CN113121485B - 一种3-芳基香豆素类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3‑芳基香豆素类衍生物及其制备方法和用途，是以取代苯乙酸和取代2‑羟基苯甲醛为原料，在三乙胺和乙酸酐存在下，发生串联的缩合‑内酯化反应，反应完毕后，再各自独立地经三种后处理方法得到3‑芳基香豆素类衍生物。本发明提供的3‑芳基香豆素类衍生物对SIRT3蛋白具有良好的亲和力，并能上调SIRT3蛋白的去乙酰化酶活性，逆转ISO(异丙肾上腺素)刺激诱导的心肌肥厚，可用于制备抗心血管疾病或抗糖尿病药物。

Description

一种3-芳基香豆素类衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物化学及药学领域，特别涉及一种3-芳基香豆素类衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
蛋白质翻译后修饰是蛋白质功能调控的关键。Sirtuins(silent informationregulartors，沉默信息调节因子)蛋白家族作为重要的去乙酰化酶，在调节基因组稳定性、能量代谢、应对细胞应激等过程中发挥着重要的作用(Theranostics,2020,10(18),8315)。在Sirtuins家族的七个成员中，SIRT3(沉默信息调节因子3)蛋白是定位于线粒体的一类NAD依赖的去乙酰基化酶，在肾脏、心脏、大脑和肝脏等线粒体丰富的器官中广泛表达，其调节的乙酰化修饰对于维持这些器官中的线粒体稳态至关重要(Cell,2010,143(5),802-812)。
研究证实，机体中高代谢率的组织和器官对线粒体功能障碍更为敏感，SIRT3活性失衡会导致线粒体中超过80种不同底物的乙酰化水平异常，继而发生线粒体功能障碍，并成为多种疾病的诱因。在神经退行性疾病中，SIRT3的底物p53高度乙酰化导致神经细胞发生线粒体依赖性细胞凋亡，而激活SIRT3即可防止其诱导的细胞色素C从线粒体向细胞质的释放(J.Biol.Chem,2012,287(29),24460-24472)。此外SIRT3还能够激活自噬，发挥修复线粒体的功能，从而抑制细胞死亡(Trends Biochem.Sci,2010,35(12),669-675)。SIRT3作为线粒体动力学的关键调节剂，同时参与到代谢性疾病的病理发展过程中，SIRT3去乙酰化酶的活化能够抑制因代谢失衡而导致的肥胖、糖尿病、肝病和肾病(Kidney Int,2013,83(4),568-581)。有研究显示SIRT3表达缺失会加剧急性肾损伤。相反，SIRT3的激活通过减少亲环素D的乙酰化从而抑制急性肾损伤所致的线粒体功能障碍。同时也有报道指出，SIRT3能够抑制内皮细胞向间充质转变，从而缓解肾纤维化。
SIRT3的缺失或酶活性下调也是诱导慢性心功能失调的原因之一。SIRT3对心脏的保护作用源于其对线粒体产能的增强，激活线粒体复合体I并增强电子传递链功能以维持ATP稳态(Cell,2016,167(4),985-1000)。鉴于SIRT3对能量产生和利用的调控及其对心脏代谢稳态的重要性，SIRT3被视作通过调控线粒体能量代谢发挥心肌保护作用的重要药物靶标。
目前有多个关于SIRT3激动剂的报道，其中包括天然产物和厚朴芬、水飞蓟宾和白藜芦醇等，但此类SIRT3激动剂大多存在靶点广泛、特异性较差等问题。而寡核苷酸类的SIRT3靶向激动剂由于生物利用度低，药代动力学较差以及易受核酸酶降解的缺点而限制了其临床应用。因此，目前对SIRT3激动剂的研发热点主要集中于靶向别构调控，别构调节具有结合位点多样化，调节特异性高，调节分子多元化等优势。考虑到SIRT3是一个多底物的高活性去乙酰化酶，进一步开发新的SIRT3激动剂对于衰老、神经退行性疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、心脏病和其他代谢性疾病的治疗和干预具有重要意义和良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种3-芳基香豆素类衍生物，或药学上可接受的盐或前药。
本发明的另一目的在于提供一种上述3-芳基香豆素类衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述3-芳基香豆素类衍生物在制备激活SIRT3活性、维持线粒体正常功能、保护心肌、抗神经退行性疾病、抗肝脏疾病、抗肾脏疾病、抗心肌肥大、抗糖尿病药物中的用途。
本发明的又一目的在于提供3-芳基香豆素类衍生物中活性化合物3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素及其新晶型、3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素及其新晶型，以及具有此种晶型的活性化合物在制备激活SIRT3活性、维持线粒体正常功能，保护心肌、抗神经退行性疾病、抗肝脏疾病、抗肾脏疾病、抗心肌肥大、抗糖尿病药物中的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种3-芳基香豆素衍生物，或药学上可接受的盐或前药，所述3-芳基香豆素衍生物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002955794640000031
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9可各自独立地选自H、羟基、乙酰氧基、甲氧基或卤素原子；或者R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中两个相邻的取代基可连接形成一个或多个亚甲二氧基即-OCH2O-，其余取代基独立地选自H、羟基、乙酰氧基、甲氧基或卤素原子。卤素原子可独立地选自氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
所述式Ⅰ的3-芳基香豆素衍生物，优选自下述任意一种：
(1)3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素；
(2)3-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-6-氯香豆素；
(3)3-(2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(4)3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素；
(5)3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(6)3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素；
(7)3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(8)3-(2,4-二羟基苯基)香豆素；
(9)3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(10)3-(2-羟基5-甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素；
(11)3-(2-羟基苯基)-7-甲氧基香豆素；
(12)3-(3-乙酰氧基-4-甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素；
(13)3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素；
(14)3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素；
(15)2-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-3H-萘并[2,1-b]吡喃-3-酮；
(16)3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)香豆素；
(17)3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素；
(18)3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素；
(19)3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二羟基香豆素；
(20)3-(2-溴苯基)香豆素；
(21)3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)香豆素；
(22)3-(2-羟基苯基)香豆素；
(23)3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-乙酰氧基香豆素；
(24)3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素；
(25)3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)香豆素；
(26)3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素；
(27)3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(28)3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素；
(29)3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素；
(30)3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素；
(31)3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素。
所述式Ⅰ的3-芳基香豆素衍生物，优选3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(化合物6)、3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(化合物9)、3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(化合物14)、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(化合物17)、3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素(化合物26)、3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(化合物30)、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(化合物27)、3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(化合物31)；更优选3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(化合物6)或3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(化合物31)。
所述3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(化合物6)，优选晶型为：粉末X-衍射图的反射角2θ在约19.8±0.2°,24.2±0.2°,16.2±0.2°,24.7±0.2°,13.0±0.2°,15.1±0.2°,18.8±0.2°,27.8±0.2°,25.9±0.2°,28.2±0.2°,23.1±0.2°,28.7±0.2°,29.7±0.2°,26.6±0.2°,42.7±0.2°处有特征吸收峰，其红外光谱(FT-IR,KBr压片,υmax/cm-1)在约3348,3115,1680,1608,1286,1261,1209,1128,862,775,744,640cm-1处有特征吸收峰。
