CN113106103A

CN113106103A - Ldlr基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN113106103A
Application number: CN202110364339.XA
Authority: CN
Inventors: 程翔; 查灵凤; 王景林
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-04-05
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2041-04-05
Also published as: CN113106103B

Abstract

本发明属于LDLR基因研究领域，具体公开了LDLR基因突变体及其应用。包括与野生型LDLR基因相比，具有c.2517‑2518insCA突变的核酸；以及与野生型LDLR相比，具有p.C839fs突变的多肽。还涉及包含有前述核酸和/或前述基因突变的构建体，以及用于制备防治高胆固醇血症药物的质粒的制备方法，包括下述步骤以野生型LDLR基因为模版，扩增得突变LDLR cDNA片段，酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化的GATC序列，纯化突变片段，突变片段与表达载体进行双酶切、酶连得表达质粒，制质粒菌液，从质粒菌液中提取质粒。本发明发现了LDLR基因的新的突变位点，对该突变位点的检测可以用于高胆固醇血症患者的辅助诊断，并且可进一步应用于高胆固醇血症患者的分子诊断。

Description

LDLR基因突变体及其应用

技术领域

本发明属于LDLR基因研究领域，尤其涉及LDLR基因突变体及其应用。

背景技术

家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia，FH)是一种严重的常染色体显性单基因遗传性疾病。世界范围内FH杂合患者的发病率为1/500，成为最常见的代谢性疾病之一。纯合子患者症状严重，发病率为1/1000000，血浆低密度脂蛋白胆同醇(Lowdensity lipoprotein cho1esterol，LDL-c)水平大幅度增高，多部位肌腱黄色瘤和早发动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)，严重者青少年时期可发生冠心病甚至心梗死亡。LDLR基因突变是FH的主要病理基础，在临床确诊的FH患者中约50％可检测到LDLR基因突变。

LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上218个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。LDLR与LDL结合后，在有被小窝内吞成内体，多个内体相互融合为不规则的大泡，大泡膜上质子泵的活性使泡内pH降至6.5以下，在此酸性条件下，LDLR与LDL分离，前者回到细胞表面重新起作用，后者则进入溶酶体,在多种水解酶作用下分解代谢。LDLR基因突变引起细胞膜表面的LDL-R缺如或结构功能异常，导致肝脏对血循环低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)清除障碍并在组织内过度淤积。

发明内容

针对上述问题，本发明提供LDLR基因突变体及其应用，主要发现一种新的LDLR基因突变体，并填补了家族性高胆固醇血症的基因一个方面的漏缺。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

