CN113136393A - 一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用 - Google Patents

一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用 Download PDF

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Abstract

本发明专利属于水稻品种基因工程领域，具体一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用，miR398b前体序列片段的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。本发明通过CRISPR‑Cas9技术基因敲除OsmiR398b基因，显著增加了OsCSD2基因在水稻中的表达量，提高了水稻SOD酶活性，增加水稻对镉的抗性，同时也降低水稻镉的积累量。

Description

一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用
技术领域
本发明专利属于水稻品种基因工程领域，具体一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用，通过干扰OsmiR398b基因可用于提高植物对重金属镉的抗性，降低镉污染对水稻的不良影响。
背景技术
稻田镉污染问题日益严峻，已经成为农作物质量安全的严重隐患。水稻是中国最重要的粮食作物，能够富集和积累较多的镉，镉在水稻中的积累会造成营养缺乏、叶绿素合成抑制、光合作用降低、氧化应激等毒害反应。更为严重的是，镉通过食物链在人体中，会引起人体多种疾病发生，包括痛痛病、肾功能紊乱、心脑血管疾病，甚至癌症，镉积累也对整个粮食产业、加工出口均造成了重大打击。目前，培育低Cd水稻，保障粮食生产安全是我们迫切需要解决的问题之一。
随着稻田镉污染问题的日益严峻，关于水稻耐镉性能也不断在研究中，例如公开号为CN105755022A、公开日20160713的中国发明专利申请专利公开的一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白，基因OsGSTU5编码表达蛋白质谷胱甘S-转移酶（glutathione-S-transferase, GSTs），催化谷胱甘肽（glutathione, GSH）与镉螯合，促进镉的代谢隔离，从而提高植物耐镉能力。其通过构建OsGSTU5基因的水稻过表达株系，提高水稻植株对镉胁迫的耐受能力。通过水稻耐镉基因OsGSTU5的生理特性及调控机制研究，为镉胁迫下植物的生理功能及调控机理研究提供了基因资源和理论依据，同时为GSTs蛋白超级家族的功能研究提供基因资源。又如公开号为CN111041035A、公开日20200421的中国发明专利申请专利研究的水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用，将所述的OsNAC3基因的超表达载体转入宿主，能够提高宿主植物的耐镉性，因此，OsNAC3基因在增加植物耐镉能力方面具有良好应用前景。
研究还显示，镉在植物体内的过多积累，会诱导产生活性氧（ROS，如过氧化氢、超氧阴离子、氧自由基等），ROS能被抗氧化物和抗氧化物酶有效清除，这些抗氧化物和抗氧化物酶能够缓解水稻镉的毒害，其对水稻镉的吸收和积累没有一致结果。超氧化物歧化酶（SOD）是清除植物体内多余的ROS的一种重要酶，是保障植物氧化还原平衡的关键酶，能够保障镉胁迫条件下的水稻生长安全。因此，提高SOD酶活性，不但能够增加植物对外界镉污染生态环境的抗逆性，也能够通过改善膳食（高SOD大米）增加人体抵抗机能。研究表明，CSD2基因表达是产生SOD酶及活性的关键，CSD2基因敲除显著降低水稻SOD酶活性，严重抑制水稻生长，CSD2基因表达量增加能够增加SOD酶含量及清除活性氧的能力。
发明内容
本发明的第一目的是提供miR398b前体序列片段的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。
CSD2基因的转录和翻译受非编码RNAs（miRNA）负调控，miR398b是一种非编码RNA分子，长度约为20-22个核苷酸，能通过序列特异性方式切割CSD2基因的转录或通过翻译抑制其表达。通过干扰miR398b基因表达将上调CSD2基因以及蛋白表达量，增加水稻对镉抗逆性。
本发明首次公布了miR398b在镉积累以及水稻抗镉过程中起到了至关重要的作用，能够显著缓解水稻镉的毒害，降低镉的积累，减少水稻镉毒害风险的途径和方法。
本发明的第二目的是提供一种OsmiR398b干涉片段，其负链具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，5’-AGAGTCCCGGCAGGGGCGACCTGAGAACACACGAAAGACCAGACCGCCTCATACCGTGTGTTCCCAGCTCGCCCCTGTAGGAACTCC-3’。
正链具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，5’-GGAGTTCCTACAGGGGCGAGCTGGGAACACACGGTGATGAGGCGGTCTGGTCTTTCGTGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCCGGGACTCT-3’。