所述3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(化合物31)，优选晶型为：粉末X-衍射图的反射角2θ在约10.1±0.2°,6.1±0.2°,12.2±0.2°,17.2±0.2°,28.1±0.2°,14.6±0.2°,23.5±0.2°,14.5±0.2°,17.1±0.2°,16.1±0.2°,24.8±0.2°,27.0±0.2°,18.3±0.2°处有特征吸收峰。其红外光谱(FT-IR,KBr,υmax/cm-1)在约3219,1697,1612,1300,1132,1024,812,775,740,692cm-1处有特征吸收峰。
所述式Ⅰ的3-芳基香豆素类衍生物的制备方法，是以取代苯乙酸和取代2-羟基苯甲醛为原料，在三乙胺和乙酸酐存在下，发生串联的缩合-内酯化反应，反应完毕后，再各自独立地采用A、B或C三种后处理方法得到式I所示的3-芳基香豆素类衍生物。
所述取代苯乙酸、取代2-羟基苯甲醛、三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1∶1∶(2～5)∶(3～7)。所述串联的缩合-内酯化反应的反应温度为80～140℃，优选110～120℃；反应时间为6～14小时，优选10小时。
所述的后处理方法A是将反应混合物倒入冰水中，搅拌，得到粘稠状固体，再用大量的水洗涤至水相为中性，再采用柱层析或重结晶方法将所述粘稠状固体进行纯化，得到式I所示的3-芳基香豆素类衍生物。
所述的后处理方法B是将反应混合物倒入冰水中，搅拌，得到粘稠状固体，再用大量的水洗涤至水相为中性，然后加入无机碱A溶液进行碱化处理并使反应混合物溶解于水相，进而采用有机溶剂A萃洗2～3次，水相用无机酸A进行酸化，将析出的固体抽滤、洗涤，滤液用有机溶剂A提取2～3次，将提取液合并、浓缩，浓缩物与抽滤得到的固体合并，再经柱层析或重结晶方法进行纯化，得到式I所示的3-芳基香豆素类衍生物。
所述的后处理方法C是将反应混合物倒入冰水中，搅拌，得到粘稠状固体，再用大量的水洗涤至水相为中性，然后加入无机酸A的水溶液进行水解反应。反应完毕后，抽滤得滤饼，经柱层析或重结晶方法进行纯化，得到式I所示的3-芳基香豆素类衍生物。
后处理方法B中，所述无机碱A包括但不限于为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠或碳酸钾，优选为氢氧化钠。
后处理方理B和C中，所述无机酸A包括但不限于为盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸，优选为盐酸；所述有机溶剂A包括但不限于为乙酸乙酯、甲基四氢呋喃、甲苯、氯仿或二氯甲烷。
本研究发现，所述3-芳基香豆素类衍生物(式I)对SIRT3蛋白具有良好的亲和力，并能上调SIRT3蛋白的去乙酰化酶活性，逆转ISO(异丙肾上腺素)刺激诱导的心肌肥厚。因而本发明所述的3-芳基香豆素类衍生物可用于制备抗心血管疾病或抗糖尿病药物。
所述3-芳基香豆素类衍生物(式I)可以经口服或不经口服方式给药。经口服给药时，采用常规的制剂技术，将所述3-芳基香豆素类衍生物与常规的药学上可接受的载体混合制成常规的固体制剂，包括颗粒剂、胶囊或片剂等；不经口服给药时，采用常规的制剂技术将其制成注射液、输液剂或栓剂等。给药的施用量是根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病和严重程度等变化来采取不同的用量。
一种抗心血管疾病、抗糖尿病的药物组合物，含有治疗有效量的上述3-芳基香豆素类衍生物(式I)为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。所述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂或表面活性剂。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明的3-芳基香豆素类衍生物能有效激活SIRT3活性，对SIRT3蛋白具有良好的亲和力，并能上调SIRT3蛋白的去乙酰化酶活性，逆转ISO(异丙肾上腺素)刺激诱导的心肌肥厚，靶点精准，特异性明显。
(2)本发明提供的3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素及其新晶型、3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素及其新晶型，可以显著逆转ISO(异丙肾上腺素)刺激诱导的心肌肥厚。
(3)本发明的制备方法简单，成本低，可以用多种药物载体组合使用，用药方便。
附图说明
图1为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)的核磁共振氢谱(400MHz,DMSO-d6)；
图2为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)的红外光谱；
图3为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)的X-射线粉末衍射图谱；
图4为3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的核磁共振氢谱(500MHz,DMSO-d6)；
图5为3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的红外光谱；
图6为3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的X-射线粉末衍射图谱；
图7为3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)、3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素(13)、3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素(26)、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(27)、3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(30)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)在不同浓度下与全长SIRT3的结合图；
图8为3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)影响SIRT3去乙酰化酶活性的实验结果；其中：(A)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)对SIRT3酶活激动能力的量效曲线；(B)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)不同浓度给药24h后对原代心肌细胞内MnSODAC122乙酰化蛋白的影响；(C)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)不同浓度给药24h后对原代心肌细胞内MnSOD总乙酰化蛋白的影响；
图9为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)抑制ISO刺激原代心肌细胞导致的心肌肥大实验结果；其中，(A)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)在不同浓度给药24h后对原代心肌细胞内β-MHC和ANF蛋白表达水平的影响；(B)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)在不同浓度给药24h后对原代心肌细胞表面积影响；(C)为3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)在不同浓度给药24h后对原代心肌细胞表面积影响的统计图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但是，不以任何形式限制本发明。应该指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，本发明还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语属于本发明的技术领域常用的专业术语，与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在限制本发明。
实施例1：3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素(1)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基5-甲基苯甲醛(4.47g，32.86mmol)，乙酸酐(20.13g，197.18mmol)和三乙胺(13.30g，131.45mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体5.14g，即3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素，收率：62％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.57(s,1H),7.96(s,1H),7.52(s,1H),7.42(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.29–7.18(m,2H),6.96–6.89(m,1H),6.86(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),2.37(s,3H)。
实施例2：3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素(1)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基5-甲基苯甲醛(4.47g，32.86mmol)，乙酸酐(16.77g，164.31mmol)和三乙胺(9.98g，98.59mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体4.8g，即3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素，收率：58％。
实施例3：3-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-6-氯香豆素(2)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基-4-氯苯甲醛(4.30g，27.45mmol)，乙酸酐(16.81g，164.68mmol)和三乙胺(11.11g，109.78mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.20g，54.89mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体6.23g，即3-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-6-氯香豆素，收率：75％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),8.01(s,1H),7.88(d,J＝2.5Hz,1H),7.65(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),6.87(dd,J＝3.0,2.4Hz,1H),6.85–6.82(m,2H),3.69(s,3H)。
