CN113304200A - 五味子提取物的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药提取物新应用技术领域,具体而言,涉及五味子提取物的新应用。五味子提取物在制备治疗和/或预防新型冠状病毒感染药物中的应用,其可以有效抑制新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的活性,也抑制其进入,继而对于新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染有良好的治疗效果,特别地对COVID‑19有良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物新应用技术领域,具体而言,涉及五味子提取 物的新应用。
背景技术
在过去的20年,冠状病毒在人群中共造成三次大规模疫情:2003年的 严重急性呼吸系统综合症(SARS)、2012年的中东呼吸综合征(MERS) 和现在的COVID-19。冠状病毒属于冠状病毒科,套式病毒目,可被分为α、 β、γ和δ四个属,包括新型冠状病毒在内的这些高致病性冠状病毒都归类 为β冠状病毒属。
新型冠状病毒是有包膜,单股正链RNA病毒,作为一种新型冠状病毒, SARS-CoV-2与SARS-CoV有79%的基因组序列相似性,与MERS-CoV 有50%的相似性,基因组编码E、M、N、S四个结构蛋白,其中,S蛋白 在病毒附着、融合、进入和传播中发挥关键作用,也是宿主产生中和性抗 体的主要靶点;它包括N端负责与受体结合的S1亚基及C端介导病毒膜 融合的膜融合的S2亚基,S1亚基的受体结合域(RBD)可与细胞受体血 管紧张素2(ACE2)直接结合;新型冠状病毒S蛋白还有一个独特的S1/S2 多碱性蛋白酶切割位点,可被跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)、呋喃蛋白 酶等切割,TMPRSS2促进病毒在质膜表面的进入,呋喃切割位点可降低 SARS-CoV-2S蛋白的稳定性,并促进RBD与受体结合所需的构象相适应。
五味子是中国传统医学中治疗“虚证”的著名药用植物,在现代植物药理 学中也广受欢迎;其主要次生代谢产物——木脂素决定了五味子的多种生 物学活性;当归酰基戈米辛O(Angeloylgomisin O)和五味子乙素 (Schisantherin B)是五味子果实中提取到的两种重要木脂素,但是现有技 术中并没有记载或者暗示五味子提取物,特别是归酰基戈米辛O (Angeloylgomisin O)和五味子乙素可以用于治疗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)感染,或者COVID-19。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供五味子提取物在制备治疗和/或预防新型冠状病 毒感染药物中的应用。本发明实施例提供的五味子提取物可以有效抑制新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)的活性,也抑制其进入,继而对于新型冠状病 毒(SARS-CoV-2)感染有良好的治疗效果,特别地对COVID-19有良好的 治疗效果。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供一种五味子提取物在制备治疗和/或预防新型冠 状病毒感染药物中的应用。
在可选的实施方式中,所述五味子提取物为五味子果实的提取物。
在可选的实施方式中,所述五味子提取物为从五味子中提取得到的木 质素。
在可选的实施方式中,所述五味子提取物包括当归酰基戈米辛O或五 味子乙素。即当归酰基戈米辛O或五味子乙素可以作为抗新型冠状病毒药 剂的活性成分,且当归酰基戈米辛O或五味子乙素可以作为单一的活性成 分,也可以形成活性组合物。同时,该抗新型冠状病毒药剂可以是颗粒剂 也可以现有技术中其他剂型的药剂。
在可选的实施方式中,所述药物为抑制SARS-CoV-2进入的抑制剂。
在可选的实施方式中,所述药物为抑制SARS-CoV-2活性的抑制剂。
在可选的实施方式中,在细胞实验中,所述五味子乙素对于 SARS-CoV-2活病毒的IC50值为7-8μM,优选为7.377μM。
在可选的实施方式中,在细胞实验中,所述归酰基戈米辛O对于 SARS-CoV-2活病毒的IC50值为3.5-4μM,优选为3.727μM。
在可选的实施方式中,在细胞实验中,所述归酰基戈米辛O对于 SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为16-17μM,优选为16.97μM。
在可选的实施方式中,在细胞实验中,所述五味子乙素对于 SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为40-45μM,优选为40.41μM。
本发明具有以下有益效果:本发明实施例提供的五味子提取物能够抑 制SARS-CoV-2的活性,更能抑制其进入,继而对于SARS-CoV-2有良好 的抑制效果,可以用于治疗SARS-CoV-2感染,继而用于制备治疗和/或预 防新型冠状病毒感染的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需 要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些 实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲, 在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的当归酰基戈米辛O抑制SARS-CoV-2假 型病毒的效果图;
