CN113087762B - 一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，包括松茸蛋白粉的提取和水解松茸蛋白粉，所述松茸蛋白粉的提取是将松茸子实体预处理后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，进行超声提取，最后调节pH至8.7~9.2，在72~76℃下进行碱提取1.3~1.6h，离心取上清液进行盐析，再进行透析和冷冻干燥。本发明在pH为9.5下超声，然后进行碱提的复合提取蛋白方式提取的松茸蛋白的提取率为8.34%，松茸蛋白粉制备抗氧化水解肽的水解度达到85.8%。本发明制备的抗氧化水解肽对DPPH自由基的清除率的IC50为0.38mg/mL；对ABTS自由基的清除率的IC50为64.6μg/mL；对羟基自由基的清除率的IC50为60.4μg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及抗氧化肽制备技术领域，具体涉及一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法。
背景技术
食品在贮存过程中产生的自由基主要通过氧化脂类、蛋白质类物质从而导致食品的风味、香气、质地、颜色等品质的恶化。细胞内，自由基通过氧化修饰DNA、蛋白质、脂质等分子从而引发人类的癌症、动脉硬化和衰老等相关疾病。抗氧化剂是一种化合物，可通过延缓脂质过氧化过程来延长保质期，同时可以预防自由基引起的相关疾病的发生。人造抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚（BHA）、丁基羟基甲苯（BHT）等对几种氧化系统表现出很强的抗氧化活性，但它们会带来潜在的健康风险，因此使用受到严格管制。所以，从天然物质中寻找和开发抗氧化剂以取代食品和药材中使用的合成抗氧化剂十分必要。
松茸（Tricholoma matsutake）是一种与松科植物共生的菌根真菌，其子实体具有十分重要的商业价值，不仅因其具有独特的美味，而且还因其具有降低胆固醇、抗氧化和免疫调节活性等多种生物学活性。但是，松茸蛋白酶解肽是否具有抗氧化潜能尚未见报道。
现有技术中在蛋白提取过程中，采用了多种手段复合进行提取，比如：超声辅助酶解提取、超声辅助碱提取、酶解法与碱提法复合提取、酶解法与超声辅助碱提法复合提取等方法，但是不同原料体系中的蛋白结构、性质差异很大，其适用的提取方法也不同，且不同的提取方法，在同一体系中提取的蛋白中氨基酸组成、流变性质、热变性温度及微观结构等产生不同，导致其最终蛋白质性能、发挥的效果也不同。目前研究中存在的问题是，松茸子实体蛋白提取困难，提取过程中容易发生变性，导致蛋白提取率较低，提取的蛋白质制得的水解肽的抗氧化性能不高。
发明内容
基于目前存在的技术问题，本发明目的在于提供一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，显著提高蛋白提取率，提取的蛋白制备的蛋白酶水解肽具有优异的抗氧化性。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，包括松茸蛋白粉的提取和水解松茸蛋白粉，其特征在于：所述松茸蛋白粉的提取是将松茸子实体预处理后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，进行超声提取，最后调节pH至8.7~9.2，在72~76℃下进行碱提取1.3~1.6h，离心取上清液进行盐析，再进行透析和冷冻干燥。
本发明采用在碱性环境下进行超声处理，裂解细胞壁的同时，促进了细胞颗粒薄膜的破裂和溶解，有利于蛋白质的溶出， 同时改变了蛋白质的带电状况，从而改变了蛋白质和蛋白质之间、蛋白质和溶液之间的相互作用，之后停止超声，将pH调节至8.7~9.2，并提高温度至72~76℃，进行单一碱提，进一步破坏细胞壁结构，并促进较短时间内碱和蛋白质实现正负电荷的结合，从而提高对蛋白的溶解，该方法有效防止蛋白质在提取过程中发生变性，提高了松茸蛋白的提取率，调控了提取的蛋白质的结构、性能和稳定性，使其水解生成的水解肽具有优异的抗氧化性。
优选的，上述调节pH具体是采用氢氧化钠调节pH至9，在74℃下进行碱提1.5h。
进一步，上述超声是在功率为200~250W下进行超声处理15~20min。
进一步，上述盐析具体是在所述上清液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析12~24h，盐析后的溶液得沉淀物，所述透析是用PBS磷酸盐缓冲液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液，将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中进行透析除盐，4℃下静置24h，收集透析袋中溶液即为松茸蛋白溶液。
进一步，上述水解松茸蛋白，具体是将所述松茸蛋白粉溶解在缓冲液中形成溶液，依次经过碱性蛋白酶和风味蛋白酶的酶解后离心、取上清液冷冻干燥，其中碱性蛋白酶的添加量为松茸蛋白粉质量的2%，酶解环境是pH为9.5，温度为50℃，酶解2h，风味蛋白酶的添加量为松茸蛋白粉质量的2%，酶解环境的pH为7，酶解温度为50℃，酶解时间为2h。
最具体的，一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：
步骤一、松茸蛋白的提取
