CN111803501A - 手性氯喹羟氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物靶点3cl水解酶抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了手性的氯喹、羟基氯喹或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗冠状病毒肺炎药物中，以冠状病毒关键药物靶点3CL水解酶(Mpro)为作用靶点的应用。手性的氯喹、羟基氯喹均与引发肺部等炎症的Mpro具有较强结合强度，可显著性地抑制Mpro的活性，表明其具有防治冠状病毒引发肺炎的作用，可作为抗肺炎药物使用。通过对hERG钾离子通道的抑制活性评价，提供了氯喹、羟基氯喹及其对映异构体对hERG钾离子通道可能产生心脏毒性的浓度。通过手性高效液相色谱和手性合成制备手性氯喹、羟基氯喹，可以选择S构型的氯喹、羟基氯喹或其盐单独作为药物，或者形成药物组合物，用于治疗冠状病毒引发的疾病，由于其活性更强、心脏毒性小，给药剂量的范围大大拓宽。

Description

手性氯喹羟氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物 靶点3CL水解酶抑制剂的用途
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及手性的氯喹、羟基氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物靶点3CL水解酶抑制剂的用途。
背景技术
2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，于2019年12月首次爆发，由新型冠状病毒，又称严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起。其临床特征为发热，干咳，乏力，并逐步进展为气喘，呼吸乏力等症状。尽管部分轻症患者可自愈，但仍有较多患者在后期病情快速进展，发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症、肾功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒和出血凝血障碍。该病主要经呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感，具有高度传染性。世界卫生组织已宣布，新冠疫情已构成全球大流行。目前已有超过188个国家和地区受到该病的影响。截至2020年6月6日，根据约翰霍普金斯大学发布的实时数据，全球累计确诊病例已超过673万例，死亡人数超过39万人(病死率约为5.8％)。新冠病毒爆发的传染性和致命性，不仅对社会和经济造成了严重的影响，也对医学界和世界各国政府提出了前所未有的挑战。
目前新冠肺炎尚未有疗效明确的治疗药物，临床治疗多采取隔离、抗病毒、对症支持等疗法为主，然而这些治疗仍不能满足临床需求。一方面，常用的抗病毒药物易引起神经毒性，腹泻，心律失常，肝功能异常等副作用，对于患有基础代谢障碍，免疫功能低下，或者癌症等多种基础疾病的老年人尤为需要谨慎使用。另一方面，采取对症治疗，对于逆转重症患者病情效果不明显，或者效果不佳，易引发合并感染，造成多发性、弥漫性病变。因此开展针对新型冠状病毒的靶向药物研究将具有重大意义。
新冠病毒是一种有包膜的单链RNA β属冠状病毒。新冠病毒的感染起始于病毒粒子表面棘突糖蛋白(Spike，S蛋白)与细胞表面血管紧张素转换酶(ACE2)受体的结合。冠状病毒进入宿主细胞后解体，将核衣壳和病毒RNA释放到细胞质中，病毒RNA 5′末端开放阅读框(ORF1a/b)编码多聚蛋白质(pp1a和pp1ab)。pp1a和pp1ab可被木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease，PLpro)和3CL蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease，3CLpro，也被叫做Mpro)切割，产生非结构蛋白(non-structural proteins，NSPs)，如RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)和解螺旋酶(helicase)等，它们都是参与冠状病毒转录和复制的重要酶。其中，新型冠状病毒与SARS-nCoV的3CLpro水解酶有高达96％相似度的氨基酸序列。在疫情发生后，饶子和/杨海涛团队快速表达并解析了新冠病毒的3CL水解酶(Mpro)并获得了高分辨率晶体结构(PDB ID：6LU7)，极大的推动了此类小分子抑制剂的研发。当3CL水解酶活性被抑制后，病毒的转录和复制将被影响，从而抑制其繁殖和扩散。因此，3CL水解酶被认为是开发抗病毒药物有吸引力的关键靶点之一。
氯喹(Chloroquine)及其衍生物羟基氯喹(Hydroxychloroquine)作为被美国FDA通过的安全老药，是最具有临床价值的一种治疗疟疾以及类风湿关节炎的药物，且价格低廉。氯喹从1944年开始应用于临床，最初用来治疗疟疾，以后用途逐渐扩大。1951年，用于治疗类风湿关节炎，有一定效果。羟基氯喹为4-氨基喹啉衍生物类非类固醇类抗炎药，作用和机制与氯喹类似，但毒性仅为氯喹的一半。羟基氯喹也有抗疟、抗炎、抗寄生虫、抗原虫、调节免疫、抗感染、光滤、抗凝等作用，还可以用于治疗系统性和盘状红斑狼疮以及类风湿关节炎。
最近研究发现，磷酸氯喹在细胞水平上能有效抑制新型冠状病毒的感染(EC50＝1.13μM in Vero E6 cells)。法国确诊的36例新冠病毒患者从早期就使用羟基氯喹治疗方案，从3月16日起，每日服用600mg羟基氯喹，每天在医院进行鼻咽拭子检测来了解其病毒载量。2020年3月28日，FDA在紧急使用许可下授权使用羟基氯喹和氯喹。2020年4月1日，欧洲药物管理局发布指导意见，氯喹和羟基氯喹仅用于临床试验或紧急使用项目。但是在近期的临床试验中，有关氯喹和羟氯喹可能导致心脏节律的问题引发了一系列关注。
值得注意的是，迄今为止，所有针对COVID-19的临床试验都是使用氯喹或羟基氯喹的外消旋混合物，因此观察结果实际上是这两种药物的两种不同但非常相似的光学异构体的共同表现。手性药物的不同对映体与蛋白质的相互作用不同，因此可能会有不同的药理作用与效果。作为手性药物，氯喹或羟基氯喹的两种对映体在患者中可能表现出不同的疗效和安全性。这些差异，无论大小，都可以转化为性能差异，这些差异可能会影响氯喹或羟基氯喹对映体最终能否成为COVID-19可行的治疗药物的决策过程，这还需要进一步的测试，包括临床试验。
氯喹和羟基氯喹的排除半衰期都非常长(20～50天)。由于非常低的代谢率，这些药物会随着时间的推移在组织中过量积累，尤其是眼睛、皮肤、大脑、心脏和肝脏。氯喹和羟基氯喹的最大推荐剂量(据FDA，分别为300mg/kg和400mg/kg)以外的长期和更高的剂量会使患者面临不良反应的风险，如不可逆视网膜病变、神经疾病和心脏毒性。
