CN113150072B - 一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽及其编码序列和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽及其编码序列和应用。本发明提供了一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽，其特征在于，所述信号肽为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明通过分子生物学手段，确定AtRNH1C蛋白中第69‑77位的氨基酸序列抑制了其自身线粒体的定位能力。

Description

一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽及其编码序列和 应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种调节蛋白在细胞器中精细定位的信号肽及其编码序列和应用。

背景技术

R-loop是一种三链核酸结构，由RNA-DNA杂合链和另一条单链DNA组成。全基因组分析表明，R-loop在各个物种的基因组中均存在(Crossley等，2019；Garcia-Muse和Aguilera，2019)，这种常见的染色质特征参与许多生理过程，例如基因表达、DNA复制、组蛋白修饰、DNA损伤修复和基因组稳定性维持等(Costantino和Koshland，2015年；Crossley等，2019年；Garcia-Muse和Aguilera，2019年)。因此，R-loop的形成和消除应受到严格调控。

R-loop形成受多因素影响，例如特定的DNA序列，DNA拓扑结构和调控蛋白等。同样也有许多因素限制了R-loop的形成，如核糖核酸酶、解旋酶、拓扑异构酶、降解体和RNA结合及加工因子(综述于Hegazy等，2020；Crossley等，2019；Santos-Pereira和Aguilera，2015；Silva等，2018)。在引起R-loop变化的因子中，进化保守的RNase H(H1和H2)可以特异性消化RNA-DNA杂合链中的RNA单链，从而直接从基因组中去除R-loop(Cerritelli和Crouch，2009)。

哺乳动物RNase H1双重定位于细胞核和线粒体。人的RNase H1的功能丧失会导致严重疾病，小鼠RNase H1的组成型敲除会导致胚胎致死(Lima等，2016；Reyes等，2015)。进一步的研究发现，RNase H1对于哺乳动物的线粒体DNA(mtDNA)复制至关重要(综述于Akman等，2016；Holt，2019)。

在拟南芥中，有3个RNase H1，分别是AtRNH1A、AtRNH1B和AtRNH1C，它们分别位于细胞核、线粒体和叶绿体中(Yang等，2017)。其中，叶绿体定位的AtRNH1C对于叶绿体基因组稳定性是必不可少的(Yang等，2017)。但是，拟南芥中其他两个RNase H1蛋白的生物学功能仍不清楚。

线粒体和叶绿体是内共生细胞器，它们在植物代谢、细胞稳态和环境感知中起着重要作用。绝大多数线粒体和叶绿体蛋白都在细胞核中编码，通过信号肽运输途径进入相应的细胞器(Schmidt等，2010；Wiedemann and Pfanner，2017)。在此途径中，具有N端信号肽的前体蛋白在细胞质中被生物合成，并将蛋白引导至正确的细胞器/隔室中。线粒体和叶绿体自己的基因组编码其活动所需的有限的一组蛋白质。因此，核基因组和细胞器基因组之间的紧密协调对于生物发挥完整功能至关重要。

植物信号肽的研究主要集中在小分子肽。小分子肽作为胞间通讯的关键成分，主要参与信号干扰、反应途径、显示抗菌活性，并以配体的形式与细胞膜表面的受体激酶相互作用，从而实现细胞之间的信号交流。小分子肽是重要的胞间信号感应分子,在植物的不同器官组织、发育阶段主要参与调节植物的生长发育过程和应答生物和非生物胁迫的应激反应，以协调和整合细胞功能。

