CN113138239B - 小柴胡复方制剂指纹图谱及其构建方法和小柴胡复方制剂的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药制剂的质量检测技术领域，具体提供了小柴胡复方制剂指纹图谱及其构建方法和小柴胡复方制剂的含量测定方法，其中，小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法包括以下步骤，(1)小柴胡复方制剂供试品溶液的制备；(2)取小柴胡复方制剂供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液‑乙腈为流动相梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，在本发明的洗脱条件下，不仅显著增加了共有峰个数，而且明显提高了共有特征峰的分离度，大大缩短检测时间，而且各共有峰峰形良好且无干扰，从而能够更加全面、清楚、有效的对小柴胡复方制剂进行质量检测。

Description

小柴胡复方制剂指纹图谱及其构建方法和小柴胡复方制剂的 含量测定方法

技术领域

本发明属于中药制剂的质量检测技术领域，具体涉及一种小柴胡复方制剂指纹图谱及其构建方法和小柴胡复方制剂的含量测定方法。

背景技术

小柴胡颗粒是由柴胡、黄芩、党参、大枣水提部分与姜半夏、生姜70％醇提部分混合浓缩、制粒得到的复方制剂。用于治疗外感病，邪犯少阳证，症见往来寒热、胸胁苦满、食欲不振、心烦喜呕、口苦咽干。

国家食品药品监督管理局共有98家企业具有小柴胡颗粒生产批号，现行中国药典(2020年版)仅对小柴胡颗粒中黄芩苷进行含量限定要求。现有技术中已有研究建立小柴胡颗粒指纹图谱检测方法，但这些指纹图谱均是建立在同一厂家的多个批次样品上，不能代表市面上不同厂家生产的小柴胡颗粒样品。

例如，专利文献CN105786771A中公开了一种小柴胡复方制剂的指纹图谱检测方法，然而该方法构建的指纹图谱存在共有特征峰个数少，各特征峰分离度差，耗时长的问题。

因此，研究一种新的有效、准确、全面地检测小柴胡复方制剂质量的方法成为了亟待解决的问题。

发明内容

因此，本发明的目的在于解决现有技术中小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱的共有峰个数少、分离度不佳以及耗时长的问题，提供了一种小柴胡复方制剂指纹图谱及其构建方法。

具体的，本发明公开了一种小柴胡复方制剂纹图谱的构建方法，包括以下步骤，

(1)小柴胡复方制剂供试品溶液的制备；

(2)取小柴胡复方制剂供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流动相中乙腈的体积百分数为：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。

根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(1)包括：称取小柴胡复方制剂，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。

某些优选的实施方式中，本发明通过使用正交表对不同来源、不同性质的原料药进行合理组合，然后按照药典方法制得多批柴胡颗粒标准汤剂冻干粉，利用这些批次小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉构建生成了小柴胡复方制剂对照指纹图谱，建立的指纹图谱方法更加适用于市面上小柴胡颗粒的评价。

某些优选的实施方式中，本发明公开了一种小柴胡复方制剂纹图谱的构建方法，包括以下步骤，

(1)收集至少6批次以上的北柴胡、黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片，收集大枣与生姜的合格饮片，按照中国药典对所有收集的饮片进行含量测定和浸出物含量测定，得到浸出物含量结果和含量测定结果。将浸出物含量结果和含量测定结果进行排序，得到每批次每种原料药的序列号。按照如下公式计算每批次每种原料药的得分。得分＝同一批同种原料药浸出物含量测定结果排序号*0.5+同一批同种原料药含量测定结果的排列号*0.5。将各批次的北柴胡、黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片按照得分情况筛选出高、中、低分为三个质量水平的批次。其中高水平是指得分最高的批次，中水平是指得分中位数水平对应的批次，低水平是指得分最低的批次。按照5因素3水平正交表选择不同批次的北柴胡、黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片制备小柴胡颗粒标准汤剂，共得到18批小柴胡颗粒标准汤剂。

(2)取步骤(1)制得的小柴胡颗粒标准汤剂制备小柴胡复方制剂供试品溶液；

(3)取小柴胡复方制剂供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，含甲酸的水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流动相中乙腈的体积百分数为：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。

具体的，将浸出物含量结果和含量测定结果同时按照从低到高或者从高到低分别进行排序，得到每批次每种原料药的序列号。例如，北柴胡有9批样品，从最高水平的浸出物含量到最低水平的浸出物含量的序列号依次为9，8，7，6，5，4，3，2，1。

大枣与生姜饮片作为次要药味仅收集2批次以上，选择1批合格的制备小柴胡颗粒标准汤剂。

步骤(1)还包括，另选择质量水平为中水平黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片分别与不同产地的南柴胡饮片，制备南柴胡组成的小柴胡颗粒标准汤剂。

根据本发明任一项所述的构建方法，满足A-C中任意一项或者多项：

A、步骤1)中，加入10-40倍量溶剂，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.3-5h。

优选的，提取时间为0.3-5h，更优选为30-60min。所述倍量表示每克小柴胡复方制剂中加入溶剂的毫升数。

优选的，小柴胡复方制剂经粉粹处理得到粉末，取过60目筛的小柴胡复方制剂粉末。

B、所述固液分离独立地选自离心或者过滤；

C、所述溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种。

根据本发明任一项所述的构建方法中，小柴胡复方制剂是以柴胡、黄芩、党参、甘草、大枣、生姜、姜半夏为原料药按照常规技术手段制得的复方制剂。按照重量份数计，小柴胡复方制剂包括如下原料：柴胡21-28份、黄芩6-13份、党参6-13份、生姜6-13份、姜半夏6-13份、甘草6-13份和大枣6-13份。对于这些复方制剂均可采用本发明的方法构建指纹图谱。小柴胡复方制剂优选为小柴胡汤的固体制剂、半固体制剂和液体制剂，更优选为小柴胡颗粒、小柴胡胶囊和小柴胡片中的至少一种。小柴胡复方制剂可以按照常规技术手段制备，例如但不局限于中国药典规定的方法。

根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(1)包括：取过40-80目筛的小柴胡复方制剂粉末0.7-3.0g，加入25-75ml甲醇，超声提取20-60min，室温放置冷却后，甲醇补重，取上清液过0.22μm有机滤器，取滤液，作为供试品溶液。

根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)包括：检测波长190-800nm，流速为0.2-0.3ml/min，柱温30-40℃，进样量为2-10μl，优选的,254nm为检测波长，流速0.3ml/min，柱温为35℃。

根据本发明任一项所述的构建方法，梯度洗脱程序包括0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～30min,60～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈；

