/cm2以上、1×105/cm2以上、5×105/cm2以上、10×105/cm2以上、50×105/cm2以上、或100×105/cm2以上的细孔的密度,可以为1×104/cm2~100×108/cm2、1×105/cm2~100×108/cm2。
在一实施方式中,在第2细胞培养基材21为细胞培养插件的情况下,只要使用内径与第1细胞培养基材11相比小的第2细胞培养基材21(细胞培养插件)即可。由此,能够将第2细胞培养基材21插入到第1细胞培养基材11的培养部分而使用。
在本发明中使用的细胞可以来源于任意动物,但优选来源于脊椎动物,更优选来源于哺乳动物,最优选来源于人。
所谓成纤维细胞,是构成结缔组织的细胞之一,是在多个脏器和组织存在的细胞。成纤维细胞在皮肤中主要包含于真皮组织。本发明的色素沉积皮肤模型1所使用的成纤维细胞优选为来源于真皮的成纤维细胞。
所谓角质形成细胞(keratinocyte),是构成表皮的细胞之一,是在生物体的表皮组织中,在最深部(基底层)一边分裂一边朝向上层而向棘层、颗粒层、进而角质层分化一边向表面移动,最后变为垢而脱落的细胞。
所谓黑素细胞(角质形成细胞),是构成表皮组织的细胞之一,是在生物体中存在于表皮的基底层,形成黑素的细胞。
本发明所使用的成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞分别分别可以是从生物体组织采集的原代培养细胞,也可以是预先被分离和/或增殖而被市售或分发的细胞,可以是株化的细胞,也可以是从ES细胞、iPS细胞、或Muse细胞等多能干细胞分化诱导而得的细胞。
第1细胞群100可以包含除成纤维细胞以外的细胞,可以包含例如,真皮组织所包含的肥大细胞、组织细胞、浆细胞、真皮树突细胞等。第1细胞群100所包含的成纤维细胞,例如,包含1×104~108个/cm2、优选为0.1~10×105个/cm2的细胞数。
第2细胞群200可以包含除角质形成细胞和黑素细胞以外的细胞,可以包含例如表皮组成所包含的朗格汉斯细胞、梅克尔细胞。第2细胞群200包含例如,角质形成细胞:黑素细胞为1:1~1000:1、优选为3:1~30:1的比的细胞。第2细胞群200包含例如1×102~106个/cm2、优选为1.0~10×104个/cm2、更优选为约4~8×104个/cm2的角质形成细胞,包含1~10×103个/cm2、优选为4~8×103个/cm2的黑素细胞。
第1细胞群100所包含的成纤维细胞使用通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞。通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞优选在光敏剂的存在下被光照射而造成损伤。作为所使用的光敏剂,可举出例如,补骨脂素、NAD、核黄素、色氨酸、叶酸、卟啉、亚甲蓝、被硫醇基保护了的金纳米簇(AUxSRy)等。通过使用光敏剂,被照射的光被敏化,可以高效率地成对纤维细胞带来损伤。
对成纤维细胞造成损伤时所使用的光只要是对细胞内的核酸、例如DNA、RNA造成损伤,但全部细胞不死亡的程度的波长即可,优选为紫外光(约200nm~约400nm),更优选为UVA(约320nm~约400nm)。照射的光的强度只要是对细胞内的核酸、例如DNA、RNA造成损伤,但不会诱导凋亡等而全部细胞死亡的程度即可,可以通过波长、照射的时间、细胞密度等来适当调整。例如,在照射UVA的情况下,只要照射0.01J/cm2~100J/cm2、优选为0.1J/cm2~20J/cm2、更优选为0.5J/cm2~10J/cm2即可。
通过将进行了光照射的成纤维细胞培养一定期间,可以不诱导凋亡等,而仅使生存的成纤维细胞增殖(相当于图1的(B))。通过光照射而受到损伤的成纤维细胞显示例如细胞的形态伸长,增殖能力降低,黑素生成因子(例如干细胞生长因子(SCF))的产生量增加等细胞的衰老水平增加了的特征(参照图3)。细胞的衰老水平可以通过测定一般已知的细胞衰老标志物,例如,衰老相关酸性β-半乳糖苷酶(SA-βgal)的表达量、p21/p53通路、p16通路等细胞周期检查机制的持久活化、IL-6等细胞衰老相关分泌表型(Senescence-associatedsecretory phenotype(SASP))因子的表达量等来研究。通过调节光照射量,可以获得所希望的衰老水平的成纤维细胞。
构成色素沉积皮肤模型1的第1细胞群100所包含的成纤维细胞是通过光照射而具有损伤,但不死亡而生存的成纤维细胞。因此,在本发明的色素沉积皮肤模型1中,包含大致均质的成纤维细胞,可以提供活性的偏差少的稳定的体系。