核酸，

与野生型LDLR基因(一种为SEQ NO：1)相比，所述核酸具有c.2517-2518insCA突变。

一些方式中，所述核酸为DNA。

多肽，

与野生型LDLR相比(一种为SEQ NO：2)，所述多肽具有p.C839fs突变。

基因突变，与野生型LDLR基因相比，所述基因突变具有c.2517-2518insCA突变。

生物模型在制备筛选制剂中应用，所述生物模型至少携带下列之一：

a.前述的核酸；

b.前述的多肽；

c.前述的基因突变。

一些方式中，所述筛选制剂为筛选家族性高胆固醇血症的制剂。

筛选家族性高胆固醇血症生物样品的试剂盒，包含有

能检测LDLR基因突变体的试剂，与野生型LDLR基因相比，所述LDLR基因突变体具有c.2517-2518insCA突变；

优选的，所述LDLR基因突变体至少为下述中之一：

a.前述的核酸；

b.前述的多肽；

c.前述的基因突变。

一些方式中，所述试剂为核酸探针或引物；

所述引物的核苷酸序列为：

正向引物序列：ATGGTACGATGCCCGTGTTT，

反向引物序列：CTGAATGAGCGCACAGAAGC；

核酸探针核酸序列为：

正向探针序列：CCCTACAGTGCTCCTCGTC，

反向探针序列：CATGGGCTCTGGCTTTCT。

构建体，包含有前述核酸和/或前述的基因突变。

重组细胞，所述重组细胞是通过前述的构建体转化受体细胞或表达前述多肽而得。

抑制剂在防治家族性高胆固醇血症药物中的应用，所述抑制剂至少对下述中任一具有抑制作用：

a.LDLR基因的c.2517-2518insCA突变；

b.LDLR基因多肽的p.C839fs突变。

用于制备防治高胆固醇血症药物的重组蛋白，由前述的重组细胞表达。

用于制备防治高胆固醇血症药物的质粒的制备方法，包括下述步骤：

(A)以野生型LDLR基因为模版，扩增得突变LDLR cDNA片段；

(B)酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化的GATC序列，纯化突变LDLR cDNA片段；

(C)突变LDLR cDNA片段与表达载体用HindIII酶和Kpn1酶进行双酶切、T4 DNA连接酶酶连得表达质粒；

(D)将酶连反应所得体系加入大肠杆菌受态细胞中，得质粒菌液；

(E)从质粒菌液中提取质粒。

一些方式中，步骤(A)中，以野生型LDLR基因为模版，定点突变上游引物F-mut:5'GGCTGCAGTGGCCACCTAGGAGAC3'，下游引物R-mut：5'TGGATGTCTCCTAGGTGGCCACTG以及DNA聚合酶Primer Star通过聚合酶链式反应扩增得到突变LDLR cDNA片段；和/或

步骤(B)中，以DpnI酶酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化的GATC序列，去除模板质粒留下PCR突变产物，使突变LDLR cDNA片段得到初步纯化；和/或

步骤(C)中，表达载体为pCMV-3XFlag和pEGFP-C1，表达质粒为pCMV-3XFlag-LDLR-Mut和pEGFP-C1-LDLR-Mut；和/或

步骤(E)中，通过单克隆抗体鉴定和/或测序确定正确的质粒菌液；和/或

步骤(E)中，通过使用Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II进行质粒的抽提。

本发明的有益效果是：

(1)本发明发现了LDLR基因的新的突变位点，对该突变位点的检测可以用于高胆固醇血症患者的辅助诊断，并且可进一步应用于高胆固醇血症患者的分子诊断；

(2)本发明可以对高胆固醇血症的发病机理提供重要线索，对高胆固醇血症的诊断治疗具有十分重要的意义；

(3)本发明中的LDLR突变位点较为罕见，在诊断试剂盒中收录本发明中的突变位点，进一步丰富高胆固醇血症诊断试剂盒的诊断位点；

(4)在本发明的基础上，能够以检测人基因组中c.2517-2518insCA位点基因型作为筛查、鉴定高胆固醇血症的手段；或者将检测人基因组中c.2517-2518insCA突变或基因型的物质用于制备筛查高胆固醇血症患者产品、检测高胆固醇血症产品、检测、鉴定或辅助鉴定与高胆固醇血症相关的单核苷酸多态性的产品。其中，上述检测人基因组中c.2517-2518insCA突变或基因型的物质，包括但不限于扩增包含c.2517-2518insCA位点在内的基因组DNA片段的PCR引物对和成套探针。

附图说明

图1为一个高胆固醇血症患者家系图谱；

图2为高胆固醇血症患者先证者和正常人LDLR基因c.2517-2518insCA突变的Sanger测序验证峰对比图；

图3为正常人群中c.2517-2518insCA突变筛查；

图4为野生型和突变型LDLR的表达量；

图5为LDLR蛋白的氨基酸突变位点位置展示图；

图6为生物信息学预测中功能预测示意图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明：

核酸，包括含下列目标片段，

所述目标片段与野生型LDLR基因相比(一种为SEQ NO：1)，所述核酸具有c.2517-2518insCA突变。另一些现有或后续发现的LDLR基因，只要存在c.2517-2518insCA突变，并且具有与本发明相同、相近效果的突变体都应当落入本发明保护范围。并不局限于除c.2517-2518insCA突变外，其他序列必须与SEQ NO：1一致。所述核酸为DNA。

