CN113092749B - 一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法。通过在微孔板中包被杀螟硫磷包被原，以杀螟硫磷纳米抗体融合碱性磷酸酶(Nb‑ALP)识别及信号放大元件，样品中杀螟硫磷与板上包被原竞争结合Nb‑ALP，随后洗去多余的药物和抗体，连接在微孔板的Nb‑ALP催化随后加入的L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐(AAP)水解生成抗坏血酸(AA)；随后再向其中加入邻苯二胺(OPD)，壳聚糖修饰的铂纳米颗粒(Ch‑Pt NPs)，AA与OPD竞争性地被具有类氧化特性的Ch‑Pt NPs催化氧化。其中，OPD被氧化为荧光物质2,3‑二氨基酚(DAP)，荧光发射峰为568nm；而氧化态AA与OPD反应生成喹喔啉衍生物(DFQ)，荧光发射峰为430nm；因此，样品中杀螟硫磷的含量更为灵敏地反映在430nm与568nm的荧光比值上，实现对杀螟硫磷农药高灵敏检测的目的。

Description

一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，更具体地，涉及了一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法。
背景技术
农药是指在农业上用于防治病虫及调节植物生长、除草等药剂。杀螟硫磷作为一种常见的有机磷农药，已在蔬菜水果种植中作为杀虫剂得到广泛应用。然而，由于杀螟硫磷的广泛使用和不当处理而造成的农药污染，已对环境和民众健康造成一定的负面影响。杀螟硫磷作为有机磷农药的一种，能够抑制生物体内乙酰胆碱酯酶活性，即使浓度比较低，也会抑制胆碱导致中枢神经传递受损，进一步损害人体健康；长期低浓度积累，也可能会造成致命后果。因此，正确管理和使用农药，准确评价农药污染是保障人体健康、保障食品质量安全的首要要求。传统的采用气相色谱、高效液相色谱、质谱等金标准方法对农产品中的农药残留虽然可以进行高精度测定痕量的农药残留，但是这些方法对仪器设备的要求高、耗时长，且需要比较专业的操作技巧，限制了其现场的应用，因此，开发出快速、简便、选择性检测杀螟硫磷的替代方法具有重要意义。
基于抗原抗体特异性结合反应的ELISA方法具有成本低、操作简便、特异性高、检测通量高等优点，在食品污染物快速筛查上备受关注。然而，传统基于比色测定的ELISA，由于灵敏度一般，在分析复杂基质中痕量物质时往往受到限制。目前，利用杀螟硫磷的免疫分析方法主要基于比色测定的传统ELISA方法。如：Liu等建立了一种基质固相分散体和ELISA方法，对杀螟硫磷IC50为120.7ng/mL(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for theDetermination of Five Organophosphorus Pesticides in Camellia Oil,Liu etal.Journal of Food Protection,2014,77(7):1178-1183)；Li等基于制备的有机磷农药单克隆抗体建立的ELISA，其中杀螟硫磷IC50为164.84ng/mL(Immunochemical andmolecular characteristics of monoclonal antibodies against organophosphoruspesticides and effect of hapten structures on immunoassay selectivity,Li etal.Food and Agricultural Immunology,2015,26(1):109-119)；然而在国标(GB2763-2019)中，杀螟硫磷食品中的最大残留限量低至50ng/mL，考虑到样品基质效应带来的干扰，现有的杀螟硫磷ELISA方法的灵敏度不能达到检测要求。因此，如何开发更高灵敏度的免疫检测方法是有关学者一直致力研究的问题。
目前为止，有关的免疫检测方法增敏的策略报道很多。其中一种策略是，引入新的信号输出体系，将抗原抗体间分子识别活动转化为更灵敏的信号被检出。例如已经建立的荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学免疫分析技术等。由于其高灵敏度、简便性，荧光免疫分析技术作为传统基于比色测定的ELISA的重要补充，具有广阔应用前景。然而，当前大部分荧光免疫分析方法一样是基于单一荧光强度的测定“turn-off”或“turn-on”，荧光信号易受外部环境因素的影响，导致信噪比低、精密度低。而且目前尚未有关于杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法报道。
发明内容