或者，所述梯度洗脱程序包括：0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～6min,20～28vt％乙腈；6～9min,28vt％乙腈；9～13min,28～35vt％乙腈；13～15min,35～50vt％乙腈；15～18min,50～52vt％乙腈；18～19min,52vt％乙腈；19～21min,52～60vt％乙腈；21～23min,60～70vt％乙腈；23～25min,70vt％乙腈；25～27min,70～75vt％乙腈；27～30min,75～80vt％乙腈；

或者，所述梯度洗脱程序包括：0～2min,15vt％乙腈；2～4min,15～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10.5min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～27min,60～65vt％乙腈；27～30min,65～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈。

根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)中，所述的含甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.1％-0.5％，优选的为0.5％。

某些优选的实施方式中，构建方法还包括，采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、党参炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品指纹图谱的步骤。

可以采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、党参炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2的任一种或者多种对照品制备对照品溶液，采用两种或者两种以上对照品时，可以将各对照品混合制备混合液，也可以单独配制对照品溶液。

根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、党参炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2对照品，加溶剂制成每1ml含柴胡皂苷b2 1.02-65μg、柴胡皂苷b1 1.25-80μg、黄芩苷40.16-2570μg、黄芩素4.14-265μg、汉黄芩苷7.34-470μg、党参炔苷6.88-440μg、6-姜辣素3.44-220μg、甘草苷2.5-160μg、甘草酸5.78-370μg和甘草皂苷G2 1.02-65μg的混合对照品溶液。

优选的，所述溶剂选自乙醇水溶液或者纯甲醇；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数不高于30％。

某些优选的实施方式中，还包括小柴胡复方制剂对照指纹图谱的构建，对多批小柴胡复方制剂供试样品检测得到的指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成小柴胡复方制剂对照指纹图谱。某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成小柴胡复方制剂对照指纹图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。

至少采用10批小柴胡复方制剂得到对照谱图，例如采用10个批次、15个批次、20个批次、47个批次的小柴胡复方制剂。

本发明还提供了一种小柴胡复方制剂指纹图谱，由上述任一所述的构建方法得到。

本发明还提供了一种小柴胡复方制剂对照指纹图谱，其具有26个共有峰，保留时间分别为2.342min、2.966min、3.155min、7.076min、7.726min、8.941min、9.552min、10.055min、11.026min、11.305min、11.447min、11.851min、12.132min、12.683min、13.064min、15.273min、15.744min、16.538min、17.402min、19.663min、20.392min、21.090min、21.396min、21.825min、21.955min和22.647min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％、<0.05％。

本发明还提供了另一种小柴胡复方制剂对照指纹图谱，其具有26个共有特征峰，各特征峰与14号峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.18(1号峰)、0.23(2号峰)、0.25(3号峰)、0.56(4号峰)、0.61(5号峰)、0.70(6号峰)、0.75(7号峰)、0.79(8号峰)、0.87(9号峰)、0.89(10号峰)、0.90(11号峰)、0.93(12号峰)、0.96(13号峰)、1.00(14号峰)、1.03(15号峰)、1.20(16号峰)、1.24(17号峰)、1.30(18号峰)、1.37(19号峰)、1.55(20号峰)、1.61(21号峰)、1.66(22号峰)、1.69(23号峰)、1.72(24号峰)、1.73(25号峰)和1.79(26号峰)。

本发明还提供了另一种小柴胡复方制剂对照指纹图谱，其具有26个共有特征峰，各特征峰与14号峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.18(1号峰)、0.23(2号峰)、0.25(3号峰)、0.56(4号峰)、0.61(5号峰)、0.70(6号峰)、0.75(7号峰)、0.79(8号峰)、0.87(9号峰)、0.89(10号峰)、0.90(11号峰)、0.93(12号峰)、0.96(13号峰)、1.00(14号峰)、1.03(15号峰)、1.20(16号峰)、1.24(17号峰)、1.30(18号峰)、1.37(19号峰)、1.55(20号峰)、1.61(21号峰)、1.66(22号峰)、1.69(23号峰)、1.72(24号峰)、1.73(25号峰)和1.79(26号峰)；而且其中有1-10个特征峰分别与对照品指纹图谱中的1-10个特征峰的保留时间相同或者其中有1-10个特征峰的保留时间与对照品指纹图谱中的1-10个特征峰的保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％或者<0.05％，所述对照品指纹图谱为本发明所述的对照品指纹图谱。

本发明中，小柴胡复方制剂对照指纹图谱还可以使用单批次或者多批次小柴胡复方制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的小柴胡复方制剂指纹图谱；可选的，小柴胡复方制剂对照指纹图谱还可以使用多批次小柴胡复方制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成指纹图谱。

可选的，至少采用10批小柴胡复方制剂得到对照谱图，例如采用10个批次、15个批次、20个批次、47个批次的小柴胡复方制剂。

本发明解决的另一技术问题是克服现有技术无法测定小柴胡复方制剂中的柴胡成分和/或甘草成分和/或黄芩成分的缺陷，从而提供了一种小柴胡复方制剂的含量测定方法。

小柴胡复方制剂供试品溶液的制备；

对照品溶液的制备：采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2对照品中的至少一种制备对照品溶液；

测试步骤：取小柴胡复方制剂供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流动相中乙腈的体积百分数为：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。

作为优选地实施方式，梯度洗脱程序包括0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～30min,60～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈；

或者，所述梯度洗脱程序包括：0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～6min,20～28vt％乙腈；6～9min,28vt％乙腈；9～13min,28～35vt％乙腈；13～15min,35～50vt％乙腈；15～18min,50～52vt％乙腈；18～19min,52vt％乙腈；19～21min,52～60vt％乙腈；21～23min,60～70vt％乙腈；23～25min,70vt％乙腈；25～27min,70～75vt％乙腈；27～30min,75～80vt％乙腈；

或者，所述梯度洗脱程序包括：0～2min,15vt％乙腈；2～4min,15～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10.5min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～27min,60～65vt％乙腈；27～30min,65～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈。

作为优选地实施方式，所述小柴胡复方制剂供试品溶液是按照本发明小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法中的小柴胡复方制剂供试品溶液的制备方法进行制备。

所述测试步骤是按照本发明任一所述的小柴胡复方制剂指纹图谱构建方法中的色谱条件进行测试。可以采用内标法或者外标法进行测试，也可以建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中的成分含量。

本发明还提供了本发明的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法和/或本发明的小柴胡复方制剂对照指纹图谱和/或本发明的小柴胡复方制剂的含量测定方法在小柴胡复方制剂产品的质量检测中的用途。