多肽，

与野生型LDLR相比(一种为SEQ NO：2)所述多肽具有p.C839fs突变。同前，并不局限于除p.C839fs突变外，其他序列必须与SEQ NO：2一致。

a.前述核酸；

b.前述多肽；

c.前述基因突变。

所述筛选制剂为筛选家族性高胆固醇血症的制剂。

筛选家族性高胆固醇血症生物样品的试剂盒，包含有

能检测LDLR基因突变体的试剂，与野生型LDLR基因相比，所述LDLR基因突变体具有c.2517-2518insCA突变。

一种实质方式中，所述LDLR基因突变体至少为下述中之一：

a.前述核酸；

b.前述多肽；

c.前述基因突变。

所述试剂为核酸探针或引物；一种实质方式中，

所述引物的核苷酸序列包括：

序列为ATGGTACGATGCCCGTGTTT的正向引物，和/或

序列为CTGAATGAGCGCACAGAAGC的反向引物；

核酸探针核酸序列包括：

序列为CCCTACAGTGCTCCTCGTC的正向探针，和/或

序列为CATGGGCTCTGGCTTTCT的反向探针。

构建体，包含有前述核酸或前述基因突变。

重组细胞，所述重组细胞是通过前述构建体转化受体细胞或表达前述多肽而得。

用于制备防治高胆固醇血症药物的重组蛋白，由前述重组细胞表达。

(A)以野生型LDLR基因为模版，扩增得突变LDLR cDNA片段；

(E)从质粒菌液中提取质粒。

上述步骤更具体的说明：

步骤(A)中，以野生型LDLR基因为模版，定点突变上游引物F-mut:5'GGCTGCAGTGGCCACCTAGGAGAC3'，下游引物R-mut：5'TGGATGTCTCCTAGGTGGCCACTG以及DNA聚合酶Primer Star通过聚合酶链式反应扩增得到突变LDLR cDNA片段；和/或

a.LDLR基因的c.2517-2518insCA突变，

b.LDLR基因多肽的p.C839fs突变。

用于制备防治高胆固醇血症药物的质粒的一种具体构建步骤如下：

野生型LDLR基因的cDNA(CCDS12254、NM_000527.4)表达质粒购维真生物科技有限公司。

(1)以野生型LDLR cDNA为模板，带有HindIII酶切位点的上游引物LDLR-HindIII-F：5'CCCAAGCTTATGGGGCCCTGGGGCCCTGGGGCTGGAA 3'和带有Kpn1酶切位点的下游引物LDLR-Kpn1-R 5'CGGTGGTACTCACGCCACGTCATCCTCCAG3'以及高保真DNA聚合酶Primer Star通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到带有酶切位点的野生型LDLR cDNA片段。

(2)以上一步中的野生型LDLR cDNA为模板，定点突变上游引物F-mut:5'GGCTGCAGTGGCCACCTAGGAGAC3'，下游引物R-mut：5'TGGATGTCTCCTAGGTGGCCACTG以及高保真DNA聚合酶Primer Star通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到突变LDLR cDNA片段。具体反应体系及扩增步骤如下：

反应体系：

扩增程序：

(3)DpnI酶消化突变PCR产物

DpnI识别并酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenine)的GATC序列。从大肠杆菌提取的质粒会被甲基化，而PCR产物没有甲基化，所以DpnI酶能够特异型切割模板质粒而不会影响PCR产物，从而去掉模板质粒留下PCR突变产物。

DpnI酶消化消化体系及步骤：

Buffer和水等充分混匀后再加入DpnI酶，加入DpnI酶后可以用枪吹打或轻轻涡旋混匀，37℃孵育1小时或更长时间。

(4)目的片段与载体的酶切：将片段与表达载体用HindIII酶和Kpn1酶进行双酶切。

目的片段(野生型LDLR cDNA和突变LDLR cDNA)酶切体系：

表达载体(pCMV-3XFlag和pEGFP-C1)酶切体系：

37℃酶切反应6-8小时，分别纯化回收片段跟载体。

(5)目的片段与载体酶连

双酶切后的片段与载体经过纯化回收后测浓度，按照目的片段(mol)：载体(mol)＝3:1，使用T4 DNA连接酶4℃酶连过夜。

野生型LDLR cDNA片段和突变LDLR cDNA片段分别与表达载体pCMV-3XFlag酶连，得到表达质粒pCMV-3XFlag-LDLR-Wt和pCMV-3XFlag-LDLR-Mut。