为了弥补已有技术空白，本发明提供一种检测杀螟硫磷荧光比率型免疫分析方法。通过在微孔板中包被杀螟硫磷包被原，杀螟硫磷纳米抗体融合ALP(碱性磷酸酶)，应用抗原抗体的特异性结合反应，构建竞争反应模式，随后洗去多余的药物和抗体，连接在微孔板的ALP与随后加入的AAP(L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐)反应生成AA(抗坏血酸)，AA再与随后加入的Ch-Pt NPs(壳聚糖修饰的铂纳米颗粒)和OPD(邻苯二胺)反应。其中，AA、Ch-PtNPs和OPD反应生成DFQ，荧光发射峰为430nm；Ch-Pt NPs和OPD反应生成DAP，荧光发射峰为568nm。因此，由于药物浓度不同，可竞争反应使后续酶催化产生的AA浓度不同，最终产生DFQ和DAP含量不同，最后计算430nm和568nm荧光强度比值，可实现对杀螟硫磷农药检测的目的。本方法具有方便、操作简单、灵敏度高(IC50可低至0.554ng/mL)优势，可用于杀螟硫磷快速检测，应用前景广阔。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法，其包括以下步骤：
S1.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将壳聚糖先溶解于醋酸缓冲液中，在搅拌条件下，往壳聚糖溶液中滴加H2PtCl6溶液，混合后室温搅拌一定时间，随后加入新制的NaBH4溶液，继续室温搅拌，获得Ch-Pt NPs，储存备用；
S2.微孔板的包被：将杀螟硫磷包被原加入微孔板中，温育一段时间，随后洗去包被液；将板拍干，加入一定体积封闭液，温育一段时间后，将板拍干，于烘箱中烘干，储存备用；
S3.标准曲线的建立：将不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与抗体同时加入步骤S2得到的微孔板中，温育一定时间后，洗板，加入AAP溶液温育，随后加入步骤S1制备的Ch-PtNPs和OPD溶液，温育，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I430/I568和(I430/I568)/(I430/I568)0，其中，(I430/I568)0指杀螟硫磷浓度为0时的荧光强度峰比值，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
S4.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S3的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入所述步骤S3得到的标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S1中HAc和水的体积比为0.01～0.02：1。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S1中壳聚糖和HAc溶液质量体积比为0.001～0.005：1。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S1中H2PtCl6溶液浓度为1～10mM，H2PtCl6与壳聚糖溶液体积比为0.01～0.04：1，搅拌时间20～60min。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S1中NaBH4浓度0.1～0.5M，加入体积比为0.02～0.05：1，搅拌时间为60～120min。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S2中杀螟硫磷包被原体积100μL，温育6～8h。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S2中封闭液需100～200μL，封闭1～3h。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S3中纳米抗体的浓度为0.1～0.4μg L-1，时间为30～40min。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S3中AAP浓度为1～5mM，时间为30～40min。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤S3中Ch-Pt NPs浓度为1～5mM，OPD浓度为1～5mM；加入Ch-Pt NPs和OPD后，反应时间为10～20min。
作为本发明提供的所述的检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法的一种优选实施方式，该分析方法具体包括以下步骤：
步骤S11.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将0.1g壳聚糖溶于50mL 1％HAc溶液中，从中吸取47mL壳聚糖溶液于烧杯中，在搅拌条件下往溶液中滴加2mL浓度为10mM的H2PtCl6，室温搅拌30min。加入新制1mL浓度为0.2M的NaBH4溶液，室温搅拌90min，即可得到Ch-Pt NPs；