利用此RNA干涉片段能够显著的降低水稻中的重金属镉的积累量。
本发明的第三个目的是提供一种miR398b干涉片段的表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻金属耐受蛋白基因OsCSD2的OsmiR398b干涉片段。
本发明的第四目的是提供OsmiR398b干涉片段的应用，用于增加植物对金属的抗性。
进一步说，是增加植物对镉金属的抗性。
尤其是，增加水稻对镉金属的抗性，同时也降低水稻镉的积累量。
通常认为，水稻耐镉性能的提升，是因为诱导了水稻体内相关的抗性蛋白（例如谷胱甘肽、螯合肽、金属硫蛋白）的过量表达，能够将镉螯合在液泡等非代谢区域，减少可食用部分的毒害症状，但是水稻本身体内的镉积累量并不会减少，反而会被认为是生长良好的水稻被误食。而在本申请敲除OsmiR398b基因的水稻中意外发现，水稻镉的积累量降低了。
本发明的第五目的是一种提升水稻耐镉性的方法，降低水稻OsmiR398b的表达量。
本发明通过CRISPR-Cas9技术基因敲除OsmiR398b基因，显著增加了OsCSD2基因在水稻中的表达量，提高了水稻SOD酶活性，增加水稻对镉的抗性，同时也降低水稻镉的积累量。目前虽然有研究表明OsmiR398b及其靶基因参与了水稻Cd和铜胁迫响应，但是还未有OsmiR398b调控镉抗性和积累量的报道。本发明公布了非编码RNAs的OsmiR398b的基因新功能及应用方法，为水稻及其他作物品种基因育种提供新的方法和途径。
附图说明
附图1为CRISPR-Cas9骨架载体的T-DNA区结构图；
附图2为水稻遗传转化过程图；
附图3为OsmiR398b敲除植株目的片段PCR鉴定图；
附图4为CdCl2处理对野生型（WT）和转基因水稻生长变化的影响。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明进行进一步地详细说明。下述实施方式中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
miR398b干涉片段的表达载体的构建：
（1）获取OsmiR398b基因序列及靶位点
利用miRBase数据库，筛选OsmiR398b序列和前体序列，并对OsmiR398b的基因组序列进行确认，在OsmiR398b转录之前，其前体序列的正链和负链上分别设计Cas9识别靶标记位点。
前体序列为：
5’-GGAGTTCCTACAGGGGCGAGCTGGGAACACACGGTGATGAGGCGGTCTGGTCTTTCGTGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCCGGGACTCT-3’。
（2）引物设计并获得向导RNA（sgRNA）片段
在上、下游引物的5’端分别加上tgca和aaac作为酶切接口，添加cagt作为保护位点，GGTCTCA作为酶切识别位点。
OsmiR398b的Primer F：cagtGGTCTCAtgcatgttcccagctcgcccctgt；
OsmiR398b的Primer R：cagtGGTCTCAaaacacaggggcgagctgggaaca。
在上游引物中，酶切接口tgca之后的20位碱基为sgRNA，在下游引物中，酶切接口aaac之后的20位碱基是sgRNA的互补序列，进行PCR基因扩增。
（3）水稻CRISPR-Cas9骨架载体的构建
将pCAMBIA1300的骨架进行改造，获得我们所需要的载体，空载pBWA（V）HU-YLCas9含有潮霉素抗性基因、Cas9蛋白、启动子、终止子和ccdB元件，空载pBWD（LB）DNAi只含有ccdB元件，通过Eco31I酶进行酶切，将向导RNA（sgRNA）片段连接到pBWA（V）HU-YLCas9载体，通过Eco31I酶酶切空载体：pBWA(V)HU-YLCas9，通过LguI酶对中间载体进行酶切，然后用T4DNA连接酶将其分别与OsmiR398b连接，从而获得最终载体pYL-HU-OsmiR398b。载体中35S*2启动潮霉素抗性基因Hygromycin，Ubi启动Cas9蛋白，OsU3启动sgRNA，并检测载体序列（重组载体如图1）。
实施例2：
农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化
（1）水稻种子诱导愈伤与继代：将水稻日本晴（Oryza sativa L. Japonica cv.“Nipponbare”）种子剥去颖壳，放置于37℃ 恒温箱烘干；超净台中，用无菌水清洗，将水沥干；使用75% （v/v）的酒精振荡洗涤；再用无菌水清洗，将水沥干；加入25%次氯酸钠（NaClO）溶液没过种子，置于摇床上以100 rpm的速度振荡清洗30min，漂洗完之后使用无菌水清洗；倒掉无菌水，将水稻种子均匀铺放在无菌滤纸上以除去其表面残留的水分，吹干之后，将干燥的种子接种到诱导培养基中，于30℃暗培养箱中培养40天左右；40天之后，将种子盾片上长出的淡黄色颗粒状愈伤组织剥离，放入继代培养基中培养，30℃暗培养2周。诱导和继代培养基：N6基本 培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate） 400mg/L+2，4-D2.0mg/L+植物琼脂（Agar）8.0g/L（pH5.8）。
（2）农杆菌的培养：
挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