在一实施方式中,构成色素沉积皮肤模型1的表皮模型20可以使用例如,市售的TESTSKIN(商标)LSE-melano(TOYOBO)、MelanoDerm(商标)(MatTek)等。
色素沉积皮肤模型1例如可以使用通常的角质形成细胞培养所使用的培养液例如KG培养基、EpilifeKG2(クラボウ)、Humedia-KG2(クラボウ)、测定培养基(TOYOBO)等作为培养液,在约37℃下经0~14天进行。作为培养基,此外可以使用DMEM培养基(GIBCO)或将含有抗坏血酸的KGM与DMEM进行1:1混合而得的培养基等。
第1细胞群100优选与水凝胶形成剂一起被接种。在本说明书中,所谓“水凝胶形成剂”,是指为了形成水凝胶而添加的物质。作为在本发明中使用的水凝胶形成剂,可以选自例如,胶原、明胶、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、纤维素、果胶、淀粉、层粘连蛋白、血纤蛋白原/凝血酶、原纤蛋白、弹性蛋白、树胶、纤维素、琼脂、谷蛋白、酪蛋白、白蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、触觉蛋白/巢蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖糖胺聚糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、Matrigel以及它们的组合。
在一实施方式中,工序(2)可以在抗坏血酸、抗坏血酸衍生物或其盐的存在下实施。如果抗坏血酸、抗坏血酸衍生物或其盐存在,则促进成纤维细胞的增殖、胶原产生,从而如真皮的结构那样的多层化被促进,因此是优选的。在本说明书中,所谓“抗坏血酸衍生物”,是指例如,抗坏血酸2磷酸酯、抗坏血酸1磷酸酯、L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸2-葡糖苷等,进一步,也包含其盐(钠盐、镁盐等)。
本发明所提供的色素沉积皮肤模型1中,通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞直接或间接地作用于黑素细胞,从而黑素的产生被促进。因此,通过测定色素沉积皮肤模型1的色素产生和/或色素沉积的程度,可以对于影响色素沉积的因子进行评价。
<用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法(第1方式)>
本发明可以提供使用了色素沉积皮肤模型的、用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法。在一实施方式中,本发明的方法包括下述工序:
工序(1),对色素沉积皮肤模型1应用候选因子,进行培养,
工序(2),以上述色素沉积皮肤模型1中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对上述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
在一实施方式中,候选因子可以是例如,低分子化合物、肽、核酸、蛋白质、哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、猴、人等)的细胞、组织提取物或细胞培养上清液、来源于植物的化合物或提取物(例如,生药提取物、来源于生药的化合物)、和来源于微生物的化合物或提取物或培养产物等。
将候选物质添加于色素沉积皮肤模型1,培养所希望的时间后,测定色素沉积皮肤模型1中的色素产生和/或色素沉积的程度,从而可以对由候选物质产生的色素沉积的治疗或预防效果进行评价。例如,在与不添加候选物质、或添加了不具有色素沉积的治疗或预防效果的任意物质的色素沉积皮肤模型1的色素产生和/或色素沉积的程度相比,添加了候选物质的色素沉积皮肤模型1中的色素产生和/或色素沉积的程度高的情况下,该候选物质可以评价为具有色素沉积的治疗或预防效果的物质。
在本说明书中所谓“色素产生”,是指色素沉积皮肤模型产生的色素、例如黑素色素的产生。黑素色素主要通过黑素细胞产生。色素产生量例如可以通过从色素沉积皮肤模型、特别是第2细胞群(角质形成细胞和黑素细胞)提取黑素色素,测定405nm的吸光度从而求出黑素量。此外,色素产生量例如可以通过将色素沉积皮肤模型、特别是第2细胞群(角质形成细胞和黑素细胞)所包含的黑素或编码其的核酸量(例如mRNA量)通过使用ELISA法、流式细胞仪法、蛋白质印迹法、免疫组织化学法、qPCR法等方法来测定,但不限定于此。