野生型LDLR cDNA片段和突变LDLR cDNA片段分别与表达载体pEGFP-C1酶连，得到表达质粒pEGFP-C1-LDLR-Wt和pEGFP-C1-LDLR-Mut。

具体体系如下：

注意设置体系中只有载体，没有目的片段的阴性对照。

(6)转化：将酶连反应完成的10L体系和阴性对照体系分别加进100L DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42℃热击90秒，立即放于冰上再静置3分钟，接着加入500L无抗生素的LB培养基，置于37℃振荡摇床100转/分钟，复苏活化2小时后，3000×rpm,离心5分钟，留取100uL上清将菌体轻轻悬起，涂布于含有对应抗性的LB固体培养平板上，于37℃培养箱培养12-16小时。

(7)单克隆的鉴定：观察酶连转化与阴性对照转化的平板，正常情况下，阴性的平板基本不长克隆或克隆很少。挑取数个单克隆于3mL对应抗性的LB液体培养基中，37℃振荡摇床200转/分钟，培养12小时，先取200uL菌液20％甘油保种，剩余的菌液使用质粒小提试剂盒抽提质粒进行双酶切检测验证。

(8)测序：上一步双酶切检测的质粒，如果经过琼脂糖凝胶检测有目的片段和载体片段两条条带，则挑选1-2管质粒进行测序。

测序正确的质粒的菌液接种于15mL还有对应抗性的LB液体培养基中，使用Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II进行质粒的抽提，琼脂糖凝胶检测，测浓度，保存于-20℃。

(9)高纯度质粒抽提

取测序正确的质粒菌液到含有20ml相应抗生素的LB培养基的50ml离心管中，37℃振捣摇床200转/分钟培养12-16小时。低速离心机3600转，离心20分钟，弃上清，管子倒扣在干净的纸张上5分钟，菌体沉淀在管底待用。使用OMEGA的Endo-free Plasmid DNA MiniKit II试剂盒，提取高质量去内毒素质粒，步骤如下

1.在吸附柱中加入500μl平衡缓冲液，放置5分钟，12000g离心2分钟，弃收集管中液体；

2.在上述菌体沉淀中加入500μl Solution I(使用前加入RNase A)溶液，用移液器吹打或者涡旋，将沉淀完全吹散，直至无菌体结块；

3.将重悬好的菌液转移到2mlEP管中，加入500μl solution II，立即轻轻上下颠倒混匀6-8次，菌体完全裂解，菌液变得澄清，放置5分钟；

4.立即加入250μl冰浴的N3 buffer，轻轻上下颠倒6-8次，直至完全混匀，有白色絮状沉淀产生。12000g转离心15分钟；

5.小心吸取上清转移至新的1.5mlEP管中，加入0.1倍体积的冰浴ETR solution，上下颠倒混匀，溶液变浑浊。冰上放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液又变清亮；

6.42℃金属恒温器孵育5分钟，溶液变浑浊，12000xg离心5分钟，蓝色ETR于管底部；

7.小心吸取上清转移至2mlEP管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温静置5分钟；

8.移液器吸取700ul(步骤7)中的溶液到平衡处理过的吸附柱中，放置5分钟，12000×g离心2分钟，弃掉收集管中的液体；

9.重复步骤8至步骤7中的液体全部经过吸附柱；

10.加入500μl HBCbuffer到吸附柱中，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，弃掉收集管中的液体；

11.加入600μl DNA wash buffer到吸附柱中，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，弃废液。重复洗涤一次；

