CN113069450B - Fto抑制剂在制备抗氧化产品中的应用 - Google Patents

Fto抑制剂在制备抗氧化产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了FTO抑制剂在制备抗氧化产品中的应用。FTO抑制剂能够提高紫外氧化损伤细胞的超氧化物歧化酶含量和活性，促进细胞产生内源性高酶活性的超氧化物歧化酶，较外源性给予超氧化物歧化酶更具有稳定性和有效性，同时避免了潜在的毒副作用。FTO抑制剂还能够下调细胞内活性氧簇水平与I‑collagen蛋白含量，具有良好的抗氧化作用，其在制备抗氧化产品中具有广阔的应用前景。

Description

FTO抑制剂在制备抗氧化产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及FTO抑制剂在制备抗氧化产品中的应用。
背景技术
皮肤长期暴露于紫外线(ultraviolet，UV)中可产生活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)，包括氧自由基、超氧化物等。自由基是指外层轨道含有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子，自由基中又以氧自由基(例如超氧阴离子自由基O2-)对机体危害最大。氧自由基的化学性质比较活泼，可与任何细胞成分发生反应，对细胞造成严重的破坏，这被称为氧化损伤。因此皮肤长期暴露于紫外线中产生的氧自由基可间接损伤细胞DNA、脂质、蛋白质，并依次激活信号通路抑制胶原生成，而导致皮肤过早老化，临床表现为皱纹、纹理粗糙、皮肤松弛、雀斑、毛细血管扩张、色素斑等，并且与皮肤癌的发生有密切关系(Kim H N,Gil C H,Kim Y R,et al.Anti-photoaging properties of thephosphodiesterase 3inhibitor cilostazol in ultraviolet B-irrdiated hairlessmice[J].Rep,2016.6.31169)。
超氧化物歧化酶(SOD)是机体抗氧化酶系统的一个重要成员，能催化超氧阴离子自由基O2-歧化反应生成氧气和过氧化氢，催化机体氧化与抗氧化系统的平衡，在防辐射、防衰老、抗肿瘤等方面均有明显效果。SOD的分子量高达32000D，是大分子物质，含30％极性氨基酸，分子排列十分紧密，因此具有较强的溶解性和渗透性，容易通过汗腺或皮脂腺开口透过表皮层到达真皮及真皮下发挥作用。但因为本身为大分子物质，可能成为潜在的抗原导致过敏性变态反应，且其半衰期很短，稳定性不高。实现外源性SOD的利用需要具备较高的工艺条件，减少其毒副作用，并保证其生物活性、有效性及稳定性。
RNA甲基化修饰约占RNA所有修饰的60％以上，而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，简称m6A)是mRNA最常见修饰，也是发现的第一个可逆的甲基化修饰，广泛参与细胞生命的各个过程(Zhao,B.S.,I.A,Roundtree and He,C.PublisherCorrection:Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications[J].NatRev Mol Cell Biol,2018.19(12):808)。FTO是第一个被发现的m6A去甲基化酶，可逆甲基化，从而影响基因的表达与下游蛋白的翻译(Ye Fu,Dan Dominissini,Gideon Rechavi,Chuan He,Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNAmethylation[J].Nature Reviews Genetics,2014,5(15):293-306)。目前已有研究表明，FTO不仅能够通过调节肝细胞中的m6A水平影响线粒体含量和脂肪代谢，而且能够通过不同方式参与调控多种肿瘤发生发展，如：影响肿瘤细胞生长和增殖，抑制细胞分化，干预肿瘤干细胞自我更新，影响肿瘤转移和放化疗敏感性等。然而，现有技术中几乎没有关于FTO抑制剂在抗氧化方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供FTO抑制剂在制备抗氧化产品中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本申请通过UVB照射人角质形成细胞Hacat与鼠成纤维细胞L929实验来测试FTO抑制剂FB23-2的抗氧化性能。首先利用CCK8法对不同浓度的FB23-2(4、6、7、8、9、10、15μmol/L)进行Hacat、L929细胞毒性实验；将这两种细胞分为3组：a.不加药，不照UVB组；b.不加药，给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2；c.给予FB23-2，浓度梯度分别为4、6、8、9、10、12、15μmol/L并给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2，应用流式细胞仪检测细胞内的ROS水平；应用Real-time Quantitative PCR法观察超氧化物歧化酶1(SOD1)mRNA、超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA的变化，以及通过Western Blot法检测SOD1、I型胶原(I-collagen)蛋白量。结果显示：FB23-2浓度小于10μmol/L时，对细胞基本无毒性；当FB23-2浓度为10μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平明显下调，显著低于其他药物浓度下细胞及未给药物细胞内ROS水平；给予浓度为10μmol/L的FB23-2干预后，Hacat细胞的SOD1 mRNA与SOD2 mRNA表达量、SOD1蛋白量与I-collagen蛋白量升高，L929细胞的SOD1 mRNA与SOD2 mRNA表达量以及I-collagen蛋白量升高。