通常，在药物引起的毒副作用中，心脏毒性是一项十分重要的检测指标，其主要原因为：阻断心脏的快速延迟整流电流，造成心脏动作电位时程中QT间期延长，进而诱发尖端扭转性室性心动过速，严重时可引起突然死亡。IKr由hERG基因编码的Kv11.1钾离子通道传导，在整个动作电位时程中起到至关重要的作用,各国的药物监管部门规定临床药物必须按照国际协调会议指南进行全面的hERG活性和QT间期评价。尽早有效地预测、评价、优化，避免药物对hERG钾通道的抑制活性和患者心脏突发死亡事件，有助于降低药物开发的成本，提高药物开发的成功率。
发明内容
尽管氯喹和羟基氯喹外消旋混合物在细胞层面展出不同的抗新冠病毒活性，每个异构体的功能以及可能产生的hERG毒性还没有被报道，尤其是现在临床试验中广为关注的心脏毒性。如果两种对映体的有效性和安全性可以进一步被评价并区分，加之已经了解的其抗病毒活性和药代动力学差异，那么COVID-19可以用不含可能导致不良反应和稀释治疗效果的对映体，而是单独使用更有效、更安全的对映体进行治疗。单对映体的给药剂量可能更高，如果需要，可用通过更长的治疗时间以获得更好的药物效果，这将优于以前开发的外消旋氯喹或羟基氯喹。因此，迫切需要评估氯喹和羟基氯喹对映体的心脏毒性，为COVID-19的治疗提供更广泛的安全性治疗指标。此外对于新靶点的研究，可以提供更多药物作用机制的信息。
本发明的目的是，通过分析不同构型的手性氯喹、羟基氯喹或其盐的心脏毒性，从而提供手性氯喹、羟基氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物靶点3CL水解酶抑制剂的用途。
本发明的另一目的是提供一种预防和/或治疗冠状病毒引发的疾病的药物组合物。
本发明的另一目的是提供一种合成手性的氯喹、羟基氯喹或其盐的方法。
为达到上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
手性的氯喹、羟基氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物靶点3CL水解酶抑制剂的用途。
进一步地，所述手性的氯喹、羟基氯喹选自以下化合物：
Figure BDA0002544461740000031
进一步地，所述手性的氯喹、羟基氯喹的盐选自以下化合物：
Figure BDA0002544461740000041
进一步地，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐选自以下化合物：
Figure BDA0002544461740000042
进一步地，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐为药学上可接受的盐或酯、互变异构体、多晶型物、假多晶型物、无定形形式、水合物或溶剂化物。
进一步地，所述冠状病毒包括：SARS、MERS、新型冠状病毒SARS-CoV-2。
一种预防和/或治疗冠状病毒引发的疾病的药物组合物，其包含手性的氯喹、羟基氯喹或其盐。
进一步地，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐选择以下化合物中的至少一种：
Figure BDA0002544461740000043
Figure BDA0002544461740000051
药物组合物中，手性的氯喹、羟基氯喹或其盐可与其他防治新型冠状病毒的药物搭配使用。
进一步地，所述药物组合物为S-氯喹、S-羟基氯喹或其药学上可接受的盐与阿奇霉素的组合。
进一步地，所述药物组合物为S-氯喹、S-羟基氯喹或其药学上可接受的盐与阿奇霉素和锌的组合。
进一步地，所述药物组合物包括药学上可接受的载体或辅料。
进一步地，所述药物组合物为胶囊、片剂、丸剂、霜剂、乳剂、软膏剂、混悬剂、冻干剂、胶囊、缓释剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。
进一步地，所述冠状病毒包括：SARS、MERS、新型冠状病毒SARS-CoV-2。
该药物组合物适用于人或动物，动物包括猫、狗、鹦鹉、鱼、八哥等宠物。
手性的氯喹、羟基氯喹或其盐在制备冠状病毒的药物中的应用。这得益于手性的氯喹、羟基氯喹或其盐与冠状病毒关键药物靶点3CL水解酶(Mpro)具有较高的结合强度，可以抑制3CL水解酶的活性。
进一步地，所述冠状病毒是新型冠状病毒SARS-CoV-2。
一种合成手性的氯喹、羟基氯喹或其盐的方法，包括以下步骤
以手性扁桃酸为拆分试剂，对化合物A手性拆分得到化合物B，
化合物B与4,7-二氯喹啉反应得到化合物C，
化合物C与硫酸或磷酸反应得到产物，
其中，R为氢或羟基，X为硫酸或磷酸，
Figure BDA0002544461740000052
一种通过手性高效液相色谱制备上述手性化合物的方法，包括以下步骤：通过手性高效液相色谱柱将外消旋原料分离得到手性产物，其中，固定相为多糖类键合硅胶；流动相为水溶性有机溶剂与非水溶性有机溶剂组成的混合溶液体系；检测波长为220～300nm。
进一步地，所述多糖类键合硅胶为直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶。
进一步地，所述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或异丙醇，所述非水溶性有机溶剂为正己烷、环己烷、异己烷或正庚烷。
进一步地，所述流动相为体积比是85：15的正己烷和异丙醇。
进一步地，所述溶剂体系中加入体积为溶液总体积0.1％的有机碱。
进一步地，所述有机碱为二乙胺。
进一步地，所述流动相为等度或梯度洗脱。
本发明通过对体外心肌细胞中的hERG离子通道的抑制性评价，提供了手性的氯喹、羟基氯喹或其盐对hERG的产生心脏毒性的药物浓度。所述细胞来自人体心肌细胞；所述离子通道为hERG离子通道。
