CN113133535A - 一种具有抗消化性质的可溶性非变性ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物及其制备方法 - Google Patents
一种具有抗消化性质的可溶性非变性ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白‑多糖复合物及其制备方法。该方法包括，将可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白粉末和多糖粉末混匀，加水，低温搅拌，调pH至酸性，冷冻干燥，粉碎过筛。本发明采用的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白纯度高，三螺旋结构保持完整，具有改善关节炎活性，且溶解性好，有利于在肠道中充分释放其活性部位；所述的海藻酸钠、阿拉伯胶、果胶、黄原胶和卡拉胶均为阴离子多糖，在酸性条件下与可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白结合形成复合物，减少其在胃消化过程中的降解，保证可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白活性位点所在的三螺旋结构保持完整到达小肠内，从而发挥出最大的功效；本发明的方案简便易行、稳定性好、活性高。
Description
技术领域
本发明属于保健品技术领域，具体涉及到一种具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物及其制备方法。
背景技术
关节炎是各种类型关节炎性疾病的总称，泛指发生在人体一个或多个关节的，以关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限等为特征的，关节内炎性侵蚀、骨或软骨退化的关节疾病。关节炎与退行性病变、自身免疫等各种因素有关，并非一种单一的疾病。常见的有骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎等，其中骨关节炎发病率最高，尤其是在中老年人中发病率可高达60％。
骨关节炎是一种以关节软骨的磨损、破坏、丢失，并伴有关节周围骨质增生的一种退行性疾病，主要表现为关节疼痛及功能障碍，目前中国骨关节炎患者的常规治疗包括口服消炎止痛和氨基葡萄糖类药物、关节腔内注射玻璃酸钠、物理治疗和外科手术等，美国骨科医师学会(AAOS)指南唯一推荐的骨关节炎治疗药物为非甾体类抗炎止痛药，但该类药物会对人体产生较大的副作用，且无法修复已磨损的关节软骨和延缓骨关节炎的进展，因此迫切需要一种新的治疗手段。
胶原蛋白是动物体内含量最多的蛋白，约占总蛋白的30％，也是细胞外基质的主要结构蛋白，主要存在于动物的皮、软骨、肌腱、血管、角膜等结缔组织中。其中，Ⅱ型胶原蛋白主要分布于软骨、玻璃体、髓核、胚胎角膜、视网神经膜等组织中，是构成软骨基质的主要成分之一，它能够促进软骨细胞的分化，增进骨骼健康，口服非变性Ⅱ型胶原蛋白可抑制关节炎的发生和发展。
非变性Ⅱ型胶原蛋白是指由3条相同的多肽链组成的三螺旋结构完整的大分子，口服并经过胃肠消化系统后作用于小肠相关淋巴组织，刺激信息传递分子，如细胞因子和参与增殖分化的趋化因子，激活树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞，也称抗原提呈细胞，它们可将非变性Ⅱ型胶原蛋白的抗原表位提呈给CD4+T细胞，促进调节性T细胞产生发挥免疫耐受作用，从而抑制关节炎的发生和发展。
可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白，是溶解性较好并具有完整三螺旋结构的Ⅱ型胶原蛋白，早在1977年，Trentham D E等人通过胃蛋白酶提取了可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白。然而，相关研究发现可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的热稳定性及胃消化稳定性较差，即三螺旋结构很容易被破坏，且消化时pH值越低可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的结构破坏越明显，并且可能伴随着活性表位的丢失。2004年，Carina Porporatt等人发现可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的和壳聚糖通过静电作用或氢键形成复合物，对酶的消化有抵抗作用，但其测定指标及效果有限。
多糖因其具有增稠、保水等特性而被广泛应用于食品工业中，改善了食品的质地和品质。在溶液中蛋白质和多糖之间可以发生许多相互作用，这取决于不同生物聚合物的pH和离子强度环境、电离和电荷密度、结构和浓度。大量的研究报道了多糖在胃肠消化过程中对生物活性化合物的保护作用。其中，生产中使用最广泛的阴离子多糖，如海藻酸钠、果胶、卡拉胶、阿拉伯胶、黄原胶等，在酸性条件下，能够与带正电的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白相互结合，形成可溶性或不溶性复合物。因此，可能具有降低非变性Ⅱ型胶原蛋白在胃肠道中的消化程度，维持三螺旋结构的完整性的作用。
目前国内外也有一些含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的相关产品的制备方法及其产品，但都没有关注其胃消化稳定性的提升，而对于其他蛋白质的消化稳定性的提高则有一定的研究。如余世峰等人(余世峰,王存堂,宫春宇,等.玉米淀粉_大豆蛋白抗消化复合物的制备方法.)通过将大豆蛋白溶解(2-10％)、糊化玉米淀粉、热交联(70-100℃，3-10小时)、干燥(48小时)、粉碎、纯化、离心、洗涤、干燥、粉碎、过筛得到了玉米淀粉大豆蛋白抗消化复合物，但是其所采用热交联过程温度较高，不适用于热稳定性较低的非变性Ⅱ型胶原蛋白。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物及其制备方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其原料包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白和多糖。
本发明提供的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，按照质量份数计，包括如下原料：
可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白 20-100份；
多糖 5-80份。
优选地，本发明提供的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，按照质量份数计，包括如下原料：
可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白 20-95份；
多糖 5-80份。
进一步地，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白为鸡胸软骨提取得到的Ⅱ型胶原蛋白，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的纯度为40-80％，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白具有完整的三螺旋结构。