本发明还提供了一种小柴胡复方制剂的质量检测的方法，包括将待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱与小柴胡复方制剂对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱为使用待测小柴胡复方制剂产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述小柴胡复方制剂对照指纹图谱为本发明所述的小柴胡复方制剂对照指纹图谱。

待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱与小柴胡复方制剂对照指纹图谱的相似度如果不低于0.75-0.95(例如0.75)，则为质量合格；如果低于0.75-0.95(例如0.75)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件得到。

本发明还提供了一种小柴胡复方制剂的质量检测的方法，包括将待测小柴胡复方制剂产品按照本发明的方法测定含量的步骤。

本发明中，0.1％或者0.5％甲酸分别指的是含体积百分数为0.1％或0.5％的甲酸的水溶液。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，在本发明的洗脱条件下，不仅显著增加了共有峰个数(可达26个)，而且明显提高了共有特征峰的分离度，大大缩短分析时间，而且各共有峰峰形良好且无干扰，从而能够更加全面、清楚、有效的对小柴胡复方制剂进行质量检测。

2.本发明所述的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法，通过收集不同产地饮片，制备小柴胡颗粒标准汤剂，依据药典建立的小柴胡颗粒标准汤剂具有代表性与参考性。在小柴胡颗粒标准汤剂基础上建立的指纹图谱方法可表征小柴胡颗粒中柴胡、黄芩、党参、甘草与生姜药味的信息，并适用于市面上小柴胡颗粒的评价。

3.本发明所述的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法，通过采用甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1中的至少一种制备对照品溶液并构建对照品指纹图谱，可以实现对小柴胡复方制剂指纹图谱中1-10个共有峰进行定位，使得检测得到的色谱更精确、稳定、可靠，侧面说明采用本发明的色谱条件可以实现小柴胡复方制剂中10种有效成分，即甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1的有效分离，构建的指纹图谱具有高度的可靠性。

4.本发明所述的小柴胡复方制剂的含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含甲酸的水溶液-乙腈梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，所建立的多成分含量测定方法，可同时测定小柴胡颗粒中8个成分含量，包括主要药味中柴胡皂苷b2、黄芩苷与甘草酸。通过对市面上47批小柴胡颗粒含量测定，所建立的含量测定方法与指纹图谱方法具有快速、代表性与普适性，且节省样品制备时间与检测时间。

5.本发明所述的小柴胡复方制剂的质量检测方法，通过待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱与小柴胡复方制剂对照指纹图谱进行比较，对小柴胡复方制剂的特征有效成分进行质量检测，使得对所述小柴胡复方制剂相关制剂的质量检测更全面，保证了所述小柴胡复方制剂相关制剂质量的有效性和可控性；通过对待测小柴胡复方制剂中的成分进行含量测定，准确的定量小柴胡颗粒中柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草苷、甘草皂苷G2、甘草酸的含量，定量评价小柴胡复方制剂的质量，两者均适用于对市面上小柴胡颗粒进行质量评价。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例1中不同提取溶剂考察中混合对照品溶液的色谱图；图2为本发明实验例1中不同提取溶剂考察中供试品的色谱图；图3为本发明实验例2中检测波长选择的色谱图；图4为图3的局部放大图；图5为本发明实验例2中梯度条件1的色谱图；图6为本发明实验例2中梯度条件2的色谱图；图7为本发明实验例2中优化梯度条件3的色谱图；图8为本发明实验例2中优化梯度条件4的色谱图；图9为本发明实验例2中优化梯度条件5的色谱图；图10为本发明实验例2中优化梯度条件6的色谱图；图11为本发明实验例2中优化梯度条件7的色谱图；图12为本发明实验例2中优化梯度条件8的色谱图；图13为本发明实验例2中优化梯度条件9的色谱图；图14为本发明实验例2中优化梯度条件10的色谱图；图15为本发明实验例2中优化梯度条件11的色谱图；图16为本发明实验例3中对照品的选择的色谱图；图17为本发明实施例4中20批小柴胡标准汤剂指纹图谱；图18为本发明实施例5中小柴胡颗粒标准汤剂对照指纹图谱与单味药比对图谱；图19为本发明对比例1的方法构建的指纹图谱；图20为本发明实施例1与对比例3的方法构建的指纹图谱；图21为本发明对比例3和4的方法构建的指纹图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实验例、实施例以及对比例中使用的小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉均是按照中国药典工艺制备得到小柴胡颗粒标准汤剂，然后冻干得到冻干粉，具体为取柴胡24g、黄芩9g、党参9g、甘草9g、大枣9g，加入8倍量水480ml(2000ml圆底烧瓶)，加热回流1.5h，过滤，残渣加入5倍量水300ml，继续加热回流1.5h，滤出，挤压残渣，合并两次滤液，减压浓缩至250ml。取生姜9g、姜半夏9g加入250ml的70vt％乙醇，置于渗漉装置中浸渍24h后渗漉，渗漉液减压浓缩至50ml。合并水提部分与醇提部分，减压浓缩至250ml，转移至1000ml茄形瓶中，-39℃旋转冷冻20min，置于冻干机，冻干，制备冻干粉备用。

实验例1提取溶剂的考察

1、仪器与试药：

Nexera X2系列岛津LC-30A超高效液相色谱仪、METTLER TOLEDO电子天平PL402-L、METTLER TOLEDO XS 105分析天平、FA1004电子天平(上海越平科学仪器有限公司)、KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、H/T16M台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)。色谱分析用水为娃哈哈饮用纯净水，甲醇，乙腈为色谱纯(Fisher)，甲酸为分析纯；提取用甲醇、乙醇均为分析纯。实验所用标准品信息见表1。

表1标准品信息

2、实验方法：

(1)供试品溶液的制备

取同一批小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉样品，每份0.20g，相当于原药0.75g，分别以甲醇、5vt％乙醇水溶液、15vt％乙醇水溶液、30vt％乙醇水溶液、45vt％乙醇水溶液、70vt％乙醇水溶液、乙醇为提取溶剂，每个提取溶剂样品平行制备2份，各加入提取溶剂25ml，超声提取30min，分别用各自提取溶剂补重后，上清液过0.45μm有机滤膜，得到供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备

精密称量各对照品适量，甲醇定容，制成含甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1的浓度分别为160μg/ml、440μg/ml、2570μg/ml、470μg/ml、265μg/ml、65μg/ml、370μg/ml、220μg/ml、65μg/ml、80μg/ml的混合对照品溶液。

(3)高效液相法测试

将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入岛津LC-30A超高效液相色谱仪中检测，分别得到混合对照品指纹图谱和供试品指纹图谱。