在本说明书中,所谓“色素沉积的程度”,是指可见光下的色素沉积皮肤模型、特别是第2细胞群(角质形成细胞和黑素细胞)的颜色的明度。本发明的色素沉积皮肤模型依赖于黑素细胞产生的黑素量而明度变化。因此,如果黑素量变多则明度降低,色素沉积皮肤模型呈现深色。相反如果黑素量降低则明度上升,色素沉积皮肤模型呈现浅色。即,通过将色素沉积皮肤模型的颜色的明度进行比较,可以对由添加的候选物质带来的色素沉积的治疗或预防效果进行评价。明度可以通过将色素沉积皮肤模型作为图像而记录,使用公知的图像测定手段来定量。
<用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法(第2方式)>
在其它实施方式中,本发明的方法包括下述工序:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群100进行培养,
工序(2),将在上述工序(1)中获得的第1细胞群100,在第1细胞培养基材11上进行培养,
工序(3),在上述工序(2)中获得的第1细胞群100上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群200,进行培养,
工序(4),在包含候选因子的基材上,应用在上述工序(3)中获得的上述第2细胞群,将所得的色素沉积皮肤模型1a进行培养,
工序(5),以上述色素沉积皮肤模型1a中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对上述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
上述其它实施方式使用图2进行说明。由于工序(1)~(3)与上述色素沉积皮肤模型的制造方法所记载的工序通用,因此这里省略其说明(图2的(A)~(D))。此外,由于工序(5)与上述“用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法(第1方式)”所记载的工序(2)通用,因此这里省略其说明。
在一实施方式中,本发明包括:在包含候选因子的基材上,应用在上述工序(3)中获得的上述第2细胞群200,将所得的色素沉积皮肤模型1a进行培养的工序(参照工序(4)、图2的(F))。在工序(3)中使用的基材(例如,图2(E)和(F)的第3细胞培养基材11a)上的候选因子可以是例如,低分子化合物、肽、核酸、蛋白质、哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、猴、人等)的细胞、组织提取物或细胞培养上清液、来源于植物的化合物或提取物(例如,生药提取物、来源于生药的化合物)、和来源于微生物的化合物或提取物或培养产物等。在一实施方式中,候选因子如图2(E)和(F)所示那样,可以是任意细胞,例如,包含间充质干细胞的成纤维细胞的前体细胞、成纤维细胞(例如,未受到由光照射造成的损伤的成纤维细胞、或由光照射造成的损伤低的成纤维细胞)等。在本说明书中,所谓“未受到由光照射造成的损伤的成纤维细胞”或“由光照射造成的损伤低的成纤维细胞”,是未实施上述光照射工序的成纤维细胞,是指与上述“通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞”相比,衰老水平低的成纤维细胞。在一实施方式中,作为候选因子的第3细胞群100a可以被接种于具有多孔膜的第3细胞培养基材11a。
在一实施方式中,工序(4)可以是将在工序(3)中获得的上述第2细胞群200直接接种或叠层在作为候选因子的第3细胞群100a上的工序,也可以是将接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材21上的第2细胞群200应用于作为候选因子的第3细胞群100a上的工序。在后者的情况下,能够将第2细胞培养基材21简单地转移到其它真皮模型上。
实施例
以下,基于实施例进一步详细地说明本发明,但它们丝毫不限定本发明。
1.使用的材料和方法
1-1.成纤维细胞的培养和PUVA处理