本发明采用手性高效液相色谱法将氯喹和羟基氯喹的外消旋混合物进行手性拆分，并对R-和S-氯喹、R-和S-羟基氯喹以及外消旋氯喹、羟基氯喹的抗病毒作用进行了平行测试。初步结果显示，S-氯喹和S-羟基氯喹在体外抗SARS-CoV-2实验中均表现出比它们各自的R-对映体更显著的活性。具体地说，S-羟基氯喹的结果显示出明显的对映选择性，其效率比R-羟基氯喹高60％。S-氯喹和S-羟基氯喹的IC50分别是1.761μM和1.444μM,而他们的R-对映体各自的IC50值分别是1.975μM和2.445μM。外消旋氯喹和羟基氯喹的IC50值则分别1.801μM和1.752μM，如预期的结果一样，其IC50值分别两个对映体之间。外消旋氯喹和羟基氯喹的IC50表示，在测试条件下，S-对映体是抗病毒活性的主要贡献者。这意味着R-对映体或是作为抗病毒活性的小贡献者，提供迄今为止未知的可能益处，如细胞因子风暴管理，或者导致不良副作用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明发现：S型氯喹和S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐的抗冠状病毒活性优于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体；S型氯喹和S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐对心肌细胞中的hERG抑制率要小于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体体，并且其抑制浓度高于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体；S型氯喹和S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐对冠状病毒3CL水解酶活性的抑制作用优于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体。这充分说明，S型的氯喹、羟基氯喹及其盐相比R型的氯喹、羟基氯喹及其盐，具有更强的抗病毒活性以及更低的心脏毒性，是更有潜力的针对冠状病毒尤其是新型冠状病毒的药物。通过拆分，可以选择S构型的氯喹、羟基氯喹或其盐单独作为药物，或者与其他药物、载体、辅料等形成药物组合物，用于治疗冠状病毒引发的疾病，由于其活性更强、而且心脏毒性小，其给药剂量的范围大大拓宽。
2、本发明提供了通过手性高效液相色谱制备手性氯喹、羟基氯喹的方法以及合成手性的氯喹、羟基氯喹或其盐的方法，可以大规模制备手性的氯喹、羟基氯喹。
附图说明
图1是实施例1氯喹手性拆分的HPLC图谱；
图2是实施例4羟基氯喹手性拆分的HPLC图谱；
图3是实施例8氯喹及其对映异构体的药物浓度抑制率曲线；
图4是实施例9羟基氯喹及其对映异构体的药物浓度抑制率曲线；
图5是实施例10S-羟基氯喹与新型冠状病毒药物靶点3CL水解酶的结合模式图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及附图，对本发明进一步详细阐释。所属实施例仅用于阐释本发明，而非限制本发明范围，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
在描述实验细节时，使用了某些缩写和缩略词。尽管它们中的大多数能被本领域技术人员所理解，但下表包含了这些缩写和缩略词的列表。
Figure BDA0002544461740000071
Figure BDA0002544461740000081
实施例1
通过手性高效液相色谱制备手性氯喹
从市场购买的外消旋氯喹磷酸盐1，在碱性条件下转化为游离态外消旋氯喹2。
Figure BDA0002544461740000082
在0℃下，将13.0g的磷酸氯喹溶于75mL水中，随后加入50mL 12％的NaOH水溶液，搅拌半小时后，加入25mL乙酸乙酯，继续搅拌半小时。反应液自然升到室温，用100mL的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用150mL的饱和食盐水、水洗涤，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠。用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到形状为淡黄色粘稠状液体的游离的氯喹7.6g，产率94％。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.50(d,J＝5.4Hz,1H),7.94(t,J＝1.8Hz,1H),7.69(dd,J＝9.1,1.3Hz,1H),7.34–7.28(m,1H),6.42(d,J＝5.4Hz,1H),5.36(d,J＝7.3Hz,1H),3.71(hept,J＝6.4Hz,1H),2.52(q,J＝7.1Hz,4H),2.47–2.40(m,2H),1.73(dq,J＝13.9,7.0Hz,1H),1.62(dddd,J＝22.4,15.2,11.6,6.6Hz,3H),1.31(dd,J＝6.4,1.4Hz,3H),1.00(td,J＝7.2,1.4Hz,6H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ151.93,149.31,149.01,134.64,128.68,124.85,121.18,117.28,99.20,52.46,48.22,46.73,34.48,23.79,20.08,11.34。
采用手性高效液相色谱法对游离态氯喹进行手性色谱分离，可以得到光学纯的R和S游离态氯喹。发明人尝试了现有的AD3、OD、OJ、AS3、IC、ADH、ODH手性柱，均不能分开外消旋的游离态氯喹，可见现有技术无法实现对映体的拆分；发明人通过采用直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)手性柱，并在流动性中加入二乙胺作为碱，最终完成了手性拆分。
将5.03g氯喹溶于等容正己烷/异丙醇/二乙胺中，比例为85：15：0.1(v/v/v)。将所得溶液装入CHIRALPAKAY-H(AYH0CE-VC001)手性柱中，用相同的溶剂体系洗脱。制备条件为：流速为1.0mL/min，检测波长为UV 254nm，温度为35℃。第一个在4.86分钟的洗脱化合物是S-氯喹，第二个在5.33分钟的洗脱化合物是R-氯喹。收集各对映体的组分并进行组合。采用旋转蒸发器减压脱除溶剂，得到了纯光学异构体，S-氯喹的质量为2.56g，ee>95％；R-氯喹的质量为2.48g，ee>95％，结果如图1所示。
实施例2
光学纯氯喹磷酸盐的制备
R与S游离态氯喹转化为光学纯氯喹磷酸盐
Figure BDA0002544461740000091
将640mg的S-氯喹溶于4mL乙醇，加热至回流。向上述溶液中滴加0.25mL的85％的磷酸，回流反应两小时，此时有大量白色固体析出。反应液冷却到室温后过滤，用1mL乙醇洗涤三次滤饼，得到白色的S-磷酸氯喹固体868mg，产率84％，[α]D 27.8＝79.7(c＝0.5,H2O)。
Figure BDA0002544461740000092
将640mg的R-氯喹溶于4mL乙醇，加热至回流。向上述溶液中滴加0.25mL的85％的磷酸，回流反应两小时，此时有大量白色固体析出。反应液冷却到室温后过滤，用1mL乙醇洗涤三次滤饼，得到白色的R-磷酸氯喹固体887mg，产率86％，[α]D 26.8＝-74.4(c＝0.5,H2O)。
实施例3
通过手性合成方法制备手性磷酸氯喹
