CN113116819A - 一种载siRNA纳米脂质杂化胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，其中包含siRNA、由内向外包覆siRNA的阳离子脂质和脂质外层。本发明提供的siRNA可以选择性沉默三个主要导致胎盘过度表达的sFLT1的sFLT1 mRNA亚型，而不会降低全长FLT1的mRNA。带正电的阳离子脂质与带负电的siRNA结合形成复合物，提高了siRNA的稳定性。脂质外层包裹复合物后可以靶向胎盘，使siRNA在胎盘处积累，提高细胞对递送系统的摄取和促进内涵体的逃离。本发明还公开了所述胶束的制备方法和所述胶束在制备治疗子痫前期药物中的应用，为子痫前期的基因治疗提供了新思路。

Description

一种载siRNA纳米脂质杂化胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，涉及一种载siRNA杂化胶束及其制备方法和应用。
背景技术
子痫前期是胎盘诱发的妊娠高血压疾病。全球每年因子痫前期造成近76000名孕产妇和500000婴儿死亡。子痫前期的妇女通常在妊娠20周后迅速发展为高血压，经常伴有蛋白尿、肾损伤、HELLP(溶血、肝酶升高和低血小板)综合征、癫痫发作、中风等症状，严重的会危及生命导致死亡。对胎儿的发育影响为子宫内生长受限、缺氧引起的神经系统损伤(例如脑瘫)，严重的导致死亡。目前对患有子痫前期的妊娠期妇女而言，除了终止妊娠外，并无有效的治疗方法。
子痫前期的母体症状是由抗血管生成蛋白的血清水平明显升高异常引起的，抗血管生成蛋白由细胞外血管内皮生长因子受体1(VEGFR1，也称为全长FLT1)对应的sFLT1蛋白分泌得到。sFLT1蛋白通过膜结合的VEGF受体FLT1清除循环中的VEGF和胎盘因子，并减弱血管内皮生长因子VEGF信号传导。血清sFLT1水平被认为是子痫前期的诊断和预后指标。
siRNA诱发的基因沉默相比于基因敲除或crisper基因编辑技术更加简单有效，已被广泛应用于疾病治疗。构建能够满足治疗需求的siRNA递送系统靶向胎盘治疗成为了研究热点。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，具有载药量和包封率高、安全性好、体内稳定性好、且可靶向胎盘等优点。
本发明的目的之二在于提供一种载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法。
本发明的目的之三在于提供载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期药物中的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，所述纳米脂质杂化胶束siRNA、由内向外包覆siRNA的阳离子脂质体、脂质外层；
所述脂质外层由DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇组成。
进一步地，所述siRNA的sense和antisense的核苷酸序列为分别为：5’-CAUCAUAGCUACCAUUUAUU-3’，5’-AAUAAAUGGUAGCUAUGAUG-3’。
进一步地，所述阳离子脂质为DLin-MC3-DMA。
进一步地，所述脂质体外层中DSPE-PEG2000-FA与磷脂的质量比为1～5-10，胆固醇与磷脂的质量比为1:4～6。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
所述载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法，包括以下步骤：
1)将DLin-MC3-DMA溶液滴加至siRNA溶液中反应得到siRNA@DLin-MC3-DMA复合物；
2)将步骤1)得到的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物与DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇溶解于氯仿中，旋干溶剂，形成薄膜；再将薄膜重新分散到PBS溶液中，超声后进行高压均质循环，分离纯化得到载siRNA纳米脂质杂化胶束，记为FA-Lip-siRNA@DMD。
进一步地，所述步骤1)中DLin-MC3-DMA胶束溶液浓度为0.1mg/mL，siRNA溶液浓度为20μM，DLin-MC3-DMA胶束溶液与siRNA溶液的体积比为20～30:1。
进一步地，所述步骤2)中siRNA@DLin-MC3-DMA复合物中DLin-MC3-DMA与DSPE-PEG2000-FA的质量比为0.08～0.33:1。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期药物中的应用。
进一步地，所述载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期的可靶向胎盘的药物中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，其中包含siRNA、由内向外包覆siRNA的阳离子脂质体和由DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇组成的脂质外层。本发明提供的siRNA可以选择性沉默三个主要导致胎盘过度表达的sFLT1的sFLT1 mRNA亚型，而不会降低全长FLT1的mRNA，可有效降低子痫前期孕鼠血浆内sFLT1的浓度。
带正电荷的阳离子脂质可以与带负电荷的siRNA结合形成复合物并对其进行压缩。阳离子脂质与带负电荷的细胞膜接触，提高细胞对递送系统的摄取和促进内涵体的逃离。具有无毒、无免疫原性、可自然降解、良好的生物相容性等优点。
脂质体外层包裹在阳离子脂质和siRNA形成的复合物外部，采用叶酸键接在DSPE的亲水外层，作为靶头靶向胎盘，PEG2000修饰后增加了脂质体的亲水性。脂质外层中的叶酸与胎盘中高表达的叶酸受体结合，可触发叶酸介导的胞吞作用，提高细胞对药物的摄取率，从而更好的完成siRNA的递送。载siRNA纳米脂质杂化胶束具有高包封率、安全性好、体内稳定和可靶向胎盘等优点。
2.本发明还提供了载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法，具有步骤简单的特点。
3.本发明还提供了载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期药物中的应用，在杂化胶束的包裹下，药物可靶向胎盘，使siRNA在胎盘处积累，并减少妊娠期母体内循环sFLT1、尿蛋白的量。载siRNA纳米脂质杂化胶束可靶向胎盘但不到达胎儿，对胎儿发育无不良影响。
附图说明
图1为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束合成过程路线图；
图2为本发明siRNAs@DLin-MC3-DMA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞图；