本发明中采用的非变性Ⅱ型胶原蛋白为从鸡胸软骨中提取的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白，溶解性好、纯度高，在肠道能够充分释放含有活性表位的三螺旋结构，转运进入小肠相关淋巴系统，刺激信息传递分子(如细胞因子和参与增殖分化的趋化因子)，激活树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞，也称抗原提呈细胞，它们可将Ⅱ型胶原蛋白的抗原表位提呈给CD4+T细胞，促进调节性T细胞产生并发挥免疫耐受作用，从而抑制关节炎的发生和发展。
进一步地，所述多糖为阴离子多糖。所述阴离子多糖为食品胶。所述阴离子多糖可以在在酸性条件下能够与可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白产生静电相互作用，形成复合物。
优选地，所述阴离子多糖为海藻酸钠、果胶、卡拉胶、阿拉伯胶、黄原胶中的一种以上。
本发明中所采用的海藻酸钠是一种从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，溶于水成粘稠状液体，其1wt％的水溶液pH为6-8，该物质在pH6.0-9.0之间粘性稳定，加热至80℃以上粘性降低。
本发明中所采用的阿拉伯胶是一种安全无害的增稠剂，在水中可逐渐溶解，呈酸性的粘稠状液体，是一种碳水化合物聚合体，可在大肠中被部分降解。
本发明中所采用的果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，溶于水后形成乳白色粘稠状胶态溶液，呈弱酸性，耐热性强。
本发明中所采用的黄原胶具有独特的流变性，作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂，可广泛应用于食品、医药等20多个行业，是目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖。黄原胶溶液粘度不随温度变化而发生很大变化，即使低浓度的水溶液仍然显示出稳定的高黏度；对酸碱十分稳定；稳定的双螺旋结构使其具有抗酶解能力，许多的酶类如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶等酶都不能使黄原胶降解。
本发明中所采用的卡拉胶，浓度低时形成低粘度的溶胶，接近牛顿流体，浓度升高形成高粘度溶胶，则呈非牛顿流体。
本发明提供的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物可以是片剂、粉剂、颗粒剂或丸剂。
本发明提供一种制备上述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的方法，包括如下步骤：
将所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白和多糖混合均匀，得到混合物，然后将所述混合物加入去离子水中，搅拌处理，得到混合液，调节所述混合液的pH为酸性，冷冻干燥，粉碎，过筛，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
进一步地，所述水的质量为混合物质量的20-40倍。
进一步地，所述搅拌处理的温度为4-20℃。
进一步地，所述搅拌处理的时间为2-8小时。
进一步地，所述冷冻干燥的时间为24-48小时。
进一步地，所述过筛的筛孔大小为20-100目。
上述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，本发明还对其进行体外模拟胃消化研究测试。该测试包括：
将所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物用去离子水溶解，得到待测溶液(蛋白浓度为10mg/mL)，再按1:1的比例加入模拟胃液，调节pH 2.0，稳定10min后再次确认pH，加入胃蛋白酶，置于37℃恒温摇床中，转速100r/min，2.0h后调节pH 7.0-7.5灭酶。对消化前后的样品进行黏度、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色光谱测定。
该复合物经体外模拟胃肠消化后，黏度下降程度变小，仅下降了1.1-1.6倍，而单纯的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白经体外模拟胃消化后，黏度下降约30倍。
该复合物经体外模拟胃消化后，非变性Ⅱ型胶原蛋白的α1链降解程度显著减小，而单纯的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白经体外模拟胃消化后，其α1链降解程度较大。
该复合物经体外模拟胃消化后，非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构保留了消化前的50-59％，而单纯的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白经体外模拟胃消化后，三螺旋结构仅保留了19％。
本发明采用的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白纯度高，三螺旋结构保持完整，具有改善关节炎活性，且溶解性好，有利于在肠道中充分释放其活性部位；所述的海藻酸钠、阿拉伯胶、果胶、黄原胶和卡拉胶均为阴离子多糖，在酸性条件下与可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白结合形成复合物，减少其在胃消化过程中的降解，保证可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白活性位点所在的三螺旋结构保持完整到达小肠内，从而发挥出最大的功效。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，方法简单，易于规模化生产，得到的产物可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物易保存，该产物含丰富的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白。
(2)本发明提供的制备方法，所采用的原料配方中的海藻酸钠、阿拉伯胶、果胶、黄原胶和卡拉胶均能对可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的胃消化产生一定的保护作用，保证其活性位点所在的三螺旋结构到达小肠时仍大部分保持完整，从而发挥出最大的功效。
附图说明
图1为对比例1、实施例1、2、3、4、5、6、7、8制备的产物在模拟胃消化前后的黏度变化图；
图2为对比例1、实施例1、2、3、4、5、6、7、8制备的产物在模拟胃消化后的电泳图；
图3为对比例1制备的产物在模拟胃消化前后的圆二色光谱图；