与哺乳动物紧凑的环状线粒体DNA(mtDNA)不同，植物线粒体的基因组较大(范围187～2400kb，取决于物种)且更为复杂，由圆形、线性和多支双链和单链分子等异质种群构成(Gualberto和Newton，2017年)。这种复杂性是重复序列之间频繁同源重组(homologousrecombination，HR)的结果，并且同源重组效率取决于同源序列的长度(Arrieta-Montiel等，2009；Gualberto和Newton，2017；Jaime I Davila1，2011)。长重复序列(>1kb)进行高频重组以产生同种亚型，该类型可能参与了重组介导的复制(Backert等，1996；Morley等，2019)。相比之下，中等大小重复序列(intermediate-sized repeats，简称为IRs，50-500bp)之间的同源重组很少且不对称，并且两个预测DNA交换产物的其中之一会优先积累(Arrieta-Montiel等，2009；Gualberto和Newton，2017；Jaime I Davila1，2011年)。由于重组活动会导致线粒体DNA重排和基因组不稳定，从而影响植物的适应性和存活，因此IRs之间的HR会受到HR监控途径严格控制。但是到目前为止，仅拟南芥中鉴定到该途径中的几个基因，例如MUTS HOMOLOG1 MSH1(Arrieta-Montiel等，2009；Sun，2011)、ORGANELLARSINGLE-STRANDED PROTEIN1 OSB1、(Zaegel等，2006)、RecA同源基因RECA2和RECA3(Miller-Messmer等，2012)、RECG1(Wallet等，2015)和SWI/SNF复合体B SWIB5(Blomme等，2017)。以上基因突变后IR间异位HR频率增加，但是精确的调控机制仍不清楚。

虽然现有技术中已经鉴定出100多种双重靶向蛋白(Carrie和Small，2013年)，但还未见根据细胞条件变化而发生的蛋白定位变化的相关研究。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种调节蛋白在细胞器中精细定位的信号肽。

用于解决问题的方案

本发明在第一方面提供了一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽，其特征在于，所述信号肽为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。

在优选的实施方案中，所述信号肽能够抑制来源于拟南芥的AtRNH1C蛋白定位到其自身线粒体中。

本发明在第二方面提供了一种编码本发明在第一方面中所述的信号肽的基因序列，其特征在于，所述基因序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其互补序列。

本发明在第三方面提供了一种含有本发明在第一方面中所述的信号肽的重组融合蛋白。

本发明在第四方面提供了一种含有本发明在第二方面所述的基因序列的重组表达载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。

本发明在第五方面提供了一种发明在第一方面中所述的信号肽在将目标蛋白定位于线粒体中的应用。

在优选的实施方案中，所述目标蛋白为来源于拟南芥的AtRNH1C蛋白。

本发明在第六方面提供一种将目标蛋白定位于线粒体中的方法，其特征在于，将SEQ ID NO：1所示的多肽从拟南芥的AtRNH1C蛋白中敲除。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明人通过大量实验发现，在功能性AtRNH1B存在的前提下，AtRNH1C的线粒体定位通常被完全抑制，但在AtRNH1B缺失时其亚细胞定位发生了变化，这表明AtRNH1C不是经典的双重靶向蛋白。

(2)AtRNH1C的双重定位不是由于其表达量增加所致，因为在Col-0中过表达AtRNH1C时，它仅定位于叶绿体。

(3)通过分子生物学手段，确定AtRNH1C蛋白中第69-77位的氨基酸序列抑制了其自身线粒体的定位能力。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1示出了突变体atrnh1b-1和突变体atrnh1b-2的结构示意图。

图2A和图2B分别示出了AtRNH1B在两个突变体atrnh1b-1、atrnh1b-2和野生型Col-0中的表达情况，其中所示P1、P2、P3和P4为扩增目标片段的引物。

图3A和图3B分别示出了突变体atrnh1b-1、atrnh1b-2和野生型Col-0的在不同时间的表型。

图4A示出了透视电子显微镜下单突变体atrnh1b-1和双突变体atrnh1b/c种子中线粒体的超微结构，其中a-b为单突变体atrnh1b-1的超微结构，c-g是双突变体atrnh1b/c的超微结构；图4B示出了透视电子显微镜下野生型Col-0和突变体atrnh1c种子中线粒体的超微结构。

图5示出了AtRNH1C在缺少AtRNH1B的情况下，野生型Col-0、单突变体atrnh1b-1、atrnh1b-2和atrnh1c的亚细胞定位。

图6示出了线粒体定位的AtRNH1C-GFP融合蛋白在突变体atrnh1b-1和突变体atrnh1c中的亚细胞定位。

图7A示出了重组融合蛋白CTS^1C-GFP、CTS^1C-AtRNH1C-GFP、AtRNH1CΔCTS-GFP在野生型Col-0原生质体中的亚细胞定位；图7B示出了融合蛋白MTS^1B-GFP和融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C-GFP在野生型Col-0原生质体中的亚细胞定位。