图3为本发明DLin-MC3-DMA胶束的临界胶束浓度测定；
图4为本发明DLin-MC3-DMA胶束TEM图；
图5为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的琼脂糖凝胶电泳图，其中A组为添加800μL的siRNA，B组至F组添加siRNA@DLIN-MC3-DMA复合物的体积分别为1000μL、900μL、800μL、700μL、600μL；
图6为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束粒径、zeta电位的测定，其中图6A为载siRNA纳米脂质杂化胶束粒径分布图，图6B为载siRNA纳米脂质杂化胶束zeta电位分布图；
图7为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的TEM图；
图8为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的粒径、电位稳定性图；
图9为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束在RNase A中的稳定性测试图；
图10为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束作用后HTR-8/SVneo细胞迁移能力图，其中图10A为HTR-8/SVneo细胞迁移图，图10B为HTR-8/SVneo细胞迁移率(****表示P＜0.0001，**表示P＜0.01，n＝3)；
图11为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束作用后HTR-8/SVneo细胞侵袭能力图；
图12为本发明ELISA法测定细胞上清sFLT1含量图，其中图12A为sFLT1标准曲线，图12B为HTR-8/SVneo细胞上清中sFLT1含量(****表示P＜0.0001，**表示P＜0.01，n＝3)；
图13为本发明HTR-8/SVneo细胞定性摄取研究，其中13A为不同时间HTR-8/SVneo细胞对脂质体的摄取，图13B为4h时HTR-8/SVneo细胞对脂质体的摄取；
图14为本发明流式细胞仪定量检测HTR-8/SVneo细胞对脂质体的摄取；
图15为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效学研究：各组妊娠期小鼠体重变化，其中a组为Control组，b组为L-NAME组，c组为裸siRNA组，d组为非靶向脂质体Lip-siRNA@DMD组，e组为靶向脂质体FA-Lip-siRNA@DMD组；
图16为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效学研究：各组胎鼠体重和顶臀长对比，其中a组为Control组，b组为L-NAME组，c组为裸siRNA组，d组为非靶向脂质体Lip-siRNA@DMD组，e组为靶向脂质体FA-Lip-siRNA@DMD组；
图17为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效学研究：图17A为尿蛋白标准曲线，图17B为妊娠期见各组孕鼠24h尿蛋白含量检测，其中a组为Control组，b组为L-NAME组，c组为裸siRNA组，d组为非靶向脂质体Lip-siRNA@DMD组，e组为靶向脂质体FA-Lip-siRNA@DMD组；
图18为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效学研究：图18A为sFlt标准曲线，图18B为妊娠期见各组孕鼠血浆中sFlt含量检测，其中a组为Control组，b组为L-NAME组，c组为裸siRNA组，d组为非靶向脂质体Lip-siRNA@DMD组，e组为靶向脂质体FA-Lip-siRNA@DMD组；
图19为本发明靶向脂质载体注射后不同时间段在PE小鼠体内的分布情况；
图20为本发明FA-Lip-IR780在PE小鼠体内24h活体成像结果，其中a、肝，b、肺，c、心，d、肾，e、脾，f、胎盘，g、胎儿。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
图1为本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的合成路线图。
实施例1
载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备
1)siRNA@DLin-MC3-DMA复合物的制备：
1.1)DLin-MC3-DMA溶液的配制：称取0.5mg DLin-MC3-DMA，向其中加入500μL无水乙醇，充分溶解即得1mg/mL的DLin-MC3-DMA溶液，置于-20℃保存，备用；取200μLDLin-MC3-DMA溶液加无水乙醇定容至2mL，超声充分混匀，置于圆底烧瓶中，37℃恒温水浴下，旋转蒸发15mi除去溶剂，加入磷酸盐缓冲液4mL，37℃水化20min，超声5min，即得0.1mg/mL的DLin-MC3-DMA胶束溶液，置于4℃保存，备用。
1.2)siRNA溶液的配制：取1OD siRNA在4000rpm/min下离心3min，然后慢慢打开管盖，加入125μL的DEPC水，震荡溶解即得20μM的siRNA溶液，然后在无菌操作台中将siRNA溶液分装于200μL的无酶PCR管内，置于-20℃下保存，备用；
1.3)将步骤1.1)得到的稀释的DLin-MC3-DMA胶束溶液与步骤1.2)得到的稀释的siRNA溶液按体积比25:1轻轻混合得到混合物。将混合物适当涡旋，室温下孵育20min待出现白色浑浊后，离心干燥得siRNA@DLin-MC3-DMA复合物，然后保存在4℃下备用。
2)载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备：
2.1)DSPE-PEG2000-FA的制备：
Figure BDA0003036526060000051
2.1.1)室温下，将叶酸(化合物1)溶于无水甲醇中，向其中加入1.5摩尔当量催化剂1-乙基-3-(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)、2摩尔当量N羟基丁二酰亚胺，室温搅拌反应24h。旋干溶剂后，用甲醇洗涤沉淀，硅胶柱纯化得到化合物2；
2.1.2)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)溶解于无水氯仿中，加入1摩尔当量的COOH-PEG2000-NHBOC和1摩尔当量的EDCI催化剂，室温反应24小时。旋干溶剂、洗涤、过硅胶柱纯化产物，得DSPE-PEG2000-HNBOC(化合物3)，将化合物3在三氟乙酸中回流得到化合物4；
2.1.3)将步骤2.1.1)得到的化合物2和步骤2.1.2)得到的化合物4溶解于无水氯仿中，加入摩尔当量1:1的N-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS/EDC)，室温下搅拌反应48h，旋干溶剂、洗涤，Sephade LH20柱纯化得到DSPE-PEG2000-FA(化合物5)；
