CN113106144A - Dna片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种DNA片段靶向富集方法,该方法包括根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA,并合成所述向导RNA;获取样本DNA;通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应,以从所述样本DNA上切割所述靶标片段;对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳,切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块;回收所述胶块中的DNA并进行测序。本发明提供的DNA片段靶向富集方法可适用度高,引入偏倚小。
Description
技术领域
本发明涉及cas9-capture技术领域,具体涉及一种DNA片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用。
背景技术
在分子实验中,需要大量的测序步骤。大部分情况下,科学研究或临床检测关注的都只是基因组上特定的一些基因,此时进行全基因组的测序,实际上绝大部分的测序数据是浪费的,因此DNA捕获技术对于高通量测序技术的广泛应用意义重大。
目前已有许多的技术方案着力于解决适合二代测序的DNA捕获,由于二代测序读长短,通过探针捕获、PCR捕获等方法可以较容易的将小片段的DNA捕获下来。然而,现有的捕获方法由于大多基于先将基因组DNA片段化,再进行捕获,不可避免的会带来捕获偏倚。而且,科学研究和临床检测中有相当一部分的基因用这些捕获方法并不合适,例如:长达2.3Mbp的DMD基因、含有polyQ的基因、DNA重复区域、copy number variation、微缺失/微重复综合征等。
因此有必要提供一种新型的DNA片段靶向富集方法,以解决上述技术问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种DNA片段靶向富集方法,以解决现有技术的DNA捕获方法存在捕获偏倚的技术问题。
为实现上述目的,本发明提出的DNA片段靶向富集方法,包括以下步骤:
根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA,并合成所述向导RNA;
获取样本DNA;
通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应,以从所述样本DNA上切割所述靶标片段;
对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳,切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块;
回收所述胶块中的DNA并进行测序。
优选地,所述获取样本DNA的步骤包括:
获取样本组织,加入DNA裂解液研磨后,加入蛋白酶K,密封并放入摇床,获得细胞裂解液;
在所述细胞裂解液中加入Tris饱和酚摇匀后,离心,获取第一上清液;
在所述第一上清液加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀后,离心,获得第二上清液;
在所述第二上清液中加入氯仿和异戊醇的混合液后,离心,获得第三上清液;
在所述第三上清液中加入乙醇后,离心,弃上清,加入TE缓冲液,获得所述样本DNA。
优选地,所述Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液中,Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1;
所述氯仿和异戊醇的混合液中,氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
优选地,所述回收所述胶块中的DNA并进行测序的步骤包括:
回收所述胶块中的DNA,获得富集DNA片段;
在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段,进行测序,所述人工合成DNA片段中带有尿嘧啶。
优选地,所述在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段,进行测序的步骤包括:
对所述富集DNA片段进行超声打断处理后,加入磁珠试剂并回收,加入人工合成DNA片段,进行文库构建和测序。
优选地,所述DNA片段靶向富集方法还包括向导RNA及cas9蛋白切割效率的验证方法:
根据位于所述靶标片段上下游两端的所述向导RNA设计验证引物;