实施例4：3-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-6-氯香豆素(2)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基-4-氯苯甲醛(4.30g，27.45mmol)，乙酸酐(14.01g，137.23mmol)和三乙胺(8.33g，82.34mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.20g，54.89mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体，即3-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-6-氯香豆素5.65g，收率：68％。
实施例5：3-(2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯基)-7-羟基香豆素(3)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯乙酸(5g，25.49mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.52g，25.49mmol)，乙酸酐(15.61g，152.94mmol)和三乙胺(10.32g，101.96mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.06g，76.47mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.9g，即3-(2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：78％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),9.25(s,1H),7.86(s,1H),7.53(d,J＝8.5Hz,1H),6.82(s,1H),6.79(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.74(d,J＝2.1Hz,1H),6.52(s,1H),5.95(s,2H)。
实施例6：3-(2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯基)-7-羟基香豆素(3)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯乙酸(5g，25.49mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.52g，25.49mmol)，乙酸酐(13.01g，127.45mmol)和三乙胺(7.74g，76.47mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.06g，76.47mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.09g，即3-(2-羟基-4,5-亚甲二氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：67％。
实施例7：3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素(4)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.54g，32.86mmol)，乙酸酐(20.13g，197.18mmol)和三乙胺(13.30g，131.45mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.94g，98.59mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.18g，即3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率：74％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),9.50(s,1H),7.89(s,1H),7.55(d,J＝8.5Hz,1H),7.27–7.16(m,2H),6.90(d,J＝7.7Hz,1H),6.87–6.79(m,2H),6.76(d,J＝2.2Hz,1H)。
实施例8：3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素(4)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.54g，32.86mmol)，乙酸酐(16.77g，164.31mmol)和三乙胺(9.98g，98.59mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.94g，98.59mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.52g，即3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率：66％。
实施例9：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(5)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.25g，23.56mmol)，乙酸酐(14.43g，141.38mmol)和三乙胺(9.54g，94.25mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.83g，70.69mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.26g，即3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率：71％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.48(s,1H),9.04(s,1H),7.88(s,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),6.88(s,1H),6.80(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.74(d,J＝2.2Hz,1H),6.53(s,1H),3.75(s,3H),3.68(s,3H)。
实施例10：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(5)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.25g，23.56mmol)，乙酸酐(12.03g，117.81mmol)和三乙胺(7.15g，70.69mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.83g，70.69mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.82g，即3-(2-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率：65％。
实施例11：3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)的制备
向圆底烧瓶中加入2-溴-4-羟基苯乙酸(5g，21.64mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(2.99g，21.64mmol)，乙酸酐(13.26g，129.84mmol)和三乙胺(8.76g，86.56mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法C，将反应混合物缓慢倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状褐色固体，水洗至水相为中性，然后加入适量水作溶剂，37％的盐酸(12.79g，129.84mmol)，于80℃搅拌反应6h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，冷却至室温，抽滤得滤饼，滤饼用水洗涤至滤液近中性，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.48g，即3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率：76％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.52(s,1H),10.12(s,1H),7.87(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),7.08(d,J＝2.2Hz,1H),6.82(td,J＝8.4,2.2Hz,2H),6.76(d,J＝1.9Hz,1H)(如图1所示)。FT-IR(KBr,υmax/cm-1):3348,3115,1680,1608,1286,1261,1209,1128,862,775,744,640cm-1(如图2所示)。
实施例12：3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)的制备
向圆底烧瓶中加入2-溴-4-羟基苯乙酸(5g，21.64mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(2.99g，21.64mmol)，乙酸酐(11.05g，108.20mmol)和三乙胺(6.57g，64.92mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法C，将反应混合物缓慢倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状褐色固体，水洗至水相为中性，然后加入适量水作溶剂，37％的盐酸(12.79g，129.84mmol)，于80℃搅拌反应6h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，冷却至室温，抽滤得滤饼，滤饼用水洗涤至滤液近中性，干燥，经乙醇-水混合溶剂重结晶，得浅黄色结晶5.19g，即3-(2-溴4-羟基苯基)-7-羟基香豆素，收率72％。
实施例13：3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(7)的制备
向圆底烧瓶中加入3-羟基-4-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.79g，27.45mmol)，乙酸酐(16.81g，164.68mmol)和三乙胺(11.11g，109.78mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(4.39g，109.78mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经乙酸乙酯-石油醚混合溶剂重结晶，得淡黄色固体4.37g，即3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：56％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.60(s,1H),9.14(s,1H),8.10(s,1H),7.64(d,J＝8.5Hz,1H),7.25(d,J＝2.1Hz,1H),7.18(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.03(d,J＝8.5Hz,1H),6.86(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.79(d,J＝2.1Hz,1H),3.86(s,3H)。