将1×105个正常人成纤维细胞用增殖用培养基(DMEM+10%胎牛血清)进行了培养。在成为100%汇合前置换成加入了补骨脂素(终浓度25ng/mL)(SigmaAldrich社制)的增殖用培养基,进行了培养。在24小时后用1mL的磷酸缓冲液(PBS)使其溶胀后,除去PBS,置换成加入了补骨脂素(终浓度25ng/mL)的1mL的PBS,进行了6J/cm2 UVA照射(SAN-EI UVE-502S)(以下,称为“PUVA处理”)。然后,用1mL的PBS使其溶胀后,除去PBS,置换成增殖用培养基,培养2~7天左右。在该过程中,通过PUVA处理的影响而细胞一部分死亡,但然后,生存的成纤维细胞增殖了。将PUVA未处理的来源于同一供体的成纤维细胞设为相对于上述PUVA处理成纤维细胞的对照(图3~6)。
1-2.真皮模型的制作
在上述1-1.中分别使用PUVA处理、或PUVA未处理(对照)的成纤维细胞而制作出真皮模型。如果简单描述,则在上述1.的步骤后,除去增殖用培养基而用1mL的PBS使其溶胀。然后,除去PBS,将细胞剥离剂(TrypLE SELECT,Thermo Fisher Scientific社制)在6孔板的每1孔中添加300μL,在37℃5%CO2培养箱内静置5分钟,进行了细胞剥离处理。添加增殖用培养基使反应停止,在15ml离心管中回收了细胞悬浮液。以1000rpm离心5分钟后,除去上清液,将细胞颗粒用增殖用培养基再悬浮,以成为5×105个细胞/mL的方式调整。在制作能够应用于6孔板的各孔的真皮模型时,在冰上调制由表1的组成构成的凝胶悬浮液。
表1:包含成纤维细胞的真皮模型用凝胶悬浮液的组成
在6孔板中设置真皮模型制作用细胞培养插件,在细胞培养插件内中添加了3mL凝胶悬浮液。在37℃5%CO2培养箱中使凝胶悬浮液固化后,在6孔板中添加含有抗坏血酸(AA2G)的增殖用培养基2mL,在37℃5%CO2培养箱中培养24小时。
1-3.与表皮模型组合了的色素沉积皮肤模型的制作
与上述真皮模型分开地,使用了由黑素细胞和角质形成细胞构成的市售的表皮模型(MatTek社制)(参照图1(C))。
将制作的表皮模型载置在上述1-2.的真皮模型上而组合(参照图1(D)),设置于专用容器(コーニング·バイオコート,深孔板,6孔用)(Corning,#355467),加入9.5mL的三维皮肤模型用培养基(将表皮模型专用培养基(MatTek,#EPI-100-NMM-113)与DMEM以1:1混合而得),以3~4天1次的频率用相同培养基进行了培养基交换。
1-4.置换了真皮模型的色素沉积皮肤模型
将与使用PUVA处理成纤维细胞而制作的真皮模型组合而培养了10天的表皮模型,与使用PUVA未处理的正常成纤维细胞而制作的真皮模型进行置换,进一步进行了10天培养(参照图2(E)和(F))。另外,置换用真皮模型(使用PUVA未处理的成纤维细胞而制作的真皮模型)在置换前一天制作。
2.结果
2-1.PUVA处理后的成纤维细胞
图3显示PUVA处理后和未处理的成纤维细胞。PUVA处理后的成纤维细胞伸长了(图3(A))。研究了PUVA处理后和未处理的成纤维细胞的增殖数的变动,结果PUVA处理后的成纤维细胞的增殖速度显著降低了(图3(B))。
2-2.PUVA处理后的成纤维细胞的衰老水平
对PUVA处理后和未处理的成纤维细胞各自的细胞溶解物中的衰老相关因子SA-β-gal的酶活性值进行了研究,结果PUVA处理后的成纤维细胞的SA-β-gal的酶活性值显著增加了(图4(A))。此外,进行了SA-β-gal的染色,结果PUVA处理后的成纤维细胞观察到显著大量的SA-β-gal阳性细胞(蓝绿色)(图4(B))。
2-3.PUVA处理后的成纤维细胞的黑素生成因子/SCF的产生水平
将PUVA处理后和未处理的成纤维细胞各自进行单层培养,在PUVA处理1天前、PUVA处理第0、1、3、7、14、21天通过ELISA法测定培养上清液所包含的SCF量,作为每1细胞的分泌量而算出,结果PUVA处理后的成纤维细胞的SCF水平显著增加了(图5(A))。此外,使用SCF抗体进行SCF染色,通过DAPI进行核染色,制作出SCF染色和核染色的融合图像(Merge),结果,在PUVA处理后的成纤维细胞中观察到大量SCF阳性细胞(图5(B))。
2-4.PUVA处理后的成纤维细胞的黑素生成因子/HGF的产生水平
将PUVA处理后和未处理的成纤维细胞各自进行单层培养,使用HGF抗体进行HGF染色,通过DAPI进行核染色,制作出HGF染色和核染色的融合图像(Merge),结果,在PUVA处理后的成纤维细胞中观察到大量HGF阳性细胞(图6(A))。
2-5.PUVA处理后的成纤维细胞的黑素生成因子/HGF的产生水平
图7是显示PUVA处理后(A)或未处理(B)的色素沉积皮肤模型中的、表皮模型的色素沉积的图。观察到进行了PUVA处理的色素沉积皮肤模型中的、表皮模型的色素沉积被促进。
2-6.置换了真皮模型的色素沉积皮肤模型