称取氯喹侧链(化学名：(±)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷)72g(0.46mol)，加入250mL圆底烧瓶中，再加入异丙醇100mL，搅拌使其溶解；将D-(-)-扁桃酸(R-(-)-扁桃酸)36.5g(0.24mol)加入反应瓶中，室温搅拌，有大量白色固体析出；搅拌3h使成盐完全，抽滤，用异丙醇洗涤固体三次，每次50mL；母液合并后浓缩至100mL，加入少量抽滤所得固体作为晶种，使未析出的固体结晶析出；抽滤，异丙醇洗涤三次，每次50mL。合并两次抽滤所得白色固体，置于250mL烧瓶中，倒入50mL异丙醇，回流搅拌，缓慢滴加异丙醇至完全澄清，停止加热，冷却，析晶。抽滤，放入真空干燥箱干燥，得白色固体68.8g，为(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷R-(-)-扁桃酸盐，收率94.9％。
采用L-(+)-扁桃酸(S-(+)-扁桃酸)为拆分试剂，采取与上述相同的操作步骤，可得到(S)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷S-(+)-扁桃酸盐，收率93.8％。
测得比旋光度值如下，(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷R-(-)-扁桃酸盐：[α]D 20＝-56.1°(c＝1.0g/100mL,H2O)；(S)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷S-(+)-扁桃酸盐：
Figure BDA0002544461740000101
(c＝1.0g/100mL,H2O)。
Figure BDA0002544461740000102
将上一步骤拆分得到的(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷R-(-)-扁桃酸盐68.8g用200mL水溶解，加入1M NaOH调pH＝11～12，水相加入适量氯化钠，用二氯甲烷萃取三次；合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得无色油状物35.3g(0.251mol)，为游离碱形态的(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷(即R-氯喹侧链)。将其转移至三颈烧瓶中，称取4,7-二氯喹啉44.8g(0.226mol)、异丙醇6mL，加热至130℃，搅拌，反应18h，停止反应，自然冷却；加入1M NaOH溶液调pH＝12，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，浓缩；再加2M HCl溶液调pH＝2，用二氯甲烷洗去少量未反应的4,7-二氯喹啉，再将水相调至pH＝12，用二氯甲烷萃取、浓缩，得黄色油状物72.4g，为R-(-)-氯喹粗品(含量75％，HPLC)。
用200mL无水乙醇将上述R-(-)-氯喹粗品油状物溶解。加热至80℃，搅拌回流15分钟；滴加磷酸(0.34mol，17.7mL)，搅拌回流1h。有大量白色固体析出，停止加热，冷却至室温；过滤，用乙醇、丙酮各润洗三次；将所得R-磷酸氯喹用50mL水溶解，在蒸馏装置上加热至100℃，蒸出15mL水后，溶液变浑浊；滴加几滴水至澄清，滴加无水乙醇至恰好不浑浊，停止加热，冷却至室温，放入冰箱降温析晶。过滤，干燥，得R-(-)-磷酸氯喹62g，收率53.2％，纯度99.5％(HPLC)，R-(-)-磷酸氯喹比旋光度：[α]D 20＝-74.73°(c＝2.1,H2O)。
R-(-)-磷酸氯喹核磁共振数据表征：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.16(m,1H),8.11-7.99(m,1H),7.66(m,1H),7.55-7.39(m,1H),6.78-6.68(m,1H),4.02(d,J＝4.8Hz,1H),3.14-2.99(m,6H),1.71(s,4H),1.29(d,J＝6.4Hz,3H),1.13(t,J＝6.8Hz,6H).13C NMR(125MHz,D2O)δ154.98,142.04,138.98,137.70,127.01,123.82,118.64,114.76,98.50,51.08,49.43,47.13,31.79,20.18,18.65,8.05。
S-(+)-磷酸氯喹采用相同方法制备得到，收率54.6％，纯度99.6％(HPLC)，比旋光度：[α]D 20＝+74.78°(c＝2.1,H2O)。
S-(+)-磷酸氯喹核磁共振数据表征：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.25(m,1H),8.21-8.11(m,1H),7.85-7.70(m,1H),7.63-7.51(m,1H),6.81(m,1H),4.11(d,J＝4.8Hz,1H),3.22-3.07(m,6H),1.79(d,J＝3.6Hz,4H),1.38(d,J＝6.4Hz,3H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H).13C NMR(125MHz,D2O)δ154.90,142.06,138.92,137.66,126.96,123.79,118.61,114.70,98.50,51.07,49.42,47.17,31.78,20.18,18.64,8.09。
实施例4
通过手性高效液相色谱制备手性羟基氯喹
从市场购买的外消旋羟基氯喹硫酸盐3，在碱性条件下转化为游离态外消旋羟基氯喹4。
Figure BDA0002544461740000111
在0℃下，将10.9g的硫酸羟基氯喹溶于75mL水中，随后加入25mL12％的NaOH水溶液，搅拌半小时后，加入25mL乙酸乙酯，继续搅拌半小时。反应液自然升到室温，用100mL的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用150mL的饱和食盐水、水洗涤，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠。用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到形状为淡黄色粘稠状液体的游离的羟基氯喹7.7g，产率91％。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.49(d,J＝5.4Hz,1H),7.93(d,J＝2.2Hz,1H),7.75(d,J＝9.0Hz,1H),7.35–7.26(m,1H),6.39(d,J＝5.5Hz,1H),5.19(d,J＝7.7Hz,1H),3.70(hept,J＝6.1Hz,1H),3.57(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(s,1H),2.64–2.42(m,6H),1.81–1.48(m,4H),1.31(d,J＝6.3Hz,3H),1.01(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ151.80,149.15,148.99,134.66,128.48,124.94,121.17,117.16,99.00,58.36,54.70,52.88,48.20,47.34,34.16,23.91,20.21,11.60。