通过所述验证引物和所述样本DNA进行扩增,获得包括所述向导RNA的待验证片段;
通过所述cas9蛋白和所述向导RNA对所述待验证片段做体外cas9酶切反应,以切割所述待验证片段,将经过切割的所述待验证片段与预设片段大小进行比较。
本发明还提出一种如前述的DNA片段靶向富集方法在基因组靶向测序,尤其是针对基因组结构变异,如拷贝数变异、微缺失微重复等的靶向测序中的应用。
本发明提供的DNA片段靶向富集方法,通过将靶标片段富集,从而有利于后续测序的进行,减小测序时对不必要的区域的进行测序;与常规的片段富集方法相比:本发明提供的方法操作相简单,捕获步骤中引入的偏倚小,可适用于CNV检测、polyQ基因检测,以及长片段DNA及三代测序。与CATCH技术相比:操作相对较简单,用酚氯仿-乙醇沉淀法替代琼脂糖包被法提取DNA;此外由于cas9切割下来的DNA片段相对量实际上很少,在建库步骤加入外源DNA,能减少目的片段在建库过程中的丢失。
附图说明
图1为本发明DNA片段靶向富集方法一实施例的流程示意图;
图2为本发明DNA片段靶向富集方法另一实施例的部分流程示意图;
图3为本发明DNA片段靶向富集方法又一实施例的部分流程示意图;
图4为SOX10基因及向导RNA的位置示意图;
图5为样本DNA体外cas9酶切反应后的琼脂糖凝胶电泳图;
图6为待验证片段cas9酶切反应后的琼脂糖凝胶电泳图;
图7为T1、C1、T2、C2四个区域DNA回收qPCR箱型图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
另外,本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
请参阅图1,本发明提出一种DNA片段靶向富集方法,包括以下步骤:
步骤S1,根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA,并合成所述向导RNA;
靶标片段为需要富集后进行测序的目标片段,在本实施例中以基因全长约16Kbp的SOX10基因作为靶标片段。DNA序列信息为现有技术中已经公开的与靶标基因同源的DNA序列,本实施例中在UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)中查找到与SOX10基因对应的DNA序列信息,该DNA序列信息编号为chr22:37,970,300-37,989,422,共约19Kbp。请参阅图4,为SOX10基因及向导RNA的位置示意图。其中A部分为SOX10的CDS区间,B部分为向导RNA,C部分为靶标片段上下游向导RNA。从C部分进行酶切,可得到靶标片段。
向导RNA(sgRNA)是结合并引导cas9蛋白与基因组上特定的部位结合的特殊小片段RNA。根据DNA序列信息分析向导RNA,获得SOX10基因中多个向导RNA,两相邻向导RNA之间间隔大约2kb左右。
步骤S2,获取样本DNA;
样本DNA中包含靶标片段。在本实施例中,通过采集受试者外周血5ml,用常规酚氯仿-乙醇沉淀法提取白细胞的DNA为样本DNA,将提取的样本DNA溶于500ul TE缓冲液中。还可以采用琼脂糖包被法进行样本DNA的提取。
步骤S3,通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应,以从所述样本DNA上切割所述靶标片段;
cas9蛋白是一种由RNA介导的核酸内切酶,与cas9蛋白结合的向导RNA通过与基因组上特定部位结合,将cas9蛋白带到该特定部位。cas9发挥核酸内切酶活性,将该特定部位的DNA切断。采用cas9蛋白特异性好,切割DNA的效率高,在细胞内、37℃下即可稳定发挥功能。在本实施例中,通过上下游的向导RNA sgRNA-1和sgRNA-9介导cas9蛋白进行酶切。酶切过程中,还需要加入缓冲液等试剂;本实施例中缓冲液试剂包括100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA。
步骤S4,对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳,切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块;
在本实施例中,采用1%的琼脂糖凝胶,在电压120V电泳40至60分钟。获得具有清晰条带的胶块。请参阅图5,为样本DNA体外cas9酶切反应后的琼脂糖凝胶电泳图。图5中样品孔里明显强条带的位置为20k(酚氯仿提取的DNA平均长度为20k),所以在标记最大条带和样品孔里强条带之间的区域大约10k~20k。划出来的区域里一般是看不到条带的,因为切下来的片段长度相对于全基因组是很小的(10^6分之一),所以切下来的片段染料是染不出来的。这也是本案为什么需要加外源DNA,以减少建库过程中的损失。