图4为实施例1制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图5为实施例2制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图6为实施例3制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图7为实施例4制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图8为实施例5制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图9为实施例6制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图10为实施例7制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图11为实施例8制备的产物在模拟胃消化后的圆二色光谱图；
图12为对比例1、实施例1、2、3、4、5、6、7、8制备的产物在模拟胃消化前后在圆二色光谱222nm的椭圆率结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例及对比例所用到的重量(质量)份数，作为举例，重量单位可以为克、千克等，也可以是本领域常用的任意其他用量。
以下实施例及对比例所用到的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白为鸡胸软骨提取得到的Ⅱ型胶原蛋白，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的纯度为40-80％，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白具有完整的三螺旋结构。
对比例1
一种蛋白制品的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份。
2、按上述比例准确称量所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白，加入2000份去离子水中，4℃搅拌2小时，调pH至酸性，冷冻干燥(24小时)，粉碎，过筛(20目)，得到一种蛋白制品。
3、体外模拟胃消化实验：将上述蛋白制品作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的用量为100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白溶液的黏度在消化后约降低30倍；如图2所示，电泳图谱中α1链的条带颜色与未经消化的样品相比显著变浅，说明水解较多；如图3和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降约5.3倍，说明对比例1制备的蛋白制品中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏严重，仅保留了消化前的19％。
实施例1
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，海藻酸钠30份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入5000份去离子水中，10℃搅拌8小时，调pH至酸性，冷冻干燥(36小时)，粉碎，过筛(50目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的用量为100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的溶液黏度在消化后约降低1.5倍；如图2所示，电泳图谱中α1链条带颜色轻微变浅，说明水解较少；如图4和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降约1.9倍，说明实施例1制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构的破坏程度较轻，约保留了消化前的52％。
实施例2
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，海藻酸钠40份。
2、按上述比例准确称量各组分，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入4000份去离子水中，20℃搅拌4小时，调pH至酸性，冷冻干燥(48小时)，粉碎，过筛(100目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的用量为100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的溶液黏度在消化后约降低1.4倍；如图2所示，电泳图谱中α1链条带颜色轻微变浅，说明水解较少；如图5和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降约1.85倍，说明实施例2制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构的破坏程度较轻，约保留了消化前的54％。
实施例3
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，果胶30份，阿拉伯胶20份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入4000份去离子水，20℃搅拌2小时，调pH至酸性，冷冻干燥(36小时)，粉碎，过筛(50目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于适量10mL去离子水中，所述待测样品的100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的溶液黏度在消化后约降低1.1倍；如图2所示，电泳图谱中α1链条带颜色轻微变浅，说明水解较少；如图6和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.8倍，说明实施例3制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的56％。
实施例4
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，果胶20份，黄原胶30份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入5000份去离子水，4℃搅拌8小时，调pH至酸性，冷冻干燥(24小时)，粉碎，过筛(20目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的溶液黏度在消化后约降低1.3倍；如图2所示，电泳图谱中α1链条带颜色轻微变浅，说明水解较少；如图7和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.8倍，说明实施例4制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的56％。
实施例5
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，黄原胶50份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入5000份去离子水，10℃搅拌4小时，调pH至酸性，冷冻干燥(48小时)，粉碎，过筛(50目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的黏度在消化后约降低1.3倍；如图2所示，电泳图谱中α1肽链颜色轻微变浅，说明水解较少；如图8和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.95倍，说明实施例5制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的51％。