为验证FTO抑制剂可促进细胞、组织表达SOD，我们又采用了另一种FTO抑制剂恩他卡朋进行实验。具体实验设计如下。
通过UVB照射人角质形成细胞Hacat与鼠成纤维细胞L929实验来测试FTO抑制剂恩他卡朋的抗氧化性能。将这两种细胞分为3组：a.不加药，不照UVB组；b.不加药，给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2；c.给予恩他卡朋，浓度梯度分别为0、2.5、3、3.5、4μmol/L并给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2。采用流式细胞仪检测UVB对各组细胞的氧化影响，结果显示当恩他卡朋浓度为3μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平明显下调，显著低于其他药物浓度下细胞及未给药物细胞内ROS水平。利用CCK8法检测浓度为3μmol/L的恩他卡朋时对Hacat与L929细胞毒性，结果显示该浓度下无毒性。利用Real-time Quantitative PCR法、Western Blot法观察给予恩他卡朋处理后Hacat与L929SOD1 mRNA、SOD2 mRNA变化，SOD1、I-collagen蛋白量变化。结果显示：给予浓度为3μmol/L的恩他卡朋干预后，Hacat细胞的SOD1 mRNA表达量升高，SOD1蛋白量与I-collagen蛋白量升高，L929细胞的SOD1 mRNA与SOD2 mRNA表达量以及I-collagen蛋白量升高。表明FTO抑制剂可以提高细胞内SOD的表达量，提高细胞抗氧化效果。
因此，本发明提供FTO抑制剂的以下新用途：
FTO抑制剂在抗氧化或在制备抗氧化产品中的应用。
FTO抑制剂在促进细胞或组织超氧化物歧化酶表达或在制备提高细胞或组织超氧化物歧化酶含量产品中的应用。
优选地，FTO抑制剂在制备提高细胞的超氧化物歧化酶活性产品中的应用。
优选地，FTO抑制剂在制备提高细胞的超氧化物歧化酶1蛋白含量产品中的应用。
优选地，FTO抑制剂在制备提高细胞或组织超氧化物歧化酶1mRNA和/或超氧化物歧化酶2mRNA含量产品中的应用。
FTO抑制剂在降低细胞或组织的活性氧水平或在制备降低细胞或组织的活性氧水平产品中的应用。
FTO抑制剂在提高细胞或组织的I型胶原蛋白含量或在制备提高细胞或组织的I型胶原蛋白含量产品中的应用。
优选地，所述产品为护肤品和/或保健品和/或药物。
优选地，所述FTO抑制剂为FB23-2或恩他卡朋。
优选地，所述细胞为L929和/或Hacat细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了FTO抑制剂在制备抗氧化产品中的应用，具体体现在：FTO抑制剂能够提高紫外氧化损伤的细胞的SOD含量和SOD酶活性，促进细胞产生内源性的高酶活性SOD，较外源性给予SOD更具有稳定性和有效性，同时避免了潜在的毒副作用。FTO抑制剂还能够下调细胞的氧化水平与I-collagen蛋白含量，具有良好的抗氧化作用，其在制备抗氧化产品中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度的FTO抑制剂FB23-2对Hacat(a)、L929(b)细胞毒性的影响。
图2为不同浓度的FTO抑制剂FB23-2对Hacat细胞的ROS水平的影响。
图3为不同浓度的FTO抑制剂FB23-2对L929细胞的ROS水平的影响。
图4为FTO抑制剂FB23-2对Hacat细胞的SOD1 mRNA和SOD2 mRNA的影响。
图5为FTO抑制剂FB23-2对L929细胞的SOD1 mRNA和SOD2 mRNA的影响。
图6为FTO抑制剂FB23-2对Hacat细胞中的SOD1与I-collagen蛋白含量的影响。
图7为FTO抑制剂FB23-2对L929细胞中的I-collagen蛋白含量影响。
图8为不同浓度的FTO抑制剂恩他卡朋对Hacat细胞的ROS水平的影响。
图9为不同浓度的FTO抑制剂恩他卡朋对L929细胞的ROS水平的影响。
图10为FTO抑制剂恩他卡朋对Hacat、L929细胞毒性的影响。
图11为FTO抑制剂恩他卡朋对Hacat细胞的SOD1 mRNA的影响。
图12为FTO抑制剂恩他卡朋对L929细胞的SOD1 mRNA和SOD2 mRNA的影响。
图13为FTO抑制剂恩他卡朋对Hacat细胞中的SOD1与I-collagen蛋白含量的影响。
图14为FTO抑制剂恩他卡朋对L929细胞中的I-collagen蛋白含量影响。