2.2)按照胆固醇与磷脂的添加质量比为1:5、DSPE-PEG2000-FA与磷脂的添加质量比为1:7.5、DSPE-PEG2000-FA质量0.6mg，溶于乙醇中超声混合均匀，于40℃下旋蒸除去溶剂，然后加入800μL的步骤1.3)得到的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物，适当涡旋，加PBS水化30min，探头超声功率200W，时间5min，超声模式为每超声3s间隔5s，即得靶向脂质体--载siRNA纳米脂质杂化胶束(记为FA-Lip-siRNA@DMD)。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：对比例1的产物成分中只包含裸siRNA，其余与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于：对比例2中省去DSPE-PEG2000-FA，得到非靶向脂质体治疗药物，记为Lip-siRNA@DMD。其余与实施例1相同。
实验例1
载siRNA纳米脂质杂化胶束的物理化学性质表征
1.1siRNAs@DLin-MC3-DMA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞
琼脂糖凝胶的制备过程为：精密称取1.2g琼脂糖于锥形瓶内，加入40mL电泳缓冲液(1×TBE)，在微波炉中煮沸溶解，观察无不溶物，稍冷后倒入凝胶板中，插上梳子，室温下静置30min，待凝胶凝固后进行实验。在干净的封口膜上将上样缓冲液(5×RNA LoadingBuffer)和样品以1:5的比例混匀，样品为制得的DLin-MC3-DMA胶束与siRNA的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物和游离siRNA溶液的待测液。
结果如图2所示当DLin-MC3-DMA与siRNA的体积比为25:1时，凝胶电泳实验结果与电位测试结果一致。
1.2siRNA@DLin-MC3-DMA结合率的测定
为评价siRNA@DLin-MC3-DMA的结合率，将不同添加比例的siRNA@DLin-MC3-DMA胶束溶液分别于4℃下12000rpm离心30min，用核酸测定仪测定上清液中siRNA的含量，siRNA与DLin-MC3-DMA的结合率计算公式如下所示，测试结果如表1所示。
Figure BDA0003036526060000061
表1
Figure BDA0003036526060000062
Figure BDA0003036526060000071
结果如表1所示，当DLin-MC3-DMA胶束溶液与siRNA的体积比为25:1时，二者的结合率最佳，既可以保证siRNA与阳离子脂质完全结合，保证了后期体内细胞对siRNA的摄取，也避免了DLin-MC3-DMA添加量过多产生副作用。
1.3临界胶束浓度(CMC)的测定
本发明采用芘荧光探针法测定DLin-MC3-DMA的CMC，如图3所示，以DLin-MC3-DMA浓度的对数为横坐标，I339/I334值为纵坐标作图，拐点处即为胶束开始形成的浓度，即CMC值。当DLin-MC3-DMA浓度达到某一值时，I339/I334值明显开始增大，表明芘所处的微环境开始变化，开始从极性的水溶液中转移至胶束的疏水内核。通过对散点进行直线拟合，得到两条直线方程分别为y＝0.0686x+0.4967和y＝0.342x+0.3807，这两条直线方程交点的横坐标LogC＝0.424，从而计算出DLin-MC3-DMA的CMC值为2.66μg/mL。
1.4透射电镜TEM观察载DLin-MC3-DMA胶束的形态
胶束的形态是影响细胞摄取的主要因素之一。研究表明，圆形粒子较其他形状的粒子具有更好的细胞摄取率。按照实施例1的方法制备DLin-MC3-DMA胶束溶液表征其TEM。
结果如图4所示，DLin-MC3-DMA胶束呈球形，大小均一，具有明显的核壳结构。
实验例2
2.1载siRNA纳米脂质杂化胶束粒径和zeta电位的测定
2.1.1磷脂与胆固醇的添加比例的影响
分别称取质量比为1:4、1:5、1:6的胆固醇与磷脂，后续相关步骤同实施例1，超声完成后即得空白脂质体(liposome)，取1mL检测粒径与电位，结果如表2所示。
表2
NO. 胆固醇：磷脂 粒径/nm PDI 电位/mV
1 1:4 155.2±4.90 0.290±0.026 -4.03±1.701
2 1:5 137.1±5.90 0.259±0.034 -7.33±2.921
3 1:6 150.0±1.73 0.303±0.023 -3.19±0.587
由表2可知，马尔文粒径仪通过动态光散射测得胆固醇和磷脂的质量比为1:5时，平均粒径为137.1±5.90nm，PDI为0.259，表明在此添加比例下的脂质体粒径较为均一。
2.1.2DSPE-PEG2000-FA的用量的影响
在实验例2.1.1的基础上，固定胆固醇与磷脂的质量比为1:5，分别向其中添加不同量的DSPE-PEG2000-FA，后续相关步骤同实施例1，超声完成后即得DSPE-PEG2000-FA修饰的靶向脂质体(记为FA-Lip)，取1mL检测粒径与电位，结果如表3所示。
表3
DSPE-PEG2000-FA/mg 粒径/mm PDI 电位/mV
2.5 150.80±23.42 0.490±0.012 -0.67±1.387
1.0 114.90±15.57 0.416±0.073 -19.87±1.893
0.6 92.87±8.76 0.294±0.054 -25.03±0.551
0.5 104.00±3.46 0.522±0.071 -28.93±2.401
0.4 110.10±16.75 0.351±0.025 -22.60±0.346
0.3 119.70±14.67 0.394±0.022 32.20±1.744
结果如表3所示，表明加入适量的DSPE-PEG2000-FA后，磷脂分子之间结合更加紧密，稳定性也有一定程度的提高。
2.1.3siRNA@DLin-MC3-DMA复合物用量的影响
根据上述实验例，确定胆固醇与磷脂的添加质量比为1:5，DSPE-PEG2000-FA的添加量为0.6mg，将上述三种物质溶解于无水乙醇中，于40℃旋蒸除去溶剂。然后分别向其中加入不同量的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物(其中siRNA与DLin-MC3-DMA的添加比例同实施例1)，后续相关步骤同实施例1。即得载siRNA纳米脂质杂化胶束，取出1mL用于测试粒径和zeta电位，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003036526060000081
由表4可知，当加入复合物的体积为800μL时，平均粒径增加至122.7±14.41nm；结果表明，少量复合物的载体使脂质体的粒径小幅增加，而随着游离复合物增加，平均粒径反而会变小。
2.2载siRNA纳米脂质杂化胶束包封率的测定