将构建好的表达载体电击法导入至农杆菌EHA105感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素（kana）和50mg/L利福平（rif）抗生素的LB固体平板上，28℃培养40小时左右；挑取单菌落接种至5mL LB三抗液体培养基中，在摇床上以250rpm速度震荡，28℃培养30-36h；取0.5-1mL菌液以1：100（v/v）的比例接种到LB三抗液体培养基中进行扩大培养，28℃震荡培养，控制OD值范围在0.2-0.5。
（3）侵染与共培养：
将扩大培养的农杆菌菌液倒入离心管中，4000rpm低温（4 ℃）离心20min；弃去上清，加入5mL的悬浮培养基，吹打混匀之后，再用悬浮培养基加满离心管，轻微混匀之后，放置冰上20min；将继代两周的愈伤组织置于育苗盒中，倒入悬浮后的农杆菌菌液，常温置于摇床上，100rpm震荡15min；去除菌液，将愈伤组织均匀铺放于装有滤纸的大平皿中，充分摆开，晾干0.5-1.5小时；铺一层无菌滤纸在共培养培养基上，并在滤纸上滴加1mL悬浮培养基；待愈伤组织晾干之后，将愈伤组织夹入共培养培养基上，28℃暗培养3天。共培养培养基：N6基本培养基+蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白 （caseinhydrolysate）400mg/L+脯氨酸（proline）250mg/L+葡萄糖（glucose）10g/L+AS（乙酰丁香酮）100μmol/L+植物凝胶（Phytagel）4.0g/L（pH5.2）。悬浮培养基：AAM培养基+蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+AS（乙酰丁香酮）100μmol/L（pH5.2）。
（4）洗愈伤与筛选：将暗培养3天染有大量农杆菌的愈伤组织，置于育苗盒中，用无菌水洗涤数次，直至洗涤愈伤的水清澈透亮；在无菌水中加入500mg/L的羧苄青霉素，浸泡愈伤组织，在摇床上以100 rpm的速度震荡洗涤15min；沥尽无菌水，将愈伤组织均匀铺放于含有无菌滤纸的大平皿中，晾干之后接于一筛培养基中，28℃暗培养两周；筛选两周的愈伤组织再转入二筛选培养基中，继续培养15-30天，直至观察到在褐化愈伤组织边缘重新生长出亮黄色的抗性愈伤组织。一筛培养基：N6基本培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+2，4-D2.0mg/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+头孢霉素（Cef）250mg/L+植物琼脂（Agar）8.0g/L（pH5.8）。二筛培养基：N6基 本培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+2，4-D2.0mg/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+头孢霉素（Cef）250mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.8g/L（pH5.8）。
（5）分化与生根：将经过筛选之后长出的淡黄色，质地紧密的抗性愈伤组织转移至分化培养基中，在16小时光照，8小时黑暗条件下培养40-60天；待分化培养基中长出的小苗达到9cm以上时，将小苗接入含有抗生素潮霉素的生根培养基中，培养成活的水稻即为T0代植株。分化培养基：MS基本培养基+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）0.8g/L+蔗糖（sucrose）30g/L+NAA（萘乙酸）0.2mg/L+IAA（吲哚-3-乙酸）0.2mg/L+KT（激动素）2mg/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.8g/L（pH5.8）。生根培养基：1/2 MS基本培养基+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）0.8g/L+蔗糖（sucrose）30g/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.5g/L（pH5.8）。
（6）检测：获得T1代植株后，通过目的基因PCR检测（如附图3所示）与测序来筛选敲除阳性苗，PCR检测结果如附图3所示，测序结果如表1所示，显示遗传转化之后，得到了OsmiR398b敲除苗8株。OsmiR398b扩增片段大小为427 bp，以转化后的农杆菌和试剂体系为阳性对照和阴性对照，确认8株OsmiR398b敲除苗均为阳性，分析测序的结果，解码正确的突变形式。之后经繁种获得了T2代的转基因苗，并通过qRT-PCR来鉴定敲除阳性苗。
实施例3：
基因过表达水稻植株的获得：
载体构建如下：
1、通过miRBase检索水稻OsmiR398b的基因组位置、前体序列以及成熟体序列，用GUS基因作为报告基因构建OsmiR398b过表达载体。在设计引物时，添加GGTCTCA作为Eco31I的酶切识别位点，OsmiR398b引物序列如下所示：OsmiR398b-F：CAGTGGTCTCACAACGGAGTTCCTACAGGGGCGAG；OsmiR398b-R：CAGTGGTCTCATACAAGAGTCCCGGCAGGGGCGAC。GUS基因GFP-F：CAGTGGTCTCAGGGTTGTATCGTGAAGGGCGAGGA；GFP-R：cagtGGTCTCatacatcagtagagctcgtccatgc。
