CN113134084A - 谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒及其制备，该复合纳米颗粒从内至外依次是金纳米颗粒、聚多巴胺涂层和接枝的甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇。复合颗粒的尺寸小，包覆的PDA涂层与长链的聚乙二醇使其具有良好的生物相容性，也减少了网状内皮系统的吞噬，增加了其血液停留时间，在静脉注入后可以高效富集到肿瘤区域；到达肿瘤细胞中后，肿瘤微环境中高浓度的还原型谷胱甘肽将复合纳米颗粒中的二硫键还原为巯基断裂，纳米颗粒脱去聚乙二醇后打破了颗粒之间原有的静电平衡，大的聚集体形成后将颗粒的LSPR转移到近红外光区域，增强其对近红外光吸收能力，从而可以用于肿瘤的光声成像与光热治疗。

Description

谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒及其制备
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒及其制备。
背景技术
癌症是一种因为细胞异常生成而引起的高致死率疾病，根据世界卫生组织的报告，在2015年因癌症死亡的人数达到880万。常见的癌症治疗手段是以药物为基础，辅以化疗或放射治疗，其目的都是为了杀死肿瘤细胞。然而长期的药物治疗会使患者对药物产生耐药性，治疗效果会逐步变差，化疗和放射疗法会对病灶周围健康组织产生同等的损害，这些传统疗法的副作用都较为明显。
光热疗法是一种治疗肿瘤的新方法，其具有很大的发展潜力。光热治疗法是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法，该方法普遍具有无毒无害，患者痛感少和治疗时间短的优点。
光声成像是光声效应而兴起的生物医学成像方式，通过这种方式可以在没有电离辐射的情况下，以高空间分辨率实时获得有关病变组织的解刨、功能和分子含量信息。光声成像具有很高的空间分辨率和很深的成像深度，与超声成像相比其具有更好的组织对比度。
但是想要达到最佳的光热治疗和光声成像效果，设计研发高效的光热材料具有重要意义。
金纳米粒子具有独特的光学和表面等离子共振(SPR)特性，也具有比表面积大、生物相容性好等优势性能，颗粒通过增强渗透性和滞留性富集到肿瘤中，通过被动靶向的方式到达肿瘤区域。金纳米颗粒在可见光或近红外光区域有强的光吸收，在相应波长激光照射下会释放出大量的热能。金纳米粒子吸收的光比有机染料分子强数百万倍，被吸收的光几乎全部通过非辐射性质被转换成热来造成肿瘤的损伤。利用金纳米颗粒表面等离子共振峰可以实现在可见光区域强吸收，用连续激光照射后。可以实现光热治疗。但是值得注意的一点是，对于皮下和深埋在组织内的肿瘤治疗，近红外光是必须的，因为其相比于可见光具有较强的穿透深度，而且这一区域对组织中的血红蛋白和水分子吸收都很小，所以，作为光热治疗剂，金纳米颗粒必须具有近红外强吸收能力。
虽然金纳米颗粒具有良好的可见光区域光声成像与光热治疗效果，但在实体肿瘤治疗时需要通过近红外光去触发光声成像与光热治疗以达到高穿透深度的效果。而问题是，相比于大尺寸的纳米粒子，小尺寸的金纳米颗粒才更适用于静脉注射到生物体内，因为其血液停留时间长，生物半衰期短；但是又只有大尺寸的金纳米颗粒才表现出光声成像与光热治疗所需的近红外光强吸收能力，这就产生了一个矛盾，这个矛盾也是本领域目前首要要解决的重要问题之一，虽然近年来也提出了一些解决策略，但是实用、方便、易于功能化且能解决小尺寸金纳米颗粒近红外区吸收增强问题的策略还是未见报道。
中国专利CN 109528690 B公开一种双响应的中空介孔硅包覆聚多巴胺接枝聚乙二醇甲基丙烯酸酯载药微球及其制备方法，聚多巴胺包覆主要赋予了中空介孔硅独特的谷胱甘肽响应性，接枝聚乙二醇后可提高纳米微球的生物响应性和水溶性，改性后的中空介孔硅可达到靶向治疗的目的。但是该方案主要还是要解决的药物缓释问题，希望通过药物完成肿瘤的治疗，并不能对肿瘤诊断产生有益效果也不能用于肿瘤的光热治疗中，该材料用于肿瘤治疗时效果并不理想且会产生较强的毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒及其制备，可将小尺寸金纳米颗粒利于静脉给药和大尺寸金纳米颗粒利于肿瘤光热治疗与光声成像的优势进行结合统一，为肿瘤的光热治疗与光声成像提供更好的解决方案。