采用手性高效液相色谱法对游离态羟基氯进行手性色谱分离，可以得到光学纯的R和S游离态羟基氯喹。
将9.64g羟基氯喹溶于等容正己烷/异丙醇/二乙胺中，比例为85：15：0.1(v/v/v)。将所得溶液装入CHIRALPAKAY-H(AYH0CE-VC001)手性柱中，用相同的溶剂体系洗脱。制备条件为：流速为1.0mL/min，检测波长为UV 254nm，温度为35℃。第一个在10.17分钟的洗脱化合物是S-羟基氯喹，第二个在11.85分钟的洗脱化合物是R-羟基氯喹。收集各对映体的组分并进行组合。采用旋转蒸发器减压脱除溶剂，得到了纯光学异构体，S-羟基氯喹的质量为2.89g，ee>95％；R-羟基氯喹的质量为2.53g，ee>95％，结果如图2所示，剩余2.88g外消旋羟基氯喹。
实施例5
光学纯羟基氯喹硫酸盐的制备
R与S游离态羟基氯喹转化为光学纯羟基氯喹硫酸盐
Figure BDA0002544461740000121
将700mg的S-羟基氯喹溶于2mL乙醇，加热到60℃。向上述溶液中滴加188mg的80％的硫酸，在60℃下反应一小时。将反应液在零下20℃结晶，趁冷过滤，用1mL冰的乙醇洗涤三次滤饼，得到白色的S-硫酸羟基氯喹固体805mg，产率89％，[α]D 26.8＝95.6(c＝0.32,H2O)。
Figure BDA0002544461740000122
将700mg的R-羟基氯喹溶于2mL乙醇，加热到60℃。向上述溶液中滴加188mg的80％的硫酸，在60℃下反应一小时。将反应液在零下20℃结晶，趁冷过滤，用1mL冰的乙醇洗涤三次滤饼，得到白色的R-硫酸羟基氯喹固体745mg，产率82％，[α]D 26.1＝-107.75(c＝0.32,H2O)。
实施例6
通过手性合成方法制备手性磷酸羟基氯喹
称取(±)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇100g(0.574mol)加入250mL圆底烧瓶中，再加入100mL异丙醇，搅拌使其溶解；将D-(-)-扁桃酸(即R-(-)-扁桃酸)43.65g(0.287mol)加入反应瓶中，搅拌15分钟，有大量白色固体析出；搅拌3h使成盐完全，抽滤，用异丙醇洗涤固体三次，每次50mL；母液合并后浓缩至100mL，加入上步抽滤所得固体作为晶种，使未析出的固体结晶析出；再次抽滤，异丙醇洗涤三次，每次50mL；合并两次抽滤所得白色固体，置250mL烧瓶中，倒入50mL异丙醇重结晶，回流，搅拌；缓慢滴加异丙醇至完全澄清，停止加热，冷却析晶；抽滤，放入真空干燥箱。得白色固体84.0g，为(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇R-(-)-扁桃酸盐(即R-羟氯喹侧链)，收率95.0％。
采用L-(+)-扁桃酸(即S-(+)-扁桃酸)为拆分试剂，采取与上述相同的操作步骤，可得到(S)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇S-(+)-扁桃酸盐(即S-羟氯喹侧链)，收率95.4％。
测得比旋光度值如下，(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇R-(-)-扁桃酸盐：[α]D 20＝-50.4°(c＝1.0,H2O)；(S)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇S-(+)-扁桃酸盐：
Figure BDA0002544461740000131
(c＝1.0,H2O)。
Figure BDA0002544461740000132
将上一步骤拆分所得的(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇R-(-)-扁桃酸盐84.0克用200mL水溶解，加入1M的NaOH溶液，调节pH＝11～12，水相加入适量氯化钠，用二氯甲烷萃取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩，得44.8g(0.257mol)无色油状物，为游离碱形态的(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇(即R-羟氯喹侧链)。将其转移至三颈烧瓶中，称取4,7-二氯喹啉40.73g(0.206mol)、异丙醇8mL，加热至130℃，搅拌，反应23h，停止反应，自然冷却；加入2M的HCl溶液，调节pH＝2，用二氯甲烷洗去少量未反应的4,7-二氯喹啉；向上述水相加入1M NaOH溶液调pH>12，用二氯甲烷萃取，有机相用水萃洗直至水相pH＝7～8，以除去残余的手性侧链。有机相旋转蒸发至棕色浸膏状且质量不再变化，得到R-(-)-羟氯喹游离碱粗品，重81.14g。
将上述R-(-)-羟氯喹游离碱粗品加入95％乙醇325g(约合浸膏质量4倍)中，搅拌溶解；将20.83g浓硫酸缓慢加入81g(同浸膏质量)95％乙醇溶液中，配制形成稀释液，将其缓慢滴加至R-(-)-羟氯喹游离碱的乙醇溶液中，控制pH＝4～5，于65℃回流1小时；停止加热，降温，析晶，过滤，干燥，得白色固体61.14g，为R-(-)-硫酸羟氯喹，收率68.3％，纯度98.8％(HPLC)。R-(-)-硫酸羟氯喹比旋光度：[α]D 20＝-118.87°(c＝2.1,H2O)。
R-(-)-硫酸羟氯喹核磁共振数据表征：
1H NMR(500MHz,D2O)δ8.26(m,1H),8.21-8.09(m,1H),7.83-7.65(m,1H),7.60-7.47(m,1H),6.82(m,1H),4.16-4.07(m,1H),3.86(t,J＝5.5Hz,2H),3.32-3.18(m,6H),1.90-1.76(m,4H),1.40(d,J＝6.5Hz,3H),1.26(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(125MHz,D2O)δ154.92,142.09,138.89,137.62,126.96,123.91,118.61,114.71,98.56,55.28,53.67,52.02,49.49,48.20,31.78,20.00,18.67,7.83。