图15为FTO抑制剂恩他卡朋对Hacat细胞中的总SOD酶活性的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 FTO抑制剂FB23-2对紫外线氧化损伤Hacat细胞、L929细胞的影响
(一)实验材料
FTO抑制剂FB23-2，分子式为C18H15Cl2N3O3，购自喀斯玛，厂家为ProbeChem，货号为PC-36169，采用DMSO将其溶解为浓度为20mmol/L的储存液。
(二)实验方法
1.首先对FB23-2进行细胞毒性实验，采用CCK8实验方法。将人角质形成细胞Hacat，鼠成纤维细胞L929以10×104的密度接种于96孔板，每个孔100μL。给予FB23-2，终浓度梯度分别为4、6、7、8、9、10、15μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，加入CCK8溶液10μL，37℃孵育2小时，在450nm处下测定吸光度OD值。
结果分析：FB23-2对Hacat、L929细胞毒性结果见图1。结果显示当FB23-2药物浓度为10μmol/L时，对细胞基本无毒性。
2.将Hacat细胞、L929细胞以2×105的密度接种于六孔板，每个孔200μL。将细胞分为3组：a.不加药，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后不照UVB组；b.不加药，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，去上清，加入1mLPBS后给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2；c.给予FB23-2，终浓度梯度分别为4、6、8、10、12、15μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，去上清，加入1mLPBS后给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2。处置完细胞后，加入1μL浓度为10μmol/L的2’,7’-二氯荧光双乙酸盐(DCFH-DA)，在细胞培养箱内孵育30min，孵育结束后，用PBS洗涤细胞2次，应用流式细胞仪进行检测，观察给药后细胞对抗紫外线氧化作用，结果以荧光度值表示。
结果分析：Hacat细胞、L929细胞ROS流式结果分别如图2、图3所示。结果显示Hacat细胞、L929细胞紫外线照射后ROS水平上调；当FB23-2药物浓度为10μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平明显下调，显著低于其他药物浓度下细胞及未给药物细胞内ROS水平。说明紫外线照射可上调Hacat细胞、L929细胞内ROS水平，给予FB23-2可下调Hacat细胞、L929细胞内ROS水平，且当FB23-2药物浓度为10μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平最低。结合图1结果，当FB23-2药物浓度为10μmol/L时，对Hacat细胞、L929细胞基本无毒性，后续实验选择10μmol/L作为FB23-2干预浓度。
3.将Hacat细胞、L929细胞以2×105的密度接种于六孔板，每个孔200μL。分为2组：a.不加药，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时；b.给予FB23-2，终浓度为10μmol/L(药物毒性小，抗氧化性最强)，37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时。使用Trizol法分别提取2组细胞总RNA，利用Real-time Quantitative PCR(qPCR)法分析给药后细胞的SOD1mRNA、SOD2 mRNA是否发生变化。
结果分析：给予10μmol/LFB23-2 72小时后，Hacat细胞、L929细胞的SOD1mRNA、SOD2 mRNA qPCR结果分别如图4、图5所示。结果显示给予FB23-2干预后，Hacat细胞SOD1mRNA表达量显著升高(P＜0.05)；L929细胞SOD1mRNA、SOD2 mRNA表达量显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。说明给予FB23-2干预后可上调Hacat细胞、L929细胞SOD1 mRNA表达量，上调L929细胞SOD2mRNA表达量。
4.将Hacat细胞与L929细胞按照是否给予FB23-2处理及是否给予紫外线光照处理分别分为4组：a1.Hacat control组，b1.Hacat+FB23-2组，c1.Hacat+UVB组，d1.Hacat+FB23-2+UVB组以及a2.L929 control组，b2.L929+FB23-2组，c2.L929+UVB组，d2.L929+FB23-2+UVB组。a1、c1、a2、c2组细胞在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时，b1、d1、b2、d2组细胞给予FB23-2，终浓度为10μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，将c1、d1、c2、d2组细胞给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2，后再次将c1、d1、c2、d2组细胞放入细胞培养箱中培养4h。最后收集各组细胞并通过Western Blot法检测SOD1，I-collagen蛋白定量。