色谱条件如下：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm,2.1×100mm)，柱温35℃，流速0.3ml/min，乙腈(A)-0.5％甲酸(B)梯度洗脱，0～2min，17％A；2～4min，17～20％A；4～7.5min，20～28％A；7.5～10min，28％A；10.5～16min,28～35％；16～18min，35～50％A；18～21min，50～52％A；21～22min，52％A；22～24min，52～60％A；24～30min，60～80％A；30～31min，80％A，进样量均为3μl，检测波长254nm。

3、实验结果

由图1可知，混合对照品在上述色谱条件下，分离度良好，各对照品峰与相邻峰的分离度分别为12.106(甘草苷)、28.718(党参炔苷)、7.616(黄芩苷)、22.439(汉黄芩苷)、1.616(黄芩素)、28.159(甘草皂苷G2)、12.709(甘草酸)、3.655(6-姜辣素)、5.134(柴胡皂苷b2)、8.207(柴胡皂苷b1)。

不同提取溶剂提取的小柴胡冻干粉的色谱图显示见图2，在图2中1为甘草苷，2为党参炔苷，3为黄芩苷，4为黄芩素，5为甘草酸，6为6-姜辣素，7为柴胡皂苷b2，8为柴胡皂苷b1，9为8-姜酚，10为10-姜酚。随着乙醇浓度的升高，保留时间2.5min～4min成分提取率降低，而保留时间7.9min成分(党参炔苷)在70％乙醇中峰面积最低。而甲醇对保留时间21min后成分提取较完全，且对党参炔苷提取效果较好，此溶剂提取下保留时间2.5min～4min成分分离度不佳，后期可通过优化色谱条件达到色谱峰与基线分离。

为对数据进行进一步量化比较，将所有数据导入至“中药色谱指纹图谱软件”进行分析。选择峰面积>10000的15个共有峰进行分析，并以峰面积/取样量(A/W)进行数据校正，共有峰A/W结果见表2。实验结果显示，除保留时间9.31min成分15％乙醇提取效果较好，其余14个成分均以甲醇提取较完全。以此15种成分A/W总和为评价标准，提取效果依次为甲醇>水>15％乙醇>30％乙醇>45％乙醇>5％乙醇>70％乙醇(见表2)。

表2不同溶剂提取小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉共有峰A/W值(n＝2)

综上，甲醇提取成分较完全，除黄芩、柴胡、甘草饮片成分外，可展示出党参与生姜成分，且提取能力要优于其他溶剂，故选择甲醇作为小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉的最佳提取溶剂。

实验例2色谱条件的确定

1、检测波长的选择

本发明初期共考察了210nm、254nm、270nm、330nm四个波长，实验结果显示254nm下柴胡成分表征完全(保留时间21-23min)，其他波长下响应值过低，因此，最佳波长为254nm(见图3和图4)。

2、流动相的选择和梯度条件的优化

除了梯度程序和流动相外，其余色谱条件均与实施例1相同，以梯度程序和流动相作为变量，采用了多个不同的洗脱梯度和流动相(梯度条件1-2和优化梯度条件3-11，见表3-7)对同一份供试品溶液进行测定，结果见表8和图5-15。

其中，供试品溶液的制备方法为：取小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉样品约0.20g(相当于生药1.5g)，加入甲醇25ml，超声提取30min，用甲醇补重后，上清液过0.45μm有机滤膜，得到供试品溶液，测试。表格中流动相A和B的百分含量均为体积百分数。

表3梯度条件1

表4梯度条件2

时间(分钟)	A％	B％
			0.01	5	95
3.00	5	95
			18.00	100	0
21.00	100	0

实验前期考察了表3和表4两种溶剂系统，色谱图见图5和6所示，同等条件下，两种溶剂系统下，乙腈-水对色谱峰分离度更好，杂质峰较少，故本发明选择乙腈-水作为梯度洗脱溶剂进行进一步条件优化。

表5优选梯度条件3～5

表6梯度条件6～8

表7梯度条件9～11

表8各梯度色谱峰系统适用性参数

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根据结果可知，洗脱条件3的色谱图中有大量峰无法分离，特征性较差。优化洗脱条件4，色谱峰10.733、11.898、12.773、14.070、17.653、20.717分离度均大于1.5，说明该梯度条件下对此5个主要色谱峰分离效果良好，该梯度条件下，色谱峰11.898、17.653的拖尾因子在0.95～1.05之间，说明峰形对称，分离良好。优化梯度洗脱条件5，主要色谱峰8.765(峰面积最大)分离度大于1.5，拖尾因子1.060，略有拖尾，峰形得到改善。优化梯度洗脱条件6，峰面积最大色谱峰9.020，分离度6.938，拖尾因子1.043，说明该洗脱条件下，此色谱峰得到完全分离，且峰形对称。优化梯度条件7中，汉黄芩苷(保留时间11.081)分离度为3.025，拖尾因子1.031，此成分在该优化条件下得到充分分离且峰形对称。优化梯度条件7～8，色谱峰18.359(来源于甘草)与相邻峰可以较好分离，且拖尾因子在逐渐改善。总之，优化梯度条件4～8对小柴胡复方制剂中来源于黄芩中成分分离效果较好，来源于柴胡与甘草的成分分离效果较差。

优化梯度条件9，在前期条件的基础上，来源于甘草、党参(6.649min)与黄芩中成分分离度均大于1.5，可以与相邻峰得到良好分离，但来源于甘草与柴胡中成分保留时间22～24min中的色谱峰存在前沿峰与拖尾峰。梯度条件10在梯度洗脱时间21min后缓慢提高有机相浓度，使色谱峰21.915(甘草酸)由拖尾峰改善为正常对称峰形(拖尾因子0.988)。梯度条件11，在优化条件基础上，对来源于柴胡中成分进行优化，使23.098min色谱峰峰形改善，拖尾因子1.038处于正常范围内。以优化梯度条件9-10对小柴胡复方制剂中来源于黄芩与甘草中成分可以良好分离。优化梯度洗脱11为最优条件，其对小柴胡复方制剂中主要成分达到较好分离度，且峰形拖尾因子大多数处在0.95-1.05之间，可以较好的表征小柴胡复方制剂主要成分，而且可以得到26个共有特征峰。

实验例3对照品的选择

1、实验方法

对照品溶液的制备：分别精密称量柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品加甲醇溶解、定容制得浓度分别为241.33μg/ml、65.33μg/ml的对照品溶液。

