CN113143897A - 4-氨基二苯甲酮的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物新应用技术领域，具体而言，涉及4‑氨基二苯甲酮的应用。本发明提供一种4‑氨基二苯甲酮在制备抗冠状病毒的抗病毒制剂中的应用。4‑氨基二苯甲酮能够有效抑制3Clpro的活性，继而抑制新型冠状病毒的活性，继而可以作为抗新冠病毒的药物，同时，对于新冠病毒感染导致的疾病，例如肺炎和呼吸综合征等有良好的治疗效果。

Description

4-氨基二苯甲酮的应用

技术领域

本发明涉及药物新应用技术领域，具体而言，涉及4-氨基二苯甲酮的应用。

背景技术

自2019年12月新型冠状病毒(SARS-CoV-2)爆发以来，病毒病 COVID-19在世界范围内大流行，根据世界卫生组织的数据，截止2021年 3月30日，全球共有确诊病例128,074,532例，累计报告死亡病例98,563,012 例，为人类健康和世界公共卫生带来巨大挑战。

在过去的20年，冠状病毒在人群中共造成三次大规模疫情：2003年的严重急性呼吸系统综合症(SARS)、2012年的中东呼吸综合征(MERS) 和现在的COVID-19。冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，可被分为α、β、γ和δ四个属，包括新型冠状病毒在内的这些高致病性冠状病毒都归类为β冠状病毒属。

新型冠状病毒是有包膜的单股正链RNA病毒，作为一种新型冠状病毒， SARS-CoV-2与SARS-CoV有79％的基因组序列相似性，与MERS-CoV 有50％的相似性。SARS-CoV-2的基因组包含约30,000个核苷酸，5’端的 ORF1a/ORF1ab开放阅读框编码两个多蛋白pp1a和pp1ab，多蛋白可以被其自身包含的PLpro和3CLpro水解处理成16个非结构蛋白(Nsp1-16)。3CLpro可以在多蛋白的氮端超过11个位点进行水解，将多蛋白水解成多个有生物活性的蛋白如RdRp，解旋酶等，因此抑制3CLpro的活性可以有效抑制病毒的复制；3CLpro其识别位点为谷氨酰胺，在人体内尚未发现可以识别谷氨酰胺的蛋白酶，所以根据此靶点开发的药物安全性更高；并且 3CLpro在冠状病毒中高度保守，基于此位点开发的药物可作为广谱的冠状病毒抑制剂，所以3CLpro是一个十分有潜力的理想靶点。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供4-氨基二苯甲酮的应用。本发明实施例提供的 4-氨基二苯甲酮能够有效抑制3Clpro的活性，继而抑制新型冠状病毒的活性，继而可以作为抗新冠病毒的药物，同时，对于新冠病毒感染导致的疾病，例如肺炎和呼吸综合征等有良好的治疗效果。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种4-氨基二苯甲酮在制备抗冠状病毒的抗病毒制剂中的应用。

在可选的实施方式中，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

在可选的实施方式中，所述抗病毒制剂为抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂。

在可选的实施方式中，所述抗病毒制剂为抑制3Clpro的抑制剂。

第二方面，本发明提供一种4-氨基二苯甲酮在制备治疗新冠病毒感染导致的疾病的药物中的应用。

在可选的实施方式中，所述疾病包括肺炎。

在可选的实施方式中，所述药物为抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂；

优选地，所述药物为抑制3Clpro的抑制剂。

第三方面，本发明提供一种4-氨基二苯甲酮在制备抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂中的应用。

第四方面，本发明提供一种4-氨基二苯甲酮在制备抑制3Clpro活性的抑制剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：4-氨基二苯甲酮能够有效抑制3Clpro的活性，继而抑制新型冠状病毒的活性，继而可以作为抗新冠病毒的药物，同时，对于新冠病毒感染导致的疾病，例如肺炎和呼吸综合征等有良好的治疗效果，扩大了4-氨基二苯甲酮的应用范围，也扩大了治疗新冠病毒的药物的种类。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的SARS-CoV-2 3Clpro的荧光检测的GraphPad Prism 8数据处理结果图；

图2为本发明实验例1提供的4-氨基二苯甲酮抑制SARS-CoV-2 3Clpro 的检测结果图；

图3为本发明实验例2提供的4-氨基二苯甲酮抑制SARS-CoV-2活病毒的检测结果图；

图4为本发明实验例2提供的4-氨基二苯甲酮在400μM时细胞核DAPI 染色的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实验例提供的活毒实验使用的SARS-CoV-2，相关体外实验全程在生物安全3级实验室操作。