根据实验例2.1.3制备载siRNA纳米脂质杂化胶束，取制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束30μL，向其中加入5μL肝素(1％)，静置15min，置换出游离siRNA@DLin-MC3-DMA复合物中的siRNA，于12000rpm离心10min，取上清1.5μL用核酸定量仪检测siRNA的浓度，每组测3个样品。载siRNA纳米脂质杂化胶束按照如下计算公式计算包封率，结果如表5所示：
Figure BDA0003036526060000082
表5
复合物体积/μL 600 700 800 900 1000
包封率/％ -- -- 92.7 72.6 53.5
结果如表5所示，本发明制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束具有较高的包封率，当siRNA@DLin-MC3-DMA复合物添加量为600μL、700μL时，复合物全部载入脂质体；当复合物添加量为800-1000μL时，包封率53.5％-92.7％，脂质杂化胶束中的siRNA的量处于较高水平，有助于药效的发挥。
2.3载siRNA纳米脂质杂化胶束的琼脂糖凝胶电泳测定
按照实验例2.13制备载siRNA纳米脂质杂化胶束，取制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束30μL，向其中加入5μL肝素(1％)孵育20min，琼脂糖凝胶电泳法考察不同添加体积siRNA@DLin-MC3-DMA复合物的脂质体中，游离siRNA@DLin-MC3-DMA复合物中siRNA的含量，并使用Image J软件分析条带亮度。结果如表6、图5所示：
表6
组别 A B C D E F
包封率/％ -- 60.70 84.95 97.20 97.17 97.21
图5所示为添加不同体积siRNA@DLin-MC3-DMA复合物得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束的凝胶电泳图，图中显示当siRNA@DLin-MC3-DMA复合物的添加量为600-800μL时，没有明显可见的条带，表明此添加量的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物已全部载入脂质体中。表6的结果显示利用琼脂糖凝胶检测的包封率与核酸定量检测结果一致。
综上，本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束的最优配方为：DLin-MC3-DMA胶束(DLin-MC3-DMA胶束溶液浓度0.1mg/mL)与siRNA溶液(20μM)的体积比为25:1、胆固醇与磷脂的质量比为1:5、DSPE-PEG2000-FA与磷脂的质量比为1:7.5，DSPE-PEG2000-FA的添加量0.6mg。
实验例3
3.1载siRNA纳米脂质杂化胶束粒径、电位的测定
取实施例1制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束样品，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪利用动态光散射测定胶束在温度25℃散射角173℃下的粒径及zeta电位，记录粒径数量分布及正负标准偏差和多分散性指数PDI，评价其物理稳定性。
结果如图6所示，载siRNA纳米脂质杂化胶束的平均粒径为122.70nm，表明形成的杂化胶束分散比较均匀；Zeta电位的测量值为-26.63mV，高的负电位值反映出纳米粒子之间具有一定的排斥作用，从而确保了杂化胶束在水中的稳定性。
3.2载siRNA纳米脂质杂化胶束的透射电镜表征
除了粒径和zeta电位外，脂质杂化胶束的形态也是影响细胞摄取的重要因素。研究表明，圆形粒子较其他形貌的粒子具有更好的细胞摄取率。取实施例1制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束样品配制成溶液，取20μL溶液滴到铜网上，晾干后进行透射电子显微镜表征，观察并拍照。
结果如图7所示，本发明制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束均为圆形粒子，且颗粒大小分布均匀，有助于载siRNA纳米脂质杂化胶束被细胞摄取和药效的发挥。
实验例4
4.1载siRNA纳米脂质杂化胶束的粒径、电位稳定性
为了考察本发明得到的药物的稳定性，将实施例1制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束放置于4℃的环境中7天以鉴定稳定性。结果如图8所示，将载siRNA纳米脂质杂化胶束放置于4℃环境中，7天内杂化胶束的粒径和电位几乎没有变化，表明本发明得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束稳定性良好。
4.2载siRNA纳米脂质杂化胶束的RNase A稳定性
核糖核酸酶(Ribonuclease A，RNase A)对RNA有水解作用，siRNA在RNase A存在的环境下极其不稳定。取本发明实施例1得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束和与实施例1负载量siRNA量相同的裸siRNA，分别与等体积的RNase A溶液(0.1mg/mL)在37℃下共孵育1h、2h、4h、6h，孵育完成后加入EDTA溶液(5mM)终止降解。接着向其中加入0.1mol/L Triton X-100，0.1％肝素各4μL，室温孵育30min以获得纳米脂质杂化胶束中的siRNA。取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳测试。
结果如图9所示，本发明的载siRNA纳米脂质杂化胶束与RNase A共孵育6h，在各个时间点凝胶板上仍然有清晰可见的条带，表明本发明的纳米脂质杂化胶束对siRNA具有良好的保护作用，能够降低RNase A对siRNA的降解作用，增加siRNA对核糖核酸酶的稳定性。
实验例5
载siRNA纳米脂质杂化胶束对细胞的毒性研究
5.1载siRNA纳米脂质杂化胶束对细胞增殖能力的影响
本发明采用MTT法测定脂质体DLin-MC3-DMA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性。将处于对数生长期且生长状态良好的细胞制成单细胞悬液，计数后以每孔1.5×104个接种于96孔板内培养，并配制10％血清的1640培养液。MTT溶液浓度为5mg/mL。
向上述96孔板内加入按实施例方法得到的含有浓度的范围为3.1μg/mL～500μg/mL脂质体(FA-Lip)或载体DLin-MC3-DMA胶束的培养液，细胞板周围用PBS封板，然后继续在37℃、5％CO2中培养。培养24h后弃去培养液，避光条件下，每孔加入含20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱中避光培养4h。弃上清，每孔加入100μL DMSO孵育10min，然后30min内用酶标仪(Thermo,USA)测定490nm波长下的吸光度OD值。