超高效液相法测试：将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入岛津LC-30A超高效液相色谱仪中检测，进样量均为3μl，分别以乙腈(A)-水(B)和乙腈(A)-0.5％甲酸水溶液(B)为流动相进行检测，梯度洗脱，洗脱条件如下，0～2min,17％A；2～4min,17～20％A；4～7.5min,20～28％A；7.5～10min,28％A；10.5～16min,28～35％；16～18min,35～50％A；18～21min,50～52％A；21～22min,52％A；22～24min,52～60％A；24～30min,60～80％A；30～31min,80％A。

2、实验结果

其中，图16为柴胡皂苷a与柴胡皂苷d对照品在乙腈-水与乙腈-0.5甲酸水数据对比图。a为柴胡皂苷d在乙腈-水溶剂系统下的色谱图，b为柴胡皂苷a在乙腈-水溶剂系统下的色谱图，c为柴胡皂苷d在乙腈-0.5甲酸水溶剂系统下的色谱图，d为柴胡皂苷a在乙腈-0.5％甲酸水溶剂系统下的色谱图。从图16可知，柴胡皂苷a在酸性和水煎煮高温的条件下会发生成分转化，不适宜作为指纹图谱指纹峰。而本发明指纹图谱中含有的柴胡皂苷b2与柴胡皂苷b1均为柴胡皂苷a与柴胡皂苷d在煎煮条件下的转化产物，稳定性良好。

实验例4小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱的建立与验证

1、仪器与试药：同实验例1的仪器与试药。

2、实验方法

2.1小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉制备

收集14批柴胡饮片(其中，北柴胡9批、南柴胡5批)，9批黄芩、7批党参、8批甘草与8批姜半夏饮片，大枣与生姜饮片作为次要药味仅收集1批和2批。具体批号信息如下：

首先，按照中国药典对所有收集饮片进行含量测定、浸出物测定与水分测定。其次，按照浸出物与含量测定的综合评分排序，权重各赋值0.5，按照如下公式计算每批次每种原料药的得分。得分＝同一批同种原料药浸出物含量测定结果排序号*0.5+同一批同种原料药含量测定结果的排列号*0.5，在合格饮片中按照得分情况筛选高(得分最高值)、中(得分中位数)、低(得分最低值)三个质量水平的北柴胡、黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片。大枣与生姜饮片仅选择1个批次合格样品，南柴胡饮片按产地各选择1个批次合格饮片。

再次，根据筛选出三个水平的柴胡、黄芩、党参、姜半夏与甘草饮片，按照5因素3水平正交表(见表9)选择饮片，按照中国药典工艺制备方法，进行XCHT-1～XCHT-18共18批以北柴胡为君药的标准汤液煎煮，制备18批小柴胡颗粒标准汤剂，并制成冻干粉备用。另选择中位数水平黄芩、党参、甘草与姜半夏饮片分别与不同产地的南柴胡饮片，按照中国药典工艺制备方法，制备南柴胡组成的小柴胡颗粒标准汤剂，并制成冻干粉备用。标准汤剂煎煮过程中生姜与大枣均选择单一水平，减少实验次数。

表9正交表(1为高水平、2为中水平，3为低水平)

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上述小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉制备的制备方法为：按照2020版中国药典制备方法，取柴胡24g、黄芩9g、党参9g、甘草9g、大枣9g，加入8倍量水480ml(2000ml圆底烧瓶)，加热回流1.5h，过滤，残渣加入5倍量水300ml，继续加热回流1.5h，滤出，挤压残渣，合并两次滤液，减压浓缩至250ml。取生姜9g、姜半夏9g加入250ml的70％乙醇，置于渗漉中浸渍24h后渗漉，渗漉液减压浓缩至50ml。合并水提部分与醇提部分，减压浓缩至250ml，转移至1000ml茄形瓶中，-39℃旋转冷冻20min，置于冻干机，冻干，制备冻干粉备用。

2.2供试品溶液的制备

称量上述制备的20批小柴胡汤冻干粉，取样量均为0.20g，相当于原药的0.75g，分别加入25ml甲醇，超声提取30min，室温放置冷却后，甲醇补重，取上清液过0.22μm有机滤器，备分析用，即得供试品溶液。

各取20批小柴胡汤供试品提取液50μl，作为QC样品。每份样品平行制备2份。

2.3对照品溶液的制备

精密称量各对照品适量，甲醇定容，制成含甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、浓度为160μg/ml、440μg/ml、2570μg/ml、470μg/ml、265μg/ml、65μg/ml、370μg/ml、220μg/ml、65μg/ml、80μg/ml的混合对照品溶液

2.4色谱检测条件

将供试品溶液和混合对照品溶液注入色谱仪中检测，进样量均为3μl，色谱检测条件如下：岛津LC-30A超高效液相色谱仪，Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm,2.1×100mm)，柱温35℃，流速0.3ml/min，乙腈(A)-0.5％甲酸(B)梯度洗脱，0～2min，17％A；2～4min，17～20％A；4～7.5min，20～28％A；7.5～10min，28％A；10.5～16min,28～35％；16～18min，35～50％A；18～21min，50～52％A；21～22min，52％A；22～24min，52～60％A；24～30min，60～80％A；30～31min，80％A；检测波长为254mm；得到20批小柴胡标准汤剂指纹图谱和对照品色谱图。

2.5方法学考察：

取QC样品，按2.4项下色谱检测条件连续进样6次，考察仪器精密度。并于室温状态下0h、2h、4h、6h、12h、24h进样，考察样品日间稳定性。精密称量1批小柴胡颗粒标准汤剂样品，按2.2项下制备供试品溶液，平行制备6份，按2.4项下色谱检测条件检测，考察方法重复性。

2.6相似度评价

取市面上31家企业生产的47批小柴胡颗粒样品和小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉分别按照2.2项下方法制备供试品溶液，然后按照2.4项下色谱条件检测，得到47批小柴胡颗粒指纹图谱和小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱。

3、实验结果

3.1小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱

将20批小柴胡标准汤剂指纹图谱导入至“中药色谱指纹图谱相似度软件”进行共有峰指认与对照指纹图谱建立。色谱图见附图17。20批小柴胡颗粒标准汤剂共有26个共有峰，生成小柴胡颗粒标准汤剂对照指纹图谱。