实施例14：3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(7)的制备
向圆底烧瓶中加入3-羟基-4-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.79g，27.45mmol)，乙酸酐(14.01g，137.23mmol)和三乙胺(8.33g，82.34mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(4.39g，109.78mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.05g，即3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：52％。
实施例15：3-(2,4-二羟基苯基)香豆素(8)的制备
向圆底烧瓶中加入2,4-二羟基苯乙酸(5g，29.74mmol)，2-羟基苯甲醛(3.63g，29.74mmol)，乙酸酐(18.21g，178.41mmol)和三乙胺(12.04g，118.94mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.57g，89.21mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经乙醇-水混合溶剂重结晶，得淡黄色固体6.5g，即3-(2,4-二羟基苯基)香豆素，收率：77％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),9.52(s,1H),7.91(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,1H),7.27–7.14(m,2H),6.93–6.71(m,4H)。
实施例16：3-(2,4-二羟基苯基)香豆素(8)的制备
向圆底烧瓶中加入2,4-二羟基苯乙酸(5g，29.74mmol)，2-羟基苯甲醛(3.63g，29.74mmol)，乙酸酐(15.18g，148.68mmol)和三乙胺(9.03g，89.21mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.57g，89.21mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液调节pH＝3，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.92g，即3-(2,4-二羟基苯基)香豆素，收率：70％。
实施例17：3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(9)的制备
向圆底烧瓶中加入3-甲氧基苯乙酸(5g，30.09mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.16g，30.09mmol)，乙酸酐(18.43g，180.53mmol)和三乙胺(12.18g，120.35mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.61g，90.27mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经乙酸乙酯-石油醚混合溶剂重结晶，得淡黄色固体6.62g，即3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：82％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.62(s,1H),8.19(s,1H),7.61(d,J＝8.0Hz,1H),7.35(d,J＝7.5Hz,1H),7.28(s,2H),6.96(d,J＝7.0Hz,1H),6.83(d,J＝7.6Hz,1H),6.76(s,1H),3.81(s,3H)。
实施例18：3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(9)的制备
向圆底烧瓶中加入3-甲氧基苯乙酸(5g，30.09mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.16g，30.09mmol)，乙酸酐(15.36g，150.44mmol)和三乙胺(9.13g，90.27mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.61g，90.27mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经乙醇-水混合溶剂重结晶，得淡黄色固体6.13g，即3-(3-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：76％。
实施例19：3-(2-羟基5-甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(10)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(4.18g，27.45mmol)，乙酸酐(16.81g，164.68mmol)和三乙胺(11.11g，109.78mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.29g，82.34mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.21g，即3-(2-羟基5-甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：88％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.05(s,1H),7.97(s,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝2.3Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.87(d,J＝1.5Hz,1H),6.82(d,J＝1.4Hz,2H),3.88(s,3H),3.69(s,3H)。
实施例20：3-(2-羟基5-甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(10)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(4.18g，27.45mmol)，乙酸酐(14.01g，137.23mmol)和三乙胺(8.33g，82.34mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.29g，82.34mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.55g，即3-(2-羟基5-甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：80％。
实施例21：3-(2-羟基苯基)-7-甲氧基香豆素(11)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(5g，32.86mmol)，乙酸酐(20.13g，197.18mmol)和三乙胺(13.30g，131.45mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.64g，即3-(2-羟基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：64％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.94(s,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,1H),7.26(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.24–7.18(m,1H),7.01(d,J＝2.3Hz,1H),6.96(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.91(d,J＝8.0Hz,1H),6.86(t,J＝7.4Hz,1H),3.87(s,3H)。
实施例22：3-(2-羟基苯基)-7-甲氧基香豆素(11)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(5g，32.86mmol)，乙酸酐(16.77g，164.31mmol)和三乙胺(9.98g，98.59mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.12g，即3-(2-羟基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：58％。
实施例23：3-(3-乙酰氧基-4-甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(12)的制备
向圆底烧瓶中加入3-羟基-4-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.79g，27.45mmol)，乙酸酐(16.81g，164.68mmol)和三乙胺(11.11g，109.78mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.89g，即3-(3-乙酰氧基-4甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：78％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.20(s,1H),7.80(d,J＝8.5Hz,1H),7.70(d,J＝8.8Hz,2H),7.30(d,J＝2.1Hz,1H),7.17(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.03(d,J＝8.8Hz,2H),3.81(s,3H),3.76(s,3H),2.32(s,3H)。
实施例24：3-(3-乙酰氧基-4-甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(12)的制备
向圆底烧瓶中加入3-羟基-4-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.79g，27.45mmol)，乙酸酐(14.01g，137.23mmol)和三乙胺(8.33g，82.34mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.08g，即3-(3-乙酰氧基-4甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：70％。
实施例25：3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素(13)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基-5-氯苯甲醛(5.15g，32.86mmol)，乙酸酐(20.13g，197.18mmol)和三乙胺(13.30g，131.45mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.94g，98.59mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体8.15g，即3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素，收率：91％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.65(s,1H),8.01(s,1H),7.88(d,J＝2.4Hz,1H),7.65(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.25(dd,J＝14.4,7.6Hz,2H),6.98–6.80(m,2H)。