S-(+)-硫酸羟氯喹采用相同方法制备得到，收率73.0％，纯度98.5％(HPLC)，比旋光度：[α]D 20＝+116.98°(c＝2.1,H2O)。
S-(+)-硫酸羟氯喹核磁共振数据表征：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.32-8.18(m,1H),8.17-8.01(m,1H),7.68(m,1H),7.56-7.40(m,1H),6.88-6.74(m,1H),4.08(m,1H),3.86(t,J＝5.2Hz,2H),3.38-3.08(m,6H),1.95-1.70(m,4H),1.40(d,J＝6.4Hz,3H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,D2O)δ155.27,142.08,139.04,137.93,127.08,123.99,118.91,115.07,98.49,55.21,53.68,51.94,49.42,48.27,31.79,19.94,18.68,7.85。
实施例7
氯喹及羟氯喹手性侧链的外消旋化
氯喹手性侧链，化学名：(R)-或(S)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷；羟氯喹手性侧链，化学名：(R)-或(S)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇。实现氯喹及羟氯喹手性侧链(或富含某单一构型的手性侧链)的外消旋化，即由(R)-或(S)-氯喹侧链及(R)-或(S)-羟氯喹侧链经消旋化制备得到外消旋氯喹侧链及羟氯喹侧链)，对手性拆分后剩余的无效、废弃光学异构体的回收利用、降低成本、提高原子经济性等将产生积极效果。
(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷的外消旋化
称取R-羟氯喹侧链(化学名：(R)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷)36g(0.23mol)，将其溶于250mL甲苯中，加入1.8g雷氏镍，在常压及氢气氛围下，于70℃搅拌反应12小时，测得反应上清液旋光度为零或接近零时，冷却，静置，抽滤，滤液浓缩至干，得无色油状液体35.2克，为(±)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷，收率97.2％。
采用S-氯喹侧链(化学名：(S)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷)，采取与上述相同的操作步骤，可得到(±)-2-氨基-5-二乙氨基戊烷，收率98.2％。
(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇的外消旋化
称取R-羟氯喹侧链(化学名：(R)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇)50g(0.287mol)，将其溶于290mL甲苯中，加入2.5g雷氏镍，在常压及氢气氛围下，于70℃搅拌反应12小时，测得反应上清液旋光度为零或接近零时，冷却，静置，抽滤，滤液浓缩至干，得无色油状液体48.5克，为(±)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇，收率97％。
采用S-羟氯喹侧链(化学名：(S)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇)，采取与上述相同的操作步骤，可得到(±)-2-[(4-氨基戊基)乙胺基]乙醇，收率98.3％。
实施例8
外消旋氯喹磷酸盐、R和S光学纯氯喹磷酸盐的抗病毒活性评价
应用Vero E6细胞，药物预处理1h，弃药物；MOI＝0.05含药感染细胞1h，弃去药及2019-nCoV病毒液；加入不同浓度药物溶液。病毒感染1天后，固定进行荧光染色，应用Celigo仪器扫板，计算药物对病毒感染的抑制率，计算IC50。药物作用时间为全程给药(感染前、中、后)，以未经药物处理细胞的感染率为对照标准，经不同组药物处理后，检测药物对病毒感染的抑制率。
结果如图3所示，其中S-氯喹磷酸盐(S-CQ)的抑制浓度为1.761μM，其对映异构体R-氯喹磷酸盐(R-CQ)的抑制浓度为1.975μM，外消旋氯喹磷酸盐(Rac-CQ)的抑制浓度为1.801μM，因此S构型的氯喹磷酸盐的抗病毒活性优于R构型和外消旋混合物。
实施例9
外消旋羟基氯喹硫酸盐、R和S光学纯羟基氯喹硫酸盐的抗病毒活性评价
应用Vero E6细胞，药物预处理1h，弃药物；MOI＝0.05含药感染细胞1h，弃去药及2019-nCoV病毒液；加入不同浓度药物溶液。病毒感染1天后，固定进行荧光染色，应用Celigo仪器扫板，计算药物对病毒感染的抑制率，计算IC50。药物作用时间为全程给药(感染前、中、后)，以未经药物处理细胞的感染率为对照标准，经不同组药物处理后，检测药物对病毒感染的抑制率。
结果如图4所示，其中S-羟基氯喹硫酸盐(S-HCQ)的抑制浓度为1.444μM，而其对映异构体R-羟基氯喹硫酸盐(R-HCQ)的抑制浓度为2.445μM，外消旋羟基氯喹硫酸盐(Rac-HCQ)的抑制浓度为1.752μM，因此S构型的羟基氯喹硫酸盐的抗病毒活性优于R构型和其外消旋混合物。
实施例10
S-羟基氯喹对新型冠状病毒靶点3CL水解酶(Mpro)结合模式
本实施例依托天河二号和深圳超算等超级计算机及团队自主研发药物/靶标结合强度精准预测软件(GA-FEP)，采用分子对接、动力学模拟和绝对自由能微扰方法(具体方法参考J Med Chem，2019，62，2099-2111)预测氯喹与新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL水解酶(Mrpo高分辨晶体结构，PDB ID:6LU7)的结合强度。S-羟基氯喹、R-羟基氯喹、S-氯喹、R-氯喹与靶点Mpro的绝对结合自由能理论预测值ΔGbinding分别为-11.325、-9.782、-10.639和-9.972kcal/mol。其中S-羟基氯喹与Mpro的结合模式如图5所示，羟基氯喹的二乙氨基上的氮原子与Mpro的41号组氨酸形成氢键相互作用，其中一侧的乙基与44号半胱氨酸和42号缬氨酸形成疏水相互作用；甲基丁氨基的甲基伸进187号天冬氨酸和49号甲硫氨酸组成的口袋；氯喹啉环处在165号甲硫氨酸、190号苏氨酸和189号谷氨酰胺组成的口袋中。
上述结果表明手性的氯喹、羟基氯喹与新型冠状病毒靶点3CL水解酶具有较强的结合强度，通过抑制3CL水解酶活性，从而抑制病毒的转录和复制，手性的氯喹、羟基氯喹对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。
实施例11
氯喹、羟基氯喹及其对映异构体对新型冠状病毒关键药物靶点3CL水解酶(Mpro)的抑制作用