步骤S12.微孔板的包被：吸取100μL杀螟硫磷包被原于微孔板中，放入37℃温育箱中包被8h，取出洗涤干净包被液；加入封闭液120μL封闭3h，甩干封闭液，放入37℃中烘干；
步骤S13.标准曲线的建立：将50μL不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与50μL抗体溶液加入微孔板中混合，温育40min后，洗液洗板；每孔加入2mM的AAP溶液100μL，温育40min；加入2.5μM Ch-Pt NPs溶液50μL和4mM OPD溶液50μL，温育20min，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值(I430/I568)/(I430/I568)0，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S14.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S13的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
通过在微孔板中包被杀螟硫磷包被原，杀螟硫磷纳米抗体融合ALP，应用抗原抗体的特异性结合反应，构建竞争反应模式，随后洗去多余的药物和抗体，连接在微孔板的ALP与随后加入的AAP反应生成AA，AA再与随后加入的Ch-Pt NPs和OPD反应。其中，AA、Ch-PtNPs和OPD反应生成DFQ，荧光发射峰为430nm；Ch-Pt NPs和OPD反应生成DAP，荧光发射峰为568nm。因此，由于药物浓度不同，可竞争反应使后续酶催化产生的AA浓度不同，最终产生DFQ和DAP含量不同，最后计算430nm和568nm荧光强度比值，可实现对杀螟硫磷农药检测的目的。
通过测定在同一激发波长下两个发射强度比值变化的比率荧光分析方法，由于两个发射峰强度受到的外界的干扰是一样的，两者的比值一定程度上抵消了外界干扰因素，具有自带内标效应，因此具有更高精密度、信噪比及灵敏度。该方法对杀螟硫磷检测限下达0.087ng/mL，显著低于现有检测方法，可用于杀螟硫磷快速检测，应用前景广阔。同时，该方法具有更好的干扰能力，基于碱性磷酸酶(蛋白酶)与(Ch-Pt NPs)(纳米酶)级联催化反应介导信号输出体系，无需采用易分解的H2O2具有更好的稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例1步骤S1制备的壳聚糖修饰铂纳米颗粒的透射电镜图；
图2是本发明实施例1步骤S1制备的壳聚糖修饰铂纳米颗粒的X射线衍射图。
图3是基于铂纳米颗粒催化反应的荧光比率型免疫分析方法的原理示意图。
图4是本发明实施例1步骤S3检测杀螟硫磷标准曲线。
具体实施方式
如背景技术所述的，当前大部分荧光免疫分析方法一样是基于单一荧光强度的测定“turn-off”或“turn-on”，荧光信号易受外部环境因素的影响，导致信噪比低、精密度低。而通过测定在同一激发波长下两个发射强度比值变化的比率型荧光分析方法，由于两个发射峰强度受到的外界的干扰是一样的，两者的比值一定程度上抵消了外界干扰因素，具有自带内标效应，因此该方法具有更高精密度、信噪比及灵敏度。
发明人前期将基于辣根过氧化物酶(HRP)ELISA平台与比率荧光分析技术结合构建了高灵敏检测氨基甲酸乙酯的荧光比率型免疫分析方法。该方法利用HRP在H2O2条件下可催化氧化邻苯二胺(OPD)催化氧化产生既有颜色(橘黄色：最大吸收波长～450nm)又发荧光的2,3-二氨基吩嗪(DAP)(Ex：430nm；Em：570nm)，DAP可以淬灭与其发射峰分离度很好的荧光硅纳米颗粒(Si QDs)(Ex：350nm；Em：440nm)的荧光，从而使抗原-抗体识别事件更为灵敏反映在DAP与Si QDs的发射峰强度比值(I570/I440)的变化上。但是，该比率荧光分析方法的信号输出体系需要用到易分解不稳定的H2O2，一定程度限制其应用推广。为了具有更好的抗干扰能力及稳定性，本发明人提出基于蛋白酶-纳米酶级联催化介导高灵敏比率荧光信号作为免疫反应的信号输出，构建抗干扰强、高灵敏的荧光比率型免疫分析方法用于杀螟硫磷的检测。具体地，如图3所示，本发明通过在微孔板中包被杀螟硫磷包被原，以杀螟硫磷纳米抗体融合碱性磷酸酶(Nb-ALP)识别及信号放大元件，样品中杀螟硫磷与板上包被原竞争结合Nb-ALP，随后洗去多余的药物和抗体，连接在微孔板的Nb-ALP催化随后加入的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(AAP)水解生成抗坏血酸(AA)；随后再向其中加入邻苯二胺(OPD)，壳聚糖修饰的铂纳米颗粒(Ch-Pt NPs)(纳米酶)，AA与OPD竞争性地被具有类氧化特性的Ch-PtNPs催化氧化。