(1)SARS-CoV-2 3CLpro表达载体的构建

①设计并合成正向引物 5’-TACCATGGCCAGTGGTTTTAGAAAAATGG-3’和反向引物5’-TGCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATG-3’；

②利用上述引物在SARS-CoV-2(2019-nCoV)3CLpro Gene ORF cDNA 表达质粒(NC_045512.2)上得到目的片段，使用PCR技术进行体外扩增；

③将PCR体外扩增后的目的片段和pET-28a载体在37℃经NcoI和 XhoI进行双酶切1.5h，经琼脂糖凝胶进行鉴定并回收大小正确的条带；

④将纯化的PCR产物和线性化质粒按照摩尔比约3:1用T4连接酶在 16℃水浴条件下连接4h；

⑤将连接产物转化于TOP 10大肠杆菌感受态细胞，并涂布在LB平板上(卡那霉素抗性)于37℃培养过夜；

⑥从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有500μL的LB培养基中 (培养基中加入卡那霉素抗性)，37℃，220rpm/min,培养6h，将浑浊的菌液送往上海生工股份有限公司测序，将测序结果正确的重组克隆命名为 pET-28a-3CL pro,保存菌种并使用质粒提取试剂盒提取pET-28a-3CL pro质粒。

(2)SARS-CoV-2 3CL pro的表达纯化

①将pET-28a-3CL pro质粒转化于BL21大肠杆菌感受态中，并涂布于LB平板上(卡那霉素抗性)37℃培养过夜；

②从平板上挑取多个单克隆分别接种于装有500μL的LB培养基中(培养基中加入卡那霉素抗性)，37℃，220rpm/min,培养6h，将浑浊的菌液送往上海生工股份有限公司测序，将测序结果正确的重组克隆保存菌种并用于菌液的扩大培养；

将菌种按照1:1000接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基的小试管中， 37℃，220rpm/min过夜培养，将小试管中的菌液转接于1L的LB培养基中(卡那霉素抗性)，37℃，220rpm/min继续培养，当菌液的OD值达到 0.6-0.8时加入1mM的IPTG进行诱导，于16℃，220rpm/min继续培养16 h；

③3000rpm/min离心40min收集大肠杆菌细胞，用缓冲液将细胞重悬后用压力破菌机破菌5-6个循环；破碎后的菌液在4℃，10000rpm/min离心40min后收集上清液；

④将得到的上清液用镍柱进行纯化，用不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱，用30mM的咪唑溶液冲洗10个柱体积洗去杂蛋白，用100mM 的咪唑缓冲液洗脱得到目的蛋白。

(3)SARS-CoV-2 3CLpro使用浓度的确定

①配制反应缓冲液：20mM Hepes，120mM NaCl，0.4mM EDTA，4 mM DTT，20％甘油，pH＝7.5；

②配制底物溶液：将反应底物Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans用 DMSO稀释至终浓度为500μM；

③将上述纯化得到的SARS-CoV-2 3CLpro用透析管置换到上述的反应缓冲液中，并用上述反应缓冲液将其稀释至4μM、2μM、1μM、0.5μM、 0.25μM、0.125μM；

④分别吸取100μL上述浓度的SARS-CoV-2 3CLpro加入黑色96孔板中，两个复孔，将96孔板置于恒温均匀仪中孵育30min，温度设置为30℃。

⑤孵育完成后，使用酶标仪测定荧光值，设定条件为激发波长340nm、发射波长490nm，保存数据作为背景值；

⑥向96孔板中加入500μM冠状病毒主蛋白荧光底物2μL，置于恒温均匀仪中孵育60min，温度设置为30℃；

⑦孵育完成后，使用酶标仪测定荧光值，设定条件为激发波长340nm、发射波长490nm，保存数据作为反应值。

⑧数据处理：实际反应值(△RFU)＝反应值—背景值，将稀释的 SARS-CoV-23CLpro浓度取以10为底的对数作为X轴，对应△RFU作为Y 轴，用GraphPad Prism 8处理数据，结果如图1所示，根据实验结果 SARS-CoV-2 3CLpro使用浓度的确定为1μM。

实验例1酶活抑制实验

将4-氨基二苯甲酮用酶活实验测定其体外酶活实验的IC₅₀，将4-氨基二苯甲酮用上述(3)中的反应缓冲液分别稀释至800μM、400μM、200μM、 100μM、50μM和25μM。采用与上述(3)相同的测定的方法测定不同浓度的4-氨基二苯甲酮对SARS-CoV-2 3CLpro的抑制效果。