图2为本发明实验例1提供的五味子乙素抑制SARS-CoV-2假型病毒 的效果图;
图3为本发明实验例1提供的五味子酯甲和五味子酚(去甲去氧五味 子素)抑制SARS-CoV-2假型病毒效果图;
图4为发明实验例2提供的当归酰基戈米辛O抑制SARS-CoV-2活病 毒效果图;
图5为发明实验例2提供的五味子乙素抑制SARS-CoV-2活病毒的效 果图;
图6为发明实验例3提供的当归酰基戈米辛O的细胞毒性检测结果图;
图7为发明实验例3提供的五味子乙素的细胞毒性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件 者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种五味子提取的新应用,具体地,该五味子提取 物可以抑制SARS-CoV-2的活性,更能抑制其进入,继而对于SARS-CoV-2 有良好的抑制效果,可以用于治疗SARS-CoV-2感染,继而用于治疗和/或 预防新型冠状病毒感染药物。
特别地,该五味子提取物为五味子果实的提取物,例如为五味子中提 取得到的木质素,具体地为当归酰基戈米辛O或五味子乙素,二者的结构 式分别如下所示:
当归酰基戈米辛O;
五味子乙素。发明人经过研究发现,上述两 者对SARS-CoV-2有良好的抑制效果,可以作为抗新型冠状病毒药剂,也 就是新冠病毒抑制剂或治疗剂或预防剂,其中,五味子乙素对于SARS-CoV-2活病毒的IC50值为7-8μM,优选为7.377μM,归酰基戈米辛O 对于SARS-CoV-2活病毒的IC50值为3.5-4μM,优选为3.727μM。五味子乙素对于SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为40-45μM,优选为40.41μM;归 酰基戈米辛O对于SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为16-17μM,优选为 16.97μM。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
药品:(1)当归酰基戈米辛O,购自四川省维克奇生物科技有限公司;
(2)五味子乙素,购自四川省维克奇生物科技有限公司;
(3)五味子酯甲,购自四川省维克奇生物科技有限公司;
(4)五味子酚(去甲去氧五味子素),购自四川省维克奇生物科技有限 公司;
细胞:Caco-2细胞,由中国科学院武汉病毒研究所微生物菌(毒)种 保藏中心提供;
SARS-CoV-2病毒,为临床株(nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019)。
构建病毒:以水疱性口炎病毒为骨架囊膜蛋白为SARS-CoV-2S蛋白的 假型病毒,这种假型病毒的进入过程与SARS-CoV-2活病毒相同,该病毒 只能单次感染,不能产生子代病毒,因此可以在生物安全2级实验室中研 究新型冠状病毒的进入过程;该病毒基因组中携带海参荧光素酶报告基因, 便于观察和检测。本研究使用的SARS-CoV-2活病毒为临床株(nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019),相关体外实验全程在生物安全3 级实验室操作。
实验例1
药物抑制SARS-CoV-2假型病毒感染实验
分别以100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM 药物浓度的当归酰基戈米辛O、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、 3.125μM、1.5625μM药物浓度的五味子乙素、50μM药物浓度的五味子酯甲 以及50μM药物浓度的五味子酚(去甲去氧五味子素)处理Caco-2细胞 (2.5*105个/mL)1小时,而后,在对应药物存在的情况下,用SARS-CoV-2 假型病毒感染细胞,1小时后吸弃药物与病毒的混合液,更换为含有2%血 清的细胞培养基,培养23小时后,裂解细胞,检测荧光素酶活性。
检测结果参见图1-图3,其中,图1为当归酰基戈米辛O抑制 SARS-CoV-2假型病毒的效果图,图2为五味子乙素抑制SARS-CoV-2假型 病毒的效果图,图3为五味子酯甲及五味子酚(去甲去氧五味子素)抑制 SARS-CoV-2假型病毒的效果图。
根据图1-图3所示可知,不同浓度梯度的当归酰基戈米辛O和五味子 乙素处理Caco-2细胞后,进入细胞的假型病毒明显下降,而其他两种五味 子提取物——五味子酯甲及五味子酚(去甲去氧五味子素)对SARS-CoV-2 假型病毒没有抑制效果,说明当归酰基戈米辛O和五味子乙素均能有效抑 制SARS-CoV-2假型病毒的感染即S蛋白介导的SARS-CoV-2的进入。
实验例2
药物抑制SARS-CoV-2活病毒感染实验