（1）将松茸子实体在60℃下烘干，粉碎后过60目筛后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，进行超声，超声功率为200~250W，超声时间为15~20min，然后调节pH至8.7~9.2，在72~76℃下进行碱提取1.3~1.6h，得蛋白提取液；
（2）向蛋白提取液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析12~24h，盐析后的溶液在10000rpm下离心20min得沉淀物，用PBS磷酸盐溶液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液；
（3）将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中，在4℃下静置24h，收集透析袋中的溶液，将溶液进行冻干，得松茸蛋白粉；
步骤二、水解松茸蛋白
将步骤1制备的松茸蛋白粉溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，形成底物质量浓度为5%的溶液，调节溶液pH值为9.5，加入松茸蛋白粉质量2%的碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解2h，然后升温煮沸15min，调节溶液pH值至7，温度维持在50℃，加入松茸蛋白粉质量2%的风味蛋白酶，酶解2h，升温煮沸15min，在10000rpm下离心15min，取上清液冷冻干燥。
本发明具有如下技术效果：
本发明通过pH为9.5时进行超声，然后进行碱提的复合提取蛋白方式提取的松茸蛋白粉提取率为8.34%，松茸蛋白粉制备的抗氧化水解肽的水解度达到85.8%，且整个碱提时间缩短，降低了碱对蛋白的破坏。本发明制备的抗氧化水解肽对DPPH自由基清除率的IC50为0.38mg/mL；对ABTS自由基清除率的IC50为64.6μg/mL；对羟基自由基清除率的IC50为60.4μg/mL，具有优异的抗氧化能力，浓度为0.1mg/mL的松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的铁螯合率达到96.4%，在浓度均为10mg/mL，总还原力分别为87.5%。
附图说明
图1：单一超声法和超声辅助常温碱提法时间对松茸蛋白提取率的影响。
图2：单一碱提法各因素对松茸蛋白的提取率的影响。
图3：松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽对DPPH自由基的清除率曲线图。
图4：松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽对ABTS自由基的清除率曲线图。
图5：松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽对羟基自由基的清除率曲线图。
图6：松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽总还原能力测定曲线图。
图7：松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽螯合铁能力测试曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，本发明实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，只是对于本发明技术方案的进一步说明，在不脱离本发明原理前提下，本领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，按如下步骤进行：
1、松茸蛋白的提取
（1）将松茸子实体在60℃下烘干，粉碎后过60目筛后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，采用220W功率进行超声提取15min，然后调节pH至8.7，室温76℃下进行碱提取1.3h得蛋白提取液；
（2）向蛋白提取液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析18h，盐析后的溶液在10000rpm下离心20min得沉淀物，用PBS磷酸盐溶液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液；
（3）将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中，在4℃下静置24h，收集透析袋中的溶液，将溶液进行冻干，得松茸蛋白粉；
2、水解松茸蛋白
将步骤1制备的松茸蛋白粉溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，形成底物质量浓度为5%的溶液，调节溶液pH值为9.5，加入松茸蛋白粉质量2%的碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解2h，然后升温煮沸15min，调节溶液pH值至7，温度维持在50℃，加入松茸蛋白粉质量2%的风味蛋白酶，酶解2h，升温煮沸15min，在10000rpm下离心15min，取上清液冷冻干燥得水解肽粉。
实施例2
一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，按如下步骤进行：
1、松茸蛋白的提取
（1）将松茸子实体在60℃下烘干，粉碎后过60目筛后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，采用200W功率进行超声提取20min，然后调节pH至9.2，在72℃下进行碱提取1.3h得蛋白提取液；