将与使用PUVA处理成纤维细胞而制作的真皮模型组合而培养了10天的表皮模型,与使用PUVA未处理的正常成纤维细胞而制作的真皮模型置换,进一步进行了10天培养,结果,观察到与进行了PUVA处理的色素沉积皮肤模型中的表皮模型的色素沉积(图7(A))相比抑制了色素沉积(图8)。
2-7.PUVA处理、未处理、置换了真皮模型的色素沉积皮肤模型的色素沉积
对PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型、和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)的外观进行了观察,结果在PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型中色素沉积被促进,与此相对,在替换条件的表皮模型中观察到色素沉积缓和的状况(图9(A))。基于图9(A)的图像进行了定量化,结果在PUVA处理的色素沉积皮肤模型中色素富集区域的比例最高,与此相对,在替换条件的色素沉积皮肤模型中显示出色素富集区域减少(图9(B))。
2-8.PUVA处理、未处理、置换了真皮模型的色素沉积皮肤模型的黑素生成
用PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型、和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)制作切片,通过Fontana-Masson染色法将表皮模型切片的黑素颗粒进行了染色(图10(A))。此外,将图10(A)的染色图像进行二值化处理,将黑素颗粒区域的比例定量化,结果在PUVA处理的色素沉积皮肤模型中黑素区域的比例最高,与此相对,在替换条件的色素沉积皮肤模型中显示出黑素区域减少(图10(B))。
2-9.PUVA处理、未处理、置换了真皮模型的色素沉积皮肤模型的黑素细胞数
用PUVA处理或未处理(对照)的色素沉积皮肤模型、和将PUVA处理的色素沉积皮肤模型的表皮模型转移到PUVA未处理的真皮模型上进行了培养的表皮模型(替换)制作切片,使用TRP2抗体将表皮模型切片的活化黑素细胞染色,和通过苏木精染色法将核进行了染色(图11(A))。从图11(A)的图像将活化黑素细胞的比例定量化,结果在PUVA处理的色素沉积皮肤模型中活化黑素细胞数的比例最高,与此相对,在替换条件的色素沉积皮肤模型中显示出活化黑素细胞数减少(图11(B))。
符号的说明
1、1a 色素沉积皮肤模型
10 第1真皮模型
100 第1细胞群
11 第1细胞培养基材
110 第1多孔膜
12 第1细胞培养容器
13 第1培养基
14 第2培养基
10a 第2真皮模型
100a 第3细胞群
11a 第3细胞培养基材
110a 第3多孔膜
20 表皮模型
200 第2细胞群
21 第2细胞培养基材
210 第2多孔膜
22 第2细胞培养容器
23 第3培养基
24 第4培养基
RD 光照射
FB 成纤维细胞
bFB 受到由光照射引起的损伤的成纤维细胞
KC 角质形成细胞
MC 黑素细胞。
Claims (21)
1.一种色素沉积皮肤模型,包含:
被接种于第1细胞培养基材上的、包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群;以及
被应用于所述第1细胞群上的、包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群。
2.根据权利要求1所述的色素沉积皮肤模型,所述通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞是在光敏剂的存在下通过紫外光的照射而造成了损伤的成纤维细胞。
3.根据权利要求2所述的色素沉积皮肤模型,所述光敏剂选自补骨脂素、NAD、核黄素、色氨酸、叶酸、卟啉、亚甲蓝、被硫醇基保护了的金纳米簇AUxSRy。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的色素沉积皮肤模型,所述光照射为UVA的光照射。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的色素沉积皮肤模型,所述第2细胞群是被接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材上的第2细胞群。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的色素沉积皮肤模型,所述第1细胞培养基材是具有多孔膜的细胞培养基材。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的色素沉积皮肤模型,所述第1细胞群是与水凝胶形成剂一起接种而得的第1细胞群。