将小柴胡颗粒标准汤剂对照指纹图谱与各组成单味药进行图谱比对，以及与混合标准品进行比对，小柴胡颗粒标准汤剂含上述混合标准品溶液中10个成分，见附图18。实验结果显示，经与单味饮片比较与混合标准品对比，小柴胡汤中保留时间10.3min与22～24min成分来源于柴胡。保留时间2.5～2.6min，9.5～13.0min，15.5min，20.5min与24.0min成分来自于黄芩。保留时间2.5～2.7min,21.3min,22.4min成分来源于甘草。保留时间7.9min，经与对照品指认发现，该峰为党参炔苷，来源于党参。大枣、姜半夏以及生姜药味在小柴胡颗粒标准指纹图谱中，除生姜在保留时间21.5min(6-姜辣素)贡献一个成分外，大枣以及姜半夏对小柴胡汤成分贡献在色谱图中无法体现。

3.2方法学考察

20批小柴胡颗粒标准汤剂共有26个共有峰，以黄芩苷(S14)为参照峰，根据各峰相对保留时间，计算精密度、重复性与稳定性。结果显示此26个共有峰精密度、重复性、日间稳定性相对保留时间RSD均小于3.0％(表10)，符合方法学要求。方法学考察结果显示，指纹图谱条件符合方法学要求，可用于质量评价与相似度计算。

表10小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱方法学考察结果(λ＝254nm)

注：S14为黄芩苷，为参照峰

以上结果表明，本发明建立的小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱包含主要药味的化学信息，可以较全面的并具有代表性的评价市面小柴胡颗粒样品质量。

3.3相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度软件”得到47批小柴胡颗粒与小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱相似度分布在0.74～0.99之间，市面上40批小柴胡颗粒与小柴胡颗粒标准汤剂指纹图谱相似度大于0.90，说明本发明建立的指纹图谱方法适用于市面上小柴胡颗粒的评价。

实验例5含量测定

1、仪器与试药：

市购31家公司生产的47批小柴胡颗粒样品信息见表11，其余仪器与试药同实验例1的仪器与试药项。

表11 31家企业生产47批小柴胡颗粒样品信息

2、实验方法

(1)供试品溶液的制备

取市购小柴胡颗粒按包装规格，随机抽取1/3包装盒内样品，将抽取小柴胡颗粒样品置于研钵中，研磨成粉末，使粉末通过60目筛，得到小柴胡颗粒。称取0.4g小柴胡颗粒(相当于生药量1.5g)，加入50ml甲醇，超声振荡提取30min，室温冷却后，甲醇补重，即得，每个供试品平行制备两份供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备

精密称量对照品适量，制成含甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1浓度为160μg/ml、440μg/ml、2570μg/ml、470μg/ml、265μg/ml、65μg/ml、370μg/ml、220μg/ml、65μg/ml、80μg/ml的混合标准品母液，倍比稀释成系列浓度，倍比稀释后成系列浓度(倍比系数为2)的混合标准品溶液。

(3)色谱检测条件

将供试品溶液和对照品溶液注入色谱仪中检测，样品进样量为2μl。色谱检测条件同实验例4。

3、方法学考察

(1)标准曲线及定量范围

取本实施例的混合标准品溶液2μl，依次注入至超高效液相色谱仪分析，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制10个成分的标准曲线见下表。

表12所测10个成分标准曲线线性关系考察与线性范围

上述多成分含量测定方法的方法学考察结果显示，10个成分的精密度结果RSD％在在0.51％～2.74％之间；稳定性结果RSD％在0.44％～0.62％之间；重复性结果RSD％在1.44～3.80％之间。均符合方法学要求。

(2)精密度及稳定性考察

精密吸取中浓度混合标准品溶液，并分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，考察10个定量成分的日间稳定性，其RSD％结果在0.44％～0.62％之间，均小于3％，甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1各成分RSD％分别为0.50％、0.62％、0.53％、0.54％、0.61％、0.59％、0.55％、0.59％、0.44％、0.54％，符合方法学要求。

重复进样同一中浓度混合标准品溶液5次，以峰面积计算其精密度RSD，10个成分精密度RSD％在0.51％～2.74％之间，均小于3％，符合方法学要求，甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1各成分峰面积RSD分别为1.10％、1.02％、1.09％、1.11％、0.51％、1.09％、2.74％、1.00％、0.88％、0.64％，符合方法学要求。

(3)重复性考察

取1份小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉，按供试液制备方法平行制备6份，考察10个定量成分的重复性。重复性结果显示10个成分RSD％在1.44～3.80％之间，均小于5％，甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1各成分RSD分别为3.66％、3.80％、2.74％、3.49％、2.19％、3.25％、2.00％、2.84％、1.44％、3.47％，符合方法学要求。

(4)加样回收率

精密称取同一份小柴胡颗粒标准汤剂冻干粉样品3份(相当于生药量1.5g)，按照本实施例的方法制备供试品溶液，分别从中取9份样品，按照每毫升中生药中含有10个成分的含量的80％、100％、120％加入标准品，涡旋，充分溶解，每个浓度平行制备3份。加入量与结果见表13。通过加样回收率实验发现，党参炔苷在样品中含量过低，仅在高浓度加样回收率下色谱图有显示，而6-姜辣素在加样回收率实验中出现色谱峰分离较差的情况，无法达到方法学95％-105％要求。故在含量测定实验中，去除6-姜辣素、党参炔苷两个定量成分。其余8个成分，满足加样回收率方法学考察。以上多成分含量测定方法，适用于同时测定小柴胡颗粒标准汤剂中甘草苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草皂苷G2、甘草酸、柴胡皂苷b2与柴胡皂苷b1的含量。

表13加样回收率考察结果表

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4、样品测试结果

按照本发明样品制备方法，测定47批小柴胡颗粒中8个成分含量。实验结果见表14，为方便比对不同规格，结果均以每袋中所含mg计。含量测定结果显示不同厂家柴胡与甘草的主要化学成分含量差异性较大。药典中仅针对黄芩苷进行含量测定，含量测定结果显示31家企业生产的47小柴胡颗粒中黄芩苷含量均符合药典要求，每袋不少于20mg，含量变化RSD为18.50％，所有厂家黄芩苷含量均符合药典要求，国内小柴胡颗粒中黄芩中成分黄芩苷与汉黄芩苷含量的RSD均小于30％。

44批小柴胡颗粒中柴胡皂苷b2与甘草酸含量在所建立含量方法的定量范围内，其中每袋小柴胡颗粒中柴胡皂苷b2含量在0.28～2.19mg范围波动，RSD为60.22％；每袋小柴胡颗粒中甘草酸含量在0.897～6.541mg范围波动，RSD为41.84％。因此，应对小柴胡颗粒中柴胡皂苷b2与甘草酸建立含量标准。以上结果显示，本发明设计的小柴胡颗粒标准汤剂多成分含量测定方法适用于市面上小柴胡颗粒的质量评价。

表14市面小柴胡颗粒含量测定结果(mg/袋，n＝2)