实施例26：3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素(13)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基-5-氯苯甲醛(5.15g，32.86mmol)，乙酸酐(16.77g，164.31mmol)和三乙胺(9.98g，98.59mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.94g，98.59mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液调节pH至1-5，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经乙酸乙酯-石油醚重结晶，得淡黄色固体7.26g，即3-(2-羟基苯基)-6-氯香豆素，收率：81％。
实施例27：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(14)的制备向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.52g，25.48mmol)，乙酸酐(15.61g，152.90mmol)和三乙胺(10.32g，101.94mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.72g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：89％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.12(d,J＝2.0Hz,1H),7.05(dd,J＝8.4Hz,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝2.0Hz,2H),6.49(t,J＝2.0Hz,1H),3.81(s,6H),2.32(s,3H)。
实施例28：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(14)的制备
向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.52g，25.48mmol)，乙酸酐(13.10g，127.42mmol)和三乙胺(7.74g，76.45mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经乙醇-水重结晶，得淡黄色固体7.37g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：85％。
实施例29：2-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-3H-萘并[2,1-b]吡喃-3-酮(15)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基-1-萘醛(4.06g，23.56mmol)，乙酸酐(14.43g，141.38mmol)和三乙胺(9.54g，94.25mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.83g，70.69mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.73g，即2-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-3H-萘并[2,1-b]吡喃-3-酮，收率：82％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(s,1H),8.83(s,1H),8.61(d,J＝8.5Hz,1H),8.22(d,J＝9.0Hz,1H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(t,J＝7.3Hz,1H),7.67–7.61(m,2H),7.19(s,1H),6.94(s,1H),3.82(d,J＝10.6Hz,6H)。
实施例30：2-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-3H-萘并[2,1-b]吡喃-3-酮(15)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基-1-萘醛(4.06g，23.56mmol)，乙酸酐(12.03g，117.81mmol)和三乙胺(7.15g，70.69mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.88g，47.13mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.24g，即2-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-3H-萘并[2,1-b]吡喃-3-酮，收率：76％。
实施例31：3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)香豆素(16)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基苯甲醛(3.35g，27.45mmol)，乙酸酐(16.81g，164.68mmol)和三乙胺(11.11g，109.78mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.20g，54.89mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.89g，即3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)香豆素，收率：80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),8.04(s,1H),7.74(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.61(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.43(d,J＝8.3Hz,1H),7.37(td,J＝7.6,1.0Hz,1H),6.90(t,J＝1.7Hz,1H),6.84(d,J＝1.7Hz,2H),3.70(s,3H)。
实施例32：3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)香豆素(16)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-5-甲氧基苯乙酸(5g，27.45mmol)，2-羟基苯甲醛(3.35g，27.45mmol)，乙酸酐(14.01g，137.23mmol)和三乙胺(8.33g，82.34mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.20g，54.89mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.15g，即3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)香豆素，收率：70％。
实施例33：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(17)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.05g，22.10mmol)，乙酸酐(13.54g，132.61mmol)和三乙胺(8.95g，88.41mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.21g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(s,1H),7.53(d,1H,J＝8.4Hz),7.14(d,1H,J＝2.0Hz),7.05(dd,1H,J＝8.4,2.0Hz),6.91(s,2H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),2.33(s,3H)。
实施例34：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素(17)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.05g，22.10mmol)，乙酸酐(11.28g，110.51mmol)和三乙胺(6.71g，66.30mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.55g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-乙酰氧基香豆素，收率：80％。
实施例35：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素(18)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(13.54g，132.61mmol)和三乙胺(8.95g，88.41mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.77g，44.20mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.15g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素，收率：65％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),7.06(d,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),3.99(s,3H),3.90(s,3H),3.87(s,3H)。
实施例36：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素(18)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(11.28g，110.51mmol)和三乙胺(6.71g，66.30mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.65g，66.30mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝5，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.75g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素，收率：60％。
实施例37：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二羟基香豆素(19)的制备