为考察本发明实施例1得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束对HUVEC细胞的毒性，同样地，向接种细胞的96孔板内加入含有浓度的范围为20nM～120nM载siRNA纳米脂质杂化胶束的培养液，培养24h后弃去培养液，避光条件下每孔加入含20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱中避光培养4h。弃上清，每孔加入100μL DMSO，孵育10min，然后30min内用酶标仪(Thermo,USA)测定490nm波长下的吸光度OD值。脂质体FA-Lip、载体DLin-MC3-DMA胶束和载siRNA纳米脂质杂化胶束对细胞增殖的抑制率均按照如下公式计算：
Figure BDA0003036526060000111
表7
Figure BDA0003036526060000112
结果如表7所示，当DLin-MC3-DMA胶束浓度低于50μg/mL时，细胞活性可达80％以上；当DLin-MC3-DMA胶束浓度大于50μg/mL时，随着浓度增加，细胞活性降低，毒性所增加。脂质体FA-Lip在500μg/mL浓度范围内的细胞活性可达到90％以上，没有明显的细胞毒性，表明脂质体具有良好的生物相容性。
表8
Figure BDA0003036526060000113
由表8可知，当载siRNA纳米脂质杂化胶束浓度大于20nM时，与载siRNA纳米脂质杂化胶束共孵育的细胞活力均小于85％，因此在载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效研究中，使用的浓度需小于或等于20nM。随着浓度升高，载siRNA纳米脂质杂化胶束在40nM～120nM的浓度时具有较显著的细胞抑制作用。
5.2载siRNA纳米脂质杂化胶束对细胞迁移能力的影响
将处于对数期且生长状态良好的HTR-8/SVneo细胞制成单细胞悬液，计数后以每孔30×104个接种于6孔板内进行培养。于37℃、5％CO2中培养，待细胞生长至80％后弃旧培养液，用200μL枪头于板底行“1”字划痕，并用PBS缓冲液小心冲洗后，加入新培养基，随机选取3个视野并拍照并记录位置，加入含有CoCl2(终浓度300μmol/L，用来模拟缺氧环境)的培养液，同时分别加入不同浓度载siRNA纳米脂质杂化胶束药物(5nM、10nM、15nM、20nM)处理，继续培养48h后观察划痕修复的情况，评价细胞迁移行为。通过Image J软件对划痕面积进行计算，统计面积缩小的范围。
结果如图10所示，载siRNA纳米脂质杂化胶束治疗组在一定程度上促进了细胞迁移，但与对照组迁移面积相比，20nM载siRNA纳米脂质杂化胶束制剂和CoCl2组的迁移率分别减少了18.09％和48.57％；与CoCl2组相比20nM制剂的细胞迁移率增加了34.49％。由结果推测，载siRNA纳米脂质杂化胶束可通过识别sFLT1 mRNA抑制其表达能力，表明本发明的载siRNA纳米脂质杂化胶束可有效发挥其作用。
5.3载siRNA纳米脂质杂化胶束对细胞侵袭能力的影响
用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，计数后以每孔5×104个接种于覆盖有1:8稀释的基质胶的小室(8μm)内，加入含有CoCl2(终浓度300μmol/L)的培养液，同时加入不同浓度的根据实施例1制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束药物(5nM、10nM、15nM、20nM)处理。下室内加入含有10％胎牛血清的培养基。孵育48h后取出上室，磷酸盐缓冲液洗三次，置于4％多聚甲醛中固定15min，再用磷酸盐缓冲液洗三次，然后0.1％结晶紫染色30min，用棉签擦掉上层未迁移的细胞，磷酸盐缓冲液洗净后通过光学显微镜观察。
如图11所示，与Control组细胞相比，CoCl2培养条件下的细胞数量显著减少；而随着载siRNA纳米脂质杂化胶束浓度增加，细胞数量呈浓度依赖性增加；与CoCl2组相比载siRNA纳米脂质杂化胶束组浓度为20nM可显著改善细胞的侵袭能力。
实验例6
ELISA法测定细胞上清sFLT1
将处于对数期且生长状态良好的HTR-8/SVneo细胞，按照5.1.3项下细胞传代步骤制成单细胞悬液，计数后以每孔1.5×104个接种于96孔板内进行培养。培养环境为37℃、5％CO2中，待细胞贴壁后弃旧培养液，加入含有CoCl2(终浓度300μmol/L)的培养液，同时分别加入不同浓度实施例1制备得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束药物(5nM、10nM、15nM、20nM)处理，继续培养48h后收集上清于1.5mL EP管内，3000rpm离心20min以去除细胞沉淀，小心吸取细胞上清至洁净的EP管中，使用酶联免疫吸附测定ELISA法检测细胞上清中sFLT1浓度。检测步骤如下：
(1)标准品的稀释与加样：对标准品进行一系列稀释，得到浓度分别为3000ng/L、2000ng/L、1000ng/L、500ng/L、250ng/L的标准品稀释液，稀释后各孔的加样量都为50μL。
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释浓度为5倍)。加样将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
(3)温育：用封板膜封板后置于37℃温浴30min。
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(300μL)，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
(7)温育：操作同步骤(3)。
(8)洗涤：操作同步骤(5)。
(9)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
(10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(11)测定：以空白孔调零，450nm波长处依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。
(12)计算标准曲线：以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线。
根据吸光度值(y)与sFLT1浓度(x)进行线性回归，可得标准曲线如图12A所示，线性回归方程为y＝0.777x-0.0812，R2＝0.9963，说明其在(0.25～3)ng/mL的浓度范围内线性关系良好，符合定量测定要求。细胞上清中可溶性血管内皮生长因子sFLT1含量检测结果见图12B，与CoCl2刺激组对比，当载siRNA纳米脂质杂化胶束浓度为20nM时，sFLT1的浓度下降了56.1％；但与Control组相比，CoCl2刺激组的细胞上清中sFLT1的浓度升高了62.1％，而20nM载siRNA纳米脂质杂化胶束组sFLT1的浓度升高了13.7％。由结果推测，siRNA经脂质体修饰后，其稳定性提高，进而增强其与sFLT1mRNA的作用并抑制sFLT1的表达。表明本发明得到的修饰后的靶向siRNA脂质体---载siRNA纳米脂质杂化胶束具有更好的治疗作用。