（2）向蛋白提取液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析24h，盐析后的溶液在10000rpm下离心20min得沉淀物，用PBS磷酸盐溶液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液；
（3）将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中，在4℃下静置24h，收集透析袋中的溶液，将溶液进行冻干，得松茸蛋白粉；
2、水解松茸蛋白
将步骤1制备的松茸蛋白粉溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，形成底物质量浓度为5%的溶液，调节溶液pH值为9.5，加入松茸蛋白粉质量2%的碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解2h，然后升温煮沸15min，调节溶液pH值至7，温度维持在50℃，加入松茸蛋白粉质量2%的风味蛋白酶，酶解2h，升温煮沸15min，在10000rpm下离心15min，取上清液冷冻干燥得水解肽粉。
实施例3
一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，按如下步骤进行：
1、松茸蛋白的提取
（1）将松茸子实体在60℃下烘干，粉碎后过60目筛后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，采用250W功率进行超声提取20min，然后调节pH至9，在74℃下进行碱提取1.5h得蛋白提取液；
（2）向蛋白提取液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析12~24h，盐析后的溶液在10000rpm下离心20min得沉淀物，用PBS磷酸盐溶液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液；
（3）将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中，在4℃下静置24h，收集透析袋中的溶液，将溶液进行冻干，得松茸蛋白粉；
2、水解松茸蛋白
将步骤1制备的松茸蛋白粉溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，形成底物质量浓度为5%的溶液，调节溶液pH值为9.5，加入松茸蛋白粉质量2%的碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解2h，然后升温煮沸15min，调节溶液pH值至7，温度维持在50℃，加入松茸蛋白粉质量2%的风味蛋白酶，酶解2h，升温煮沸15min，在10000rpm下离心15min，取上清液冷冻干燥，得水解肽粉。
我们通过进行响应面试验，并使用Design-Expert 8.0.6软件分析响应面实验的结果来预测提取松茸蘑菇蛋白在最佳工艺参数下最优提取率为8.39%，经多次重复实验验证，本实施例制备的对于松茸蛋白的实际提取率为8.34%，误差极小。
对比例1：
常温下超声辅助碱提提取松茸蛋白：
与实施例3不同的是，超声后的持续碱提是在常温下进行。
对比例1中，在pH为9.5的碱性环境下进行超声，蛋白粉的提取率为5.6%，超声后常温下持续碱提，蛋白的提取率为6.5%，如图1所示。
对比例2
单一碱提法提取松茸蛋白：
与实施例3不同的是，将松茸子实体与水混合后，调节混合液的pH至9.5，提取温度为75℃，提取2.5h，此时具有最高提取率为4.9%，若继续延长提取时间，提取率呈下降趋势，各参数对于提取率的影响如图2所示。
可见，对于松茸子实体的蛋白提取过程中，单独的碱提法和单独超声法对于松茸蛋白的提取率均很低，分别为4.9%和5.6%，超声辅助常温碱提提取率为6.5%，本发明超声辅助高温碱提法的提取对于松茸蛋白提取作用较好，提取率达到8.34%。发明人也尝试采用酶解法与碱提法复合、超声辅助酶解，甚至酶解与超声辅助碱提结合，蛋白质提取率极低，均不到本发明的0.35倍，且提取的蛋白质抗氧化性能极差，无法实现高效抗氧化应用。
实施例4
松茸蛋白源性抗氧化水解肽的抗氧化测试：
称取松茸肽水解肽粉，溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，配制不同浓度的溶液。以还原型谷胱甘肽（GSH）为阳性对照，研究松茸水解肽对自由基的清除能力，以表征其抗氧化能力。
（1）松茸水解肽和GSH对DPPH自由基清除能力
如图3所示，当浓度小于2.5mg/mL，二者清除率均随浓度的增大上升明显。在此浓度时，清除率分别为63.2%和83.9%，此时，松茸水解肽对DPPH自由基的清除率为GSH的75.3%。在浓度高于2.5mg/mL后，随浓度上升，清除率呈缓慢上升趋势，松茸水解肽和GSH在浓度为10mg/mL时，对DPPH自由基清除率分别为74.5%和87.0%，此时，松茸水解肽对DPPH自由基的清除率为GSH的85.6%，将对比例1提取的松茸蛋白粉以实施例1相同的方法制备水解肽在浓度为10mg/mL时，其对DPPH自由基清除率为47.6%。采用GraphPad Prism 9软件计算松茸水解肽和GSH对DPPH自由基清除率的IC50，分别为0.38mg/mL和0.55mg/mL。
（2）松茸水解肽和GSH对ABTS自由基清除能力