其中，OPD被氧化为荧光物质2,3-二氨基酚(DAP)，荧光发射峰为568nm；而氧化态AA与OPD反应生成喹喔啉衍生物(DFQ)，荧光发射峰为430nm；因此，样品中杀螟硫磷的含量更为灵敏地反映在430nm与568nm的荧光比值上，实现对杀螟硫磷农药高灵敏检测的目的。本发明具有灵敏度高，对杀螟硫磷检测限达0.087ng/mL，显著低杀螟硫磷残留限量标准与现有ELISA检测杀螟硫磷的方法，同时，该方法具有更好的干扰能力，基于碱性磷酸酶(蛋白酶)与(Ch-Pt NPs)(纳米酶)级联催化反应介导信号输出体系，无需采用易分解的H2O2进而具有更好的稳定性。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明阐述，但实施例只用于解释本发明，并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
其中，本发明中涉及到的单位“M”表示物质的量浓度，还可以表示为mol/L，常见的有nM(nmol/L)、μM(μmol/L)、mM(mmol/L)。
实施例1
本实施例提供了一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S11.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将0.1g壳聚糖溶于50mL 1％HAc溶液中，从中吸取47mL壳聚糖溶液于烧杯中，在搅拌条件下往溶液中滴加2mL浓度为10mM的H2PtCl6，室温搅拌30min。加入新制1mL浓度为0.2M的NaBH4溶液，室温搅拌90min，即可得到Ch-Pt NPs。
从图1、2可看出，所制备的壳聚糖铂纳米颗粒为粒径约为5nm左右的圆形颗粒，成功合成壳聚糖修饰的铂纳米颗粒。
步骤S12.微孔板的包被：吸取100μL杀螟硫磷包被原于微孔板中，放入37℃温育箱中包被8h，取出洗涤干净包被液；加入封闭液120μL封闭3h，甩干封闭液，放入37℃中烘干。
步骤S13.标准曲线的建立：将50μL不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与50μL抗体溶液加入微孔板中混合，温育40min后，洗液洗板；每孔加入2mM的AAP溶液100μL，温育40min；加入2.5μM Ch-Pt NPs溶液50μL和4mM OPD溶液50μL，温育20min，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值(I430/I568)/(I430/I568)0，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
如图4所示，随着杀螟硫磷浓度的增加，抗体与药物竞争，连接到微孔板上的抗体-碱性磷酸酶量减少，催化产生的AA含量减少，加入Ch-Pt NPs和OPD反应后，产生的DFQ减少，DAP增多，具体表现为I430/I568值降低，(I430/I568)/(I430/I568)0与杀螟硫磷浓度呈倒S型曲线，对杀螟硫磷检测限达0.087ng/mL，显著低于现有技术中检测杀螟硫磷的方法。
步骤S14.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S13的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度。
对生菜样品的实际检测：取按3.2ng/mL、8ng/mL、24ng/mL水平添加的生菜样品，按照GB23200.113 QuEChERS方法进行前处理，将处理液体稀释16倍后，按照步骤S13对其杀螟硫磷浓度进行测定。按公式：回收率(％)＝(添加后测定值-空白值/添加量×100％计算回收率。结果如表1所示，本次添加回收率在93.8～108.5之间，变异系数低于12.7％，说明该方法测定杀螟硫磷具有很好的准确性及稳定性。
杀螟硫磷添加量(ng/mL) 回收量(ng/mL) 回收率 变异系数
3.2 3.4 107.5％ 12.7％
8 7.5 93.8％ 10.3％
24 26.0 108.5％ 5.9％
实施例2
本实施例提供了一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S21.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将0.2g壳聚糖溶于50mL 1％HAc溶液中，从中吸取47mL壳聚糖溶液于烧杯中，在搅拌条件下往溶液中滴加2mL浓度为5mM的H2PtCl6，室温搅拌50min。加入新制1mL浓度为0.1M的NaBH4溶液，室温搅拌120min，即可得到Ch-Pt NPs。
步骤S22.微孔板的包被：吸取100μL杀螟硫磷包被原于微孔板中，放入37℃温育箱中包被10h，取出洗涤干净包被液；加入封闭液120μL封闭2h，甩干封闭液，放入37℃中烘干。