实施例6
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，黄原胶30份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入4000份去离子水，20℃搅拌2小时，调pH至酸性，冷冻干燥(36小时)，粉碎，过筛(100目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的黏度在消化后约降低1.5倍；如图2所示，电泳图谱中α1肽链颜色轻微变浅，说明水解较少；如图9和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.85倍，说明实施例6制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的54％。
实施例7
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，卡拉胶20份，海藻酸钠30份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入4000份去离子水，10℃搅拌6小时，调pH至酸性，冷冻干燥(36小时)，粉碎，过筛(50目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的用量为100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的黏度在消化后约降低1.1倍；如图2所示，电泳图谱中α1肽链颜色轻微变浅，说明水解较少；如图10和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.75倍，说明实施例7制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的57％。
实施例8
一种可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
1、原料：包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白100份，卡拉胶30份，海藻酸钠20份。
2、按上述比例准确称量各原料，将称量好的原料混合均匀，得到混合粉末，加入3000份去离子水，4℃搅拌4小时，调pH至酸性，冷冻干燥(24小时)，粉碎，过筛(20目)，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
3、体外模拟胃消化实验：将上述复合物作为待测样品溶于10mL去离子水中，所述待测样品的用量为100mg，得到待测溶液，按待测溶液与模拟胃消化液体积比为1:1加入模拟胃消化液(该模拟胃消化液的制备可参照INFOGEST static in vitro simulation ofgastrointestinal food digestion,Nat Protoc,2019)，混合均匀，得到混合液，调节混合液的pH 2.0，待混合液pH稳定10min后加入5μL的CaCl2溶液(0.3mol/L)、0.5mL的胃蛋白酶溶液(320mg/mL)，在37℃和转速为100r/min的恒温摇床上，进行模拟胃消化2.0h。
4、在模拟胃消化后，对消化产物进行黏度、电泳和圆二色光谱分析。如图1所示，含可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的复合物的黏度在消化后约降低1.3倍；如图2所示，电泳图谱中α1肽链颜色轻微变浅，说明水解较少；如图11和图12所示，圆二色光谱中正吸收峰处的椭圆率下降了约1.7倍，说明实施例8制备的复合物中可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构破坏程度较轻，约保留了消化前的59％。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其特征在于，原料包括可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白和多糖。
2.根据权利要求1所述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其特征在于，按照质量份数计，包括如下原料：
可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白 20-100份；
多糖 5-80份。
3.根据权利要求1所述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其特征在于，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白为鸡胸软骨提取得到的Ⅱ型胶原蛋白，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白的纯度为40-80％，所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白具有完整的三螺旋结构。
4.根据权利要求1所述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其特征在于，所述多糖为阴离子多糖。
5.根据权利要求4所述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物，其特征在于，所述阴离子多糖为海藻酸钠、果胶、卡拉胶、阿拉伯胶、黄原胶中的一种以上。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的具有抗消化性质的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白和多糖混合均匀，得到混合物，然后将所述混合物加入水中，搅拌处理，得到混合液，调节所述混合液的pH为酸性，冷冻干燥，粉碎，过筛，得到所述可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物。
7.根据权利要求6所述的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，其特征在于，所述水的质量为混合物质量的20-40倍。
8.根据权利要求6所述的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，其特征在于，所述搅拌处理的温度为4-20℃，所述搅拌处理的时间为2-8小时。
9.根据权利要求6所述的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的时间为24-48小时。
10.根据权利要求6所述的可溶性非变性Ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物的制备方法，其特征在于，所述过筛的筛孔大小为20-100目。
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