本发明的技术方案为：
一种谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒，该复合纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm内部为金纳米颗粒，金纳米颗粒外部包覆有聚多巴胺涂层，在聚多巴胺涂层外部接枝有甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇；
进一步地，复合纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm在进入肿瘤细胞后，在谷胱甘肽的还原下会使得聚乙二醇包覆层中双硫键被还原为巯基进而脱去该包覆层，颗粒聚集形成聚集体，金纳米颗粒原先处于可见光区域的表面等离子共振峰会红移至近红外光区域，在近红外区出现光吸收带。
进一步地，金纳米颗粒的粒径为20-40nm，聚多巴胺包覆层的厚度在6-10nm。
上述谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法如下：
(1)活化甲氧基封端羧基聚乙二醇的羧基端：按摩尔比配制1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和甲氧基封端羧基聚乙二醇溶液，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，将上述溶液混合后放入恒温磁力搅拌机中按条件进行搅拌反应；
(2)偶联胱胺二盐酸：向步骤(1)所得混合溶液中按摩尔比加入胱胺二盐酸，并加入40μL三乙胺，放入恒温磁力搅拌机中按条件进行搅拌反应；
(3)提纯得到白色絮状目标产物甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇(mPEG-CONH-ss-NH2)，进行冷冻干燥处理备用；
(4)采用种子介导生成法制备尺寸为20-40nm的金纳米颗粒：在三口瓶中加入50mL柠檬酸钠水溶液，加热至100℃后加入0.34mL氯金酸水溶液，生产金颗粒种子大小至10nm后，将温度降至90℃；
(5)向步骤(4)所得溶液中立即加入0.34mL柠檬酸钠水溶液与0.34mL氯金酸水溶液，该过程重复三次后得到尺寸为20-40nm的金纳米颗粒水溶液，离心提纯，于4℃保存；
(6)配制多巴胺水溶液，向多巴胺水溶液中加入步骤(5)中所制备的金纳米颗粒水溶液，加入一定量的三羟甲基氨基甲烷(Tris-hcl)调节PH为8.5，放入超声池中超声反应，离心提纯，得到Au@PDA纳米颗粒胶体水溶液；
(7)配制5mL mPEG-CONH-ss-NH2水溶液，向其中加入5mL步骤(6)制备的Au@PDA纳米颗粒胶体水溶液，并加入一定量氨水调节PH为8.5，放入恒温磁力搅拌机上按条件进行反应，反应结束后离心提纯，得到谷胱甘肽刺激诱导聚集型金纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm NPs。
进一步地，步骤(2)中，EDC、NHS、mPEG-COOH和Cys的摩尔比为4:6:1:5。
进一步地，步骤(1)和(2)中进行搅拌反应时需在避光环境下进行，并需鼓氮除氧，步骤(1)中搅拌反应时间为6-8小时，步骤(2)中搅拌反应时间为10-14小时。
进一步地，步骤(4)中柠檬酸钠水溶液浓度为2.2mM，氯金酸水溶液浓度为25mM。
进一步地，步骤(5)中柠檬酸钠水溶液浓度为60mM，氯金酸水溶液浓度为25mM。
在体外水溶液中，本申请制备的金纳米颗粒(Au@PDA-ss-PEGm NPs)具有薄的聚多巴胺涂层与甲氧基封端的胱胺化聚乙二醇包覆层，因此屏蔽掉了颗粒表面大量负电荷，这极大的提升了其在各种生物环境中的稳定性，也具有良好的生物相容性，同时具有小尺寸纳米颗粒血液循环时间长，生物半衰期短等优势，可以通过静脉注射最大程度的富集到肿瘤区域而不用担心被网状内皮系统大量吞噬。