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注：“-”为未达到定量限,SSB1代表柴胡皂苷b1,SSB2代表柴胡皂苷b2

综合市面上小柴胡颗粒上述成分测定结果，小柴胡颗粒中柴胡、黄芩与甘草的主要成分柴胡皂苷b2、黄芩苷与甘草酸取得了较好的定量结果，证明此定量方法可行。此外，柴胡皂苷b2、黄芩苷、甘草酸应共同作为小柴胡颗粒的质量控制成分，从而保障多厂家生产的小柴胡颗粒质量均一性与稳定性。而且本发明提供的含量测定方法适用范围广，可适用于黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷b2低至6.7mg/袋、1mg/袋、0.2mg/袋的小柴胡颗粒的检测。

实施例1

本实施例提供了一种小柴胡颗粒指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备

取小柴胡颗粒，随机抽取1/3包装盒内样品，将抽取小柴胡颗粒样品置于研钵中，研磨成粉末，使粉末通过60目筛。称取0.4g小柴胡颗粒(相当于生药量1.5g)，加入50ml甲醇，超声振荡提取30min，室温冷却后，甲醇补重，平行制备两份。制得供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备

精密称量各对照品适量，甲醇定容，制成含甘草苷、党参炔苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草皂苷G2、甘草酸、6-姜辣素、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、浓度为160μg/ml、440μg/ml、2570μg/ml、470μg/ml、265μg/ml、65μg/ml、370μg/ml、220μg/ml、65μg/ml、80μg/ml的混合对照品溶液。

(3)高效液相色谱检测

将上述供试品溶液和混合对照品溶液分别注入岛津LC-30A超高效液相色谱仪中检测，进样量均为3μl，色谱条件如下：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm,2.1×100mm)，柱温35℃，流速0.3ml/min，波长254nm，乙腈(A)-0.5％甲酸(B)梯度洗脱，0～2min，17％A；2～4min，17～20％A；4～7.5min，20～28％A；7.5～10min，28％A；10.5～16min,28～35％；16～18min，35～50％A；18～21min，50～52％A；21～22min，52％A；22～24min，52～60％A；24～30min，60～80％A；30～31min，80％A。

得到小柴胡颗粒指纹图谱，如图20所示。共有26个特征峰，保留时间和与14号峰的相对保留时间分别为，2.342min，0.18，1号峰；2.966min，0.23，2号峰；3.155min，0.25，3号峰；7.076min，0.56，4号峰；7.726min，0.61，5号峰；8.941min，0.70，6号峰；9.552min，0.75，7号峰；10.055min，0.79，8号峰；11.026min，0.87，9号峰；11.305min，0.89，10号峰；11.447min，0.90，11号峰；11.851min，0.93，12号峰；12.132min，0.96，13号峰；12.683min，1.00，S峰，14号峰；13.064min，1.03，15号峰；15.273min，1.20，16号峰；15.744min，1.24，17号峰；16.538min，1.30，18号峰；17.402min，1.37，19号峰；19.663min，1.55，20号峰、20.392min，1.61，21号峰；21.090min，1.66，22号峰、21.396min，1.69，23号峰；21.825min，1.72，24号峰；21.955min，1.73，25号峰和22.647min，1.79，26号峰。

对比例1

本对比例提供了一种小柴胡颗粒指纹图谱的方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备：取同一批次小柴胡颗粒按包装规格，随机抽取1/3包装盒内样品，将抽取袋装小柴胡颗粒置于研钵中，研磨通过60目筛。称取0.4g小柴胡颗粒(相当于生药量1.5g)，加入50ml甲醇，超声振荡提取30min，室温冷却后，甲醇补重。

(2)高效液相色谱检测：以乙腈(A)-0.1％甲酸水，梯度洗脱，0-6min,25％A；6-12min,25-35％A；12-21min,35-60％A；21-27min，60-80％A；27-30min,80％A；检测波长210nm、254nm。柱温35℃。

得到小柴胡颗粒指纹图谱，如图19所示。

从图19中可以看出，参照峰黄芩苷前面的党参炔苷、甘草苷未检出。柴胡中柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1未与基线分离，无法定量(保留时间19-21min)。

对比例2采用乙腈-0.1％甲酸

本对比例提供了一种小柴胡颗粒指纹图谱的方法，包括如下步骤：

取实施例1的同一批小柴胡颗粒，本对比例的方法与实施例1的区别仅在于采用的流动性B不同，本对比例采用的流动相B为体积百分数为0.1％的甲酸水溶液。结果见图20。a是以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相时混合对照品溶液色谱图；b是以乙腈-0.5％甲酸水溶液为流动相时混合对照品溶液色谱图。

从图20对比可知，使用本发明乙腈-0.5％甲酸溶剂洗脱程序对小柴胡颗粒中保留时间17.5-19.5min色谱峰成分(来源于甘草与柴胡)的分离效果更良好；而使用乙腈-0.1％甲酸洗脱系统，18.5min色谱峰分离度小于1.5，无法与相邻峰分离。

对比例3波长210nm

本对比例提供了一种小柴胡颗粒指纹图谱的方法，包括如下步骤：

检测实施例1的同一批小柴胡颗粒，与实施例1的区别仅在于检测波长不同，本对比例采用的检测波长为210nm。结果见图21-b是以乙腈-0.5％甲酸水溶液为流动相时混合对照品溶液色谱图。

从图21可知，以210nm为检测波长时，基线发生漂移，混标溶液中柴胡皂苷b2、b1、甘草酸(保留时间18.5-20min)无法在基线漂移情况下进行达到峰面积准确积分。而柴胡皂苷b2是小柴胡复方制剂中主要成分，故210nm下不适宜作为小柴胡复方制剂的检测波长。

对比例4波长210nm，乙腈与水

本对比例提供了一种小柴胡颗粒指纹图谱的方法，包括如下步骤：

检测实施例1的同一批小柴胡颗粒，与实施例1的区别仅在于采用的流动性B以及检测波长不同，本对比例采用的流动相B为水，检测波长为210nm。结果见图21-a。a是以乙腈-水为流动相时混合对照品溶液色谱图。

从图21可知，以水为流动相B时，混标溶液中，黄芩苷无法在此条件下分离良好，而此成分为小柴胡复方制剂中现有质控成分。故乙腈-水系统不适宜作为小柴胡复方制剂洗脱系统。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）小柴胡复方制剂供试品溶液的制备：称取小柴胡复方制剂，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液，溶剂选自甲醇或者乙醇；