步骤S5,回收所述胶块中的DNA并进行测序。
步骤S5包括:步骤S51,回收所述胶块中的DNA,获得富集DNA片段;
步骤S52,在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段,进行测序,所述人工合成DNA片段中带有尿嘧啶。
具体地,对所述富集DNA片段进行超声打断处理后,加入磁珠试剂并回收,加入人工合成DNA片段,进行文库构建,文库构建完成后,使用USER酶将人工合成的DNA片段切断,使其不出现在测序结果中。在本实施例中,所述人工合成DNA片段长度应与打断后的DNA长度一致(300~400bp),cg比在40%~60%,碱基序列应尽量随机。
本实施例中,使用市售试剂盒回收胶块中的DNA。用市售NEB建库试剂盒进行文库构建,文库构建完成后,使用USER酶将人工合成的DNA片段切断,使其不能进入后续的测序数据中,上机进行二代测序。USER酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物。
进一步地,请参阅图2,步骤S2包括:
步骤S21,获取样本组织,加入DNA裂解液研磨后,加入蛋白酶K,密封并放入摇床,获得细胞裂解液;
获取样本组织约50mg放入离心管中,加入DNA裂解液研磨后,获取样本组织,加入蛋白酶K 400μg/ml,密封并放入55℃摇床过夜,获得细胞裂解液。
DNA裂解液包括:20mmolL tris-Cl、5mmol/EDTA、400mmol/L NaCl、1%(m/V)SDS。
步骤S22,在所述细胞裂解液中加入Tris饱和酚摇匀后,离心,获取第一上清液;
步骤S23,在所述第一上清液加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀后,离心,获得第二上清液;
具体地,在所述第一上清液加入等体积的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液,摇匀后,4℃11000rpm离心,取上清液,获得第二上清液。其中Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液中,Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
步骤S24,在所述第二上清液中加入氯仿和异戊醇的混合液后,离心,获得第三上清液;
具体地,在所述第二上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液后,4℃11000rpm离心,取上清液。重复两次步骤S24,获得第三上清液;其中,氯仿和异戊醇的混合液中,氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
步骤S25,在所述第三上清液中加入乙醇后,离心,弃上清,加入TE缓冲液,获得所述样本DNA。
在所述第三上清液中加入75%的乙醇后,1000rpm离心,弃上清,加入TE缓冲液,获得所述样本DNA。
进一步地,请参阅图3,所述DNA片段靶向富集方法还包括向导RNA及cas9蛋白切割效率的验证方法:
步骤S6,根据位于所述靶标片段上下游两端的所述向导RNA设计验证引物;
在本实施例中,为根据sgRNA-1及sgRNA-9设计验证引物。
SgRNA-1验证引物:
F:CTCCCAGTGCTGGCCTAATA;
R:TCAAACGTGAAGCCCACTGA。
SgRNA-9验证引物:
F:CTCCATGACCTTGAGACGCA;
R:TGAGGCTATTCAAGTTTGCAGATAC。
步骤S7,通过所述验证引物和所述样本DNA进行扩增,获得包括所述向导RNA的待验证片段;
在本实施例中,为包括sgRNA-1及sgRNA-9的待验证片段。
步骤S8,通过所述cas9蛋白和所述向导RNA对所述待验证片段做体外cas9酶切反应,以切割所述待验证片段,将经过切割的所述待验证片段电泳与预设片段大小进行比较。
请参阅图6,为待验证片段cas9酶切反应后的琼脂糖凝胶电泳图。由图可见,切割后分别形成约1.6k和1.3k的片段,大小与预期相符合,证明向导sgRNA-1及sgRNA-9具有足够的特异性和效率。
本发明提供的DNA片段靶向富集方法,通过将靶标片段富集,从而有利于后续测序的进行,减小测序时对不必要的区域的进行测序;与常规的片段富集方法相比:本发明提供的方法操作相简单,捕获步骤中引入的偏倚小,可适用于CNV检测、polyQ基因检测,以及长片段DNA及三代测序。与CATCH技术相比:操作相对较简单,用酚氯仿-乙醇沉淀法替代琼脂糖包被法提取DNA;此外由于cas9切割下来的DNA片段相对量实际上很少,在建库步骤加入外源DNA,能减少目的片段在建库过程中的丢失。