在金纳米颗粒(Au@PDA-ss-PEGm NPs)到达肿瘤细胞内后，由于肿瘤细胞内存在着比正常细胞浓度高1000倍的谷胱甘肽作为还原剂，使颗粒聚乙二醇包覆层中双硫键被还原为巯基，这会使颗粒脱去这层包覆层使颗粒表面暴露在肿瘤细胞高盐离子环境中，打破原有的静电平衡状态，导致颗粒聚集形成聚集体；形成的聚集体会形成耦合等离子激元模式，这可以将原本金纳米颗粒处于可见光区域的表面等离子共振峰红移至近红外光区域，导致在近红外区有很强的光吸收带出现。当用具有高组织穿透深度的808nm连续或脉冲激光器照射肿瘤区域时，会因为金纳米粒子优异的光热性能产生大量的热量，这不仅可以应用于肿瘤的光热治疗消融肿瘤上，也可利用产生的热弹效应应用于体内肿瘤的光声成像之中。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1.本发明通过在金纳米颗粒外部包覆有聚多巴胺涂层，在聚多巴胺涂层外部利用席夫碱反应或迈克尔加成反应接枝甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇，使得制备的复合金纳米颗粒兼具小尺寸和大尺寸金纳米颗粒的优势，既能利用静脉给药方式到达肿瘤区域，又能在达到肿瘤区域后对肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽做出响应，实现大的聚集体的产生，进而产生耦合等离子体共振，增强近红外光吸收，用808nm低功率激光照射，通过物理治疗方式肿瘤，对其他正常细胞没有毒副作用，光声成像和光热治疗过程具有时空寻址性和局部性；
2.本申请制备的复合金纳米粒子由于具有薄的聚多巴胺涂层与甲氧基封端的胱胺化聚乙二醇包覆层，因此屏蔽掉了颗粒表面大量负电荷，这极大的提升了其在各种生物环境中的稳定性，也具有良好的生物相容性；
3.本申请制备的复合金纳米粒子中金颗粒的粒径在40nm左右，聚多巴胺涂层厚度为10nm左右，复合颗粒的整体粒径小，使得该复合颗粒具有小尺寸纳米颗粒血液循环时间长，生物半衰期短等优势，可以通过静脉注射最大程度的富集到肿瘤区域而不用担心被网状内皮系统大量吞噬；
4.本申请在金纳米颗粒外包裹的聚多巴胺涂层不仅进一步提高了金纳米颗粒的光学性能，也为更多功能化分子的接枝提供了更多简单的官能团位点，可以为未来潜在的更多金纳米颗粒“智能”化应用提供便捷，从而构建最初不具备的高级功能，有效用于生物医学应用中；
5.金纳米颗粒本身具有很好的生物相容性，且合成复合纳米颗粒的过程大部分也是在水相中进行的，因而复合颗粒也具有很高的生物相容性，作用过程中对细胞伤害小，也减少了网状内皮系统对纳米颗粒的吞噬，增加了其血液停留时间，以便于在静脉注入后可以高效率的富集到肿瘤区域，而不会在传递过程中出现聚集现象。
附图说明
图1是谷胱甘肽刺激诱导聚集型金纳米颗粒(Au@PDA-ss-PEGm NPs)的制备流程图；
图2是Au@PDA-ss-PEGm NPs的TEM图；
图3是甲氧基封端胱胺化聚乙二醇(mPEG-CONH-ss-NH2)与甲氧基封端羧基聚乙二醇的傅里叶红外光谱图；
图4是甲氧基封端胱胺化聚乙二醇(mPEG-CONH-ss-NH2)的X射线光电子能谱图；
图5中，a)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒的动态光散射(DLS)图谱、b)为Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒的Zeta电位图；
图6中，a)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒置于细胞盐环境PBS前后的紫外-可见光吸收光谱图；b)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒在谷胱甘肽与细胞盐环境PBS存在下的紫外-可见光吸收光谱图；c)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒在谷胱甘肽与细胞盐环境PBS存在下、紫外-可见光吸收光谱图随时间的变化情况；d)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒在谷胱甘肽与细胞盐坏境PBS存在下、紫外-可见光吸收光谱图随谷胱甘肽浓度的变化。
图7中，a)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒在有无谷胱甘肽与细胞盐环境PBS存在下经过激光照射5分钟后的光热变化曲线图谱；b)是Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒在有无谷胱甘肽与细胞盐环境PBS存在下经过脉冲激光照射后的光声信号变化图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备