12.吸附柱空转12000×g离心2分钟，完全去除洗涤缓冲液；

13.将吸附柱放在新的收集管中，室温静置待无水乙醇挥发；

14.小心在吸附柱膜上加入80μl洗脱缓冲液或者超纯水，室温静置10分钟，12000×g离心2分钟，即得到质粒溶液；

15.利用NanoDrop 2000c超微量紫外-可见分光光度计测定质粒浓度，保存于-20℃备用。

由于LDLR对于胆同醇代谢至关重要，以致该基因任何部位出现突变均可致病。以LDLR蛋白合成与功能为基础突变可划分为5型：l型突变为不表达等位基因，包括启动子序列突变、无义突变、移码突变、剪接突变，这类突变导致细胞不表达LDLR；2型突变为转运缺陷型等位基因，主要发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域，虽然能合成受体，但从内质网向高尔基体的转运障碍，堆积在内质网中最终被降解；3型突变为结合缺陷型等位基因，本型较常见，特点为突变基因编码的异常受体蛋白可以到达细胞表面，但丧失了结合LDL的功能，这类突变同样发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域；4型突变为内移缺陷型等位基因，本型罕见，发生在胞浆区域或是跨膜域，由于编码NPVY序列的密码子发生突变而致，特点为受体能与LDL结合，但不能将其转运至细胞表面并聚集于被覆陷窝；5型突变为再循环缺陷型等位基因，受体能够结合LDL，也能内移进人细胞，但在溶酶体内不能与LDL分离，受体与配体被同时降解，导致LDLR不能够再循环到细胞表面，这类突变多发生在表皮生长因子前体结构域。

需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以proteon测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。

由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作家族性高胆固醇血症，尤其是杂合子型家族性高胆固醇血症的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

下面结合一些研究实例进行说明：

一.样本收集

发明人在武汉收集到1个高胆固醇血症的家系，如图1所示，

共采集该家系成员共6人(方框所示)，其中患者2人(II-7和III-3)，正常人员4人(II-8，III-2，III-3，III-5)。

□表示正常男性，■表示患病男性，○表示正常女性，●表示患病女性，↗表示先证者。参与本发明研究的共6人(方框所示)，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。发明人采集获得上述高胆固醇血症患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

DNA提取：应用TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒抽提人外周血白细胞的DNA，利用NanoDrop2000分光光度计对上述提取的DNA样本进行浓度及纯度测定。所得的每个标本基因组DNA OD260/OD280均位于1.8-2.0之间，浓度不少于80ng/ml。

二.全外显子测序

发明人用proteon测序平台，对高胆固醇血症家系中的先证者进行全外显子组测序。

三.变异检测、注释及数据库比较

对测序公司提供的变异检测、注释结果，对非同义突变、编码区插入和缺失这两类最有可能与病理相关的突变进行研究。结果在这些样本中发现，先证者有82570个SNV突变，15209个indel突变，79个CNV。根据公共数据库dbSNP数据库、HapMap数据库、千人基因组数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.01的变异。筛选常见的导致家族性高胆固醇血症的基因LDLR，PCSK9，APOB上的突变。由此，发明人发现先证者在LDLR基因17号外显子上存在一个图2所示的杂合插入突变exon17:c.2517_2518insCA:p.C839fs。

四.Sanger法测序验证

(1)引物设计

根据基因突变在基因组中的位置，在Ensembl数据库查询突变所在的人基因组序列，在引物设计软件Primer Premier 5进行引物设计。引物序列如下：

正向引物序列：ATGGTACGATGCCCGTGTTT，

反向引物序列：CTGAATGAGCGCACAGAAGC。

(2)PCR扩增

然后，按照以下配比配制各DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系(25μl)：

扩增程序：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

(3)Sanger测序

将步骤2得到的PCR产物经纯化后，直接进行DNA测序，测序使用ABI3730XL型测序仪进行正反向测序。

分别对采集的6个家庭成员进行LDLR基因该突变位点的一代测序。根据确定序列测定结果数据突变型还是野生型，验证LDLR基因的c.2517_2518insCA突变与遗传性高胆固醇血症之间的相关性。基于测序结果，高胆固醇血症患者家系中，先证者LDLR基因17号外显子c.2517_2518insCA突变，而先证者妻子未携带该突变，先证者两个侄儿和女儿携带该突变，侄女未携带该突变，推测该位点可能为该家族的致病基因突变，先证者的侄女和女儿及其中的一个侄儿由于目前年龄较小可能没有显示出血脂异常的症状。