实验例7
HTR-8/SVneo细胞摄取行为研究
本发明通过细胞摄取实验来探究载体在一定时间内进入细胞的量。本发明采用的siRNA@DLin-MC3-DMA，由于其本申请不具备荧光效应，所以细胞摄取实验选择用荧光物质代替siRNA@DLin-MC3-DMA载入脂质体中，评价载体被细胞摄取的情况。香豆素是脂溶性物质，具有很好的生物相容性。本发明采用荧光探针香豆素-6作为siRNA@DLin-MC3-DMA的替代物，在不改变脂质体本申请的物理性质的前提下载入香豆素-6标记脂质体，利用香豆素-6能够定性观察和定量测定脂质体对滋养细胞的摄取。
7.1HTR-8/SVneo细胞定性摄取研究
将处于对数期且生长状态良好的HTR-8/SVneo细胞，按照5.1.3项下细胞传代步骤制成单细胞悬液，计数后以每孔7.5×104个接种于24孔板内，接种细胞前在24孔板内放置爬片。37℃、5％CO2中培养，待细胞贴壁后加入含有CoCl2(终浓度300μmol/L)的培养液中培养48h，弃去含有CoCl2的培养基，分别加入香豆素-6标记的的制剂FA-Lip-C6、Lip-C6、游离C6溶液，保证各组内C6的质量浓度均为1μg/mL。其中FA-Lip-C6、Lip-C6的制备方法同实施例1。游离香豆素-6(C6)溶液的配制过程为：全程避光条件下精密称取1.00mg的香豆素分散于2mL无水乙醇中，超声30min使分散均匀，0.22μm滤膜过滤，即得游离香豆素分散液。
本实验每组设置了0.5h、1h、2h、4h四个时间点，每个设置3个副孔。各组溶液的加入方法是：先加入4h的时间点的溶液，记录当时的时间，2h后加入两小时的时间点的溶液，3h后加入1h的时间点的溶液，3.5h后加入0.5h的时间点的溶液，4h后处理细胞。从培养箱中取出24孔板，弃去旧的培养基，用磷酸盐缓冲液清洗三次，使残留在细胞表面的溶液完全被清洗掉，用多聚甲醛固定30min，磷酸盐缓冲液清洗三次，DAPI染液(1μg/mL)染色20min，磷酸盐缓冲液清洗三次，抠片于载玻片上，在荧光显微镜下观察每组制剂不同时间点的细胞摄取情况。
由于siRNA与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的结合需要在细胞质中进行，因此脂质体被摄取后到达的位置十分重要。为了考察脂质体在细胞中发挥作用的部位，使用荧光显微镜观察脂质体4h时被细胞摄取后在细胞内和细胞核上的分布，结果如图13B所示。绿色标记来自C6，蓝色标记来自DAPI，其具有能够穿过细胞膜与DNA双链结合后产生强烈荧光的一种染料，可以用来定位细胞核的位置。从图中可以看出加药4h后，无论是游离C6组还是Lip-C6组，细胞中的绿色荧光都较弱，说明被细胞摄取的量较少。三组的绿色荧光主要在细胞质中，因为中间的细胞核是蓝色，边缘的细胞质是绿色，如果脂质体进入细胞核，叠加后的颜色应是青色，而merge图仍然显示为蓝色，表明脂质体未进入细胞核内；另外脂质体的粒径远大于核孔的孔径(20～70nm)，导致其无法穿过核孔进入细胞核，说明脂质体是在细胞质中发挥作用；FA-Lip-C6组细胞质中的荧光强度比游离香豆素-6组要强很多，表明靶向脂质体提高了HTR-8/SVneo细胞对C6的摄取。
7.2HTR-8/SVneo细胞定量摄取研究
本实验中细胞定量摄取测定了4h时不同制剂的摄取情况。操作方法和定性摄取相似，将处于对数期且生长状态良好的HTR-8/SVneo细胞，按照5.1.3项下细胞传代步骤制成单细胞悬液，计数后以每孔30×104个接种于6孔板内，37℃，5％CO2中培养，待细胞贴壁后加入含有CoCl2(终浓度300μmol/L)的培养液中培养48h，弃去含有CoCl2的培养基，分别加入香豆素-6标记的的制剂FA-Lip-C6、Lip-C6、游离C6溶液。C6的质量浓度一致(1μg/mL)，留一个孔加入新鲜的培养基作为空白对照组，37℃、5％CO2中培养4h后弃去板中的培养基，用磷酸盐缓冲液清洗三次，加入胰蛋白酶每孔0.5mL，倒置显微镜下观察细胞呈圆形，加入双倍培养基终止消化，轻轻吹散细胞，1000rpm条件下离心5min，弃上清，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬，重复操作两到三次，即得待测的细胞悬液样本。用流式细胞仪测定细胞内的荧光强度，测定结果用FlowJo 7.6处理。
本发明采用流式细胞仪来分析HTR-8/SVneo细胞对制剂的定量摄取率，细胞与制剂共孵育4h之后，以只加空白培养基作为对照组，在流式细胞仪上定量检测荧光强度，结果如图14所示。比较各组制剂在4h的摄取情况，从流式分析结果能直观的看出四组之间细胞摄取的差别，通过计算得出，FA-Lip-C6组(D)的细胞摄取量是游离C6组(B)的6.02倍，同时是Lip-C6组(C)的2.97倍。结果表明叶酸靶向脂质体能够增加细胞对C6的摄取量，运载更多的药物达到靶细胞中，减少药物的副作用，有助于达到高效低毒的效果。
实验例8
载siRNA纳米脂质杂化胶束的药效学研究
8.1实验动物模型的构建
实验动物：本发明选取SPF级KM雌性小鼠(许可证号：SCXK(京)2019-0010)作为动物模型构建对象，鼠龄为8～10周龄，每只重30～40g，购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司。本发明以普通动物房、标准化流程喂养，饲养环境的温度保持在22～25℃之间，相对湿度保持在60～70％之间。
动物模型构建：采用颈背部皮下注射L-NAME构建子痫妊娠小鼠模型。用磷酸盐缓冲液溶解L-NAME配制得到30mg/mL的L-NAME溶液，现配现用。妊娠小鼠自由摄食、饮水，然后在妊娠第9天(GD9)颈背部皮下注射L-NAME溶液(105mg/kg/d)，连续给药10天，分别在GD 7、GD 13、GD 18取24h尿液，检测尿蛋白量；分别在GD 8、GD 14、GD 19取血，ELISA检测血浆中sFLT1含量，若尿蛋白≥(+)、sFLT1含量(+)，视为建模成功。
实验分组：将25只妊娠小鼠鼠随机分为5组，每组5只，具体操作如下：
(1)正常妊娠组，即Control组(记为a组)：于GD 9尾静脉缓慢注射100μL生理盐水。
(2)妊娠小鼠L-NAME子痫前期模型组，即L-NAME组(记为b组)：GD 9皮下注射L-NAME 105mg/kg/d直至GD 19。
(3)妊娠小鼠裸siRNA组(记为c组)：GD 9皮下注射L-NAME 105mg/kg/d，并于GD 10尾静脉缓慢注射100μL对比例1得到的siRNA。
(4)妊娠小鼠非靶向脂质体治疗组，即Lip-siRNA@DMD组(记为d组)：GD 9皮下注射L-NAME 105mg/kg/d，并于GD 10尾静脉缓慢注射100μL对比例2得到的Lip-siRNA@DMD。