(1)EDC/NHS反应活化羧基
按照摩尔比取一定量的甲氧基封端羧基聚乙二醇(mPEG-COOH)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于玻璃瓶中的DMF溶液中，加入磁子，放入恒温磁力搅拌机中按条件进行反应，以活化甲氧基封端羧基聚乙二醇中的羧基形成具有偶联氨基活性的O-酰基异脲中间体，而NHS则用于增加中间体的稳定性来提高产率。
具体过程如下：
a、选取纯净干燥处理过后的20mL玻璃瓶作为反应容器，将磁子放入其中后放置于磁力搅拌机中，转动磁子；
b、分别配置5mL EDC、NHS、mPEG-COOH和DMF溶液；
c、将配好的EDC、NHS、mPEG-COOH和DMF药品溶液分别加入到玻璃瓶中搅拌，EDC:NHS:mPEG-COOH＝4:6:1，充分溶解后，通氮气除氧。之后转入恒温磁力搅拌机，在35℃下，避光搅拌6小时，完成羧基的活化。
(2)交联胱胺中的氨基
配置好胱胺二盐酸(Cys)溶液，溶剂为DMF，将胱胺二盐酸溶液放入反应瓶中并加入三乙胺。在恒温磁力搅拌机中按规定的摩尔比完成氨基与活化羧基后的零长度交联基团的交联反应，形成酰胺键，得到目标产物。
具体过程如下：
a、配置5mL胱胺二盐酸(Cys)溶液，并加入40μL三乙胺，搅拌30分钟以脱去盐保护；
b、搅拌结束后将溶液加入步骤(1)中活化完羧基的混合DMF溶液中，mPEG-COOH和Cys的摩尔比为1:5，通氮气除氧后，转入恒温磁力搅拌机中，并在35℃下避光搅拌12小时。
产物提纯及表征
在步骤(2)反应结束后，进行提纯操作，在透析袋中透析48小时后，冷冻干燥处理，得到白色絮状目标产物，产物的表征通过红外光谱、X射线光电子能谱与1H NMR进行。
具体过程如下
a、透析袋截留分子量为1kD，透析进行中，每6小时更换一次超纯水。完成后将溶液放入离心管中并置于-20℃冰箱内进行过夜冷冻。冷冻完成后放入真空干燥剂中干燥，时间为2天。
b、红外光谱测试使用的是溴化钾压片法；X射线光电子能谱测试使用粉末法。
如图3所示，对比mPEG-COOH与mPEG-CONH-ss-NH2的红外光谱，其在1650cm-1的峰归属于羰基的C＝O伸缩振动峰，即为酰胺I带峰，在1580cm-1的峰归属于N-H弯曲振动与C-N伸缩振动的耦合，即为酰胺II带峰，酰胺特征峰的出现说明Cys的氨基成功接枝到原料的羧基上，形成酰胺键。不仅如此，mPEG-CONH-ss-NH2在3395cm-1的伸缩振动峰说明了其伯胺基团的存在。在mPEG-COOH红外光谱中，1739cm-1处的峰归属于羧基中游离羧酸的C＝O伸缩振动，此峰在mPEG-CONH-ss-NH2中大幅度减弱，也说明mPEG-CONH-ss-NH2成功的合成。
图4所示，高分辨S 2p能谱的3/2峰位于162eV，这归因于C-S键，1/2峰位于163.3eV处，属于二硫键或可能的非结合硫。高分辨能谱显示N1s峰位于398.5eV，这证实了氮元素与硫元素的存在，进一步证明了mPEG-CONH-ss-NH2成功合成。
(3)制备Au@PDA纳米颗粒
采用种子介导生长法制备尺寸为40nm的金纳米颗粒。通过多巴胺溶液氧化自聚法，在超声反应中制备了聚多巴胺薄层为10nm厚的有机无机杂化颗粒Au@PDA。
具体过程如下：
a、制备尺寸约40nm的Au纳米颗粒
选取纯净干燥过的三口瓶，向其中加入50mL浓度为2.2mM的柠檬酸钠水溶液，放入油浴锅中加热至100℃，期间使用直流冷凝管防止水分的蒸发。到达目标温度后加入0.34mL浓度为25mM的氯金酸水溶液，反应30分钟后溶液变为柔和粉红色，此时金颗粒种子大小为10nm；反应时间到后将温度降为90℃，加入0.34mL浓度为60mM柠檬酸钠水溶液与0.34mL浓度为25mM的氯金酸水溶液，反应30分钟，此过程重复三次。反应结束后得到尺寸为40nm的Au纳米颗粒水溶液，在6500rpm/min的转速条件下离心提纯，重悬于超纯水中。
b、制备Au@PDA纳米颗粒
选取纯净干燥的20mL玻璃瓶作为溶器。配置好5mL多巴胺溶液，浓度为3mM，将多巴胺溶液用移液器吸入玻璃瓶中。将步骤a所制备的金纳米颗粒水溶液用移液器吸取5mL滴加入玻璃瓶中的多巴胺溶液里，用Tris-hcl调节pH为8.5后将玻璃瓶放入超声池中反应95min。反应结束后以13000rpm/min进行离心提纯，并重悬与超纯水中，得到Au@PDA纳米颗粒。