图8示出了AtRNH1B(靠上位置的序列)和AtRNH1C(靠下位置的序列)的序列同源性分析结果，它们之间的同源性为77％。

图9示出了重组融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C(Δ163-183aa)-GFP在野生型Col-0原生质体中的亚细胞定位。

图10示出了重组融合蛋白CTS^1C-AtRNH1C-GFP、MTS^1B-AtRNH1 C(Δ69-77aa)-GFP和CST^1C-AtRNH1 C(Δ69-77aa)-GFP在野生型Col-0原生质体中的亚细胞定位。

具体实施方式

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

相关实验方法

1.植物材料及生长条件

拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0(Columbia-0)和T-DNA插入突变体atrnh1b-1(SALK_141349)、atrnh1b-2(SALK_020028)、atrnh1c(SAIL_97_E11)的种子均购自英国诺丁汉拟南芥种子储存中心。上述突变体atrnh1b-1为在AtRNH1B的第二个外显子有T-DNA插入的突变体，上述突变体atrnh1b-2为在AtRNH1B的第六个内含子有T-DNA插入的突变体，所述突变体atrnh1b-1和突变体atrnh1b-2的结构示意图参见图1。图1中所示P1、P2、P3和P4为扩增目标片段的引物，所述引物的序列如下：

P1：GTGCTACCTATAATGAACCGC(SEQ ID NO：4)

P2：GGAAGTTGATCCTGGAAGAGAC(SEQ ID NO：5)

P3：TGGAAGGTAAACCACGAGGTACTC(SEQ ID NO：6)

P4：CAACTTCTCCTTCAGAAAGACGAG(SEQ ID NO：7)

将所述突变体atrnh1c与突变体atrnh1b-1杂交以生成双突变体，下文称为atrnh1b/c。

将经过表面灭菌的种子播种在1/2MS培养基(Murashige和Skoog盐碱；Sigma)上，所述1/2MS培养基中包含Phytagel(0.25％，w/v)并且补充了1％(w/v)蔗糖，并在4℃处理2天后将植物放在22℃的长日照条件下以16小时光照/8小时黑暗的周期生长。

2.载体构建

通过将基因的编码序列克隆到含有35S启动子和eGFP标签的pUC19载体中，构建用于原生质体转化的质粒。使用快速克隆方法构建载体(Li等，2011)，引物列表参见表1。

表1引物序列

引物名称	引物序列
		RH1C-I-RP	cttgctcacttcgaaCGCCACCTCAACTTC(SEQ ID NO：8)
RH1C-I-FP	ctcggtaccctcgagATGAACTGTCTGTCTC(SEQ ID NO：9)
		pUC19-LP	ctcgagggtaccgagctcgt(SEQ ID NO：10)
CTS-F(35S)	ctcggtaccctcgagATGAACTGTCTGTCTCATGC(SEQ ID NO：11)
		CTS-R(eGFP)	cttgctcacttcgaaCTTTGATTTAACAGCCTTTG(SEQ ID NO：12)
pUC19-GFP-RP	ttcgaagtgagcaagggcgag(SEQ ID NO：13)
		MTS-RH1C(-69_77)-LP	TATCCATCTTTGATTTAGCAGTCT(SEQ ID NO：14)
MTS-RH1C(-69_77a)-RP	GATGGATAAAGAAAAGGACGCCTT(SEQ ID NO：15)
		RH1C(-163_183a)-LP	CATCCTGGAAAAGACATGGTGTAAG(SEQ ID NO：16)
RH1C(-163_183)-RP	CCAGGATGACAAAAAAGATCAACT(SEQ ID NO：17)

载体构建方法：首先需要从拟南芥基因组DNA或者cDNA上进行PCR扩增需要连接的片段，PCR产物经过凝胶电泳后切胶，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒(Magen)的步骤进行PCR产物胶回收。后续需要做原生质体转化的载体用pUC19。原始载体所在的菌液培养好后按照质粒小提试剂盒说明书进行回收(Magen)。PCR产物和原始载体质粒用相应的限制性内切酶酶切完成切胶回收后，按照摩尔比3:1混匀加入T4连接酶和buffer，室温反应30min后进行大肠杆菌转化。成功转化后在相应的抗性固体LB培养基上，倒置在37℃培养箱中过夜培养。挑取正确的单克隆送测序，将正确的质粒提取出来备用。