结果分析：Western Blot法检测a1.Hacat control组，b1.Hacta+FB23-2组，c1.Hacat+UVB组，d1.Hacat+FB23-2+UVB组的细胞中的SOD1与I-collagen蛋白定量结果如图6所示。结果显示Hacat+FB23-2组SOD1蛋白量高于Hacat control组；Hacat+FB23-2+UVB组SOD1蛋白量高于Hacat+UVB组；Hacat+FB23-2组I-collagen蛋白量高于Hacat control组，Hacat+UVB组I-collagen蛋白量低于Hacat control组，Hacat+FB23-2+UVB组I-collagen蛋白量高于Hacat+UVB组；说明FB23-2干预后可上调Hacat细胞SOD1与I-collagen蛋白量。
Western Blot法检测a2.L929 control组，b2.L929+FB23-2组，c2.L929+UVB组，d2.L929+FB23-2+UVB组的细胞I-collagen蛋白定量结果如图7所示。结果显示，L929+FB23-2组I-collagen蛋白量高于L929 control组，L929+UVB组I-collagen蛋白量低于L929control组，L929+FB23-2+UVB组I-collagen蛋白量高于L929+UVB组。说明紫外线照射可下调Hacat细胞和L929细胞I-collagen蛋白量，FB23-2干预后可L929细胞I-collagen蛋白量。本实验中SOD1抗体对L929细胞特异性不高，L929细胞无法检测出SOD1蛋白。
实施例2 FTO抑制剂恩他卡朋对紫外线氧化损伤Hacat细胞、L929细胞的影响
(一)实验材料
FTO抑制剂Entacapone(恩他卡朋)，分子式为C14H15N3O5，购自喀斯玛，厂家为Aladdin，货号为E125270，采用DMSO将其溶解为浓度为10mmol/L的储存液。
(二)实验方法
1.将Hacat细胞、L929细胞以2×105的密度接种于六孔板，每个孔200μL。根据文献提供的恩他卡朋半抑制浓度(IC50)为3.5±0.8μmol/L，将细胞分为3组：a.不加药，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养，不照UVB组；b.不加药，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养，去上清，加入1mLPBS后给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2；c.给予恩他卡朋，终浓度梯度分别为2.5、3、3.5、4μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，去上清，加入1mLPBS后给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2。处置完细胞后，加入1μL浓度为10μmol/L的2’,7’-二氯荧光双乙酸盐(DCFH-DA)，在细胞培养箱内孵育30min，孵育结束后，用PBS洗涤细胞2次，应用流式细胞仪进行检测，观察给药后细胞对抗紫外线氧化作用，结果以荧光度值表示。
结果分析：Hacat细胞、L929细胞ROS流式结果分别如图8、图9所示。结果显示Hacat细胞、L929细胞紫外线照射后ROS水平上调；当恩他卡朋药物浓度为3μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平明显下调，显著低于其他药物浓度下细胞及未给药物细胞内ROS水平；当恩他卡朋药物浓度为3.5μmol/L、4μmol/L时，Hacat细胞、L929细胞内ROS水平与紫外线照射后细胞内ROS水平持平。说明紫外线照射可上调Hacat细胞、L929细胞内ROS水平，给予浓度为3μmol/L恩他卡朋时，能够显著下调Hacat细胞、L929细胞内ROS水平。
2.当恩他卡朋药物浓度为3μmol/L时，对Hacat细胞、L929细胞行CCK8细胞毒性实验。将人角质形成细胞Hacat，鼠成纤维细胞L929以1×105的密度接种于96孔板，每个孔100μL。给予恩他卡朋，药物浓度为3μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，加入CCK8溶液10μL，37℃孵育2小时，在450nm处下测定吸光度OD值。
恩他卡朋对Hacat、L929细胞毒性的影响如图10所示。结果显示，当恩他卡朋药物浓度为3μmol/L时，对Hacat、L929细胞基本无毒性，后续实验选择3μmol/L作为恩他卡朋干预浓度。
3.将L929细胞以2×105的密度接种于六孔板，每个孔200μL。分为2组：a.不加药，在37度，5％二氧化碳的条件下培养；b.给予恩他卡朋，终浓度为3μmol/L(药物毒性小，抗氧化性最强)，37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时。使用Trizol法分别提取2组细胞总RNA，利用Real-time Quantitative PCR(qPCR)法分析给药后细胞的SOD1 mRNA、SOD2 mRNA是否发生变化。