五.生物信息学预测

(1)突变有害性分析

根据有害性预测软件SIFT、Polyphen2_HVAR_pred、MutationTaster_pred分析，发现该位点突变是突变有害性，突变后会致病。

(2)保守性分析

如图5中，该位点位于LDLR蛋白的第839个氨基酸位置，该位点是具有保守性的，如果位点突变后会导致蛋白功能异常。

(3)功能预测

如图6中，该突变exon17:c.2517_2518insCA:p.C839fs是由于839插入了CA两个碱基导致移码突变，碱基序列重排，不能出现正常的终止密码，影响其正常翻译出LDLR蛋白，进而影响血脂。

该位点位于的区域是LDLR蛋白的胞内结构域，此区域负责调控LDLR的内吞和细胞内转运，如果其区域发生变化或LDLR的LDLR的内吞和细胞内转运将会发生异常，导致血脂升高。

六.功能验证

分别构建含有突变和野生型LDLR基因质粒，使用Lipofectamine 2000转染试剂转染HEK29T细胞，接下来用聚丙烯酰氨凝胶电泳(western blot)确定LDLR基因表达的多肽。如图4实施例所示，野生型能检测到LDLR蛋白，而突变型质粒转染后不能检测到LDLR蛋白表达。

七.临床分析

(1)ACMG标准评级

根据ACMG遗传变异分类标准与指南该位点可以评为致病性。

(2)用药情况

先证者最高LDL-C：8.05mmol/L，服用每日剂量阿托伐他汀后先证者的LDL-C由最高8.05降至5.36mmol/L，后续继续他汀加依泽麦布，和周两周注射PCSK9抑制剂治疗后LDL-C水平保持在1.2mmol/L,治疗效果较好。PCSK9抑制剂，能结合PCSK9并抑制循环型PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)的结合，从而阻止PCSK9介导的低密度脂蛋白受体降解，进而控制血脂,该药用于治疗成人杂合子型家族性高胆甾醇血症,对于纯合型家族性高胆甾醇血症患者无效。本家系应用PCSK9抑制剂后显著的降低了血脂，说明先证者还保留了部分LDLR的功能，证实了先证者是杂合突变。

(3)健康人群中c.2517_2518insCA突变筛查

使用Taqman探针法对健康人群进行c.2517_2518insCA突变筛查。

Taqman探针法进行基因分型实验的具体操作如下：

基因组DNA样本2ml、2×TaqMan GT master mix 4ml、40×TaqMan SNP探针0.2ul、去离子水1.8ul混合均匀(10ul反应体系)。每孔一人反应体系，分别加入96孔PCR板，在ABI7300实时荧光定量PCR仪进行反应。95℃变性30秒，60℃退火1分钟，重复35个循环。反应结束后，使用7500System SDS software进行基因型分型，确定以上样本是否属于携带突变。

核酸探针为Taqman探针，其核酸序列如下所示：

正向探针序列：CCCTACAGTGCTCCTCGTC，

反向探针序列：CATGGGCTCTGGCTTTCT。

结果显示200例人群中基因型都是CC,未携带突变。

基于以上的证据我们发现LDLR基因上一个新的框移突变c.2517_2518insCA会导致家族性高胆固醇血症。该位点可以用于家族性高胆固醇血症的基因筛查。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> LDLR基因突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2583

<212> DNA

<213> 人(Human)