如图4所示，当浓度小于0.5mg/mL，二者清除率均随浓度的增大上升明显。在此浓度时，清除率分别为80.0%和91.6%，此时，松茸水解肽对ABTS自由基的清除率为GSH的87.3%，超过该浓度后，随浓度上升，清除率变化较弱。松茸水解肽和GSH在浓度为10mg/mL时，对ABTS自由基清除率分别为84.3%和92.1%，此时，松茸水解肽对ABTS自由的清除率为GSH的91.5%，将对比例1提取的松茸蛋白粉以实施例1相同的方法制备水解肽在浓度为10mg/mL时，其对ABTS自由基清除率为59.1%。采用GraphPad Prism 9软件计算松茸水解肽和GSH对ABTS自由基清除率的IC50，分别为64.6μg/mL和47.0μg/mL。
（3）松茸水解肽和GSH对羟基自由基清除能力
如图5所示，当浓度小于0.5mg/mL时，二者清除率分别随浓度的增大上升明显。在此浓度时，清除率分别为87.0%和96.7%，此时，松茸水解肽对羟基自由基的清除率为GSH的90.0%。超过该浓度后，随浓度上升，清除率呈缓慢上升趋势，松茸水解肽和GSH在浓度均为10mg/mL时，对羟基自由基清除率分别为92.4%和98.9%，此时，松茸水解肽对ABTS自由的清除率为GSH的93.4%，将对比例1提取的松茸蛋白粉以实施例1相同的方法制备水解肽在浓度为10mg/mL时，其对羟基自由基清除率为67.3%。采用GraphPad Prism 9软件计算松茸水解肽和GSH对羟基自由基清除率的IC50，分别为60.4μg/mL和40.0μg/mL。
（4）松茸水解肽总还原力的测定
采用铁氰化钾法测定松茸水解肽总还原力，以表征其抗氧化性。结果如图6所示：当浓度小于2.5mg/mL时，松茸水解肽和GSH的总还原力均随浓度增大而明显上升，分别为86.8%和96.3%，此时，松茸水解肽总还原力为GSH的90.1%。超过该浓度后，随浓度的上升，清除率变化不明显，松茸水解肽和GSH总还原力最强的浓度均为10mg/mL，总还原力分别为87.5%和97.0%，此时，松茸水解肽总还原力为GSH的90.2%。上述结果表明：松茸水解肽具有较高的总还原力，并呈现剂量依赖，说明其可能通过较好的还原力而表现出较强的抗氧化性。
（5）松茸水解肽对铁的螯合能力的测定
如图7所示，松茸水解肽铁螯合能力很强，当浓度为0.1mg/mL时，铁螯合能力可达96.4%。当浓度为10mg/mL时，铁螯合能力最大，为99.8%。上述结果表明：松茸水解肽具有很好的铁螯合能力，说明其可能通过此途径表现较强的抗氧化能力。
Claims (3)
1.一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，包括松茸蛋白粉的提取和水解松茸蛋白粉，其特征在于：所述松茸蛋白粉的提取是将松茸子实体预处理后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，进行超声提取，最后调节pH至8.7~9.2，在72~76℃下进行碱提取1.3~1.6h，离心取上清液进行盐析，再进行透析和冷冻干燥，所述超声是在功率为200~250W下进行超声处理15~20min，所述水解松茸蛋白粉，具体是将所述松茸蛋白粉溶解在缓冲液中形成溶液，依次经过碱性蛋白酶和风味蛋白酶的酶解后离心、取上清液冷冻干燥，其中碱性蛋白酶的添加量为松茸蛋白粉质量的2%，酶解环境是pH为9.5，温度为50℃，酶解2h，风味蛋白酶的添加量为松茸蛋白粉质量的2%，酶解环境的pH为7，酶解温度为50℃，酶解时间为2h。
2.如权利要求1所述的一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，其特征在于：所述盐析是在所述上清液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析12~24h，盐析后的溶液得沉淀物，所述透析是用PBS磷酸盐缓冲液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液，将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中进行透析除盐，4℃下静置24h，收集透析袋中溶液即为松茸蛋白溶液。
3. 一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：
步骤一、松茸蛋白的提取
（1）将松茸子实体在60℃下烘干，粉碎后过60目筛后，溶解在pH为9.5的碱溶液中，进行超声，超声功率为200~250W，超声时间为15~20min，最后调节pH至8.7~9.2，在72~76℃下进行碱提取1.3~1.6h，得蛋白提取液；
（2）向蛋白提取液中加入饱和度为90%的硫酸铵，在4℃下静置盐析12~24h，盐析后的溶液在10000rpm下离心20min得沉淀物，用PBS磷酸盐溶液溶解沉淀物，得松茸粗蛋白溶液；
（3）将松茸粗蛋白溶液在10kDa透析袋中，在4℃下静置24h，收集透析袋中的溶液，将溶液进行冻干，得松茸蛋白粉；
步骤二、水解松茸蛋白
将步骤1制备的松茸蛋白粉溶解在PBS磷酸盐缓冲溶液中，形成底物质量浓度为5%的溶液，调节溶液pH值为9.5，加入松茸蛋白粉质量2%的碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解2h，然后升温煮沸15min，调节溶液pH值至7，温度维持在50℃，加入松茸蛋白粉质量2%的风味蛋白酶，酶解2h，升温煮沸15min，在10000rpm下离心15min，取上清液冷冻干燥。
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