(4)Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒的制备
a、选取纯净干燥后的20mL玻璃瓶，向其中加入步骤(3)中制备的Au@PDA纳米颗粒胶体水溶液。另外，配置实施例1所合成的甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇水溶液并用移液器吸入玻璃瓶中。充分混溶后放入恒温磁力搅拌机反应，反应完成后离心提纯，得到肿瘤微环境谷胱甘肽响应型纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm。
配置的甲氧基封端胱胺化聚乙二醇水溶液5mL，浓度为0.2g/mL。在恒温磁力搅拌机中反应的条件为40℃，时间为12小时。离心提纯的转速为4500rpm/min。
一、选取微量的Au@PDA-ss-PEGm进行透射电子显微镜、动态光散射、Zeta电位等表征测试，具体过程如下：
其透射电子显微镜图如图1所示，聚多巴胺壳厚约为10nm。颗粒的动态光散射与Zeta电位表征如图5所示，图5a中，Au NPs胶体水溶液与Au@PDA NPs胶体水溶液中纳米颗粒的流体力学直径分别为40.5±0.8nm与62.2±1.2nm，通过简单的计算可得聚多巴胺壳厚约为10.85±0.2nm，这与TEM所得的结果相吻合，进一步证明了聚多巴胺在金纳米颗粒上的成功包裹。制备的Au@PDA-ss-PEGm与Au@PDA-PEG胶体水溶液中纳米颗粒的流体力学直径分别为82.2±0.6nm与84.4±1.4nm。
图5b中，原始Au NPs表面存在柠檬酸根离子，其Zeta电位约为-25.46mV，Au@PDANPs的Zeta电位明显下降，约为-31.44mV，这是由于聚多巴胺的壳层附着了大量的负电荷所致。与之相反，Au@PDA-PEGm与Au@PDA-ss-PEGm的Zeta电位分别约为-5.55mV与-3.4mV，这是因为聚乙二醇是中性的原因，所有的结果都证明了Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒制备是成功的。
二、按照如下步骤检测体外Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒对高浓度谷胱甘肽的响应性：
(1)取微量Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液进行体外谷胱甘肽响应型测试，并模拟细胞内高盐离子环境，观察其在加入谷胱甘肽与PBS前后其紫外-可见光吸收光谱的变化情况，并使用Au@PDA、Au@PDA-PEGm纳米颗粒胶体水溶液作为对照组进行测试。
(2)取微量Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液进行体外谷胱甘肽响应型测试，通过观察颗粒在2mM谷胱甘肽与细胞盐环境PBS的存在下0-140分钟，其紫外-可见光吸收光谱中表面等离子共振峰(LSPR)的变化情况。
(3)取微量Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液进行体外谷胱甘肽响应型测试，通过观察颗粒在40分钟时，其在不同谷胱甘肽浓度(0-100mM)与细胞盐环境PBS下，其紫外-可见光吸收光谱中表面等离子共振峰(LSPR)的变化情况。
具体过程如下：
1.取200μL的Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液，测量其紫外-可见光吸收光谱数据，然后将其溶剂换为PBS并加入谷胱甘肽，测量其紫外-可见光吸收光谱数据，对比在加入PBS与谷胱甘肽前后吸收光谱的变化。Au@PDA、Au@PDA-PEGm纳米颗粒胶体水溶液作为对照组进行测试。
结果如图6a所示，只有Au@PDA纳米颗粒在PBS的存在下表现出强烈的表面等离子共振峰的红移，而Au@PDA-ss-PEGm与Au@PDA-PEGm纳米颗粒则表现出良好的稳定性，说明了长链聚乙二醇包覆层大大提高了纳米颗粒的耐盐性。
如图6b所示，当向存在于PBS中的纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm中加入谷胱甘肽后，光谱表现出强烈的表面等离子共振峰红移，这说明有大的聚集体产生，中是由于甲氧基封端胱胺化氨基聚义二醇对谷胱甘肽的响应，导致二硫键的断裂，脱去聚乙二醇包覆层后纳米颗粒静电平衡状态被打破所致，对照组则未观察到此现象。