<400> 1

atggggccct ggggctggaa attgcgctgg accgtcgcct tgctcctcgc cgcggcgggg 60

actgcagtgg gcgacagatg cgaaagaaac gagttccagt gccaagacgg gaaatgcatc 120

tcctacaagt gggtctgcga tggcagcgct gagtgccagg atggctctga tgagtcccag 180

gagacgtgct tgtctgtcac ctgcaaatcc ggggacttca gctgtggggg ccgtgtcaac 240

cgctgcattc ctcagttctg gaggtgcgat ggccaagtgg actgcgacaa cggctcagac 300

gagcaaggct gtccccccaa gacgtgctcc caggacgagt ttcgctgcca cgatgggaag 360

tgcatctctc ggcagttcgt ctgtgactca gaccgggact gcttggacgg ctcagacgag 420

gcctcctgcc cggtgctcac ctgtggtccc gccagcttcc agtgcaacag ctccacctgc 480

atcccccagc tgtgggcctg cgacaacgac cccgactgcg aagatggctc ggatgagtgg 540

ccgcagcgct gtaggggtct ttacgtgttc caaggggaca gtagcccctg ctcggccttc 600

gagttccact gcctaagtgg cgagtgcatc cactccagct ggcgctgtga tggtggcccc 660

gactgcaagg acaaatctga cgaggaaaac tgcgctgtgg ccacctgtcg ccctgacgaa 720

ttccagtgct ctgatggaaa ctgcatccat ggcagccggc agtgtgaccg ggaatatgac 780

tgcaaggaca tgagcgatga agttggctgc gttaatgtga cactctgcga gggacccaac 840

aagttcaagt gtcacagcgg cgaatgcatc accctggaca aagtctgcaa catggctaga 900

gactgccggg actggtcaga tgaacccatc aaagagtgcg ggaccaacga atgcttggac 960

aacaacggcg gctgttccca cgtctgcaat gaccttaaga tcggctacga gtgcctgtgc 1020

cccgacggct tccagctggt ggcccagcga agatgcgaag atatcgatga gtgtcaggat 1080

cccgacacct gcagccagct ctgcgtgaac ctggagggtg gctacaagtg ccagtgtgag 1140

gaaggcttcc agctggaccc ccacacgaag gcctgcaagg ctgtgggctc catcgcctac 1200

ctcttcttca ccaaccggca cgaggtcagg aagatgacgc tggaccggag cgagtacacc 1260

agcctcatcc ccaacctgag gaacgtggtc gctctggaca cggaggtggc cagcaataga 1320

atctactggt ctgacctgtc ccagagaatg atctgcagca cccagcttga cagagcccac 1380

ggcgtctctt cctatgacac cgtcatcagc agagacatcc aggcccccga cgggctggct 1440

gtggactgga tccacagcaa catctactgg accgactctg tcctgggcac tgtctctgtt 1500

gcggatacca agggcgtgaa gaggaaaacg ttattcaggg agaacggctc caagccaagg 1560

gccatcgtgg tggatcctgt tcatggcttc atgtactgga ctgactgggg aactcccgcc 1620

aagatcaaga aagggggcct gaatggtgtg gacatctact cgctggtgac tgaaaacatt 1680

cagtggccca atggcatcac cctagatctc ctcagtggcc gcctctactg ggttgactcc 1740

aaacttcact ccatctcaag catcgatgtc aacgggggca accggaagac catcttggag 1800

gatgaaaaga ggctggccca ccccttctcc ttggccgtct ttgaggacaa agtattttgg 1860

acagatatca tcaacgaagc cattttcagt gccaaccgcc tcacaggttc cgatgtcaac 1920

ttgttggctg aaaacctact gtccccagag gatatggttc tcttccacaa cctcacccag 1980

ccaagaggag tgaactggtg tgagaggacc accctgagca atggcggctg ccagtatctg 2040

tgcctccctg ccccgcagat caacccccac tcgcccaagt ttacctgcgc ctgcccggac 2100

ggcatgctgc tggccaggga catgaggagc tgcctcacag aggctgaggc tgcagtggcc 2160

acccaggaga catccaccgt caggctaaag gtcagctcca cagccgtaag gacacagcac 2220

acaaccaccc gacctgttcc cgacacctcc cggctgcctg gggccacccc tgggctcacc 2280

acggtggaga tagtgacaat gtctcaccaa gctctgggcg acgttgctgg cagaggaaat 2340

gagaagaagc ccagtagcgt gagggctctg tccattgtcc tccccatcgt gctcctcgtc 2400

ttcctttgcc tgggggtctt ccttctatgg aagaactggc ggcttaagaa catcaacagc 2460

atcaactttg acaaccccgt ctatcagaag accacagagg atgaggtcca catttgccac 2520

aaccaggacg gctacagcta cccctcgaga cagatggtca gtctggagga tgacgtggcg 2580

tga 2583

<210> 2

<211> 860

<212> PRT

<213> 人(Human)

<400> 2

Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe

20 25 30

Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly

35 40 45

Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu

50 55 60

Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn

65 70 75 80

Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp

85 90 95

Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp

100 105 110

Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys

115 120 125

Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro

130 135 140

Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys

145 150 155 160

Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly

165 170 175

Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu

195 200 205

Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp

210 215 220

Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp

245 250 255

Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn

260 265 270

Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu

275 280 285

Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp

290 295 300

Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp

305 310 315 320

Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr

325 330 335

Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys

340 345 350

Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys

355 360 365

Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln

370 375 380

Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr

385 390 395 400

Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg

405 410 415

Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu

420 425 430

Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser

450 455 460

Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala

465 470 475 480

Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly

485 490 495

Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe

500 505 510

Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His

515 520 525

Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile

545 550 555 560

Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr

565 570 575

Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly

580 585 590

Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro

595 600 605

Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile

610 615 620

Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn

625 630 635 640

Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His

645 650 655

Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu

660 665 670

Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn

675 680 685

Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu

690 695 700

Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala

705 710 715 720

Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val

725 730 735

Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu

740 745 750

Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser

755 760 765

His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro

770 775 780

Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val

785 790 795 800

Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys

805 810 815

Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr

820 825 830

Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro

835 840 845

Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala

850 855 860

Claims

1.核酸，其特征在于，包括含下列目标片段，

所述目标片段与野生型LDLR基因相比，所述核酸具有c.2517-2518insCA突变。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.多肽，其特征在于，

与野生型LDLR相比，所述多肽具有p.C839fs突变。

4.基因突变，其特征在于，与野生型LDLR基因相比，所述基因突变具有c.2517-2518insCA突变。

5.生物模型在制备筛选制剂中应用，其特征在于，所述生物模型至少携带下列之一：

a.权利要求1所述的核酸；

b.权利要求3所述的多肽；

c.权利要求4所述的基因突变。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述筛选制剂为筛选家族性高胆固醇血症的制剂。

7.筛选家族性高胆固醇血症生物样品的试剂盒，其特征在于，包含有

优选的，所述LDLR基因突变体至少为下述中之一：

a.权利要求1所述的核酸；

b.权利要求3所述的多肽；

c.权利要求4所述的基因突变。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针或引物；优选的

所述引物的核苷酸序列包括：

序列为ATGGTACGATGCCCGTGTTT的正向引物，和/或

序列为CTGAATGAGCGCACAGAAGC的反向引物；

核酸探针核酸序列包括：

序列为CCCTACAGTGCTCCTCGTC的正向探针，和/或

序列为CATGGGCTCTGGCTTTCT的反向探针。

9.构建体，其特征在于，包含有权利要求1所述的核酸或权利要求4所述的基因突变。

10.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受体细胞或表达权利要求3所述多肽而得。

11.用于制备防治高胆固醇血症药物的重组蛋白，其特征在于，由权利要求10所述的重组细胞表达。

12.用于制备防治高胆固醇血症药物的质粒的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

(A)以野生型LDLR基因为模版，扩增得突变LDLR cDNA片段；

(E)从质粒菌液中提取质粒。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，

14.抑制剂在防治家族性高胆固醇血症药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂至少对下述中任一具有抑制作用：

a.LDLR基因的c.2517-2518insCA突变，

b.LDLR基因多肽的p.C839fs突变。