向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,3,4-三羟基苯甲醛(2.84g，25.48mmol)，乙酸酐(15.61g，152.90mmol)和三乙胺(10.32g，101.94mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.06g，76.54mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.25g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二羟基香豆素，收率：78％。1H NMR(400MHz,CD3COCD3-d6)δ3.80(s,6H),6.49(t,J＝2.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(d,J＝2.0Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,1H),8.04(s,1H)。
实施例38：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二羟基香豆素(19)的制备
向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,3,4-三羟基苯甲醛(2.84g，25.48mmol)，乙酸酐(13.01g，127.42mmol)和三乙胺(7.74g，76.45mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(3.06g，76.54mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.69g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二羟基香豆素，收率：71％。
实施例39：3-(2-溴苯基)香豆素(20)的制备
向圆底烧瓶中加入2-溴苯乙酸(5g，23.25mmol)，2-羟基苯甲醛(2.84g，23.25mmol)，乙酸酐(14.24g，139.51mmol)和三乙胺(9.41g，93.00mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.6g，即3-(2-溴苯基)香豆素，收率：80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(s,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.61-7.52(m,2H),7.40(d,J＝4.6Hz,3H),7.36-7.25(m,2H)。
实施例40：3-(2-溴苯基)香豆素(20)的制备
向圆底烧瓶中加入2-溴苯乙酸(5g，23.25mmol)，2-羟基苯甲醛(2.84g，23.25mmol)，乙酸酐(11.87g，116.25mmol)和三乙胺(7.06g，69.75mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.83g，即3-(2-溴苯基)香豆素，收率：69％。
实施例41：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)香豆素(21)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2-羟基苯甲醛(2.52g，20.64mmol)，乙酸酐(12.64g，123.85mmol)和三乙胺(8.36g，82.57mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.49g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)香豆素，收率：81％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(s,1H),8.03(s,1H),7.74(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),7.65-7.58(m,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),6.76(s,1H),3.81(s,3H),3.78(s,3H),3.74(s,3H)。
实施例42：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)香豆素(21)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2-羟基苯甲醛(2.52g，20.64mmol)，乙酸酐(10.54g，103.21mmol)和三乙胺(6.27g，61.93mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.88g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)香豆素，收率：72％。
实施例43：3-(2-羟基苯基)香豆素(22)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基苯甲醛(4.01g，32.86mmol)，乙酸酐(20.13g，197.18mmol)和三乙胺(13.30g，131.45mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体5.26g，即3-(2-羟基苯基)香豆素，收率：72％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.61(s,1H),8.04(s,1H),7.74(dd,J＝1.6,8.0Hz,1H),7.59–7.64(m,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),7.37(td,J＝0.8,7.6Hz,1H),7.27(dd,J＝1.6,7.6Hz,1H),7.21-7.25(m,1H),6.91(dd,J＝0.8,8.0Hz,1H),6.86(td,J＝0.8,7.6Hz,1H)。
实施例44：3-(2-羟基苯基)香豆素(22)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基苯乙酸(5g，32.86mmol)，2-羟基苯甲醛(4.01g，32.86mmol)，乙酸酐(16.77g，164.31mmol)和三乙胺(9.98g，98.59mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.63g，65.73mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体5.01g，即3-(2-羟基苯基)香豆素，收率：64％。
实施例45：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-乙酰氧基香豆素(23)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(13.54g，132.61mmol)和三乙胺(8.95g，88.41mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.52g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-乙酰氧基香豆素，收率：85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),7.38(d,J＝8.8Hz,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),6.86(s,2H),3.92(s,3H),3.89(s,6H),3.87(s,3H),2.42(s,3H)。
实施例46：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-乙酰氧基香豆素(23)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(11.28g，110.51mmol)和三乙胺(6.71g，66.30mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.81g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-乙酰氧基香豆素，收率：77％。
实施例47：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素(24)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(13.54g，132.61mmol)和三乙胺(8.95g，88.41mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(0.88g，22.10mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体6.83g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素，收率：80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),8.18(s,1H),7.21(d,J＝8.2Hz,1H),7.06(d,J＝15.6Hz,3H),3.90(s,3H),3.83(s,6H),3.70(s,3H)。
实施例48：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素(24)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,3-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.72g，22.10mmol)，乙酸酐(11.28g，110.51mmol)和三乙胺(6.71g，66.30mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(0.88g，22.10mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝4，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体6.4g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-羟基香豆素，收率：75％。
实施例49：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)香豆素(25)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基苯甲醛(2.88g，23.56mmol)，乙酸酐(14.43g，141.38mmol)和三乙胺(9.54g，94.25mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.88g，47.13mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.69g，即3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)香豆素，收率：81％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.23(s,1H),8.07(s,1H),7.79(d,J＝7.7Hz,1H),7.65(dd,J＝11.4,4.2Hz,1H),7.48(d,J＝8.2Hz,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,1H),6.98(s,1H),6.61(s,1H),3.81(s,3H),3.75(s,3H)。