2、分别以水稻基因组DNA、水稻cDNA和载体DNA为模板扩增OsmiR398b前体基因序列。50 μL的PCR反应体系，完成PCR扩增：第一步：94 ℃预变性5 min；第二步：94 ℃变性30s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，30个循环；第三步：72 ℃终延伸10 min，并用1.2 %的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。
3、电泳结束之后，将88 bp（OsmiR398b）的凝胶片段切下，放同一个体系进行胶的回收，用30 μL水进行溶解，回收DNA，并将回收的DNA片段（标记为rDNA-A1），用Eco31I酶分别酶切rDNA-A1和载体，具体的酶切体系如下（20 μL）：Buffer：2μL；rDNA-A1：4μL；Eco31I：1；无菌水：13μL；37 ℃水浴酶切1 h，后将rDNA-A1和载体的酶切产物放在一起，通过PCR纯化试剂盒进行纯化，并将获得的纯化产物标记为P-rDNA-A1，后用T4 ligase连接，在20 ℃连接1 h。
4. 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞、农杆菌介导、转基因植株阳性检测方法同基因敲除。
实施例4：
对实施例2获得的基因敲除阳性水稻植株、实施例3所得的基因过表达水稻植株和野生型的水稻植株进行耐镉性能检测：
检测方法：
将野生型水稻种子、基因敲除阳性水稻种子、基因过表达水稻种子发芽5天后，将发芽一致的幼苗移栽到水培器皿中。培养条件相同，在植株长到4叶期（25天左右）时，对其进行0μM和25μM的CdCl2处理，镉处理14天后，观察各处理植株的表型。
结果：
在0μMCdCl2处理下，三者表型无明显区别。在25μM的CdCl2处理下，大部分基因敲除阳性植株相对于野生型植株，株高更高，分蘖数更多。而基因过表达植株相对于野生型植株，株高低，分蘖数更少。(见图4、表1)。该结果说明OsmiR398b基因确实与耐镉相关，其干涉表达能提高转基因植物的耐镉性。
另还对野生型水稻、基因敲除阳性水稻、基因过表达水稻体内的镉含量进行了检测，发现在25μM的CdCl2处理下，基因敲除阳性植株镉积累量最少，野生型次之，基因过表达植株镉积累量最多，见表2。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 日本晴水稻(Oryza.Sativa L.spp.japonica)
<220>
<222> (1)..(88)
<223> OsmiR398b前体序列
<400> 1
ggagttccta caggggcgag ctgggaacac acggtgatga ggcggtctgg tctttcgtgt 60
gttctcaggt cgcccctgcc gggactct 88
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 日本晴水稻(Oryza.Sativa L.spp.japonica)
<220>
<222> (1)..(87)
<223> OsmiR398b干涉片段负链
<400> 2
agagtcccgg caggggcgac ctgagaacac acgaaagacc agaccgcctc ataccgtgtg 60
ttcccagctc gcccctgtag gaactcc 87
<210> 3
<211> 88
<212> DNA
<213> 日本晴水稻(Oryza.Sativa L.spp.japonica)
<220>
<222> (1)..(88)
<223> OsmiR398b干涉片段正链
<400> 3
ggagttccta caggggcgag ctgggaacac acggtgatga ggcggtctgg tctttcgtgt 60
gttctcaggt cgcccctgcc gggactct 88

Claims (7)

1.一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的miR398b的前体序列，其特征在于，其核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。
2.一种OsmiR398b干涉片段，其特征在于，其负链具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，正链具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
3.一种miR398b干涉片段的表达载体，其特征在于，该表达载体克隆有如权利要求2所述的OsmiR398b干涉片段。
4.如权利要求2所述的OsmiR398b干涉片段的应用，其特征在于，用于调控植物对重金属的抗性。
5.根据权利要求4所述的OsmiR398b干涉片段的应用，其特征在于，用于调控植物对重金属镉的抗性。
6.根据权利要求4所述的OsmiR398b干涉片段的应用，其特征在于，用于调控水稻对过量金属供应的抗性。
7.根据权利要求4所述的OsmiR398b干涉片段的应用，其特征在于，用于降低水稻镉的积累量。
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CN112500460A (zh) * 2020-11-18 2021-03-16 中国水稻研究所 调控水稻镉砷积累的突变基因OsABCC1及其应用

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