1、实验材料
含有3CL基因的重组质粒由武汉普健生物公司合成，GST Beads购自SmartLifescience公司，多功能酶标仪为美国Molecular Device公司的SpectraMax i3，96孔黑板购自美国corning,氯喹及其他常用试剂购自Sigma。
2、实验方法
a.重组3CL水解酶的表达与纯化
将包含SARS-CoV-2来源的3CL重组质粒(pGEX4T1)转化入大肠杆菌菌株BL21(codonplus)，再将菌株在LB或2x YT培养基中生长至OD600为0.6-0.8，然后加入0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在15℃继续生长24小时进行低温诱导表达，通常1L培养基可收获约8-15g湿菌。按1：5的比例加入裂解液将菌重悬，经超声、高压破碎等方式破碎菌体后，离心取上清经GST Beads按生产商的说明进行亲和层析纯化，通过牛α-凝血酶切除GST-Tag纯化标签后，用SDS-PAGE的方法对蛋白纯度进行验证。
b.氯喹、羟基氯喹的对映异构体3CL水解酶抑制活性测试
向含1mg底物的管内加入660μL DMSO使底物终浓度为1mM，室温避光震荡10分钟后，分装30μL/每管备用，剩余冻存于-20℃。取一管分装的30μL 1mM底物，加入1500μL缓冲液(50mM Tris,1mM EDTA,pH 7.3)稀释，并置于摇床上，室温避光震摇5分钟。从冰箱取出Mpro蛋白并置于室温解冻5分钟后，向含有缓冲液的96孔板中加入5μM Mpro以及1μL稀释好不同浓度的化合物，使得终体积为50μL。使用多孔道移液器吸取50μL稀释好的底物，快速加入96孔板中反应。并立即使用多功能酶标仪测量，激发波长320nm，发射波长405nm,每分钟读数1次，连续记录10分钟，并计算抑制活性IC50。
3、实验结果
a.高纯度3CL水解酶的表达纯化
经GST Beads亲和层析获得了大量的3CL水解酶，经SDS-PAGE鉴定其纯度达95％以上，用于后续的抑制活性测试实验。
b.氯喹及氯喹/羟基氯喹及其对映异构体对3CL水解酶(Mpro)抑制活性测试
试验结果如下表所示，氯喹对3CL水解酶(Mpro)的抑制活性IC50为7.54μM，S-和R-氯喹对3CL水解酶Mpro的IC50为5.27和8.36μM；同时羟基氯喹、S-羟基氯喹、R-羟基氯喹同样对3CL水解酶Mpro有抑制作用，其IC50值为2.77，2.47，3.26μM。
Figure BDA0002544461740000161
Figure BDA0002544461740000171
Ki＝IC50/(1+[S]/Km),[S]＝10μM，Km＝1.4μM
由上述实验结果得到的结论为：首先，氯喹及羟基氯喹及其对映异构体均可抑制新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL水解酶活性，表明氯喹及羟基氯喹及其对映异构体均具有防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备为抗肺炎药物进行应用；其次，S型氯喹和S型羟基氯喹对冠状病毒3CL水解酶活性的抑制作用优于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体，这与实施例8、9的结果互相印证，说明S型氯喹和S型羟基氯喹对氯喹、羟基氯喹抗冠状活性的贡献更大，可以单独给药，从而提升药物的疗效。
实施例12
氯喹、羟基氯喹及其对映异构体对hERG的抑制作用
1、实验方法
细胞外液的配置：将10mM HEPES、145mM NaCl、4.0mM KCl、2.0mM CaCl、1.0mMMgCl2及10mM Glucose用氢氧化钠调节pH至7.3～7.4，渗透压调至290-310mOsm，过滤后4℃保存。电极内液的配置：将120mM KCl、31.25mM KOH、5.374mM CaCl2、1.75mM MgCl2、10mMEGTA、10mM HEPES及4.0mM Na2-ATP用氢氧化钾调节pH至7.2-7.3，渗透压调至290-310mOsm，过滤后-20℃分装保存。
供试品配制：分别称取化合物或阳性对照品(阿米替林)溶于DMSO中，根据其溶解性配制成10或30mM的储备溶液。实验前用DMSO将上述储备溶液按照10倍及3倍逐级稀释，然后进一步用细胞外液稀释到所需浓度。实验中采用从低浓度到高浓度连续灌流方式。
细胞准备：将细胞用PBS进行冲洗、用Trypsin溶液进行消化分离、用培养基使细胞再次悬浮后存于离心管中备用。膜片钳开始记录之前，将细胞滴加至35mm培养皿中，确保细胞具有一定密度、呈单个分离状态。
电生理试验：采用全细胞膜片钳技术记录hERG电流，35mm培养皿中加入细胞悬液，并置于倒置显微镜载物台上，待细胞贴壁后用细胞外液灌流(流速为1.0-2.0mL/min)。玻璃微电极由微电极拉制仪两步拉制，充灌电极内液后其入水电阻值为2-5MΩ。建立全细胞记录模式后，保持钳制电位为-80mV，给予去极化电压至+60mV持续850ms，然后复极化至-50mV维持1275ms引出hERG尾电流，脉冲程序每15秒钟重复一次，贯穿整个实验。电流稳定后采用从低浓度到高浓度、胞外连续灌流的给药方式并从低浓度开始，持续灌流至药效稳定，然后进行下一浓度的灌流。
2、氯喹、羟基氯喹及其对映异构体对hERG的抑制活性测试
实验中将分别测试待测化合物和阳性对照的5个不同浓度(0.3,1.0,3.0,10.0、20.0和40μM)对hERG尾电流的阻断效应。实验结束后，通过PatchMaster软件进行刺激发放及信号采。使用FitMaster和SPSS 21.0等进行进一步数据分析和曲线拟合。用尾流的抑制率表示不同浓度下各化合物的作用，抑制率＝(给药前尾电流峰值-给药后尾电流峰值)/给药前尾电流峰值×100％。测试样品的最大半数抑制浓度IC50值由Hill方程拟合分析所得。
3、实验结果
hERG离子通道抑制试验结果如下表所示，氯喹、羟基氯喹对hERG的IC50值分别为4.56和12.8μM。手性拆分后R-和S-氯喹对hERG的IC50值为4.83和12.8μM，说明手性拆分后S-氯喹的心脏毒性比氯喹有所降低；同样，手性拆分后R-和S-羟基氯喹对hERG的IC50值为15.0和>20μM，说明手性拆分后S-羟基氯喹的心脏毒性比羟基氯喹进一步降低。因此，S型氯喹和S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐对心肌细胞中的hERG抑制率要小于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体体，并且其抑制浓度高于R型氯喹和R型羟基氯喹及其外消旋体，相对于氯喹、羟基氯喹，化合物S-羟基氯喹具有最低的hERG心脏毒性。S型氯喹和S型羟基氯喹单独给药，由于毒性小，可以提升给药剂量。