实施例50：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)香豆素(25)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基苯甲醛(2.88g，23.56mmol)，乙酸酐(12.03g，117.81mmol)和三乙胺(7.15g，70.69mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.88g，47.13mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.78g，即3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)香豆素，收率：68％。
实施例51：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素(26)的制备
向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,3,4-三羟基苯甲醛(3.93g，25.48mmol)，乙酸酐(15.61g，152.90mmol)和三乙胺(10.32g，101.94mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体7.41g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素，收率：73％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.33(s,1H),7.73(d,J＝8.6Hz,1H),7.33(d,J＝8.6Hz,1H),6.88(d,J＝2.2Hz,2H),6.59(t,J＝2.2Hz,1H),3.79(d,J＝3.1Hz,9H),2.42(s,3H),2.35(s,3H)。
实施例52：3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素(26)的制备
向圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基苯乙酸(5g，25.48mmol)，2,3,4-三羟基苯甲醛(3.93g，25.48mmol)，乙酸酐(13.01g，127.42mmol)和三乙胺(7.74g，76.45mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法A，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，抽滤，水洗至滤液呈近中性，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.49g，即3-(3,5-二甲氧基苯基)-7,8-二乙酰氧基香豆素，收率：64％。
实施例53：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(27)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.05g，22.10mmol)，乙酸酐(11.28g，110.51mmol)和三乙胺(6.71g，66.30mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体5.45g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(s,2H),6.88(d,J＝2.0Hz,1H),6.81(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),3.89(s,6H),3.87(s,3H)。
实施例54：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(27)的制备
向圆底烧瓶中加入3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，22.10mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(3.05g，22.10mmol)，乙酸酐(13.54g，132.61mmol)和三乙胺(8.95g，88.41mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得白色固体5.08g，即3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：70％。
实施例55：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(28)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.14g，20.64mmol)，乙酸酐(10.54g，103.21mmol)和三乙胺(6.27g，61.93mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.85g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：79％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(s,1H),7.95(s,1H),7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝2.3Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.73(s,1H),3.88(s,3H),3.80(s,3H),3.78(s,3H),3.73(s,3H)。
实施例56：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(28)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.14g，20.64mmol)，乙酸酐(12.64g，123.85mmol)和三乙胺(8.36g，82.57mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.55g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：75％。
实施例57：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(29)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(2.85g，20.64mmol)，乙酸酐(10.54g，103.21mmol)和三乙胺(6.27g，61.93mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体5.19g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：73％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),8.55(s,1H),7.89(s,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.76(t,J＝2.4Hz,1H),6.71(s,1H),3.80(s,3H),3.78(s,3H),3.73(s,3H)。
实施例58：3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(29)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯乙酸(5g，20.64mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(2.85g，20.64mmol)，乙酸酐(12.64g，123.85mmol)和三乙胺(8.36g，82.57mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.65g，41.28mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体4.83g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：68％。
实施例59：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(30)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.59g，23.56mmol)，乙酸酐(12.03g，117.81mmol)和三乙胺(7.15g，70.69mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.88g，47.13mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝3，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得黄色固体6.11g，即3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(s,1H),7.69(s,1H),7.52(d,J＝8.6Hz,1H),7.04–6.85(m,2H),6.76(s,1H),6.64(s,1H),4.07–3.71(m,9H)。
实施例60：3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素(30)的制备
向圆底烧瓶中加入2-羟基-4,5-二甲氧基苯乙酸(5g，23.56mmol)，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.59g，23.56mmol)，乙酸酐(14.43g，141.38mmol)和三乙胺(9.54g，94.25mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(1.88g，47.13mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得黄色固体5.03g，即3-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-7-甲氧基香豆素，收率：65％。
实施例61：3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的制备
向圆底烧瓶中加入4-甲氧基苯乙酸(5g，30.09mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.16g，30.09mmol)，乙酸酐(12.29g，120.35mmol)和三乙胺(6.09g，60.18mmol)，于120℃搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法C，将反应混合物缓慢倒入冰水中，不断搅拌，得到大量黄色固体，抽滤，水洗，收集滤饼，转移至圆底烧瓶中，然后加入适量水作溶剂，37％的浓盐酸(11.86g，120.35mmol)，于80℃搅拌反应6h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，冷却至室温，抽滤得滤饼，滤饼用水洗涤至滤液近中性，干燥，经乙醇-水混合溶剂重结晶，得浅黄色固体7.42g，即3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：92％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),8.08(s,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),7.00(d,J＝8.5Hz,2H),6.81(d,J＝8.5Hz,1H),6.74(s,1H)(如图4所示)。FT-IR(KBr,υmax/cm-1):3219,1697,1612,1300,1132,1024,812,775,740,692cm-1(如图5所示)。