2.取200μL的Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液并将其溶剂换为PBS，加入谷胱甘肽后测试其在140分钟内的紫外-可见光光谱数据，每隔20min测量一次。结果如图6c所示，随着时间的增加，颗粒的表面等离子共振峰红移程度越大，在近红外区的吸光能力也越来越高，这归因于静电平衡打破而形成的聚集体会随着时间的延长越来越大所致。
3.取200μL的Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液并将其溶剂换为PBS，通过改变加入的谷胱甘肽的浓度(0mM、0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、10mM、100mM)，测量其紫外-吸收光谱的变化。结构如图6d所示，随着谷胱甘肽浓度的增加，颗粒在相同的反应时间内表现出更大的表面等离子共振峰的红移与近红外区吸光度的增强，这表面聚集体形成的速率是和谷胱甘肽浓度正相关的。
三、对制备的Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒进行体外光热效应与光声效应检测：
(1)取200μL Au@PDA-ss-PEGm胶体水溶液于离心管中，放置于固定台架上，另以Au@PDA-PEGm作为对照组。
(2)通过红外热成像仪观测纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm胶体水溶液以及对照组Au@PDA-PEGm胶体水溶液离心管的温度，室温下，使用808nm，(2)W/cm2激光器照射装有Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒以及对照组Au@PDA-PEGm纳米颗粒的离心管，在红外热成像仪中记录其在加入10mM谷胱甘肽与PBS前后其温度变化曲线。
(3)将装有Au@PDA-ss-PEGm胶体水溶液的离心管放置于光声仪器上，使用808nm脉冲激光照射五分钟后，观测在加入10mM谷胱甘肽与PBS前后，其PA信号的变化情况，并以Au@PDA-PEGm作为对照组。
具体过程如下：
a、通过热成像仪记录Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液(100μg/mL)以及对照组Au@PDA-PEGm纳米颗粒胶体水溶液(100μg/mL)在808nm、2W/cm2连续激光照射5分钟内的温度变化数据并制作成光热温度变化谱图，如图7a所示，只有Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液在PBS与谷胱甘肽共同作用下才表现出与纯水组相比较大的升温现象，而其对照组纳米颗粒水溶液无论是否有PBS与谷胱甘肽的存在，其温度上升较小，光热效应较低。
b、通过光声成像仪器测试了Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液以及对照组Au@PDA-PEGm纳米颗粒胶体水溶液在808nm、脉冲激光照射下的光声信号强度数据并制成光声信号谱图，只有如图7b所示，Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒胶体水溶液在PBS与谷胱甘肽共同存在下，其光声信号随浓度变化而上升明显，其余各组均与纯水组对比无明显上升，这充分说明了Au@PDA-ss-PEGm纳米颗粒可以对肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽做出响应，在高盐环境下形成聚集体，从而具有高效的光热效应与光声效应。
