CN113156023A - 一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)纯度的检测方法 - Google Patents
一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)纯度的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种针对5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐(5‑ALA)纯度的检测方法,方法信息及相关步骤包括:流动相A(MPA)为0.2%七氟丁酸水溶液,流动相B(MPB)为0.2%七氟丁酸乙腈溶液;色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离;样品溶剂制备:选用水/乙腈=95/5作为样品溶剂,此溶剂亦作为空白溶液;系统适用性溶液制备:将100mg的5‑ALA系统适用性对照品和5ml样品溶剂混合均匀,并用样品溶剂稀释至刻度;样品溶液制备:用样品替代5‑ALA系统适用性对照品同样条件配制,后续按进样序列注入高效液相色谱仪,测定265nm波长下溶液的色谱图。通过上述方式,本发明方法相较于现有USP方法具有主成分保留强、色谱峰形好、检测精准性更高的优势,更加适用于此化合物的纯度分析。
Description
技术领域
本发明涉及色谱分析技术领域,特别是涉及一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法。
背景技术
小分子化合物5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)是四氢吡咯的前缀化合物,为生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质,广泛应用于农业领域,同时在医学药物、饲料行业、化妆品行业和有机合成中间体等方面均有重要应用,针对上述小分子氨基酸纯度分析而言,现有技术中常规的分析方法为薄层色谱法、柱前/柱后衍生化法,在某些特定情况下也有直接使用高效液相色谱法。
薄层色谱(TLC)法操作方便,显色容易,且展开速度快,但是TLC方法的专属性差,有关物质往往不能完全分离,难以搭配其他手段进行定性定量,同时TLC方法灵敏度低,分析浓度的0.1%无法检出。
衍生化法包括柱前衍生化和柱后衍生化两种,对于柱前衍生化法,目前市面上有商品化的衍生化实际包供应,如Agilent和Waters的OPA(邻苯二甲醛)、FMOC(氯甲酸芴甲酯)衍生化套装,在进行分析实验时,可采用高效液相色谱仪的自动进样程序,将配制好的氨基酸溶液和衍生化试剂包进行反应,之后使用常规的C18分析柱搭配紫外检测器进行分离分析,为直接使用普通的HPLC对氨基酸进行分析提供了极大便利,但是这类衍生化后分析的方法中紫外检测器为通用型检测器,衍生化试剂在色谱图中存在较大相应,可能会掩盖有关物质的检出,因此该方法主要适用于含量分析;柱后衍生化方法一般为氨基酸在离子交换色谱进行分离后,再进行衍生化(通常为茚三酮)后进行检测,氨基酸分析仪即采用该原理,可对多种氨基酸进行分析,是相对比较成熟的一套方法体系,但是同柱前衍生化的弊端一致,柱后衍生化法仍是比较适用于含量分析,在执行纯度分析时会有衍生化试剂干扰的问题。
对于化合物5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA),美国药典(USP)直接采用的高效液相色谱法进行分析,其对典型样品的分析结果如下表所示:
此种直接使用高效液相色谱法对小分子氨基酸进行有关物质测定,会存在一个较大的隐患问题,鉴于氨基酸为两性离子型化合物,在常规色谱柱可耐受的pH范围内,往往存在两种构型,很可能在色谱图上体现为可相互转化的两支峰,为分析带来难度;另一方面,具备合适的保留因子K(通常为1-20)是分析方法开发的一个基本要求,针对5-ALA,此种USP方法对该化合物几乎无保留,保留因子仅为1.0,因此无法保证检测方法的专属性。
鉴于以上调研和检索,亟待开发一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,解决上述问题,提供有更加有效和针对性的检测技术。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,能够有效避免因引入衍生化试剂导致的色谱干扰问题,同时不存在USP方法下产品无保留的局限性,本发明方法主成分保留强,色谱峰形好,实用性和检测精准性更高。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,方法信息及相关步骤包括:流动相A(MPA)为0.2%七氟丁酸水溶液,流动相B(MPB)为0.2%七氟丁酸乙腈溶液;色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离;样品溶剂制备:选用水/乙腈=95/5作为样品溶剂,此溶剂亦作为空白溶液;系统适用性溶液制备:将100mg的5-ALA系统适用性对照品和5ml样品溶剂混合均匀,并用样品溶剂稀释至刻度;样品溶液制备:将100mg的样品和5ml样品溶剂混合均匀,并用样品溶剂稀释至同样刻度;后续按照空白溶液、系统适用性溶液、样品溶液的进样序列注入高效液相色谱仪,测定265nm波长下溶液的色谱图,其中样品中各个组分的面积百分比按照下列公式计算:
其中:A(i):样品溶液中组分(i)的峰面积;Atotal:样品溶液中峰面积的和。
优选的,所述高效液相色谱仪的色谱柱选用Waters Xselect CSH C18,3.5μm,150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱,流速为1.0ml/min,进样体积为20ul。
优选的,所述高效液相色谱仪的检测器选用测定265nm检测波长的DAD或者UV检测器,柱温选用30℃,样品温度为5℃,样品运行时间为25min,样品溶剂为水/乙腈=95/5,洗针为乙腈。
优选的,所述高效液相色谱仪的色谱条件选用梯度洗脱程序,洗脱程序见下表所示,
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 95 | 5 |
4 | 95 | 5 |
12 | 70 | 30 |
13 | 95 | 5 |
25 | 95 | 5 |
。
优选的,所述流动相A(MPA)的获得方式为,将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml水的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气;流动相B(MPB)的获得方式为,将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml乙腈的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气。
优选的,所述七氟丁酸选用液相色谱级别、Adamas或等同;所述乙腈选用液相色谱级别、Scharlau或等同;所述水选用超纯水或等同。
优选的,所述系统适用性溶液制备前需进行系统适用性检查。
优选的,所述系统适用性检查方法为,如果系统适用性溶液的色谱图达到以下表的色谱性能要求,证明高效液相系统适用于分析
本发明的有益效果是:
本发明提供的离子对色谱法用于分析5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度,可有效避免因引入衍生化试剂导致的色谱干扰问题,且不存在在USP(美国药典)方法下产品无保留的问题,相较于现行的USP(美国药典)方法,本发明测试方法测试的5-ALA和各已知杂质的分离均较好,色谱峰形好,专属性佳,适用性和精准性更强,具有非常好的技术价值和市场空间。
附图说明
图1是本发明获得的空白溶液全尺寸色谱图;
图2是本发明获得的系统适用性溶液全尺寸色谱图;
图3是图2的放大图,用于更清楚的体现峰形;
图4是本发明获得的样品溶液全尺寸色谱图;
图5是图4的放大图,用于更清楚的体现峰形;
图6是背景技术中通过USP(美国药典)方法测得的5-ALA的全尺寸纯度图谱;
图7是图6的放大图,用于更清楚的体现峰形。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例:
一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,方法信息及相关步骤包括:
以0.2%七氟丁酸水溶液作为流动相A(MPA),以0.2%七氟丁酸乙腈溶液作为流动相B(MPB),其中流动相A(MPA)的获得方式为:将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml水的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气;流动相B(MPB)的获得方式为:将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml乙腈的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气;配制流动相A(MPA)和流动相B(MPB)所使用的七氟丁酸选用液相色谱级别、Adamas或等同,乙腈选用液相色谱级别、Scharlau或等同,水选用超纯水或等同。
关于色谱条件如下所示:
色谱柱:采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离,具体为Waters XselectCSH C18,3.5μm particle size,150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱;
流速:1.0mL/min;
进样体积:20μL;
检测器:检测器选用测定265nm检测波长的DAD或者UV检测器;
样品溶剂:水/乙腈=95/5;
样品温度:5℃;
柱温:30℃;
样品运行时间:25min;
洗针:乙腈。
制备样品溶剂:选用水/乙腈=95/5作为样品溶剂,此溶剂亦作为空白溶液;
制备系统适用性溶液:系统适用性溶液在制备前需进行系统适用性检查,系统适用性检查方法为,如果系统适用性溶液的色谱图达到以下的色谱性能要求,证明高效液相系统适用于分析
称取100mg的5-ALA系统适用性对照品于10ml容量瓶内,加入5ml样品溶剂溶解,并用样品溶剂稀释至刻度,混合均匀,其中样品溶剂同样为水/乙腈=95/5。
制备样品溶液:称取100mg的样品于10ml容量瓶内,加入5ml样品溶剂溶解,并用样品溶剂稀释至同样刻度,混合均匀,其中样品溶剂同样为水/乙腈=95/5。