(5)妊娠小鼠靶向脂质体治疗组，即FA-Lip-siRNA@DMD组(记为e组)：GD 9皮下注射L-NAME 105mg/kg/d，并于GD 10起，每天给予100μL本发明实施例1得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束FA-Lip-siRNA@DMD直至GD 19。
其中c组、d组、e组中的siRNA量相同。
8.2妊娠子痫前期小鼠体重变化
小鼠的体重变化是评价药效的重要指标之一。正常妊娠期小鼠体重会明显增加，正常范围内的体重增加时为了满足妊娠这一特殊生理现象的代谢需求。按照8.1构建成功的动物模型来检测妊娠子痫前期小鼠的体重变化，将小鼠妊娠时间与体重变化绘制曲线，结果如图15所示，在孕鼠妊娠期第18天时，Control组孕鼠体重为70.2±4.10g，显著大于其他组；L-NAME组孕鼠体重值最小，均值为45±5.71g，表明从妊娠第9天开始连续向孕鼠体内注入L-NAME，使得孕鼠体重的增长受到明显抑制；而靶向脂质体治疗组孕鼠的体重均值为54.87±4.48g，表明与L-NAME组相比，妊娠期子痫小鼠的体重抑制现象得到缓解，药效得到发挥。而非靶向脂质体治疗组和裸siRNA组与靶向脂质体治疗组相比体重都较低，充分证明了本发明制备得到的靶向脂质体--载siRNA纳米脂质杂化胶束FA-Lip-siRNA@DMD可以更好的发挥药效。
8.3胎鼠体重和顶臀长
顶臀长是胚胎学中用于测量胎儿身体状况的标准之一，一般是由胎儿最头顶端量度至臀部最低处。按照8.1构建成功的动物模型来检测妊娠子痫前期母鼠的子代胎鼠的体重及顶臀长，本发明以妊娠第19天处死母鼠后剖腹取出子代小鼠，记录胎鼠重以及顶臀长。根据胎鼠体重和顶臀长绘制曲线，结果如图16所示。在妊娠第18天时，Control组胎鼠体重为1.3±0.05g，显著大于其他组；L-NAME组胎鼠体重为0.9±0.10g，表明自妊娠第9天开始连续向母鼠体内注入L-NAME，使得L-NAME组胎鼠体重的增长受到抑制；而靶向脂质体治疗组胎鼠的体重为1.25±0.07g，表明和L-NAME组相比，妊娠期子痫小鼠的体重抑制现象得到缓解，药效得到发挥。而非靶向脂质体治疗组和裸siRNA组与靶向脂质体治疗组相比胎鼠体重都较低，充分证明了本发明制备得到的靶向脂质体--载siRNA纳米脂质杂化胶束FA-Lip-siRNA@DMD可以更好的发挥药效。
在妊娠第18天时，Control组胎鼠顶臀长为25.96±0.05mm，L-NAME组胎鼠顶臀长为15.09±2.37mm，表明自妊娠第9天开始连续向母鼠体内注入L-NAME，L-NAME组胎鼠的生长受到明显抑制；而靶向脂质体治疗组胎鼠的顶臀长为25.13±0.91nm，表明与L-NAME组相比，胎鼠的生长发育得到改善。而非靶向脂质体治疗组和裸siRNA组与靶向脂质体治疗组相比胎鼠顶臀长都较低，充分证明了本发明制备得到的靶向脂质体--载siRNA纳米脂质杂化胶束FA-Lip-siRNA@DMD药效更好。
8.4尿蛋白检测
按照8.1构建成功的动物模型来检测妊娠子痫前期孕鼠的尿蛋白量。本发明采用标准代谢笼收集孕鼠尿液，将标准代谢笼内装好滤网板过滤粪便，然后以每笼单只的形式将各组孕鼠置于笼内，以10mL离心管接取孕鼠尿液。期间孕鼠禁食，可自由摄水，收集24h(20:00-20:00)空腹尿并记录尿量。将收到到的尿液以3000rpm离心20min取上清，冻存于-80℃冰箱内。待实验全部结束收集全部样本，检测尿总蛋白含量。各组孕鼠收集尿蛋白的时间均为：GD 7、GD 13和GD 18。总蛋白检测步骤如下：
(1)配制工作液：根据标准品和样品数量，以体积比50:1将BCA试剂盒Cu试剂配制成BCA工作液，充分混匀；
(2)稀释标准品：用PBS将10μL BSA标准品稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20μL分别加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL。
(3)将样品分别作2倍、4倍、8倍等不同倍数稀释，加20μL稀释溶液到96孔板的样品孔中。
(4)向步骤(3)的96孔板的样品孔中每孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30min。用酶标仪测定562nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
根据吸光度值(y)与蛋白浓度(x)进行线性回归，可得标准曲线如图17A所示，线性回归方程为y＝1.9653x+0.1926，R2＝0.9948，表明其在0.1～0.5mg/mL的浓度范围内线性关系良好。
孕期GD7、GD13、GD18各组孕鼠24h尿蛋白变化如图17B所示，各组孕鼠在妊娠第7天时的尿蛋白量的差异均无统计学意义；第9天给予L-NAME后，在妊娠第13天(GD13)时，除Control组外，其余各组尿蛋白的量显著高于GD7；且各组小鼠24h尿蛋白水平明显高于Control组。妊娠第18天时，L-NAME组尿蛋白量是Control组的5倍左右，靶向脂质体治疗组FA-Lip-siRNA@DMD组小鼠24h尿蛋白水平有所升高，但增加速度减慢；与L-NAME组相比，FA-Lip-siRNA@DMD组小鼠24h尿蛋白水平显著降低。
8.4ELISA法测定各组孕鼠血浆sFLT1水平
将妊娠第8天和14天各组孕鼠禁食12h后，眼眶取血，肝素润洗过的1.5mL EP管留取全血，6000rpm离心10min，取上清冻干，保存在-80℃以备后续检测。将妊娠第19天的各组孕鼠禁食12h后，摘眼球取血，使血液垂直流入肝素润洗过的1.5mL EP管中，6000rpm离心10min，分离血浆，将上清移至清洁的200μL EP管中，置于-80℃冰箱保存备用。
实验前30min将试剂盒和收集的血浆样品恢复至室温，对标准品进行一系列稀释，得到浓度分别为900ng/L、600ng/L、300ng/L、150ng/L、75ng/L的标准品稀释液，其余步骤同实验例6项操作，用ELISA试剂盒检测血浆中sFLT1含量。
根据吸光度值(y)与sFLT1浓度(x)进行线性回归，可得标准曲线如图18A所示，线性回归方程为y＝2.1623+0.0154，R2＝0.9992，说明其在(0.075～0.9)ng/mL的浓度范围内线性关系良好。
本发明通过ELISA法检测到子痫前期血浆中可溶性血管内皮生长因子受体1(sFLT1)的浓度，结果如图18B所示，在妊娠第8天(GD 8)，各组小鼠sFLT1浓度均无显著性差异；第9天向实验组孕鼠给予L-NAME后，妊娠第14天(GD 14)sFLT1浓度显著高于GD8，且各组小鼠sFLT1浓度明显高于Control组。妊娠第19天时(GD19)，L-NAME组sFLT1浓度为Control组的2.06倍。靶向治疗FA-Lip-siRNA@DMD组孕鼠血浆中sFLT1浓度在GD19时比在GD14时更低，表明靶向药物发挥了药效，对孕鼠的子痫前期有一定的抑制作用。
综上，本发明提供了一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，其中包含siRNA、由内向外包覆siRNA的阳离子脂质体和由DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇组成的脂质外层。本发明提供的siRNA可以选择性沉默三个主要导致胎盘过表达的sFLT1的sFLT1 mRNA亚型，而不会降低全长FLT1的mRNA，可有效降低子痫前期孕鼠血浆内sFLT1的浓度。