以下通过具体实施例对本发明提出的DNA片段靶向富集方法有效性进行说明:
根据靶标片段SOX10基因分析得到上下游向导RNA,即sgRNA-1和sgRNA-9。获取被试者白细胞DNA,实验组采用上述DNA片段靶向富集方法加入sgRNA-1和sgRNA-9做体外cas9酶切反应,对照组不加入sgRNA-1和sgRNA-9,其它操作与实验组一致。
请参阅图5,为样本DNA体外cas9酶切反应后的琼脂糖凝胶电泳图。图中所示的T1、C1区域为10k~20k的片段,T2、C2区域为3k~10k的片段。证明实验组酶切成功。
采用qPCR验证富集DNA片段,分别用两对引物针对SOX10基因的T1、C1、T2、C2四个区域DNA回收的样品进行qPCR验证,用actin基因引物作为内参指标。
引物1:
F:CTCCTTGGATAGGGCTGGAAGA;
R:GTTCCGAGTTCCAGGGTCCTT。
引物2:
F:CATCGGAGGCCTTACCACTC;
R:CTAGCCCTTAGGCACTGTGG。
内参引物:
F:GGCATGGGTCAGAAGGATT;
R:TGGTGCCAGATTTTCTCCA。
请参阅图7,为T1、C1、T2、C2四个区域DNA回收qPCR箱型图。结果显示T1/T2中SOX10基因的含量远高于C1/C2样品,证明本方法实现了对SOX10基因的富集。
以上所述仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种DNA片段靶向富集方法,其特征在于,包括以下步骤:
根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA,并合成所述向导RNA;
获取样本DNA;
通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应,以从所述样本DNA上切割所述靶标片段;
对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳,切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块;
回收所述胶块中的DNA并进行测序。
2.如权利要求1所述的DNA片段靶向富集方法,其特征在于,所述获取样本DNA的步骤包括:
获取样本组织,加入DNA裂解液研磨后,加入蛋白酶K,密封并放入摇床,获得细胞裂解液;
在所述细胞裂解液中加入Tris饱和酚摇匀后,离心,获取第一上清液;
在所述第一上清液加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀后,离心,获得第二上清液;
在所述第二上清液中加入氯仿和异戊醇的混合液后,离心,获得第三上清液;
在所述第三上清液中加入乙醇后,离心,弃上清,加入TE缓冲液,获得所述样本DNA。
3.如权利要求2所述的DNA片段靶向富集方法,其特征在于,所述Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液中,Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1;
所述氯仿和异戊醇的混合液中,氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
4.如权利要求2所述的DNA片段靶向富集方法,其特征在于,所述回收所述胶块中的DNA并进行测序的步骤包括:
回收所述胶块中的DNA,获得富集DNA片段;
在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段,进行测序,所述人工合成DNA片段中带有尿嘧啶。
5.如权利要求4所述的DNA片段靶向富集方法,其特征在于,所述在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段,进行测序的步骤包括:
对所述富集DNA片段进行超声打断处理后,加入磁珠试剂并回收,再加入人工合成DNA片段,进行文库构建和测序。
6.如权利要求1所述的DNA片段靶向富集方法,其特征在于,所述DNA片段靶向富集方法还包括向导RNA及cas9蛋白切割效率的验证方法:
根据位于所述靶标片段上下游两端的所述向导RNA设计验证引物;
通过所述验证引物和所述样本DNA进行扩增,获得包括所述向导RNA的待验证片段;
通过所述cas9蛋白和所述向导RNA对所述待验证片段做体外cas9酶切反应,以切割所述待验证片段,将经过切割的所述待验证片段电泳与预设片段大小进行比较。
7.一种如前述的DNA片段靶向富集方法在基因组靶向测序,尤其是针对基因组结构变异,如拷贝数变异、微缺失微重复等的靶向测序中的应用。
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