上述实验表明肿瘤微环境谷胱甘肽刺激诱导聚集型金纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm可以成功的对肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽做出响应，使纳米颗粒表面聚乙二醇包覆层中二硫键断开，从而脱去了包覆层。纳米颗粒表面暴露在高盐离子环境中，这立即打破了静电平衡状态，导致了纳米颗粒之间形成聚集体，形成表面等离子耦合激元，将表面等离子共振峰红移至近红外区域，也大大增强了其在近红外区域的光吸收能力。这解决了小尺寸金纳米颗粒利于静脉给药到达肿瘤内部，而大尺寸金纳米颗粒才能更好的进行光热肿瘤治疗与成像这一限制，也给基于肿瘤微环境响应性制药的方法提供了一个简单有效的思路。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒，其特征在于，该复合纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm内部为金纳米颗粒，金纳米颗粒外部包覆有聚多巴胺涂层，在聚多巴胺涂层外部接枝有甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇。
2.如权利要求1所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒，其特征在于，复合纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm在进入肿瘤细胞后，在谷胱甘肽的还原下会使得聚乙二醇包覆层中双硫键被还原为巯基进而脱去该包覆层，颗粒聚集形成聚集体，金纳米颗粒原先处于可见光区域的表面等离子共振峰会红移至近红外光区域，在近红外区出现光吸收带。
3.如权利要求1所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒，其特征在于，金纳米颗粒的粒径为20-40nm，聚多巴胺包覆层的厚度在6-10nm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)活化甲氧基封端羧基聚乙二醇的羧基端：按摩尔比配制EDC、NHS和甲氧基封端羧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液，溶剂为DMF，将上述溶液混合后放入恒温磁力搅拌机中按条件进行搅拌反应；
(2)偶联胱胺二盐酸：向步骤(1)所得混合溶液中按摩尔比加入胱胺二盐酸Cys，并加入40μL三乙胺，放入恒温磁力搅拌机中按条件进行搅拌反应；
(3)提纯得到白色絮状目标产物甲氧基封端胱胺化氨基聚乙二醇mPEG-CONH-ss-NH2，进行冷冻干燥处理备用；
(4)采用种子介导生成法制备尺寸为20-40nm的金纳米颗粒：在三口瓶中加入50mL柠檬酸钠水溶液，加热至100℃后加入0.34mL氯金酸水溶液，生成粒径大小为6-10nm的金颗粒种子后，将温度降至90℃；
(5)向步骤(4)所得溶液中立即加入0.34mL柠檬酸钠水溶液与0.34mL氯金酸水溶液，该过程重复三次后得到尺寸为20-40nm的金纳米颗粒水溶液，离心提纯，于4℃保存；
(6)配制多巴胺水溶液，向多巴胺水溶液中加入步骤(5)中所制备的金纳米颗粒水溶液，调节pH为8.5，超声，离心提纯，得到Au@PDA纳米颗粒胶体水溶液；
(7)取0.1g mPEG-CONH-ss-NH2配制5mL的水溶液，向其中加入5mL 步骤(6)制备的Au@PDA纳米颗粒胶体水溶液，调节pH为8.5，放入恒温磁力搅拌机上进行反应，反应结束后离心提纯，得到谷胱甘肽刺激诱导聚集型金纳米颗粒Au@PDA-ss-PEGm NPs。
5.如权利要求4所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，EDC、NHS、mPEG-COOH和Cys的摩尔比为4:6:1:5。
6.如权利要求4所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中进行搅拌反应时需在避光环境下进行，并需鼓氮除氧，步骤(1)中搅拌反应时间为6-8小时，步骤(2)中搅拌反应时间为10-14小时。
7.如权利要求4所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中柠檬酸钠水溶液浓度为2.2mM，氯金酸水溶液浓度为25mM。
8.如权利要求4所述的谷胱甘肽刺激诱导聚集型复合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(5)中柠檬酸钠水溶液浓度为60mM，氯金酸水溶液浓度为25mM。
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