实施例62：3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的制备
向圆底烧瓶中加入4-甲氧基苯乙酸(5g，30.09mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.16g，30.09mmol)，乙酸酐(15.36g，150.44mmol)和三乙胺(9.13g，90.27mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法C，将反应混合物缓慢倒入冰水中，不断搅拌，得到大量黄色固体，抽滤，水洗，收集滤饼，转移至圆底烧瓶中，然后加入适量水作溶剂，37％的浓盐酸(11.86g，120.35mmol)，于80℃搅拌反应6h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，冷却至室温，，抽滤得滤饼，滤饼用水洗涤至滤液近中性，干燥，经乙醇重结晶纯化得淡黄色固体6.86g，即3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：85％。
实施例63：3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)的制备
向圆底烧瓶中加入4-甲氧基苯乙酸(5g，30.09mmol)，2,4-二羟基苯甲醛(4.16g，30.09mmol)，乙酸酐(18.27g，180.53mmol)和三乙胺(9.22g，90.27mmol)，于110℃搅拌反应10h，薄层色谱监控反应进程。反应完毕后，按后处理方法B，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，得到粘稠状固体，倒出上层清液，用水浸泡洗涤粘稠物至水相接近中性。向上述粘稠物中加入氢氧化钠(2.41g，60.18mmol)水溶液50mL，搅拌使其溶解，用乙酸乙酯萃洗两次，分液得水层，缓慢滴加稀盐酸水溶液，调节pH＝2，析出大量固体，抽滤，水洗，收集滤饼，干燥，经柱层析纯化得淡黄色固体6.62g，即3-(2-羟基-3,4,5-三甲氧基苯基)-7-羟基香豆素，收率：82％。
测试例1：晶型表征：化合物6和化合物31的X-射线粉末衍射(XRPD)测试
仪器型号：PANalytical Empyrean X-射线衍射仪
测试条件：Cu靶，Kα1、Kα2辐射，管电流40mA，管电压40KV，扫描步长0.026°，范围扫描5°～70°。化合物6的X-射线粉末衍射测试数据见表1，其X-射线粉末衍射测试谱图如图3所示。化合物31的X-射线粉末衍射测试数据见表2，其X-射线粉末衍射测试谱图如图6所示。
表1.化合物6的X-射线粉末衍射测试数据
Figure BDA0002955794640000321
Figure BDA0002955794640000331
表2.化合物31的X-射线粉末衍射测试数据
Figure BDA0002955794640000332
Figure BDA0002955794640000341
Figure BDA0002955794640000351
测试例2：系列3-芳基香豆素衍生物体外激动SIRT3去乙酰化酶活性测试实验技术方法：两步法去乙酰化酶活性荧光检测
实验采用CycLex的SIRT3去乙酰化酶活性荧光检测试剂盒测定SIRT3酶活性。其原理是通过构建一个N端带有荧光基团，C端带有淬灭基团的乙酰化底物肽段，当该底物与去乙酰化酶SIRT3接触后，由于去乙酰化作用而使赖氨酸残基暴露，随后被检测体系中的肽酶识别和剪切，使荧光基团脱离出来，随后被仪器检测到荧光。因此可根据检测体系的荧光强度来判断样品中SIRT3的酶活性。
用50μM上述实施例制备得到的系列3-芳基香豆素衍生物处理细胞后，裂解细胞，提取细胞裂解液加入SIRT3一抗，孵育12h后加入琼脂糖珠子孵育3h，离心后用裂解液将蛋白定容至20ul，加入试剂盒内反应体系，将上述反应体系依次加入到96孔白板中，在多功能酶标仪上进行连续波长检测。发射波长：440-460nm，激发波长：340-360nm，检测时间60min。待反应速率恒定后终止反应，读取荧光强度，进行统计分析。
实验结果如表3所示，其中化合物6、9、14、17、27、31在浓度为50μM时能够在体外明显激活SIRT3的去乙酰化酶活性。其中，化合物6即3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素和化合物31即3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素的效价最高。其中，化合物编号与发明内容中优选的3-芳基香豆素衍生物的序号相一致，如化合物1即为(1)3-(2-羟基苯基)-6-甲基香豆素。
表3.系列3-芳基香豆素衍生物的SIRT3激动能力测试数值
Figure BDA0002955794640000361
测试例3：3-(2-溴-4-羟基苯基)-7-羟基香豆素(6)和3-(4-甲氧基苯基)-7-羟基香豆素(31)与SIRT3全长蛋白结合实验。
实验技术方法：表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonancetechnology,SPR)。该技术是基于SPR检测生物传感芯片(Biosensorchip)上配体与分析物作用的前沿技术，与传统手段相比，SPR无需对样品进行标记，能实现实时检测、灵敏度高等优点。本发明将纯化的SIRT3全长蛋白进行SPR检测。操作步骤如下：将感应芯片插入Bicore 800K检测系统，用PBST溶液平衡系统。待测蛋白溶解到醋酸钠溶液中，然后通过氨基将上述蛋白固定在感应芯片的独立垂直通路上，摸索相关参数，待技术稳定后，溶解于PBST溶液的不同浓度的待测化合物水平流入芯片，实验结果数据用软件进行动态分析。通过该实验可以检测待测化合物在何种浓度下可以与SIRT3蛋白相互结合，结合与分离的时间等参数。
图7展示了3-芳基香豆素类衍生物(式I)能够与全长SIRT3蛋白结合，化合物6、化合物26、化合物30和化合物31的效果都很好，其中化合物6和化合物31为最优，解离常数KD值分别为15μM和24.3μM，实验结果表明本发明的化合物特别是化合物6和化合物31与SIRT3蛋白有较好的亲和力。
测试例4：化合物6、化合物31上调SIRT3去乙酰化酶活性实验
实验技术方法：
(1)免疫印记(WesternBlot)技术：细胞经不同药物处理12-24h后，用PBS清洗细胞，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂裂解细胞，将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上，经过BSA封闭液封闭1h后，分别用对应一抗稀释液，在4℃孵育过夜，再用HRP标记的二抗孵育1h，最后用Tanon显影仪检测蛋白表达水平。
(2)SIRT3去乙酰化酶活性检测：实验采用CycLex的SIRT3去乙酰化酶活性荧光检测试剂盒测定SIRT3酶活性。其原理是通过构建一个N端带有荧光基团，C端带有淬灭基团的乙酰化底物肽段，当该底物与去乙酰化酶SIRT3接触后，由于去乙酰化作用而使赖氨酸残基暴露，随后被检测体系中的肽酶识别和剪切，使荧光基团脱离出来，随后被仪器检测到荧光。因此可根据检测体系的荧光强度来判断样品中SIRT3的酶活性。
用化合物6和化合物31处理细胞后，裂解细胞，提取细胞裂解液加入SIRT3一抗，孵育12h后加入琼脂糖珠子孵育3h，离心后用裂解液将蛋白定容至20ul，加入试剂盒内反应体系，将上述反应体系依次加入到96孔白板中，在多功能酶标仪上进行连续波长检测。发射波长：440-460nm，激发波长：340-360nm，检测时间60min。待反应速率恒定后终止反应，读取荧光强度，进行统计分析。
(3)免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation)：弃去培养基，预冷的PBS洗涤，加入100mL IP裂解液，冰上静置将定量后的蛋白分装至1.5mL EP管中，实验组加入MnSOD一抗原液，IgG组加入相同抗性的IgG置于4℃孵育。孵育结束后，加入Protein A/G琼脂糖珠子，4℃继续孵育。低温离心弃上清，加入IP Washing Buffer 1，离心弃上清。IP WashingBuffer 2和3依次清洗沉淀。向沉淀中加入2×Loading Buffer，沸水浴中煮5min，涡旋混匀并瞬离，并进行WesternBlot。
实验结果如图8所示，其中图A为在SZC系列化合物中选出活性最强的化合物6和化合物31，体外检测化合物6和化合物31梯度浓度对SIRT3去乙酰化酶活性激动能力影响的量效曲线,实验结果提示化合物6和化合物31在激活SIRT3活性上具有较为接近的EC50值，并且在100μM浓度下能够提高SIRT3去乙酰化酶活性接近60倍。图B为不同浓度下，化合物6、化合物31对原代心肌细胞中MnSOD在K122位点(图中AcK122代表K122位点乙酰化水平)的乙酰化水平的影响，结果提示在10μM下化合物6和化合物31能够显著降低SIRT3底物MnSOD的乙酰化水平。图C为10μM化合物6、化合物31处理下，原代心肌细胞中MnSOD的总乙酰化水平显著下降。以上结果提示化合物6和化合物31能够在胞内激活SIRT3的去乙酰化酶活性，降低底物的乙酰化水平。
测试例5：化合物6、化合物31逆转ISO(Isoprenaline，异丙肾上腺素)刺激诱导的心肌肥厚实验
实验方案及步骤：
(1)细胞的培养：取1～3天新生SD大鼠，打开胸腔取出乳鼠心脏，PBS清洗后加入0.08％胰蛋白酶冰上冷消化。结束后转移至37℃水浴，转速240rpm，胰酶消化5分钟，收集上清至离心管中，重复消化步骤至组织块消化完全并用适量DMEM重悬细胞接种于25cm2培养皿，继续培养24小时后，更换新的DMEM培养基，进行后续操作。
(2)免疫印记(WesternBlot)实验：细胞经不同浓度化合物6、化合物31处理24h后，用PBS清洗细胞，加入含有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞。离心、定量、煮沸变性，用SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，转膜到PVDF膜上，经过5％脱脂牛奶封闭后，加入一抗ANF、β-MHC、α-Tubulin在4℃孵育过夜，二抗孵育1h，最后在显影仪上检测蛋白表达水平。
(3)心肌细胞表面积测定：化合物6、化合物31处理后的原代心肌细胞弃去培养基，用37℃温浴的PBS轻柔洗2次后用多聚甲醛固定细胞，弃上清加入TritonX-100破膜，山羊血清封闭30min，加入罗丹明工作液，孵育后DAPI染核，用EVOSFLAuto成像系统观察细胞形态，并用全自动细胞组学系统对实验组细胞进行表面积统计分析。
实验结果如图9所示，其中图A为给予不同浓度化合物6、化合物31处理后的原代心肌细胞在ISO刺激后胞内肥大标志蛋白β-MHC、ANF的表达水平，结果提示与对照组相比，给药组的β-MHC表达水平显著下降，并表现出浓度梯度依赖性；图B为在分别给予10μM化合物6和化合物31处理后对原代乳鼠心肌细胞进行罗丹明染色的结果，结果提示通过化合物6和化合物31处理后能部分逆转ISO刺激诱导的细胞表面积增加，使细胞形态处于正常水平；图C为统计图，实验结果提示化合物6、化合物31处理原代心肌细胞能够一定水平上逆转ISO刺激下诱导的心肌肥大。

Claims (1)

1.一种3-芳基香豆素类衍生物的用途，其特征在于：所述的3-芳基香豆素类衍生物为3-(2-溴- 4-羟基苯基)-7-羟基香豆素，用于制备具有激活SIRT3活性、保护心肌、抗心肌肥大作用的药物。
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