分别以50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM、 0.393625μM和0.1953125μM药物浓度的当归酰基戈米辛O、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM、0.393625μM和0.1953125 μM药物浓度的五味子乙素、50μM药物浓度的五味子酯甲以及50μM药物 浓度的五味子酚(去甲去氧五味子素)处理Caco-2细胞(2.5*105个/mL)1小 时,而后,在对应药物存在的情况下,将SARS-CoV-2活病毒以MOI=0.05 感染细胞,药物与病毒共同孵育24小时后,吸弃药物与病毒的混合液,用 4%多聚甲醛冲洗孔内细胞终止感染,使用SARS-CoV-2的核蛋白抗体作为 特异性抗体标记病毒,通过免疫荧光的方法检测细胞内病毒的感染情况。
检测结果参见图4和图5,其中,图4为当归酰基戈米辛O抑制 SARS-CoV-2活病毒的效果图,图5为五味子乙素抑制SARS-CoV-2活病毒 效果图。
根据图4和5可知,当归酰基戈米辛O和五味子乙素能够有效抑制 SARS-CoV-2活病毒的感染,并且这种抑制效果是呈药物浓度梯度依赖的, 说明当归酰基戈米辛O和五味子乙素能够用于抗SARS-CoV-2病毒。
实验例3
药物细胞毒性实验
使用CCK-8试剂盒测定药物的细胞毒性,试剂盒中的WST-8(2-(2-甲 氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)在电子耦合 载体1-Methoxy PMS的作用下可被线粒体内的一些脱氢酶还原成高度水溶 性的橙黄色甲臜,生成的甲臜的颜色深浅与细胞增殖成正比,与细胞毒性 成反比。不同浓度梯度的药物(具体地,当归酰基戈米辛O和五味子乙分 别设定3个浓度分别为200μM,100μM,50μM)与细胞共孵育相应的时 间后,加入WST-8,使用酶标仪在450nm波长处测得吸光值,该测定值可 间接反映活细胞的数量。
检测结果参见图6和7,其中,图6为当归酰基戈米辛的细胞毒性检测 结果图;图7为五味子乙素的细胞毒性检测结果图。
根据图6和图7可知,当归酰基戈米辛O和五味子乙素安全性良好, 在作用浓度为200μM时均没有明显细胞毒性,说明两种药物是安全有效的 抗新型冠状病毒感染的药物。
综上所述,当归酰基戈米辛O和五味子乙素均能剂量依赖性地抑制 SARS-CoV-2活病毒感染,IC50分别为3.727和7.377μM。实验证实当归酰 基戈米辛O和五味子乙素对SARS-CoV-2的进入也有较好的抑制作用,可 有效抑制SARS-CoV-2假型病毒的感染,IC50分别为16.97和40.41μM。当 归酰基戈米辛O和五味子乙素安全性良好,在作用浓度为200μM时均没有明显细胞毒性,说明两种药物是安全有效的抗新型冠状病毒感染的药物, 特别地对于COVID-19即新冠病毒肺炎有良好的治疗效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于 本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精 神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明 的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种五味子提取物在制备治疗和/或预防新型冠状病毒感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述五味子提取物为五味子果实的提取物。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述五味子提取物为从五味子中提取得到的木质素。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述五味子提取物包括当归酰基戈米辛O或五味子乙素。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述药物为抑制SARS-CoV-2进入的抑制剂。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述药物为抑制SARS-CoV-2活性的抑制剂。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于,在细胞实验中,所述五味子乙素对于SARS-CoV-2活病毒的IC50值为7-8μM,优选为7.377μM。
8.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于,在细胞实验中,所述归酰基戈米辛O对于SARS-CoV-2活病毒的IC50值为3.5-4μM,优选为3.727μM。
9.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于,在细胞实验中,所述归酰基戈米辛O对于SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为16-17μM,优选为16.97μM;
优选地,在细胞实验中,所述五味子乙素对于SARS-CoV-2假型病毒的IC50值为40-45μM,优选为40.41μM。
10.一种五味子提取物在制备治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的药物中的应用,优选地,所述五味子提取物为五味子果实的提取物,优选为木质素,更优选为当归酰基戈米辛O或五味子乙素。
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