步骤S23.标准曲线的建立：将50μL不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与50μL抗体溶液加入微孔板中混合，温育30min后，洗液洗板；每孔加入4mM的AAP溶液100μL，温育30min；加入4μM Ch-Pt NPs溶液50μL和6mM OPD溶液50μL，温育20min，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值(I430/I568)/(I430/I568)0，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S24.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S23的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度。
实施例3
本实施例提供了一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S31.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将0.5g壳聚糖溶于50mL 2％HAc溶液中，从中吸取47mL壳聚糖溶液于烧杯中，在搅拌条件下往溶液中滴加4mL浓度为20mM的H2PtCl6，室温搅拌60min。加入新制2mL浓度为0.5M的NaBH4溶液，室温搅拌120min，即可得到Ch-Pt NPs。
步骤S32.微孔板的包被：吸取100μL杀螟硫磷包被原于微孔板中，放入37℃温育箱中包被12h，取出洗涤干净包被液；加入封闭液120μL封闭1h，甩干封闭液，放入37℃中烘干。
步骤S33.标准曲线的建立：将50μL不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与50μL抗体溶液加入微孔板中混合，温育40min后，洗液洗板；每孔加入5mM的AAP溶液100μL，温育40min；加入5μM Ch-Pt NPs溶液50μL和10mM OPD溶液50μL，温育20min，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值(I430/I568)/(I430/I568)0，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S34.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S33的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.壳聚糖修饰的铂纳米颗粒的合成：将壳聚糖先溶解于醋酸缓冲液中，在搅拌条件下，往壳聚糖溶液中滴加H2PtCl6溶液，混合后室温搅拌一定时间，随后加入新制的NaBH4溶液，继续室温搅拌，获得Ch-Pt NPs，储存备用；
S2.微孔板的包被：将杀螟硫磷包被原加入微孔板中，温育一段时间，随后洗去包被液；将板拍干，加入一定体积封闭液，温育一段时间后，将板拍干，于烘箱中烘干，储存备用；
S3.标准曲线的建立：将不同浓度的杀螟硫磷标准溶液与抗体同时加入步骤S2得到的微孔板中，温育一定时间后，洗板，加入AAP溶液温育，随后加入步骤S1制备的Ch-Pt NPs和OPD溶液，温育，测定在360nm激发下，记录400～650nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I430/I568和(I430/I568)/(I430/I568)0，其中，(I430/I568)0指杀螟硫磷浓度为0时的荧光强度峰比值，以杀螟硫磷浓度为横坐标，(I430/I568)/(I430/I568)0为纵坐标绘制标准曲线；
S4.样品中杀螟硫磷浓度的测定：将等体积处理好的样品替代杀螟硫磷标准品溶液，按照步骤S3的步骤操作，将测到的(I430/I568)/(I430/I568)0代入所述步骤S3得到的标准曲线，以得到样品中杀螟硫磷浓度；
所述步骤S1中HAc和水的体积比为0.01～0.02：1；
所述步骤S1中壳聚糖和HAc溶液质量体积比为0.001～0.005：1；
所述步骤S1中H2PtCl6溶液浓度为1～10mM，H2PtCl6与壳聚糖溶液体积比为0.01～0.04：1，搅拌时间20～60min；
所述步骤S1中NaBH4浓度0.1～0.5M，加入体积比为0.02～0.05：1，搅拌时间为60～120min；
所述步骤S2中杀螟硫磷包被原体积100μL，温育6～8h；
所述步骤S2中封闭液需100～200μL，封闭1～3h；
所述步骤S3中纳米抗体的浓度为0.1～0.4μg L-1，时间为30～40min；
所述步骤S3中AAP浓度为1～5mM，时间为30～40min；
所述步骤S3中Ch-Pt NPs浓度为1～5mM，OPD浓度为1～5mM；加入Ch-Pt NPs和OPD后，反应时间为10～20min。
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