原生质体转化方法：原生质体的操作过程中，需将吸头口剪宽，操作要轻柔。原生质体尽量注意避光。

1.拟南芥原生质转化所需试剂(Yoo et al.,2007)

1)原生质体酶解液：20mM MES(pH 5.7)，1.5％(质量/体积)纤维素酶R10，0.4％(质量/体积)离析酶R10，0.4M甘露醇，20mM KCl，10mM CaCl₂，3mM2-巯基乙醇和0.1％BSA。

2)WI溶液：4mM MES(pH 5.7)，0.5M甘露醇和20mM KCl。

3)W5溶液：2mM MES(pH 5.7)，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mM KCl。

4)MMG溶液：4mM MES(pH 5.7)，0.4M甘露醇和15mM MgCl₂。

5)PEG-Ca溶液：40％(质量/体积)PEG4000，0.2M甘露醇，100mM CaCl₂。

2.原生质体的准备

1)取已在植物温室中生长约4周苗子的叶片30片，用手术刀片切成约0.5mm的细丝，浸润在10mL酶解液中，于室温静置消化约2-4hr。

2)向酶解液中加入等体积的W5溶液，充分混匀后，使原生质体充分从组织中游离出来。然后用40μM细胞滤器过滤后，100g离心2min，弃掉上清。

3)用20mL的W5溶液将原生质体悬起，置于冰上20-30min，使原生质体受重力沉降在管底。

4)用5mL枪将上清充分吸出，然后将原生质体悬在约3-5mL MMG溶液中。

3.原生质体的转化

1)将10μL大提的质粒(约10-20μg)与100μL的原生质体充分混匀，然后加入110μLPEG-Ca溶液，充分混匀后，室温静置15min。

2)然后加入1mL W5溶液终止转化反应。100g离心1min，弃掉上清。

3)再加入1mL的WI溶液，将转化了的原生质体悬起，放在室温过夜培养。

原生质体可以用于荧光显微镜观测，或裂解后做蛋白质检测等后续实验。

4.荧光显微镜观测

如先前研究所述进行原生质体转化(Yoo等，2007)。简而言之，从4周龄植物的叶子中提取原生质体，并通过20％PEG-Ca介导转化。瞬时表达14小时后，在共聚焦显微镜(ZeissLSM780)下检测GFP荧光和叶绿素自发荧光。线粒体用MitoTracker Red CMXRos(ThermoFisher，Cat。No.M7512)染料染色。

实施例1：AtRNH1C和AtRNH1B在线粒体中的功能研究

试验方法：(1)提取T-DNA插入突变体atrnh1b-1(SALK_141349)、atrnh1b-2(SALK_020028)和野生型Col-0的RNA。取出提取的RNA至少2μg，加入1μl DNase I(TURBO DNA-freeKit，Ambion)，1×TURBO DNase buffer，加入DEPC-H2O至50μl，37℃反应2h。反应结束后，为了去除DNase I，加入5μl DNase Inactivation Reagent，室温孵育5min，再回收DNase I处理完成后的RNA溶液；按照SuperScript^TMIII First-Strand Synthesis System(Invitrogen,18080051)提供的步骤进行反转录，并将反转录得到的DNA进行扩增后跑胶检测。(2)在不同时间点对野生型Col-0、突变体atrnh1b-1和突变体atrnh1b-2的表型进行观察和记录。(3)固定染色切片并用透射电镜对单突变体atrnh1b-1、单突变体atrnh1c、双突变体atrnh1b/c和野生型Col-0的线粒体超微结构进行观察。

试验结果：1)RT-PCR分析表明尽管AtRNH1B在两个突变体atrnh1b-1和atrnh1b-2中均不表达(参见图2A和图2B)，但突变体atrnh1b-1、atrnh1b-2和野生型Col-0在表型上相同(参见图3A和图3B)。