将稀释的化合物浓度取以10为底的对数作为X轴，其对应的对 SARS-CoV-23CLpro的抑制率作为Y轴，用GraphPad Prism 8处理数据并计算IC₅₀。其抑制活性IC50曲线如图2所示，计算得到的IC₅₀为181.9μM。

实验例2抑制SARS-CoV-2活病毒感染实验

将4-氨基二苯甲酮以400μM、300μM、200μM、100μM、50μM和25μM 的浓度处理Caco-2细胞1小时，在药物存在的情况下，将SARS-CoV-2活病毒以MOI＝0.05感染细胞，药物与病毒共同孵育24小时后，吸弃药物与病毒的混合液，用4％多聚甲醛处理孔内细胞以终止感染并将细胞固定，依次用双蒸水和PBS缓冲液冲洗细胞，使用0.2％的Triton X-100将孔内的细胞透化，再使用SARS-CoV-2的核蛋白抗体作为特异性抗体标记病毒，通过免疫荧光的方法检测细胞内病毒的感染情况；用DAPI荧光染料标记细胞核，根据DAPI染色情况判断药物的细胞毒性。

结果如图3和图4所示，4-氨基二苯甲酮能够呈药物浓度梯度依赖的有效抑制SARS-CoV-2活病毒的感染，其IC₅₀为211.8μM，并且其在有效浓度未见明显细胞毒性。

实验例3高通量筛选

本实验例于荧光共振能量转移原理，使用 Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans(购买自碧云天)为反应底物对片段库进行筛选，因为初级筛选阶段不涉及病毒，因此，可以在普通实验室实现高通量筛选。可以为药物的筛选以及新应用的发现提供更多的理论可行依据。

将上述纯化得到的SARS-CoV-2 3CLpro稀释至终浓度为2μM(2×)，将购自Selleck公司的片段库中的1015种化合物(其中包括4-氨基苯乙酮、 4-硝基苯胺、3-氨基-5-溴-2-羟基吡啶等)用上述的缓冲液稀释至终浓度为 200μM(2×)，阳性参照药物选用已经报道可以有效抑制SARS-CoV-2 3 CLpro活性的GC376，用反应缓冲液稀释至50μM(2×)；

①药物组：分别吸取50μL SARS-CoV-2 3CLpro(2μM)和50μL不同种类的待测药物加入黑色96孔板中，两个复孔；

②阳性药物组：分别吸取50μL SARS-CoV-2 3CLpro(2μM)和50μL GC376(50μM)加入黑色96孔板中，两个复孔；

③不加药对照组：分别吸取50μL SARS-CoV-2 3CLpro(2μM)和50μL 反应缓冲液加入黑色96孔板中，两个复孔。

采用与上述(3)相同的测定的方法进行测定，数据处理：实际反应值＝反应值—背景值，抑制率＝(不加药物组的实际反应值-药物组的实际反应值)/不加药物组的实际反应值×100％。

结果显示，化合物4-氨基二苯甲酮，其在浓度为100μM时抑制率为 34％，而其他化合物，例如4-氨基苯乙酮的抑制率仅为22.7％，4-硝基苯胺的抑制率为25.3％，3-氨基-5-溴-2-羟基吡啶的抑制率为23.7％，进一步验证了本发明实施例提供的4-氨基二苯甲酮能够有效抑制3Clpro的活性，继而抑制新型冠状病毒的活性，继而可以作为抗新冠病毒的药物，同时，对于新冠病毒感染导致的疾病，例如肺炎和呼吸综合征等有良好的治疗效果。

综上可知，4-氨基二苯甲酮能成剂量依赖性地抑制SARS-CoV-2活病毒感染，IC₅₀为211.8μM。同时，通过高通量筛选实验可以看出，4-氨基二苯甲酮可以作为SARS-CoV-23CLpro抑制剂，其IC₅₀为181.9μM，同时，可以对4-氨基二苯甲酮的结构进行结构修饰可以尽可能满足对溶解度、脂水分配系数、药代动力学及药效学的要求。且4-氨基二苯甲酮的安全性良好，在作用浓度为时均没有明显细胞毒性，说明其具有开发为靶向SARS-CoV-2 3CLpro的创新型抑制剂的潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种4-氨基二苯甲酮在制备抗冠状病毒的抗病毒制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒制剂为抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒制剂为抑制3Clpro的抑制剂。

5.一种4-氨基二苯甲酮在制备治疗新冠病毒感染导致的疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疾病包括肺炎。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂；

优选地，所述药物为抑制3Clpro的抑制剂。

8.一种4-氨基二苯甲酮在制备抑制新型冠状病毒蛋白酶的抑制剂中的应用。

9.一种4-氨基二苯甲酮在制备抑制3Clpro活性的抑制剂中的应用。

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