8.5载siRNA纳米脂质杂化胶束靶向脂质载体在子痫前期小鼠体内分布
为了考察纳米脂质杂化胶束FA-Lip-siRNA@DMD载体在子痫前期(PE)妊娠小鼠体内的分布情况，本发明采用活体成像技术来定性分析。利用荧光染料IR780来检测载体的分布。首先在避光条件下，按照实施例1制备FA-Lip-siRNA@DMD的方法，制备包载IR780的脂质体溶液(FA-Lip-IR780)，当PE小鼠模型构建成功后，即可进行活体成像实验。将实验小鼠分为三组，分别为：(1)游离IR780组；(2)Lip-IR780组；(3)FA-Lip-IR780组。采用尾静脉给药的方式，每只小鼠给药100μL，并且保证IR780的给药剂量为2mg/kg。在给药后1、6、12、24、48h的时间点，先用4％水合氯醛对小鼠进行麻醉，然后将小鼠固定好置于光学活体成像仪中，分别采集小鼠的X-ray图像和荧光图像。
实验结果如图19所示，尾静脉注射游离的荧光染料IR780，在各个时间点的荧光强度都很弱，荧光强度几乎可以忽略不计。而尾静脉注射FA-Lip-IR780在24h时已有较强的荧光强度，且这种荧光强度持续到48h，说明本发明得到的脂质体具有一定的靶向性，且含有叶酸的脂质体靶向性更强，载体到达胎盘后能够识别表面的叶酸受体，可以使药物聚集于胎盘，提高治疗效果，证明本实验中构建的载siRNA纳米脂质杂化胶束给药系统有望达到高效低毒的治疗效果。
为了进一步证明制剂的靶向性，我们取24h时的PE小鼠进行解剖，其荧光分布结果如图20所示，由图20A可以观察到，荧光在各脏器均有分布，但在胎盘的荧光强度高于其他组织，这是由于叶酸受体在肺、肾、脉络膜中也有低到中等水平的表达的原因。而sFlt-1主要由滋养细胞合成分泌，内皮细胞、成纤维细胞也可以合成，结合子痫前期的发生会使各脏器产生不同程度的损伤，推测制剂在其他脏器的低水平积累，在一定程度上可以对PE的治疗起到辅助作用。由图20B可以看到，此时的荧光基本全部分布在胎盘，在胎儿中几乎看不到荧光，说明制剂未透过胎盘到达胎儿，具有良好的胎盘靶向性，可以实现对胎儿相对安全的目的。
本发明的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA结合，其结合率高达81％以上。较高的结合率有助于实现阳离子脂质体与siRNA形成复合物，与带负电荷的细胞膜接触时可以提高细胞对递送系统的摄取和促进内涵体的逃离。本发明的阳离子脂质体具有球形结构，相较于其他形貌的粒子具有更好的细胞摄取率，有助于本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束被细胞摄取及更好的完成药物的递送，促进药效的发挥。阳离子脂质体具有无毒、无免疫原性、可自然降解、良好的生物相容性、易于表面修饰等优点。
本发明将脂质外层包裹在阳离子脂质体和siRNA形成的复合物的结构外部，采用叶酸键接在DSPE的亲水外层，作为靶头靶向胎盘，得到具有靶向作用的药物，PEG2000修饰后增加了脂质体的亲水性。脂质外层中的叶酸与胎盘中高表达水平的叶酸受体结合，一旦叶酸结合物与受体结合即可触发叶酸介导的胞吞作用，提高细胞对药物的摄取率，从而更好的完成siRNA的递送。
本发明得到的载siRNA纳米脂质杂化胶束具有良好的胶束稳定性、包封率高(53.5％以上)、安全性好、体内稳定和可靶向胎盘等优点。在杂化胶束的包裹下，药物可靶向胎盘，使siRNA在胎盘处积累，并有效减少了妊娠期母体内循环sFLT1、尿蛋白的量。本发明载siRNA纳米脂质杂化胶束可靶向胎盘但不到达胎儿，可有效降低药物对胎儿发育的不良影响。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 一种载siRNA纳米脂质杂化胶束及其制备方法和应用
<130> 说明书
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caucauagcu accauuuauu 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aauaaauggu agcuaugaug 20

Claims (9)

1.一种载siRNA纳米脂质杂化胶束，其特征在于，所述纳米脂质杂化胶束包含siRNA、由内向外包覆siRNA的阳离子脂质、脂质外层；
所述脂质外层由DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇组成。
2.如权利要求1所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束，其特征在于，所述siRNA的sense和antisense的核苷酸序列为分别为：5’-CAUCAUAGCUACCAUUUAUU-3’，5’-AAUAAAUGGUAGCUAUGAUG-3’。
3.如权利要求1所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束，其特征在于，所述阳离子脂质为DLin-MC3-DMA。
4.如权利要求1所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束，其特征在于，所述脂质外层中DSPE-PEG2000-FA与磷脂的质量比为1～5-10，胆固醇与磷脂的质量比为1:4～6。
5.如权利要求3所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将阳离子脂质体DLin-MC3-DMA配制得到胶束溶液，滴加至siRNA溶液中反应得到siRNA@DLin-MC3-DMA复合物；
2)将步骤1)得到的siRNA@DLin-MC3-DMA复合物与DSPE-PEG2000-FA、磷脂和胆固醇溶解于氯仿中，旋干溶剂，形成薄膜；再将薄膜重新分散到PBS溶液中，超声后进行高压均质循环，分离纯化得到载siRNA纳米脂质杂化胶束。
6.如权利要求5所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中DLin-MC3-DMA胶束溶液浓度为0.1mg/mL，siRNA溶液浓度为20μM，DLin-MC3-DMA胶束溶液与siRNA溶液的体积比为20～30:1。
7.如权利要求5所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中siRNA@DLin-MC3-DMA复合物中DLin-MC3-DMA与DSPE-PEG2000-FA的质量比为0.08～0.33:1。
8.如权利要求1至4任一项所述的载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述载siRNA纳米脂质杂化胶束在制备治疗子痫前期的可靶向胎盘的药物中的应用。
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