2)通过透射电子显微镜观察了线粒体的超微结构。如图4A和图4B所示，与来自野生型Col-0和单个突变体atrnh1b-1的胚胎相比，双突变体atrnh1b/c胚胎中的线粒体脊破碎或基本上消失了，超微结构严重破坏(具体参见图4A和4B)。

结论：拟南芥突变体atrnh1b(包括atrnh1b-1和atrnh1b-2)与野生型植株表型类似，而atrnh1b/c双突变体却胚胎发育致死，这说明AtRNH1C和AtRNH1B在线粒体中是功能冗余的。AtRNH1B和AtRNH1C的双重缺失会在早期胚胎发生过程中严重影响线粒体功能，从而导致atrnh1b/c胚胎在转化期间停滞并导致瘪籽。

实施例2：叶绿体定位的AtRNH1C补偿线粒体中AtRNH1B的缺失

之前研究发现AtRNH1C定位于叶绿体(Yang等，2017)。在上述研究的基础上，结合实施例1的结果，通过以下试验进一步研究叶绿体定位的AtRNH1C如何补偿线粒体中AtRNH1B的缺失。

试验方法：使用激光共聚焦显微镜ZEISS 780观察AtRNH1B缺失后AtRNH1C的亚细胞定位模式，通过瞬时原生质体瞬时转化和构建稳定转基因植物的方式，比较了野生型Col-0和两个atrnh1b突变体中AtRNH1C的定位。

其中，原生质体瞬间转化的具体操作如下：

将需要转化的质粒构建完成后，使用的农杆菌感受态细胞GV3101，具体的转化步骤包括：

1)从-80℃超低温冰箱取出农杆菌感受态GV3101 100μl，放在冰面，待感受态细胞融化后加入500ng质粒混匀，插入冰中待10min；

2)放入液氮中冷却1min，取出放入37℃水浴锅中融化细胞；

3)重复步骤2)一次，将融化后的细胞插入冰中冷却1min，加入800μl无抗LB液体培养基，放在28℃摇床上培养2-4h；

4)8000g离心30s，吸掉700μl上清，用剩下的100μl LB悬浮菌体，吸出并涂在Kana+Rif的LB固体培养基上，倒置在28℃培养箱中培养2天。

上述农杆菌转化成功后，便可以通过植物花序侵染进行转基因.

构建稳定的转基因植物的具体方法如下：

1)挑取农杆菌单克隆放入50ml Kana+Rif的液体LB中放在28℃摇床上培养待培养液变浑浊；

2)吸取1ml农杆菌液到新配置的100ml Kana+Rif的液体LB中，28℃培养约12h至液体呈橘红色，离心收集菌体；

3)用含有0.01％Silwet的5％蔗糖溶液悬浮菌体，调整OD₆₀₀值为1.0-1.2备用；

4)将需要做侵染的植物摘掉果荚和已盛开的花，尽量留下还未开花的花骨朵，将花序浸没在上述备好的蔗糖-菌液中2min，然后置于黑暗处24h；

5)一周之后再做一次花序侵染。之后按常规方法培养植物，收取T1代种子，用含有相应抗性的1/2MS培养基筛选阳性苗。

试验结果：在野生型Col-0中，AtRNH1C主要定位在叶绿体中。但是，在atrnh1b突变体中，可以明显观察到AtRNH1C-GFP与线粒体共定位(具体参见图5中的A)。稳定转基因植物中观察到同样的现象。在atrnh1c突变体中未观察到线粒体定位的AtRNH1C-GFP(具体参见图5中B和图6)。

结论：AtRNH1C只有在缺少AtRNH1B蛋白的情况下，才能定位于线粒体中。

实施例3：AtRNH1C在叶绿体和线粒体中的双重定位能力机理的研究

在实施例2所述结论的基础上，进一步研究AtRNH1C只有在缺少AtRNH1B蛋白的情况下才能定位于线粒体的机理。

试验方法：(1)制备融合蛋白CTS^1C-GFP、CTS^1C-AtRNH1C-GFP、AtRNH1CΔCTS-GFP；(2)通过原生质体瞬时转化实验观察融合蛋白在原生质体中的定位。