8.根据权利要求7所述的色素沉积皮肤模型,所述水凝胶形成剂选自胶原、明胶、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、纤维素、果胶、淀粉、层粘连蛋白、血纤蛋白原/凝血酶、原纤蛋白、弹性蛋白、树胶、纤维素、琼脂、谷蛋白、酪蛋白、白蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白即entactin/nidogen、糖蛋白、糖胺聚糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、Matrigel以及它们的组合。
9.一种色素沉积皮肤模型的制造方法,包括:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群进行培养;
工序(2),将在所述工序(1)中获得的第1细胞群在第1细胞培养基材上进行培养;以及
工序(3),在所述工序(2)中获得的第1细胞群上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群,进行培养。
10.根据权利要求9所述的方法,所述通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞是在光敏剂的存在下通过紫外光的照射而造成了损伤的成纤维细胞。
11.根据权利要求10所述的方法,所述光敏剂选自补骨脂素、NAD、核黄素、色氨酸、叶酸、卟啉、亚甲蓝、被硫醇基保护了的金纳米簇AUxSRy。
12.根据权利要求9~11中任一项所述的方法,所述光照射为UVA的光照射。
13.根据权利要求9~12中任一项所述的方法,所述第2细胞群是被接种于具有多孔膜的第2细胞培养基材上的第2细胞群。
14.根据权利要求9~13中任一项所述的方法,所述第1细胞培养基材是具有多孔膜的细胞培养基材。
15.根据权利要求9~14中任一项所述的方法,所述第1细胞群是与水凝胶形成剂一起接种而得的第1细胞群。
16.根据权利要求15所述的方法,所述水凝胶形成剂选自胶原、明胶、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、纤维素、果胶、淀粉、层粘连蛋白、血纤蛋白原/凝血酶、原纤蛋白、弹性蛋白、树胶、纤维素、琼脂、谷蛋白、酪蛋白、白蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白即entactin/nidogen、糖蛋白、糖胺聚糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、Matrigel以及它们的组合。
17.根据权利要求9~16中任一项所述的方法,所述工序(2)在抗坏血酸、抗坏血酸衍生物或它们的盐的存在下实施。
18.一种色素沉积皮肤模型,其通过权利要求9~17中任一项所述的方法而获得。
19.一种用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法,包括:
工序(1),对权利要求1~8和权利要求18中任一项所述的色素沉积皮肤模型应用候选因子,进行培养,
工序(2),以所述色素沉积皮肤模型中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对所述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
20.一种用于治疗或预防皮肤的色素沉积的因子的评价方法,包括:
工序(1),将包含通过光照射而造成了损伤的成纤维细胞的第1细胞群进行培养,
工序(2),将在所述工序(1)中获得的第1细胞群在第1细胞培养基材上进行培养,
工序(3),在所述工序(2)中获得的第1细胞群上,应用包含黑素细胞和角质形成细胞的第2细胞群,进行培养,
工序(4),在包含候选因子的基材上,应用在所述工序(3)中获得的所述第2细胞群,将所得的色素沉积皮肤模型进行培养,
工序(5),以所述色素沉积皮肤模型中的色素产生和/或色素沉积的程度作为指标,对所述候选因子的治疗或预防效果进行评价。
21.根据权利要求20所述的方法,所述候选因子是成纤维细胞。
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