结果分析：给予3μmol/L恩他卡朋72小时处理后，Hacat细胞的SOD1 mRNA和L929细胞的SOD1 mRNA、SOD2 mRNA qPCR结果分别如图11、图12所示。结果显示给予恩他卡朋干预后，Hacat细胞SOD1 mRNA表达量显著升高(P＜0.01)，L929细胞SOD1 mRNA、SOD2 mRNA表达量显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。说明给予恩他卡朋干预后可上调Hacat细胞、L929细胞SOD1 mRNA表达量和L929细胞SOD2mRNA表达量。
4.将Hacat细胞与L929细胞按照是否给予恩他卡朋处理及是否给予紫外线光照处理分别分为4组：a1.Hacat control组，b1.Hacat+恩他卡朋组，c1.Hacat+UVB组，d1.Hacat+恩他卡朋+UVB组以及a2.L929 control组，b2.L929+恩他卡朋组，c2.L929+UVB组，d2.L929+恩他卡朋+UVB组。a1、c1、a2、c2组细胞在37℃，5％二氧化碳的条件下培养，b1、d1、b2、d2组细胞给予恩他卡朋，终浓度为3μmol/L，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养72小时后，将c1、d1、c2、d2组细胞给予UVB照射，照射强度为30mJ/cm2，后再次将c1、d1、c2、d2组细胞放入细胞培养箱中培养4h。最后收集各组细胞并通过Western Blot法检测SOD1，I-collagen蛋白定量。
结果分析：Western Blot法检测a1.Hacat control组，b1.Hacta+恩他卡朋组，c1.Hacat+UVB组，d1.Hacat+恩他卡朋+UVB组的细胞中的SOD1与I-collagen蛋白定量结果如图13所示。结果显示Hacat+恩他卡朋组SOD1蛋白量高于Hacat control组；Hacat+恩他卡朋+UVB组SOD1蛋白量高于Hacat+UVB组；Hacat+恩他卡朋组I-collagen蛋白量高于Hacatcontrol组，Hacat+UVB组I-collagen蛋白量低于Hacat control组，Hacat+恩他卡朋+UVB组I-collagen蛋白量高于Hacat+UVB组，说明恩他卡朋干预后可上调Hacat细胞SOD1与I-collagen蛋白量。
Western Blot法检测a2.L929 control组，b2.L929+恩他卡朋组，c2.L929+UVB组，d2.L929+恩他卡朋+UVB组的细胞I-collagen蛋白定量结果如图14所示。结果显示，L929+恩他卡朋组I-collagen蛋白量高于L929 control组，L929+UVB组I-collagen蛋白量低于L929control组，L929+恩他卡朋+UVB组I-collagen蛋白量高于L929+UVB组。说明紫外线照射可下调Hacat细胞和L929细胞I-collagen蛋白量，恩他卡朋干预后可上调Hacat细胞和L929细胞I-collagen蛋白量。本实验中SOD1抗体对L929细胞特异性不高，L929细胞无法检测出SOD1蛋白。
5.将步骤3条件下培养的Hacat细胞使用羟胺法检测SOD酶活性，观察给药后SOD酶活性是否发生变化。
结果分析：Hacat细胞给予3μmol/L恩他卡朋处理72小时后，其总SOD酶活性结果如图15所示。结果显示给予恩他卡朋干预后总SOD酶活性显著升高，说明恩他卡朋干预后可上调Hacat细胞总SOD酶活性。

Claims (8)

1.FB23-2在制备紫外氧化损伤的抗氧化产品中的应用。
2.FB23-2在制备提高紫外氧化损伤的细胞或组织超氧化物歧化酶含量产品中的应用。
3.FB23-2在制备降低紫外氧化损伤的细胞或组织的活性氧水平产品中的应用。
4.FB23-2在制备提高紫外氧化损伤的细胞或组织的I型胶原蛋白含量产品中的应用。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在制备提高细胞的超氧化物歧化酶活性产品中的应用。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在制备提高细胞的超氧化物歧化酶1蛋白含量产品中的应用。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在制备提高细胞或组织超氧化物歧化酶1mRNA和/或超氧化物歧化酶2 mRNA含量产品中的应用。
8.根据权利要求1～7任一所述应用，其特征在于，所述产品为护肤品和/或药物。
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Entacapone is an Antioxidant More Potent than Vitamin C and Vitamin E for Scavenging of Hypochlorous Acid and Peroxynitrite, and the Inhibition of Oxidative Stress-Induced Cell Death;Aaron Y. Chen等;《MEDICAL SCIENCE MONITOR》;20160301;第22卷;687-696 *
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