化合物 最大浓度抑制率 最大测试浓度 IC<sub>50</sub>(μM)
Cisapride(西沙必利) 99.5 3 0.041
R-CQ(R-氯喹) 86.1 40 4.56
S-CQ(S-氯喹) 89.8 40 4.83
外消旋氯喹 72.3 40 12.8
R-HCQ(R-羟基氯喹) 72.0 40 12.8
S-HCQ(S-羟基氯喹) 70.9 40 15.7
外消旋羟基氯喹 32.8 20 ＞20
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (28)

1.手性的氯喹、羟基氯喹或其盐作为降低心脏毒性的抗冠状病毒药物靶点3CL水解酶抑制剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹选自以下化合物：
Figure FDA0002544461730000011
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹的盐选自以下化合物：
Figure FDA0002544461730000012
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐选自以下化合物：
Figure FDA0002544461730000013
5.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐为药学上可接受的盐或酯、互变异构体、多晶型物、假多晶型物、无定形形式、水合物或溶剂化物。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒包括：SARS、MERS、新型冠状病毒SARS-CoV-2。
7.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐适用于人或动物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述动物为猫、狗、鹦鹉、鱼或八哥。
9.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐中，S型氯喹及其药学上可接受的盐的抗冠状病毒活性优于R型氯喹及其外消旋体；S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐的抗冠状病毒活性优于R型羟基氯喹及其外消旋体。
10.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐中，S型氯喹及其药学上可接受的盐对心肌细胞中的hERG抑制率小于R型氯喹及其外消旋体，其抑制浓度高于R型氯喹及其外消旋体；S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐对心肌细胞中的hERG抑制率小于R型羟基氯喹及其外消旋体，其抑制浓度高于R型羟基氯喹及其外消旋体。
11.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐中，S型氯喹及其药学上可接受的盐对冠状病毒3CL水解酶活性的抑制作用优于R型氯喹及其外消旋体；S型羟基氯喹及其药学上可接受的盐对冠状病毒3CL水解酶活性的抑制作用优于R型羟基氯喹及其外消旋体。
12.一种预防和/或治疗冠状病毒引发的疾病的药物组合物，其包含手性的氯喹、羟基氯喹或其盐。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述手性的氯喹、羟基氯喹或其盐选择以下化合物中的至少一种：
Figure FDA0002544461730000021
Figure FDA0002544461730000031
14.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为S-氯喹、S-羟基氯喹或其药学上可接受的盐与阿奇霉素的组合。
15.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为S-氯喹、S-羟基氯喹或其药学上可接受的盐与阿奇霉素和锌的组合。
16.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为胶囊、片剂、丸剂、霜剂、乳剂、软膏剂、混悬剂、冻干剂、胶囊、缓释剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。
17.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述冠状病毒包括：SARS、MERS、新型冠状病毒SARS-CoV-2。
18.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物适用于人或动物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述动物为猫、狗、鹦鹉、鱼或八哥。
20.一种合成手性的氯喹、羟基氯喹的盐的方法，其特征在于，包括以下步骤
以手性扁桃酸为拆分试剂，对化合物A手性拆分得到化合物B，
化合物B与4,7-二氯喹啉反应得到化合物C，
化合物C与硫酸或磷酸反应得到产物，
其中，R为氢或羟基，X为硫酸或磷酸，
Figure FDA0002544461730000032
21.一种通过手性高效液相色谱制备手性的氯喹、羟基氯喹的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过手性高效液相色谱柱将外消旋原料分离得到手性产物，其中，固定相为多糖类键合硅胶；流动相为水溶性有机溶剂与非水溶性有机溶剂组成的混合溶液体系：检测波长为220～300nm。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述手性高效液相色谱柱为正向柱。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述所述多糖类键合硅胶为直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或异丙醇，所述非水溶性有机溶剂为正己烷、环己烷、异己烷或正庚烷。
25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述流动相为体积比是85：15的正己烷和异丙醇。
26.根据权利要求21～25任意一项所述的方法，其特征在于，所述溶剂体系中加入体积为溶液总体积0.1％的有机碱。
27.根据权利要求26任意一项所述的方法，其特征在于，所述有机碱为二乙胺。
28.根据权利要求21～25任意一项所述的方法，其特征在于，所述流动相为等度或梯度洗脱。
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