后续按照空白溶液、系统适用性溶液、样品溶液的进样序列注入高效液相色谱仪,测定265nm波长下溶液的色谱图,其中样品中各个组分的面积百分比按照下列公式计算:
其中:A(i):样品溶液中组分(i)的峰面积;Atotal:样品溶液中峰面积的和。
高效液相色谱仪的色谱条件选用梯度洗脱程序,洗脱程序见下表,
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 95 | 5 |
4 | 95 | 5 |
12 | 70 | 30 |
13 | 95 | 5 |
25 | 95 | 5 |
。
根据上述检测方法获得的空白溶液色谱图如图1所示,获得的系统适用性溶液色谱图如图2和图3所示,获得的样品溶液色谱图如图4和图5所示,纯度结果如下表1所示:
表1样品溶液的纯度测试结果
为了更直观的体现本发明的技术优势,本发明还提供了同样条件下通过USP(美国药典)方法下获得的样品溶液纯度图谱,如图6和图7所示,通过比较两种方法下测试的纯度图谱结果可明显看出:本发明方法在主峰前可比通过USP方法多分出一支杂质峰,主成分保留强,且本发明方法里5-ALA和各已知杂质的分离均较好,色谱峰形好,专属性佳,适用性和精准性更强,而现行的USP(美国药典)方法下主成分在死时间出峰(即保留因子小),这样的情形可能会导致杂质峰与主峰供洗脱,则会产生专属性问题。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于,方法信息及相关步骤包括:流动相A(MPA)为0.2%七氟丁酸水溶液,流动相B(MPB)为0.2%七氟丁酸乙腈溶液;色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离;样品溶剂制备:选用水/乙腈=95/5作为样品溶剂,此溶剂亦作为空白溶液;系统适用性溶液制备:将100mg的5-ALA系统适用性对照品和5ml样品溶剂混合均匀,并用样品溶剂稀释至刻度;样品溶液制备:将100mg的样品和5ml样品溶剂混合均匀,并用样品溶剂稀释至同样刻度;后续按照空白溶液、系统适用性溶液、样品溶液的进样序列注入高效液相色谱仪,测定265nm波长下溶液的色谱图,其中样品中各个组分的面积百分比按照下列公式计算:
其中:A(i):样品溶液中组分(i)的峰面积;Atotal:样品溶液中峰面积的和。
2.根据权利要求1所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪的色谱柱具体选用Waters Xselect CSH C18,3.5μm,150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱,流速为1.0ml/min,进样体积为20ul。
3.根据权利要求2所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪的检测器选用测定265nm检测波长的DAD或者UV检测器,柱温选用30℃,样品温度为5℃,样品运行时间为25min,样品溶剂为水/乙腈=95/5,洗针为乙腈。
4.根据权利要求1所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪的色谱条件选用梯度洗脱程序,洗脱程序见下表所示,
。
5.根据权利要求4所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述流动相A(MPA)的获得方式为,将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml水的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气;流动相B(MPB)的获得方式为,将2ml七氟丁酸加入到含有1000ml乙腈的溶剂瓶内,混合均匀,使用前进行超声脱气。
6.根据权利要求5所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述七氟丁酸选用液相色谱级别;所述乙腈选用液相色谱级别;所述水选用超纯水或等同。
7.根据权利要求1所述的一种针对5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)纯度的检测方法,其特征在于:所述系统适用性溶液制备前需进行系统适用性检查。
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WO2020247819A2 (en) * | 2019-06-07 | 2020-12-10 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment with aminolevulinic acid synthase 2 (alas2) modulators |
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WO2020247819A2 (en) * | 2019-06-07 | 2020-12-10 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment with aminolevulinic acid synthase 2 (alas2) modulators |
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