（2）取小柴胡复方制剂供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，采用Acquity UPLCBEH C18色谱柱，检测波长为254nm，流速为0.2-0.3ml/min，柱温30-40℃，进样量为2-10μl，以乙腈-含甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱；梯度洗脱程序包括：1）所述梯度洗脱程序包括：0~2min, 17vt%乙腈; 2~4min, 17~20vt%乙腈; 4~7.5min, 20~28vt%乙腈; 7.5~10min, 28vt%乙腈; 10.5~16min, 28~35vt%乙腈; 16~18min, 35~50vt%乙腈; 18~21min,50~52vt%乙腈; 21~22min, 52vt%乙腈; 22~24min, 52~60vt%乙腈; 24~30min, 60~80vt%乙腈; 30~31min, 80vt%乙腈；

或者，2）所述梯度洗脱程序包括：0~2min, 17vt%乙腈; 2~4min, 17~20vt%乙腈; 4~6min, 20~28vt%乙腈; 6~9min, 28vt%乙腈; 9~13min, 28~35vt%乙腈; 13~15min, 35~50vt%乙腈; 15~18min, 50~52vt%乙腈; 18~19min, 52vt%乙腈; 19~21min, 52~60vt%乙腈; 21~23min, 60~70vt%乙腈; 23~25min, 70vt%乙腈; 25~27min, 70~75vt%乙腈; 27~30min, 75~80vt%乙腈；

或者，3）所述梯度洗脱程序包括：0~2min, 15vt%乙腈; 2~4min, 15~20vt%乙腈; 4~7.5min, 20~28vt%乙腈; 7.5~10.5min, 28vt%乙腈; 10.5~16min, 28~35vt%乙腈; 16~18min, 35~50vt%乙腈; 18~21min, 50~52vt%乙腈; 21~22min, 52vt%乙腈; 22~24min,52~60vt%乙腈; 24~27min, 60~65vt%乙腈; 27~30min, 65~80vt%乙腈; 30~31min, 80vt%乙腈。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）还满足如下A-B中的任意一项或者多项：

A、加入10-40倍量溶剂，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.3-5h；

B、所述固液分离选自离心或者过滤。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）还满足如下1）-2）项中的任意一项或者多项：

1）所述的含甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.1%-0.5%；

2）高效液相色谱法的色谱条件还包括：流速为0.3ml/min；柱温为35℃；进样量为3μl。

4.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、党参炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-3中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品指纹图谱的步骤。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、党参炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2对照品，加溶剂制成每1ml含柴胡皂苷b2 1.02-65µg、柴胡皂苷b11.25-80µg、黄芩苷40.16-2570µg、黄芩素4.14-265µg、汉黄芩苷7.34-470µg、党参炔苷6.88-440µg、6-姜辣素3.44-220µg、甘草苷2.50-160µg、甘草酸5.78-370µg和甘草皂苷G21.02-65µg的混合对照品溶液。

6.一种小柴胡复方制剂的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

小柴胡复方制剂供试品溶液的制备：称取小柴胡复方制剂，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液，溶剂选自甲醇或者乙醇；

对照品溶液的制备：采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2对照品制备对照品溶液；

测试步骤：取小柴胡复方制剂供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱法检测，以Acquity UPLC BEH C18色谱柱为色谱柱，以乙腈-含甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.2-0.3ml/min，梯度洗脱程序包括：0~2min, 17vt%乙腈; 2~4min, 17~20vt%乙腈; 4~7.5min, 20~28vt%乙腈; 7.5~10min, 28vt%乙腈; 10.5~16min, 28~35vt%乙腈;16~18min, 35~50vt%乙腈; 18~21min, 50~52vt%乙腈; 21~22min, 52vt%乙腈; 22~24min, 52~60vt%乙腈; 24~30min, 60~80vt%乙腈; 30~31min, 80vt%乙腈。

7.根据权利要求6所述的小柴胡复方制剂的含量测定方法，其特征在于，对照品溶液的制备中，所采用的对照品还包括党参炔苷和/或6-姜辣素中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的小柴胡复方制剂的含量测定方法，其特征在于，

所述小柴胡复方制剂供试品溶液是按照权利要求1-3中任一所述的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法中的步骤（1）的方法进行制备；所述测试步骤还满足如下1）-2）项中的任意一项或者多项：

1）所述的含甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.1%-0.5%；

2）高效液相色谱法的色谱条件还包括：流速为0.3ml/min；柱温为35℃；进样量为3μl。

9.权利要求1-5中任一项所述的小柴胡复方制剂指纹图谱的构建方法和/或权利要求6-8中任一所述的小柴胡复方制剂的含量测定方法在小柴胡复方制剂产品的质量检测中的用途。

10.一种小柴胡复方制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱与小柴胡复方制剂对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测小柴胡复方制剂产品的指纹图谱为使用待测小柴胡复方制剂产品按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到；所述小柴胡复方制剂对照指纹图谱选自如下（1）-（5）中的任意一项：

（1）其具有26个共有峰，保留时间分别为2.342min、2.966min、3.155min、7.076min、7.726min、8.941min、9.552min、10.055min、11.026min、11.305min、11.447min、11.851min、12.132min、12.683min、13.064min、15.273min、15.744min、16.538min、17.402min、19.663min、20.392min、21.090min、21.396min、21.825min、21.955min和22.647min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0%；

（2）其具有26个共有特征峰，各特征峰与14号峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；1号峰-26号峰的规定值分别为：0.18、0.23、0.25、0.56、0.61、0.70、0.75、0.79、0.87、0.89、0.90、0.93、0.96、1.00、1.03、1.20、1.24、1.30、1.37、1.55、1.61、1.66、1.69、1.72、1.73和1.79；

（3）其具有26个共有特征峰，各特征峰与14号峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；1号峰-26号峰的规定值分别为：0.18、0.23、0.25、0.56、0.61、0.70、0.75、0.79、0.87、0.89、0.90、0.93、0.96、1.00、1.03、1.20、1.24、1.30、1.37、1.55、1.61、1.66、1.69、1.72、1.73和1.79；而且其中有1-10个特征峰分别与对照品指纹图谱中的1-10个特征峰的保留时间相同或者其中有1-10个特征峰的保留时间与对照品指纹图谱中的1-10个特征峰的保留时间的RSD<5.0%，所述对照品指纹图谱为权利要求4所述的对照品指纹图谱；

（4）使用单批次或者多批次小柴胡复方制剂按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到的小柴胡复方制剂指纹图谱；

（5）使用多批次小柴胡复方制剂按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱；和/或，包括将待测小柴胡复方制剂产品按照权利要求6-8中任一所述的小柴胡复方制剂的含量测定方法测定含量的步骤。

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