试验结果：AtRNH1C的叶绿体靶向信号CTS^1C与GFP的融合蛋白CTS^1C-GFP可以定位于野生型Col-0原生质体中的线粒体和叶绿体中，而与GFP融合的全长AtRNH1C蛋白即CTS^1C-AtRNH1C-GFP主要定位于叶绿体，没有CTS的AtRNH1C即AtRNH1CΔCTS-GFP不具有细胞器定位能力(具体参见图7A)。

结论：AtRNH1C中可能存在抑制CTS^1C线粒体定位的信号。

在上述试验的基础上，进一步进行以下试验：

试验方法：制备AtRNH1B的线粒体靶向信号MTS^1B与GFP的融合蛋白MTS^1B-GFP；用AtRNH1B的线粒体靶向信号MTS^1B替换AtRNH1C的叶绿体靶向信号CTS^1C，得到相应的融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C-GFP；通过原生质体瞬时转化实验观察上述融合蛋白在原生质体中的定位。

试验结果：融合蛋白MTS^1B-GFP本身主要定位于线粒体，当CTS^1C被AtRNH1B的线粒体靶向信号MTS^1B替代时，MTS^1B-AtRNH1C-GFP主要定位于叶绿体(具体参见图7B)。

结论：结合图7B中所示的结果，进一步验证了AtRNH1C中存在抑制CTS^1C线粒体定位的信号，该信号能够影响AtRNH1C定位到线粒体的能力。

实施例4：抑制AtRNH1C进入线粒体的信号肽

试验方法：为了找到抑制AtRNH1C进入线粒体的关键信号，分别删除了实施例3中所述融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C-GFP中第69-77位(氨基酸序列为LSSTVVSAV，以下称为SEQ IDNO：1)和第163-183位(氨基酸序列为EPAPCTVKVSEDETTSETKSK，以下称为SEQ ID NO：2)的两个蛋白序列，分别得到了重组融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C(Δ69-77aa)-GFP和MTS^1B-AtRNH1C(Δ163-183aa)-GFP。原因是这两个序列在AtRNH1B和AtRNH1C间不保守(具体参见图8)。通过原生质体瞬时转化实验观察上述两个重组融合蛋白在野生型Col-0的原生质体中的定位。

试验结果：当删除163-183aa时，重组融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C(Δ163-183aa)-GFP仍然定位于叶绿体(具体参见图9)。但当删除69-77aa时，重组融合蛋白MTS^1B-AtRNH1C(Δ69-77aa)-GFP主要定位于线粒体中(参见图10)。

结论：以上结果表明AtRNH1C蛋白内部的第69-77位的氨基酸序列(即SEQ ID NO：1)抑制了自身线粒体定位的能力。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种调节蛋白在细胞器中精确定位的信号肽及其编码序列和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Ser Ser Thr Val Val Ser Ala Val

1 5

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Pro Ala Pro Cys Thr Val Lys Val Ser Glu Asp Glu Thr Thr Ser

1 5 10 15

Glu Thr Lys Ser Lys

20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatcatcaa ccgttgtttc ggctgtg 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgctaccta taatgaaccg c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaagttgat cctggaagag ac 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaaggtaa accacgaggt actc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacttctcc ttcagaaaga cgag 24

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgctcact tcgaacgcca cctcaacttc 30

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcggtaccc tcgagatgaa ctgtctgtct c 31

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcgagggta ccgagctcgt 20

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcggtaccc tcgagatgaa ctgtctgtct catgc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttgctcact tcgaactttg atttaacagc ctttg 35

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttcgaagtga gcaagggcga g 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tatccatctt tgatttagca gtct 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatggataaa gaaaaggacg cctt 24

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

catcctggaa aagacatggt gtaag 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccaggatgac aaaaaagatc aact 24

Claims (2)

1.一种多肽在将目标蛋白定位于线粒体中的应用，其特征在于，所述目标蛋白为来源于拟南芥的AtRNH1C蛋白，所述多肽为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.一种将目标蛋白定位于线粒体中的方法，其特征在于，将SEQ ID NO：1所示的多肽从拟南芥的AtRNH1C蛋白中敲除，所述目标蛋白为来源于拟南芥的AtRNH1C蛋白。

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